EA021136B1 - Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце - Google Patents

Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце Download PDF

Info

Publication number
EA021136B1
EA021136B1 EA201200026A EA201200026A EA021136B1 EA 021136 B1 EA021136 B1 EA 021136B1 EA 201200026 A EA201200026 A EA 201200026A EA 201200026 A EA201200026 A EA 201200026A EA 021136 B1 EA021136 B1 EA 021136B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dna
primers
amplicon
pcr
biological sample
Prior art date
Application number
EA201200026A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201200026A1 (ru
Inventor
Хоуп Харт
Original Assignee
Зингента Партисипейшнс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Зингента Партисипейшнс Аг filed Critical Зингента Партисипейшнс Аг
Publication of EA201200026A1 publication Critical patent/EA201200026A1/ru
Publication of EA021136B1 publication Critical patent/EA021136B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

В изобретении описывается усовершенствованная методика количественного определения нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенной кукурузы с обозначением Bt11, в биологическом образце, а также композиций для применения в данной методике. Кроме того, изобретение касается использованных в настоящей методике пар праймеров, которые являются уникальными для объекта Bt11.

Description

Настоящее изобретение касается усовершенствованной методики количественного определения нуклеиновых кислот, уникальных для трансгенной кукурузы с обозначением ВН1, в биологическом образце, а также композиций, рекомендуемых к использованию в данной методике.
В связи с применением нормативных требований, в частности Директивы Европейской комиссии (ЕС) 1139/98, Директивы ЕС 49/2000 и Директивы ЕС 50/2000, регламентирующих использование трансгенных культурных растений, возникла необходимость в точном измерении уровней ДНК трансгенных видов, которые могут присутствовать, к примеру, в зерне, используемом для пищевых целей. Причиной значительного внимания, уделяемого аналитическим методам обнаружения и количественного анализа ДНК этих трансгенных растений, является то обстоятельство, что пороговое значение для маркировки, установленное Постоянным комитетом Европейской комиссии в 1999 году, составляет 1%.
Трансген можно распознать с помощью хорошо известного метода обнаружения нуклеиновых кислот, который включает, помимо прочего, термическую амплификацию (полимеразная цепная реакция (ПЦР)) с использованием полинуклеотидных праймеров или гибридизацию ДНК с использованием зондов нуклеиновой кислоты. В большинстве случаев для простоты и однотипности реагентов и методов, используемых для обнаружения определенной конструкции ДНК, которая применялась для преобразования различных видов растений, эти методы обнаружения, как правило, сосредоточены на часто применяемых генетических элементах, например промоторах, терминаторах и маркерных генах, поскольку для многих конструкций ДНК области кодирующей последовательности являются взаимозаменяемыми. В результате такие методы могут быть малоинформативными для дифференциации конструкций, которые различаются только в кодирующей последовательности. Кроме того, такие методы могут быть непригодны для дифференциации различных трансгенных объектов, в особенности полученных с использованием аналогичной конструкции ДНК.
С целью разграничения трансгенных объектов были разработаны методы ПЦР для конкретных объектов. Включение гетерологичной конструкции ДНК в геном растения создает уникальные, специфические для объектов стыки между интегрированной последовательностью ДНК и геномной последовательностью растения. Для трансгенных объектов, в том числе В(11, была разработана количественная методика ПЦР (количественная ПЦР) для конкретных объектов. К факторам, которые могут ограничивать применимость таких методов, могут относиться, например, влияние исходной концентрации ДНК, установленные надзорными органами стандарты, выбор праймеров и протокола ПЦР, повторяемость от образца к образцу, воспроизводимость результатов между различными лабораториями, а также пороговые значения для обнаружения низких уровней и высокой чувствительности.
По вышеизложенным причинам существует необходимость в совершенствовании количественного обнаружения нуклеиновых кислот трансгенной кукурузы ВН1 в биологическом образце.
Резюме
Настоящее изобретение касается трансформированной кукурузы (Ζοα таук) линии В(11, включающей две гетерологичные экспрессионные кассеты, одна из которых содержит кодирующую последовательность Сту1ЛЬ, которая кодирует инсектицидный белок Сту1ЛЬ, придающий растениям кукурузы ВН1 устойчивость к насекомым-вредителям, а вторая содержит кодирующую последовательность ра(, которая кодирует белок РАТ, придающий растениям кукурузы ВН1 устойчивость к гербицидам на основе глюфосината аммония. Создание объекта В(11 описано в патенте США № 6114608, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. Две экспрессионные кассеты были включены в пределах области 15 сМ на длинном плече хромосомы 8, возле положения 117, и в промежутке были фланкированы двумя общими маркерами: Ζ1Ε3 и ИМС150а.
Настоящее изобретение предлагает композиции и усовершенствованные методы количественного обнаружения специфичной для ВН1 ДНК в биологических образцах, имеющих отношение к эндогенному гену кукурузы айЫ Такое количественное определение ДНК ВН1, например, в смеси зерен кукурузы, включающей зерно линии В(11 и зерно, отличное от ВН1, основано на использовании пары праймеров и зонда, предназначенных для обнаружения последовательности 5' соединения в ВН1.
В одном варианте настоящего изобретения предлагается метод для определения количества ДНК объекта В(11 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы; в этом варианте осуществления метод включает (а) вступление биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 1, и второй праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит 8ЕЦ ГО N0: 3, в котором первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии ВН1 образует первый ампликон, содержащий 8ЕЦ ГО N0: 4, и в котором первый ампликон указывает на наличие объекта В(11; (Ь) вступление биологического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 5, и второй праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит 8ЕЦ ГО N0: 7, в котором вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий 8ЕЦ ГО N0: 8, и в котором второй ампликон указывает на наличие гена кукурузы
- 1 021136 айЬ1; (с) обеспечение условия для реакции амплификации нуклеиновых кислот и инструмента ПЦР, способного провести количественную ПЦР в реальном времени; (ά) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (Ь), образуя тем самым первый ампликон и второй ампликон; (е) одновременное обнаружение первого и второго ампликона при их образовании с помощью упомянутого инструмента ПЦР и (ί) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном, при котором количество первого ампликона указывает на количество ДНК ВН1 в биологическом образце.
В другом варианте настоящее изобретение предлагает пару праймеров, содержащую первый праймер, который состоит из ЗЕЦ ГО N0: 1, и второй праймер, который состоит из ЗЕЦ ГО N0: 2, в котором пара праймеров при использовании в ПЦР с геномной ДНК кукурузы линии ВН1 образует первый ампликон, содержащий ЗЕЦ ГО N0: 4, который указывает на наличие объекта В111.
В еще одном варианте настоящее изобретение предлагает полинуклеотидный зонд, состоящий из ЗЕЦ ГО N0: 3, который при маркировке флуоресцентной краской на 5'- и З'-концах практичен для использования в количественной ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения ампликона ВН1.
Вышеупомянутые и прочие варианты настоящего изобретения станут более понятны из нижеследующего подробного описания.
Описание последовательностей в перечне последовательностей ЗЕЦ Ю N0: 1 является праймером ВИ 1-5Рог.
8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 является праймером ВН 1-5Кеу.
ЗЕЦ ГО ΝΟ: 3 является зондом ВП 1.
8ЕЦ ГО N0: 4 является ампликоном количественной ПЦР ВЦ 1.
8ЕЦ ГО ΝΟ: 5 является праймером ΖιηαάΗΙ -Р.
5ЕЦ Ю ΝΟ: 6 является праймером 2шайЫ -К.
