ES2483121T3

ES2483121T3 - Método mejorado para cuantificar ADN en una muestra biológica

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Publication number: ES2483121T3
Application number: ES10790234.8T
Authority: ES
Inventors: Hope Hart
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2009-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2014-08-05
Anticipated expiration: 2030-06-18
Also published as: NZ596987A; CA2765958A1; BRPI1011662A2; EP2443247A1; UA105044C2; AU2010262786A1; US9096896B2; CL2011003186A1; CN102482697B; MX2011013199A; EA201200026A1; EP2443247B1; EP2443247A4; KR20120044975A; WO2010148268A1; PT2443247E; US20120100544A1; CN102482697A; CO6480907A2; EA021136B1

Abstract

Un método para cuantificar ADN de suceso Bt11 en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos de maíz, comprendiendo el método: (a) poner en contacto dicha muestra biológica con un primer par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 2, y una sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 3, en el que dicho primer par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de maíz del suceso Bt11, produce un primer amplicón que comprende SEC ID NO: 4, y en el que dicho primer amplicón es de diagnóstico para el suceso Bt11; (b) poner en contacto dicha muestra biológica con un segundo par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 5 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 6, y una segunda sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 7, en el que dicho segundo par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de maíz, produce un segundo amplicón que comprende SEC ID NO: 8, y en el que dicho segundo amplicón es indicativo de la presencia del gen adhl de maíz; (c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácidos nucleicos y un instrumento de PCR capaz de llevar a cabo una PCR en tiempo real cuantitativa; (d) llevar a cabo la PCR en tiempo real cuantitativa usando los cebadores y sondas de (a) y (b), produciendo de ese modo el primer amplicón y el segundo amplicón; (e) detectar simultáneamente dicho primer amplicón y dicho segundo amplicón según se producen por dicho instrumento de PCR; y (f) calcular una cantidad relativa de dicho primer amplicón en comparación con dicho segundo amplicón, con lo que la cantidad de dicho primer amplicón es indicativa de la cantidad de ADN de Bt11 en dicha muestra biológica.

Description

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Experimento 7: -3,57 31,6 0,999 0,90

Experimento 8: -3,55 31,5 1,000 0,91

MEDIA: -3,52 31,7 0,999 0,93

A fin de evaluar la eficiencia de la amplificación E y el coeficiente R2 del método de detección del suceso Bt11 basado en Ct, se llevó a cabo un análisis de regresión lineal de los valores de Ct frente al log[contenido de %Bt11]. Se evaluaron las rectas de regresión de los estándar de 8 experimentos independientes (véase 4.3), y se determinaron los parámetros de regresión, incluyendo la pendiente, la intersección y R2. La eficiencia de la amplificación se calculó mediante la siguiente ecuación: E = [10(-1/pendiente)] – 1. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Parámetros de regresión y eficiencias de la PCR de las curvas de calibración basadas en valores de Ct de las muestras de calibración.

Pendiente: Intersección R2 E

Experimento 1: -3,43 9,2 1,000 0,96

Experimento 2: -3,55 9,3 0,999 0,91

Experimento 3: -3,42 9,2 0,999 0,96

Experimento 4: -3,45 9,2 0,999 0,95

Experimento 5: -3,46 9,5 0,999 0,95

Experimento 6: -3,34 9,4 0,998 0,99

Experimento 7: -3,50 9,5 1,000 0,93

Experimento 8: -3,50 9,4 0,999 0,93

MEDIA: -3,46 9,3 0,999 0,95

10 A fin de evaluar la robustez del método, se llevaron a cabo reacciones de PCR bajo concentraciones variables de mezcla maestra y temperaturas de hibridación.

La estabilidad de ambos sistemas de detección con respecto a cambios en la concentración de componentes de reacción principales, se llevó a cabo un experimento a +20% y a -20% de la concentración de la mezcla maestra. Se analizaron tres muestras (0,080%, 0,90% y 5,0% de ADN del suceso Bt11 en ADN de maíz no transgénico) a 250 ng

15 de ADN genómico por reacción. En la Tabla 8 se muestra la media de los triplicados.

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Resultados de la cuantificación 2: 0,056% 0,93% 5,6%

Desviación relativa del verdadero: -30,0% 3,3% 12,0%

A fin de evaluar la influencia de las plataformas de PCR en tiempo real diferentes, se analizaron tres muestras (0,080%, 0,90% y 5,0% de ADN del suceso Bt11 en un antecedente de ADN de maíz no GM) a 250 ng de ADN genómico por reacción, cada una en un sistema de detección ABI PRISM 7700, 7500 fast (modo no rápido del experimento m) y Stratagene Mx 3005P. Los dos resultados de la cuantificación obtenidos para cada muestra se muestran en la Tabla

10.