ЗЕЦ ГО ΝΟ: 7 является праймером ΖγμγΙΙιΙ-Ρ.
ЗЕЦ ГО N0; 8 является ампликоном количественной ПЦР айЫ.
Подробное описание
Предлагаемые ниже определения основных понятий приведены для большей ясности изложения сути настоящего изобретения и с целью оказания помощи специалистам с общим знанием данной области в практическом применении настоящего изобретения. Если не указано иное, используемые в настоящем документе термины следует понимать согласно их общепринятому токованию специалистами в соответствующей области. Определения общих терминов молекулярной биологии можно также найти в толковом словаре по классической и молекулярной генетике Ригера (Кзедег с1 а1., О1о88агу οί Оепейск: С1а881са1 апй Мо1еси1аг, 5* οάίΐίοη. Зрппдег-Уег1ад: №ν Уогк, 1994). В настоящем документе использована номенклатура для оснований ДНК и аминокислот, изложенная в Своде федеральных правил США 37 § 1.822.
Достоверность метода ПЦР - близость соответствия между результатом испытания и принятым эталонным значением.
Эффективность амплификации - скорость амплификации, которая приводит к теоретическому наклону в -3,32 с эффективностью 100% в каждом цикле. Эффективность реакции можно рассчитать с помощью следующего уравнения:
Эффективность = [ю(-1/наклон)] - 1.
Термин амплифицированный в контексте данного изобретения означает построение множественных копий молекулы нуклеиновой кислоты или множественных копий, комплементарных молекуле нуклеиновой кислоты, с использованием как минимум одной из молекул нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Системы амплификации включают, кроме прочего, систему полимеразной цепной реакции (ПЦР), систему лигазной цепной реакции (ЛЦР), метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот (ЫАЗВА, корпорация Сапдепе, М188188аида, 0п1агю), системы 0-бета репликазы, метод транскрипционной амплификации (ТАЗ) и амплификации с вытеснением цепи (8ΌΑ). См., например, Э1адпо5йс Мо1еси1аг МюгоЬю1оду: Ргтар1е8 апй Аррйсайопз (Диагностическая молекулярная микробиология: принципы и применение), Ό.Η. Регкшд е1 а1., Ей., Ашепсап Зоае1у Гог МюгоЬю1оду, ^акЫпдТоп, Э.С. (1993). Продукт амплификации называется ампликоном.
Коэффициент линейности (К2) - это коэффициент корреляции градуировочной кривой, полученной с помощью линейно-регрессионного анализа.
Термин динамический диапазон в контексте данного изобретения означает диапазон концентраций ДНК ВП1, выше которого метод, предлагаемый в настоящем изобретении, используется линейным способом с приемлемым уровнем достоверности и точности.
- 2 021136
Термин трансгенный объект в контексте данного изобретения относится к рекомбинантному растению, полученному путем трансформации и регенерации клетки или ткани растения с гетерологичной ДНК, например, экспрессионной кассетой, содержащей представляющий интерес ген.
Термин объект означает исходный трансформант и/или потомство трансформанта с гетерологичной ДНК. Термин объект также относится к потомству, полученному путем скрещивания трансформанта и кукурузы другой линии. Даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем введенная ДНК и фланкирующая ДНК трансформированного родителя присутствуют в потомстве гибрида в аналогичной хромосомной локализации. Термин объект также относится к ДНК исходного трансформанта, содержащего введенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность в непосредственной близости к введенной ДНК, которая, как ожидается, перейдет к потомству, получающему введенную ДНК, в том числе представляющий интерес трансген, в результате скрещивания одной родительской клеточной линии, которая включает введенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученные в результате самоопыления) с родительской клеточной линией, которая не содержит введенной ДНК. Обычно в результате трансформации ткани растения образуется множество объектов, каждый из которых представляет введение конструкции ДНК в различное расположение генома клетки растения. Определенный объект выбирают на основании экспрессии трансгена или других требуемых характеристик. Таким образом, термины объект В111. В111 ВШ-объект являются взаимозаменяемыми.
Термин экспрессионная кассета в контексте данного изобретения означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную направить экспрессию определенной нуклеотидной последовательности в надлежащую клетку-хозяина, содержащую промотор, активно связанный с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, которая активно связана с сигналами терминации. Обычно она также содержит последовательности, требуемые для надлежащей трансляции нуклеотидной последовательности. Экспрессионная кассета также может содержать последовательности, которые не являются необходимыми в прямой экспрессии представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но которые присутствуют в связи с удобным сайтом рестрикции для удаления кассеты из вектора экспрессии. Экспрессионная кассета, содержащая представляющую интерес нуклеотидную последовательность, может быть гибридной; это значит, что как минимум один из ее компонентов является гетерологичным по отношению как минимум к одному из ее других компонентов. Экспрессионная кассета также может представлять собой экспрессионную кассету, которая, хотя и встречается в природе, была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако в большинстве случаев экспрессионная кассета является гетерологичной в отношении хозяина, т.е. определенная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессионной кассеты не встречается в клетке-хозяине в природе, и ее необходимо ввести в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью процесса трансформации, применяемого в данной области науки. Экспрессия нуклеотидной последовательности в экспрессионной кассете может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцируемого промотора, который начинает транскрипцию только после того, как клетка-хозяин подвергается действию определенного внешнего раздражителя. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор также может быть специфичным для определенной ткани, органа или стадии развития. Экспрессионная кассета или ее фрагмент после их трансформации в растение могут также называться вставленная последовательность или вставочная последовательность.
Ген - определенный участок, расположенный в пределах генома, который, кроме кодирующей последовательности, может содержать другие, в первую очередь регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, ответственные за контроль экспрессии, а именно за транскрипцию и трансляцию кодирующей части. Ген также может содержать другие нетранслируемые 5'- и З'-последовательности и терминирующие кодоны. Другими возможными компонентами являются, например, интроны.
Гетерологичная последовательность нуклеиновых кислот - это последовательность нуклеиновых кислот, которая не связана естественным образом с принимающей ее клеткой-хозяином, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновых кислот.
Предел обнаружения (ЬОО) - минимальное количество или концентрация ДНК в образце, которые могут быть достоверно обнаружены, но не всегда выражены в количественной форме. Показатель БОЭ применительно к методу, предлагаемому настоящим изобретением, составляет менее 1/20 целевой концентрации. В условиях эксперимента с помощью метода, составляющего предмет настоящего изобретения, наличие ДНК ΒΠ1 идентифицируется как минимум в 95% случаев при ЬОО, что обеспечивает <5% ложноотрицательных результатов.
Предел количественного определения (ЬОЦ) - минимальное количество или концентрация ДНК ΒΠ1 в образце, которые могут быть количественно определены с приемлемым уровнем достоверности и точности. Показатель ЬОЦ для метода, составляющего предмет настоящего изобретения, составит менее 1/10 значения целевой концентрации с Κ8ΌΓ <25%. Целевая концентрация используется в качестве порога, предписанного нормативными требованиями.
Под осуществимостью следует понимать простоту использования, применимость и эффективность внедрения и/или сопутствующие удельные затраты (например, стоимость образца в долларах) описанного здесь метода.
Термин праймеры в контексте данного изобретения означает изолированные нуклеиновые кислоты, которые присоединены к комплементарной нити целевой ДНК путем гибридизации нуклеиновой кислоты для образования гибрида праймера и нити целевой ДНК, а затем протянуты вдоль нити целевой ДНК с помощью полимеразы, такой как ДНК-полимераза. Для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться пары или наборы праймеров, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других традиционных методов амплификации нуклеиновых кислот.
Зонд - это изолированная нуклеиновая кислота, к которой прикреплен обычный обнаруживаемый маркер или репортерная группа, такая как хемилюминесцентный агент, радиоактивный изотоп, лиганд или фермент. Такой зонд является дополнительным к нити ДНК кукурузы объекта ВП1 или традиционной линии кукурузы. ДНК ВП1 может происходить из растения кукурузы ВП1 или из образца, который включает ДНК из ВП1. Зонды согласно настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но и полиамиды, а также другие материалы, используемые в качестве зондов, которые, в частности, крепятся к целевой последовательности ДНК и могут использоваться для обнаружения наличия этой целевой последовательности ДНК.
Длина праймеров и зондов обычно составляет не менее 10-15 нуклеотидов. Длина праймеров и зондов может также составлять не менее 20 нуклеотидов, или не менее 25 нуклеотидов, или не менее 30 нуклеотидов. Такие праймеры и зонды, в частности, скрещиваются с целевой последовательностью в высокоточных условиях скрещивания. Согласно настоящему изобретению праймеры и зонды могут полностью дополнять целевую последовательность, хотя отличающиеся от целевой последовательности зонды, которые сохраняют способность к скрещиванию с целевыми последовательностями, могут разрабатываться с помощью традиционных методов.
В контексте настоящего изобретения термин стандартное отклонение повторяемости (сходимости) (ΚδΌΓ) означает стандартное отклонение результатов исследований, полученных в условиях повторяемости. Условия повторяемости - это условия, при которых результаты испытаний получают одним и тем же методом, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в течение коротких промежутков времени.
В контексте настоящего изобретения термин стандартное отклонение воспроизводимости (ΚδΌκ) означает стандартное отклонение результатов исследований, полученных в условиях воспроизводимости. Условия воспроизводимости - это условия, при которых результаты исследования получают одним и тем же методом, на идентичных объектах испытаний в разных лабораториях разными операторами, с использованием различного оборудования. Стандартное отклонение воспроизводимости описывает отклонение между лабораториями.
Устойчивость метода - это его способность оставаться незатронутым незначительными, но намеренными отклонениями от экспериментальных условий, описанных в настоящей процедуре.
Селективность метода - это способность метода реагировать исключительно на представляющую интерес характеристику или аналит. Например, селективность метода ПЦР, описанного в примере 1, в котором используются праймеры, раскрытые в ЗЕЦ ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 2, состоит в том, что с его помощью можно обнаружить исключительно ДНК ВН1.
Достоверность метода - это близость соответствия между средним значением, полученным из крупной серии результатов испытаний, и принятым эталонным значением. Мера точности обычно выражается в процентах отклонения. Достоверность метода, предлагаемого настоящим изобретением, составляет во всем динамическом диапазоне ±5%.
В контексте настоящего изобретения термин уникальный применительно к ВП1 означает явно характерный или отличительный признак объекта ВП1. Таким образом, уникальные для объекта ВП1 нуклеиновые кислоты не содержатся в других растениях кукурузы, которые не принадлежат к линии ВП1.
Настоящее изобретение предлагает композиции и усовершенствованные методы для количественного обнаружения специфичной для ВН1 ДНК в биологических образцах, имеющих отношение к эндогенному гену кукурузы абЫ. Такое количественное определение ДНК ВН1, например, в смеси зерен кукурузы, включающей зерно линии ВН1 и зерно, отличное от ВН1, основано на использовании пары праймеров и зонда, предназначенных для обнаружения последовательности 5' соединения в ВН1.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает метод для определения количества ДНК объекта ВН1 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы; в этом варианте осуществления метод включает (а) вступление биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из ЗЕЦ ГО N0: 1, и второй праймер, который состоит из ЗЕЦ ГО N0: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит ЗЕЦ ГО N0: 3, в котором первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии ВН1 образует первый ампликон, содержащий ЗЕЦ ГО N0: 4, и в котором первый ампликон указывает на наличие объекта ВН1; (Ь) вступление биоло- 4 021136 гического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, который состоит из §ЕЦ ГО N0: 5, и второй праймер, который состоит из §ЕЦ ГО N0: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной краской, который содержит §ЕЦ ГО N0: 7, в котором вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий §ЕЦ ГО N0: 8, и в котором второй ампликон указывает на наличие гена кукурузы аДЫ; (с) обеспечение условия для реакции амплификации нуклеиновых кислот и инструмента ПЦР, способного провести количественную ПЦР в реальном времени; (Д) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (Ь), образуя тем самым первый ампликон и второй ампликон; (е) одновременное обнаружение первого и второго ампликона при их образовании с помощью настоящего инструмента ПЦР и (ί) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном, при котором количество первого ампликона указывает на количество ДНК ВП1 в биологическом образце.
В одном варианте осуществления данного варианта изобретения предел количественного определения (Ь0Ц) метода составляет не более 0,08% концентрации ДНК ВП1.
В другом варианте осуществления данного варианта изобретения предел обнаружения (Б0Э) метода составляет не более 0,04% концентрации ДНК ВП1.
В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения средний коэффициент линейности (К2) метода составляет не менее 0,99.
В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения относительное стандартное отклонение воспроизводимости (ΚδΌκ) метода составляет не более 24% при концентрации ДНК ВП1 0,090%.
В другом варианте осуществления данного варианта изобретения относительное стандартное отклонение повторяемости (ΚδΌΓ) метода составляет не более 17% при концентрации ДНК ВП 1 0,090%.
В еще одном варианте осуществления данного варианта изобретения достоверность метода составляет во всем динамическом диапазоне не более ±5%.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает пару праймеров, включающих первый праймер, содержащий §ЕЦ ГО N0: 1, и второй праймер, состоящий из 8ЕЦ ГО N0: 2, которые действуют совместно в ПЦР в присутствии матрицы ДНК кукурузы линии ВП1 в биологическом образце для получения ампликона, указывающего на наличие кукурузы линии ВП1.
В одном варианте осуществления данного варианта изобретения ампликон содержит §ЕЦ ГО N0: 4.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает маркированный флуоресцентной краской зонд, содержащий §ЕЦ ГО N0: 3.
Описанные ниже примеры предназначены исключительно для иллюстрации одного или более предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничивающие область настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Разработка метода количественной ПЦР ВП 1 в реальном времени (КТ-цРСК).
В этом примере описан усовершенствованный, специфический для ВП1 метод количественной ПЦР в реальном времени (КТ-цРСК) для определения относительного количества ДНК ВП1 к общему количеству ДНК кукурузы в биологическом образце.
Анализ ТацМаи® (АррйеД Вю5у51ет5, Ро51ет Сйу, СА) является техническим приемом обнаружения с помощью количественной ПЦР в реальном времени, при котором накопление продукта ПЦР отслеживается непосредственно в ходе реакции ПЦР. Расщепление молекул зонда, предназначенных для заданной цели, вследствие деятельности экзонуклеазы от 5' до 3' полимеразы ДНК Тас.| в течение каждого цикла амплификации приводит к накоплению флуоресценции. Увеличение уровней флуоресценции напрямую связано с накоплением продукта ПЦР и обнаруживается в течение каждого цикла амплификации с помощью использования специализированной установки ПЦР, включая АВ1 РК18М™ 770 или АВ1 РК18М™ 7900 НТ (АррйеД Вю5у51ет5, Ро51ег Сйу, СА).