Tabla 10. Resultados de la cuantificación usando diferentes plataformas

Valor esperado (verdadero) (%Bt11)

0,080%: 0,90% 5,0%

ABI 7500 fast

Resultados de la cuantificación 1: 0,077% 0,82% 5,7%

Desviación relativa del verdadero: -3,75% -8,9% 14,0%

Resultados de la cuantificación 2: 0,072% 0,85% 5,6%

Desviación relativa del verdadero: -10,0% -5,6% 12,0%

ABI PRISM® 770

Resultados de la cuantificación 1: 0,082% 0,85% 5,9%

Desviación relativa del verdadero: 2,5% -5,5% 18,0%

Resultados de la cuantificación 2: 0,058% 0,92% 4,8%

Desviación relativa del verdadero: -27,5% 2,2% -4,0%

Stratagene Mx 3005P

Resultados de la cuantificación 1: 0,057% 1,09% 4,7%

Desviación relativa del verdadero: -28,8% 21,1% -6,0%

Resultados de la cuantificación 2: 0,083% 0,81% 4,0%

Desviación relativa del verdadero: 3,8% -10,0% -20,0%

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A fin de evaluar los resultados de ensayo en condiciones de reproducibilidad, se llevaron a cabo dos experimentos de cuantificación en dos laboratorios diferentes, Lab 1 y Lab 2. Se analizaron diferentes muestras que contienen una concentración de ADN de Bt11 de 0,08%-5,0% (cada una por triplicado) a 250 ng de ADN genómico por reacción en diferentes sistemas de detección de secuencias. La Tabla 11 muestra los dos resultados de la cuantificación obtenidos

5 para cada concentración de ADN de Bt11 en cada laboratorio. Se calculó que la desviación estándar de la reproducibilidad (RDSR) es aproximadamente 9,0% a la concentración de Bt11 de 0,08%.

Tabla 11. Resultados de la cuantificación en condiciones de reproducibilidad (entre laboratorios)

0,080%: 0,50% 0,90% 2,0% 5,0%

Lab 1 (ABI PRISM 7900 HT)

Resultados de la cuantificación 1: 0,068% 0,49% 0,96% 2,1% 4,6%

Desviación relativa del verdadero: -15,0% -2,0% 67% 5,0% -8,0%

Resultados de la cuantificación 2: 0,080% 0,57% 0,88% 2,1% 4,7%

Desviación relativa del verdadero: 0% 14,0% -2,2% 5,0% -6,0%

Lab 2 (ABI PRISM 7700)

Resultados de la cuantificación 1: 0,076% 0,49% 0,96% 2,0% 5,0%

Desviación relativa del verdadero: -5,0% -2,0% 6,7% 0% 0%

Resultados de la cuantificación 2: 0,065% 0,51% 1,14% 2,3% 5,9%

Desviación relativa del verdadero: -18,8% 2,0% 26,7% 15,0% 18,0%

El método de cuantificación descrito aquí se sometió al European Commission Joint Research Centre (JRC,

10 Biotechnology and GMOs Unit del Institute for Health and Consumer Protection) como Community Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed (CRL-GMFF). El JRC organizó un estudio colaborador internacional que implica 12 laboratorios. Cada laboratorio ensayó cinco concentraciones de Bt11 que incluyen 0,09%, 0,40%, 0,90%, 5,00% y 8,00%. Los resultados de este estudio de validación de múltiples laboratorios se publicaron en la publicación de CRL CRLVL10/07VR (2008), que está disponible en la web mundial en gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/. El

15 método tuvo un coeficiente medio de linealidad (R2) de 0,99, una RSDr de 17% a la concentración de Bt11 de 0,09%, una RSDR de 24% a la concentración de Bt11 de 0,09%, y el mayor valor de sesgo (exactitud) de -5% a la concentración de Bt11 de 5%.

Ejemplo 3. Evaluación del método anterior

Se han publicado otros ensayos de cuantificación del suceso Bt11 (Ronning et al. 2003. Eur. Food Res. Technol.

20 216:347-354 y European Commission JRC Community Reference Laboratory (CRL) publicado el 2004, localizado en la web mundial en gmo-crl.jrc.it//summaries/Bt11-protocol.pdf, que se basa en el método de Ronning et al.).

Para evaluar este método de cuantificación, se llevaron a cabo ensayos de PCR por un laboratorio independiente sobre mezclas de ADN de Bt11 y ADN no transgénico como se describe en la publicación de CRL citada anteriormente. Este ensayo usa cebadores y sondas diseñados para unirse a la región de inserto del genoma de 3’. Los resultados de 25 múltiples experimentos sugieren que la eficiencia de la PCR de las reacciones de Bt11 usando este método es inadecuada. Las pendientes de las rectas de regresión estándar de Bt11 sugieren una falta de eficiencia de la PCR, como se compara con las rectas de regresión estándar de adh1. En 5 de 6 experimentos, la correlación de las reacciones estándar de Bt11 fue peor que para las reacciones estándar de adhl cuando las disoluciones de ADN usadas para series estándar de Bt11 y adh1 fueron idénticas. Los resultados sugieren además que el método anterior

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Claims

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