Пороговые значения цикла (С1) автоматически определяются инструментом ПЦР для каждого образца в соответствии с циклом, при котором флуоресценция превышает определенный фоновый уровень. Образцы с более высокими уровнями матрицы в начале реакции увеличиваются до обнаруживаемых уровней быстрее и вырабатывают меньшие значения СТ Для определения количества ДНК объекта ВП 1 в опытном образце для расчета с помощью линейной регрессии формулы АС1 эталонной кривой используются нормализованные значения АС'1 калибровочных образцов. Затем измеряются нормализованные значения АС'1 неизвестных образцов и с помощью рассчитанной формулы регрессии подсчитывается относительное количество ДНК объекта ВП1 в неизвестном образце. Описанный здесь анализ ТацМаи® может использоваться для точного количественного определения уровня ДНК ВП1, связанного с эндогенным калибровочным геном кукурузы. Поскольку эндогенная калибровочная последовательность остается неизменной относительно общего количества геномной ДНК кукурузы, любое отклонение в уровне ДНК, специфичной для ВП1, в отношении эндогенного гена указывает на различие в количестве копий.
- 5 021136
1.1. Система ПЦР, специфичная для объекта кукурузы линии В111.
Системы ПЦР, полученные из обеих областей соединения между введенной и геномной ДНК объекта ВН1, были протестированы на основании информации о последовательности вставки ДНК и ее фланкировании 5'- и З'-граничных последовательностей. С помощью программного обеспечения для разработки дизайна олигонуклеотидов (Рптег Ехртекк™ У2.0) были созданы три зонда и шесть амплификационных праймеров для 5'-конца, а также один зонд и три амплификационных праймера для З'-конца. Затем экспериментальным путем были испытаны все возможные комбинации этих праймеров и зондов.
Сравнение значений С1, значений ΔΚη, форм графиков амплификации и эффективности ПЦР привели к выбору для дальнейшей оптимизации комбинации одной пары праймера/зонда.
Оптимальная пара праймера и зонд расположены на соединении 5' генома-вставки; они дали лучшие результаты, чем праймеры на З'-соединении. Прямой праймер расположен в геномной ДНК; место связывания обратного праймера расположено в пределах вставки объекта ВН1, в то время как зонд охватывает соединение вставки-5'-генома. Для конкретного обнаружения ДНК объекта ВН1 фрагмент нуклеиновой кислоты из 68 пар оснований, перекрывающий гетерологичную вставную ДНК и геномную ДНК кукурузы, фланкирующую 5'-конец вставки, амплифицируется с помощью следующих праймеров:
ВШ-еу-П: 5'-ТОТОТООССАТТТАТСАТСОА-3' (5ЕО ГО N0: 1),
ВН1-еу-т5: 5'-С0СТСА0Т00ААС0ААААСТС-3' ЧЕО ГО N0: 2).
Продукты ПЦР измеряются при каждом цикле (в реальном времени) посредством следующего специфичного для заданной цели олигонуклеотидного зонда:
ВН1-еу-р1: 5'-ТТССАТОАССААААТСССТТААСОТОАОТ-3' ЧЕО ГО N0: 3), маркированного репортерным красителем, флуоресцеином (РАМ), на своем 5'-конце и красителем-тушителем, тетраметилродамином (ТАМКА) на своем 3'-конце.
С помощью этих праймеров в реакции с ДНК кукурузы В111 в качестве матрицы образуется ампликон 5>Е0 ГО N0: 4, который является уникальным и отличительным для объекта В111.
1.2. Эталонная система ПЦР, специфичная для кукурузы (абЫ).
Для относительного количественного определения ДНК объекта В111 была использована предсуществующая специфичная для кукурузы эталонная система ПЦР ((Негпапбе/ е1 а1. 2004. 1. Адпс. Рооб Сйет. 52:4632-4637), которая амплифицирует фрагмент из 135 пар оснований эндогенного гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (абЫ) (ОепЬапк ассеккюп по. АУ691949) в качестве конкретного обнаружения последовательностей 2еа тау8. В данной эталонной системе используются следующие праймеры:
2табЬ1-Р: 5'-С0ТС0ТТТСССАТСТСТТССТ-3' ЧЕО ГО N0: 5),
2табЬ1-К: 5'-ССАСТССОАОАСССТСАОТС-3' ЧЕО ГО N0: 6).
Продукты ПЦР измеряются при каждом цикле (в реальном времени) посредством следующего специфичного для заданной цели олигонуклеотидного зонда:
2табЬ1-Р: 5'-ААТСАОООСТСАТТТТСТСОСТССТСА-3' ЧЕО ГО N0: 7), который маркирован с помощью красителя У1С™ (АррНеб Вю8у8(ет8, Ро51ег Сйу, СА) на 5'-конце и ТАМКА на 3'-конце.
С помощью этих праймеров в реакции с ДНК кукурузы в качестве матрицы образуется ампликон, содержащий 5>Е0 ГО N0: 8, который указывает на наличие кукурузы абЫ.
1.3. Расчет калибровочной кривой.
Калибровочная кривая состоит из пяти образцов с фиксированным процентным содержанием ДНК В111 в общем количестве 250 нг ДНК кукурузы. Концентрация ДНК ВН1 в стандартных образцах колебалась от 10 до 0,08%. Калибровочную кривую получают путем нанесения значений Δί'Ί калибровочных образцов в зависимости от логарифма соответствующей концентрации ВН1%; наклон (а) и отрезок между двумя точками (Ь) калибровочной кривой (у = ах + Ь) затем используются для расчета среднего содержания В111% контрольных образцов, основываясь на их нормализованных значениях Δί'Έ
В ходе реакции ТацМап™ программное обеспечение, поставляемое с устройством АВ1 РК18М™ 7900 НТ, обнаруживает накопление продукта ПЦР путем накопления флуоресценции. Строится зависимость нормализованной флуоресценции, относящейся к установленным исходным уровням (ΔΚη), от номера цикла. Значение СИ получают путем нанесения производного порога через реакции, так чтобы линия проходила через логарифмическую фазу каждой реакции. Программное обеспечение системы обнаружения последовательности с устройством АВ1 РК18М™ 7900 НТ предоставляет номер цикла, при котором накопление флуоресценции (продукта ПЦР) определенной реакции выходит за пределы порогового значения (С1). Значение РАМ СИ (ВН1) сравнивается со значением У1С СИ (абЫ) для нормализации значения РАМ СИ каждой реакции до уровня общего количества имеющихся нуклеиновых кислот для получения АС1[АС1 = СИРАМ) - СН(У1С)|. Благодаря такому расчету устраняются любые отклонения, вызванные неравноценными матрицами на входе реакций. Поскольку количество копий эндогенного гена кукурузы на один геном остается неизменным, изменение значения Δί'Ί соответствует изменению в количестве (или копии) ДНК ВН1. Сравнивая значения Δί'Ί неизвестных образцов со значениями Δί'Ί известной контрольной группы, получают ΔΔί'Ί [ΔΔΟ: = Δ СП (неизвестный) - Δ СИ (известный)]. Затем количество копий может быть рассчитано с помощью значения ААСΐ, используя уравнение:
Количество копий = 2(ωα).
- 6 021136
1.4. Порядок проведения ПЦР в реальном времени.
ПЦР проводят в 96-луночных плашках. Процедура представляет собой нерезервированную систему, в которой одновременно в отдельных лунках проводят эндогенный анализ калибровочной кукурузы абЫ и анализ целевого БП1. В двух реакционных пробирках, одной для системы ВП1 и одной для системы абЫ, на льду добавляют компоненты (за исключением ДНК), представленные в табл. 1 и 2, в перечисленном порядке для приготовления мастер-миксов. Микс 2Х §1§ша ЛипрЦаП Кеабу Μίχ дополняют 550 мкл 1 моля МдС12 и 20 мкл 10000х сульфородамина 101. Затем осторожно смешивают и быстро центрифугируют. Готовят еще две реакционные пробирки, одну для ВП1 и одну для мастер-миксов абЫ, для образцов ДНК со стандартной кривой, неизвестных образцов ДНК и контрольных образцов ДНК. В каждую реакционную пробирку добавляют надлежащее количество мастер-микса (например, 20x3=60 мкл мастер-миксов для трех повторов ПЦР-реакций). В каждую пробирку добавляют надлежащее количество ДНК, указанное в табл. 1 и 2 (например, 5x3=15 мкл ДНК для трех повторов ПЦР-реакций).
Таблица 1
Смесь для реакции амплификации в конечном объеме/концентрации на одну реакционную лунку для эталонной системы кукурузы абЫ
Компонент Конечная концентрация мкл на реакцию
ЗЦта 1итрз1ап КеабуХПх (2х) 1х 12,5
Праймер Ζηι асШ- Р (10 мкмоль) 300 нмоль 0,75
Праймер Ζηι жШ- К. (10 мкмоль) 300 нмоль 0,75
Зонд Ζηι аМ- Р (10 мкмоль) 200 нмоль 0,50
Вода без нуклеазы 5,50
Матрица ДНК (не более 250 нг) 5
Общий объем реакционной смеси: 25
Таблица 2
Смесь для реакции амплификации в конечном объеме/концентрации на одну реакционную лунку для системы, специфичной для ВП 1
Компонент Конечная концентрация мкл на реакцию
8Цта 1итр51аП КеабуМ|х (2х) 1х 12,5
Праймер Βΐΐ 1-еν-Π (10 мкмоль) 200 нмоль 0,50
Праймер Βίΐ 1-βν-τ5 (10 мкмоль) 200 нмоль 0,50
Зонд Βιΐ 1-еν-ρΐ (10 мкмоль) 150 нмоль 0,38
Вода без нуклеазы # 6,12
Матрица ДНК (не более 250 нг) # 5
Общий объем реакционной смеси: 25
Каждую пробирку встряхивают в течение около 10 с, чтобы помочь снизить изменчивость между повторами каждого образца. Пробирки замедленно вращают в микрофуге. 25 мкл расфасовывают аликвотами в каждую реакционную лунку для ПЦР. Плашку герметизируют с помощью оптического колпака или оптических крышек. Плашку центрифугируют при 250хд в течение около 1 мин в диапазоне температур от 4°С до температуры, близкой к комнатной. Плашку устанавливают в устройство для проведения ПЦР и проводят ПЦР в условиях цикла, описанного в табл. 3.
Таблица 3
Цикловая программа для систем кукурузы ВП 1/абЬ1
Этап Стадия Темп. (°С) Время (сек) Сбор данных Циклы
1 ило 50 °С 120 Нет 1
2 Начальная денатурация 95 °С 600 Нет 1
3 Денатурация 95 °С 15 Нет 40
Отжиг и вставочный материал 60 °С 60 Да
1.5. Анализ данных.
После проведения вышеописанного протокола ПЦР в реальном времени результаты анализируются с помощью следующей процедуры.
Для установки порогового значения кривые амплификации одной системы (например, В111) отображаются в логарифмическом режиме. Пороговую линию располагают в зоне кривой, где профили амплификации параллельны (экспоненциальная фаза ПЦР). В случае необходимости значения С'1 актуализируются. Переход к линейному режиму осуществляют, щелкнув на оси Υ графика амплификации, а за- 7 021136 тем проверяют, чтобы предварительно установленный порог находился в геометрических пределах кривых.
Для установки исходного уровня определяют номер цикла, при котором пороговая линия пересекает первую кривую амплификации, и устанавливают исходный уровень за три цикла до этого значения (например, самое раннее значение 0=25. пересечение исходного уровня следует установить при значении 0=25-3=22).
Описанную выше процедуру повторяют на графиках амплификации другой системы (например, системы аДЬ1).
После определения порогового значения в пределах логарифмической фазы амплификации согласно вышеприведенному описанию с помощью программного обеспечения устройства рассчитывают значения О для каждой реакции. Эталонную кривую О создают путем нанесения значений О, измеренных для калибровочных точек, в зависимости от логарифма процентного содержания В111 и путем включения в эти данные линии линейной регрессии. После этого для расчета относительного количества ДНК В111 в неизвестных образцах ДНК используют формулу регрессии.
Селективность анализа В111 (прямые/обратные праймеры и зонд) была проверена опытным путем в ПЦР в реальном времени в зависимости от ДНК, выделенной из образцов, содержащих известную в данной области трансгенную кукурузу, включая В111, В110, ΝΚ603, ΜΟΝ810, ΜΟΝ863, ΜΘΝ810χ ΜΟΝ863, ТС1507, ΜΙΚ604, В1176, 0Л21, ΜΘΝ88017, Т25 и Негси1ех® КА (ΌΆ8-59122-7).
Результаты демонстрируют, что ни одна из протестированных вышеупомянутых линий трансгенной кукурузы, за исключением положительного контроля В111, не образовывала ампликоны в повторных выборках в случае использования для одной реакции всего 100 нг ДНК.
Пример 2. Подтверждение наличия В111 методом количественной ПЦР в реальном времени (КТ-цРСК).
Описанный в примере 1 метод оптимизирован с целью количественного определения ДНК ВИ 1 в биологических образцах, состоящих из смесей семян ВИ1 и традиционной кукурузы. Данный метод использует уникальную последовательность ДНК в области между вставкой и геномом растения. Эта последовательность специфична для кукурузы линии В111 и, таким образом, обеспечивает селективность этого метода применительно к объекту.
2.1. Точность/достоверность/динамический диапазон/ЬОр/ЬОО.
Для определения точности, достоверности, динамического диапазона, ЬОЦ и ЬОЭ был проведен экспериментальный проект, состоящий из восьми независимых серий.
Были созданы калибровочные образцы (от 81Д1 до 810.6) путем приготовления растворов 50 нг/мкл (250 нг на реакцию) общего количества геномной ДНК с содержанием 100; 10; 5; 1; 0,5 и 0,1% ДНК объекта В111 в фоне ДНК нетрансгенной кукурузы. Схема разведения стандарта В111 и соответствующее общее содержание геномной ДНК в ПЦР-реакции показаны в табл. 4.
Таблица 4
Схема разведения калибровочных образцов
Количество в каждом стандарте (нг)
Код образца 81Й1 8ίά2 8ЙЗ 8Й4 8ΐά5 ЗШб
Общее содержание ДНК в ПЦР 250 250 250 250 250 250
Общее содержание ДНК ВН 1 в ПЦР 250 25 12,5 2,5 1,25 0,25
Калибровочную кривую получали путем нанесения средних значений ΔΟ калибровочных образцов в зависимости от логарифма соответствующей концентрации В111 в%; наклон (а) и отрезок между двумя точками (Ь) калибровочной кривой (у = ах + Ь) затем использовались для расчета среднего процентного содержания В111 контрольных образцов, основываясь на их нормализованных значениях ΔΟ.
Для подтверждения чистоты реагентов использовали три отрицательных контроля (ΝΤί'.') на одну систему. Каждый эталонный образец (содержащий различные пропорции ДНК объекта В111 в фоне ДНК нетрансгенной кукурузы) анализировали с помощью 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию в трех идентичных копиях.
Анализ данных выполняли с использованием установки исходного уровня 3-19 для системы аДЫ и 3-21 для системы обнаружения, специфичной для объекта В111. Пороговые значения составили 0,4 (аДЫ) и 0,7 (В111) на системе обнаружения АВ1 7900 НТ.
Для каждого из 5 образцов (содержащих от 5,0 до 0,08% ДНК объекта В111 в ДНК нетрансгенной кукурузы) с целью определения достоверности и повторяемости рассчитали среднее значение (ΜΕΑΝ), относительное отклонение от ожидаемого значения (В1А8), а также стандартное отклонение (8ТЭЕУ) и относительное стандартное отклонение (К8ЭГ) результатов количественного определения. Результаты показаны в табл. 5.
- 8 021136
Таблица 5
Результаты количественного определения 8 независимых серий ПЦР в условиях повторяемости для объекта ВП1
Уровень Βΐΐ 1 Меап ΒΪ35 8ΐύβν К8БГ
5,0 % 5,4 % 8,0 % 0,32 % 5,9 %
2,0 % 1,9% -5,0 % 0,18% 9,5 %
0,90 % 0,90 % 0,0 % 0,070 % 7,8 %
0,50 % 0,53 % 6,0 % 0,076 % 14,3 %
0,080 %а 0,068 % -15,0% 0,0111 % 16,3 %
0,040 %в Все положительные
а Предел количественного определения (ЬОЦ). ь Предел обнаружения (БОБ).
Относительное отклонение среднего значения от ожидаемого (истинного) значения колебалось от -13,8 до 0% во всем динамическом диапазоне.
Значения точности (стандартное отклонение повторяемости К8БГ) для всех образцов с концентрацией В111 в пределах от 5,0 до 0,08% колебались от 5,9 до 16,3% относительного стандартного отклонения.
Было определено, что относительный предел обнаружения (БОБ) настоящего метода составил не более 0,04% в 250 нг общего количества ДНК кукурузы. Относительный предел количественного определения (БОЦ) настоящего метода составил не более 0,08% в 250 нг общего количества ДНК кукурузы.
2.2. Эффективность амплификации и коэффициент К2.
Для оценки эффективности амплификации (Е) и коэффициента К2 специфичной для объекта ВП 1 (единичной) системы ПЦР был проведен линейно-регрессионный анализ значений С'1 ВП 1 в зависимости от логарифма [% содержание ВП 1]. Были оценены линии регрессии стандартов 8 независимых серий (см. подраздел 2.1) и были определены параметры регрессии, включая наклон, отрезок между двумя точками и коэффициент К2. Эффективность амплификации была рассчитана с помощью следующего уравнения:
Е = [10(-1/наклон)] - 1
Результаты показаны в табл. 6.
Таблица 6
Параметры регрессии и эффективность ПЦР специфичных для объекта ВП1 линий регрессии
Наклон Промежуток между двумя точками К2 Е
Серия1 -3,48 31,7 1.000 0.94
Серия2 -3,61 31,9 0.999 0,89
СерияЗ -3,48 31,7 0.999 0.94
Серия4 -3,53 31,8 0.999 0.92
Серия5 -3,51 31,7 0.999 0.93
Серияб -3,40 31,5 1.000 0.97
Серия7 -3,57 31,6 0.999 0.90
Серия8 -3,55 31,5 1.000 0.91
ΜΕΑΝ (среднее значение) -3,52 31,7 0.999 0.93
Для оценки эффективности амплификации Е и коэффициента К2, основанного на значении ΔΟΐ метода обнаружения объекта ВП1, был проведен линейно-регрессионный анализ значений ΔΟΐ в зависимости от логарифма [% содержание ВП1]. Были оценены линии регрессии стандартов 8 независимых серий и были определены параметры регрессии, включая наклон, отрезок между двумя точками и коэффициент К2. Эффективность амплификации была рассчитана с помощью следующего уравнения:
Е = [10(-1/наклон)] - 1
Результаты показаны в табл. 7.
- 9 021136
Таблица 7
Параметры регрессии и эффективность ПЦР калибровочных кривых, основанных на значениях АС.'1 калибровочных образцов
Наклон Промежуток между двумя точками К2 Е
Серия 1 -3,43 9,2 1.000 0.96
Серия2 -3,55 9,3 0.999 0.91
СерияЗ -3,42 9,2 0.999 0.96
СерияД -3,45 9,2 0.999 0.95
Серия5 -3,46 9,5 0.999 0.95
Серияб -3,34 9,4 0.998 0.99
Серия7 -3,50 9,5 1.000 0.93
Серия8 -3,50 9,4 0.999 0.93
ΜΕΑΝ (среднее значение) -3,46 9,3 0.999 0.95
Для оценки устойчивости метода проводили ПЦР-реакции при переменных концентрациях мастермикса и температурах отжига.
Для определения стабильности обеих систем обнаружения в отношении изменений концентрации основных компонентов реакции проводили эксперимент при +20% и при -20% концентрации мастермикса. Три образца (содержащих 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта ВИ 1 в ДНК нетрансгенной кукурузы) анализировались с содержанием 250 нг геномного ДНК на каждую реакцию. Средние значения трипликатов показаны в табл. 8.
Таблица 8
Результаты количественного определения при ±20% мастер-микса
Ожидаемое (истинное) значение (%В111)
0,080 % 0,90 % 5,0 %
Мастер-микс +20 %
Результаты количественного определения 0,056 % 0,74 % 4,7 %
Относительное отклонение от истинного результата -30,0 % -17,8% -6,0 %
Мастер-микс -20 %
Результаты количественного определения 0,060 %а 0,74 % 5,3 %
Относительное отклонение от истинного результата -25,0 % -17,8% 6,0 %
а За исключением одного резко отклоняющегося значения.
Для оценки влияния изменения температуры отжига были проанализированы три образца (содержащие 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта ВН1 в фоне ДНК не модифицированной генетически кукурузы) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию с температурами отжига 58 и 62°С на системе обнаружения последовательности АВ1 7900 НТ. Результаты показаны в табл. 9.
- 10 021136
Таблица 9
Результаты количественного определения с использованием различных температур отжига
Ожидаемое (истинное) значение (%ВШ)
0,080 % | 0,90 % | 5,0 %
58 °С
Результат количественного определения 1 0,057 % 1,09% 5,9 %
Относительное отклонение от истинного результата -28,8 % 21,0% 18,0%
Результат количественного определения 2 0,060 % 0,90 % 5,5 %
Относительное отклонение от истинного результата -25 % 0,0 % 10,0 %
62 “С
Результат количественного определения 1 0,071 % 0,89 % 5,2 %
Относительное отклонение от истинного результата -11,3% -1,1 % 4,0 %
Результат количественного определения 2 0,056 % 0,93 % 5,6 %
Относительное отклонение от истинного результата -30,0 % 3,3 % 12,0 %
Для оценки влияния различных платформ ПЦР в реальном времени были проанализированы три образца (содержащие 0,080, 0,90 и 5,0% ДНК объекта ВН1 в фоне ДНК не модифицированной генетически кукурузы) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию, каждый на системе обнаружения АВ1 ΡΚΙ8Μ® 7700, 7500 ГаЧ (использованная в не быстром режиме) и §!та!адеие Мх 3005Р. Два результата количественного определения, полученные для каждого образца, показаны в табл. 10.
Таблица 10
Результаты количественного определения с использованием различных платформ
Ожидаемое (истинное) значение (%В111)
0,080 % 0,90% | 5,0 %
ΑΒΙ 7500 Газ!
Результат количественного определения 1 0,077 % 0,82 % 5,7 %
Относительное отклонение от истинного результата -3,75 % -8,9 % 14,0 %
Результат количественного определения 2 0,072 % 0,85 % 5,6 %
Относительное отклонение от истинного результата -10,0% -5,6 % 12,0 %
ΑΒΙ ΡΚΙ8Μ® 770
Результат количественного определения 1 0,082 % 0,85 % 5,9 %
Относительное отклонение от истинного результата 2,5 % -5,5 % 18,0%
Результат количественного определения 2 0,058 % 0,92 % 4,8 %
Относительное отклонение от истинного результата -27,5 % 2,2 % -4,0 %
81га!арепе Мх 3005Р
Результат количественного определения 1 0,057 % 1,09% 4,7 %
Относительное отклонение от истинного результата -28,8 % 21,1 % -6,0 %
Результат количественного определения 2 0,083 % 0,81 % 4,0 %
Относительное отклонение от истинного результата 3,8 % -10,0% -20,0 %
- 11 021136
Для оценки результатов испытания в условиях повторяемости были проведены две серии по количественному определению в двух разных лабораториях, ЬаЬ 1 и ЬаЬ 2. Были проанализированы различные образцы, содержащие 0,08-5,0% концентрации ДНК В111 (каждый в трех идентичных копиях) с содержанием 250 нг геномной ДНК на каждую реакцию на различных системах обнаружения последовательности. В табл. 11 показаны два результата количественного определения для каждой концентрации ДНК ВП1 в каждой из лабораторий. Было подсчитано, что стандартное отклонение повторяемости (К8ЭК) составляет приблизительно 9,0% при концентрации В!11 0,08%.
Таблица 11
Результаты количественного определения в условиях повторяемости (между лабораториями)
0,080 % 0,50 % 0,90 % 2,0 % 5,0 %
ЬаЬ 1 (ΑΒΙ ΡΚΙ5Μ 7900 НТ)
Результат количественного определения 1 0,068 % 0,49 % 0,96 % 2,1 % 4,6 %
Относительное отклонение от истинного результата -15,0% -2,0 % 6,7 % 5,0 % -8,0 %
Результат количественного определения 2 0,080 % 0,57 % 0,88 % 2,1 % 4,7 %
Относительное отклонение от истинного результата 0% 14,0 % -2,2 % 5,0 % -6,0 %
ЬаЬ 2 (ΑΒΙ ΡΚΙ3Μ 7700)
Результат количественного определения 1 0,076 % 0,49 % 0,96 % 2,0 % 5,0 %
Относительное отклонение от истинного результата -5,0 % -2,0 % 6,7 % 0% 0%
Результат количественного определения 2 0,065 % 0,51 % 1,14% 2,3 % 5,9 %
Относительное отклонение от истинного результата -18,8% 2,0 % 26,7 % 15,0% 18,0%
Описанный здесь метод количественного определения был представлен Объединенному научному центру Европейской комиссии ЦКС, Отдел биотехнологии и ГМО Института здоровья и защиты потребителей), а также Эталонной лаборатории Сообщества по обнаружению генетически модифицированных пищевых продуктов и кормов (СКЬ-ОМРР). Центром РКС было организовано международное совместное исследование с участием 12 лабораторий. Каждая лаборатория провела испытание пяти концентраций ДНК ВП1, включая концентрации 0,09, 0,40, 0,90, 5,00 и 8,00%. Результаты мультилабораторного валидационного анализа были оглашены в публикации СКВ СКЕУЪ10/07УК (2008), которая доступна на веб-сайте дто-сг1.)гс.ес.еигора.еи/. Средний коэффициент линейности метода (К2) составляет 0,99, значение К8ЭГ -17% при концентрации ВИ1 0,09%, значение К8ЭК - 24% при концентрации ВН1 0,09%, а максимальное значение отклонения (точность) равняется -5% при концентрации ВП1 5%.
Пример 3. Оценка предыдущего метода.
Существуют опубликованные описания других методик количественного определения объекта ВП1 (Коиишд е! а1. 2003. Еиг. Рооб Кек. ТесЬио1. 216:347-354, а также публикация Эталонной лаборатории Сообщества (СКВ) 1КС Европейской комиссии 2004 г., размещенная на веб-сайте:
дто-сгЦгсл1/5итта1те5/ВИ1-рго1осо1.рб£, основанная на использовании метода, описанного у Коиишд е! а1.).
Для оценки данного метода количественного определения независимая лаборатория провела анализы ПЦР на смесях ДНК В111 и нетрансгенной ДНК согласно описанию в вышеупомянутой публикации СКВ. В этом анализе были использованы праймеры и зонды, предназначенные для связывания участка 3' генома-вставки. Результаты множественных экспериментов позволяют предположить, что эффективность ПЦР-реакций ВИ 1 с использованием этого метода не является адекватной. Наклоны линий регрессии стандарта ВП1 дают основание предположить отсутствие эффективности ПЦР по сравнению с линиями регрессии стандарта абЬ1. В 5 из 6 экспериментов соответствие реакций стандарта ВИ 1 было хуже, чем для реакций стандарта абЬ1, при идентичных растворах ДНК, используемых для серий стандарта ВП1 и абЫ. Кроме того, результаты дают основание предположить, что предыдущий метод также имеет недостатки в плане точности, повторяемости и устойчивости.
Все публикации и опубликованные патентные документы, упомянутые в настоящем описании изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентный документ был конкретно и отдельно указаны как подлежащие включению в настоящий документ посредством ссылки.

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения количества ДНК ВИ1 в биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы, включающий:
    (a) приведение биологического образца в контакт с первой парой праймеров, содержащей первый праймер, состоящий из 5>ЕО ГО N0: 1, и второй праймер, состоящий из §ЕЦ ГО N0: 2, и зондом, маркированным флуоресцентной меткой, содержащим 5>Е0 ГО N0: 3, причем указанная первая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы линии ВИ 1 образует первый ампликон, содержащий §ЕЦ ГО N0: 4, являющийся отличительным для ВИ1;
    (b) приведение биологического образца в контакт со второй парой праймеров, содержащей первый праймер, состоящий из 5>Е0 ГО N0: 5, и второй праймер, состоящий из §ЕЦ ГО N0: 6, и со вторым зондом, маркированным флуоресцентной меткой, содержащим 5>Е0 ГО N0: 7, причем вторая пара праймеров при использовании в реакции амплификации нуклеиновых кислот с геномной ДНК кукурузы образует второй ампликон, содержащий 5>Е0 ГО N0: 8, который указывает на наличие гена кукурузы абЫ;
    (c) обеспечение условий для реакции амплификации нуклеиновых кислот;
    (б) проведение количественной ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зондов (а) и (Ь), получая при этом указанные первый и второй ампликоны;
    (е) одновременное обнаружение первого и второго ампликонов;
    (ί) подсчет относительного количества первого ампликона по сравнению со вторым ампликоном, при котором количество указанного первого ампликона указывает на количество ДНК ВШ в биологическом образце.
  2. 2. Способ по п.1, в котором предел количественного определения (Ь0Ц) способа составляет не более 0,08% концентрации ДНК ВШ.
  3. 3. Способ по п.1, в котором предел количественного определения (Ь0Ц) способа составляет не более 0,04% концентрации ДНК ВШ.
  4. 4. Способ по п.1, в котором средний коэффициент линейности (К2) способа составляет не менее
    0,99.
  5. 5. Способ по п.1, в котором относительное стандартное отклонение воспроизводимости (ΚδΌκ) способа составляет не более 24% при концентрации ДНК ВИ 1 0,090%.
  6. 6. Способ по п.1, в котором относительное стандартное отклонение повторяемости (ΚδΌΓ) способа составляет не более 17% при концентрации ДНК ВИ 1 0,090%.
  7. 7. Способ по п.1, в котором достоверность способа составляет во всем динамическом диапазоне не более ±5%.
  8. 8. Пара праймеров, содержащих первый праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 1, и второй праймер, который состоит из 8ЕЦ ГО N0: 2, действующие совместно в присутствии матрицы ДНК кукурузы линии ВШ в биологическом образце для получения ампликона, указывающего на наличие кукурузы линии ВШ.
EA201200026A 2009-06-18 2010-06-18 Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце EA021136B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21815509P 2009-06-18 2009-06-18
PCT/US2010/039109 WO2010148268A1 (en) 2009-06-18 2010-06-18 Improved method for quantifying dna in a biological sample

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201200026A1 EA201200026A1 (ru) 2012-07-30
EA021136B1 true EA021136B1 (ru) 2015-04-30

Family

ID=43356766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201200026A EA021136B1 (ru) 2009-06-18 2010-06-18 Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9096896B2 (ru)
EP (1) EP2443247B1 (ru)
KR (1) KR20120044975A (ru)
CN (1) CN102482697B (ru)
AP (1) AP3139A (ru)
AU (1) AU2010262786A1 (ru)
BR (1) BRPI1011662A2 (ru)
CA (1) CA2765958A1 (ru)
CL (1) CL2011003186A1 (ru)
CO (1) CO6480907A2 (ru)
EA (1) EA021136B1 (ru)
ES (1) ES2483121T3 (ru)
MX (1) MX2011013199A (ru)
NZ (1) NZ596987A (ru)
PT (1) PT2443247E (ru)
UA (1) UA105044C2 (ru)
WO (1) WO2010148268A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112533625A (zh) * 2018-08-27 2021-03-19 先正达参股股份有限公司 用于蛋白质检测的组合物以及方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020133845A1 (en) * 1996-09-03 2002-09-19 Plant Genetic Systems Nv Barstar gene
CN1584049A (zh) * 2003-08-22 2005-02-23 国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所 转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作方法及其应用
WO2007019532A2 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 North Carolina State University Peptide aptamers that bind to the rep proteins of ssdna viruses
US20080034453A1 (en) * 1999-05-06 2008-02-07 Nordine Cheikh Annotated Plant Genes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4248593A (en) * 1992-05-14 1993-12-13 Mark Holodniy Polymerase chain reaction assays for monitoring antiviral therapy
EP1868426B1 (en) * 2005-03-16 2018-02-21 Syngenta Participations AG Corn event 3272 and methods of detection thereof
EP1724360A1 (en) * 2005-05-17 2006-11-22 Eppendorf Array Technologies S.A. Identification and/or quantification method of nucleotide sequence(s) elements specific of genetically modified plants on arrays

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020133845A1 (en) * 1996-09-03 2002-09-19 Plant Genetic Systems Nv Barstar gene
US20080034453A1 (en) * 1999-05-06 2008-02-07 Nordine Cheikh Annotated Plant Genes
CN1584049A (zh) * 2003-08-22 2005-02-23 国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所 转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作方法及其应用
WO2007019532A2 (en) * 2005-08-04 2007-02-15 North Carolina State University Peptide aptamers that bind to the rep proteins of ssdna viruses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: AY 123624.1. Zea mays transgenic Pat (Pat) gene, partial cds. [online], 5 August 2002 [retrieved on 3 August 2010]. Available on the internet: URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/22121751> *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010262786A1 (en) 2012-01-12
US9096896B2 (en) 2015-08-04
MX2011013199A (es) 2012-01-09
NZ596987A (en) 2013-04-26
UA105044C2 (ru) 2014-04-10
CN102482697B (zh) 2014-04-09
AP3139A (en) 2015-02-28
WO2010148268A1 (en) 2010-12-23
PT2443247E (pt) 2014-07-18
EA201200026A1 (ru) 2012-07-30
KR20120044975A (ko) 2012-05-08
EP2443247B1 (en) 2014-06-04
BRPI1011662A2 (pt) 2016-10-25
CN102482697A (zh) 2012-05-30
CA2765958A1 (en) 2010-12-23
AP2011006051A0 (en) 2011-12-31
EP2443247A1 (en) 2012-04-25
US20120100544A1 (en) 2012-04-26
EP2443247A4 (en) 2012-11-21
CO6480907A2 (es) 2012-07-16
CL2011003186A1 (es) 2012-07-13
ES2483121T3 (es) 2014-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4814479B2 (ja) リアルタイムで内部標準を用いて遺伝子を定量する方法
JP2002536024A (ja) 蛍光結合型ｐｃｒを用いて食品中の遺伝子改変ｄｎａを定量的に検出するための試験キットおよび方法
JP7047373B2 (ja) 次世代シーケンサー用プライマー並びにその製造方法、次世代シーケンサー用プライマーを用いたｄｎａライブラリー並びにその製造方法、及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
CN104419708B (zh) 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
KR101159866B1 (ko) 소맥 내재성 ｄｎａ 서열의 검출 및 정량 방법
CN114507749B (zh) 一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法
US8865433B2 (en) Method for qualitative and quantitative detection of common wheat
Fritsch et al. Next-generation sequencing is a robust strategy for the high-throughput detection of zygosity in transgenic maize
Chaouachi et al. Molecular identification of four genetically modified maize (Bt11, Bt176, Mon810 and T25) by duplex quantitative real-time PCR
KR20190011707A (ko) 핵산 복합체 페어를 포함하는 pcr용 키트 및 이의 용도
KR102084965B1 (ko) 정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 pcr 키트
Narancio et al. Digital PCR (dPCR) and qPCR mediated determination of transgene copy number in the forage legume white clover (Trifolium repens)
JP4291568B2 (ja) 遺伝子組換え体の定量法およびそれに用いる標準分子
EA021136B1 (ru) Усовершенствованный метод количественного определения днк в биологическом образце
JP4454366B2 (ja) Ｍｄｒ１遺伝子の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
Benavides et al. Microsatellite DNA variants between the inbred SENCAR mouse strains
WO2006070667A1 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子変異の検出法ならびに検出キット
RU2724504C1 (ru) Способ создания искусственных референсных образцов днк для генетического тестирования и тест-система с образцами, полученными указанным способом
RU2763933C1 (ru) Тест-система для выявления мутации в гене btpkd собаки домашней (canis lupus familiaris), вызывающей поликистоз почек
CN114507750B (zh) 一种检测玉米转基因品系的引物组、试剂盒及检测方法
KR100687765B1 (ko) ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ를 이용하는 실시간-ＰＣＲ을 통한유전자변형 콩의 혼입률 정량분석 방법
Bhattacharya Application of genomics tools in meat quality evaluation
CN109097452B (zh) 检测细胞质遗传的方法和设备
RU2375458C2 (ru) Способ определения числа копий трансгена в образце днк
RU2555542C1 (ru) Набор синтетических олигонуклеотидов для детектирования количества копий гена бета-глюкуронидазы в трансгенных растениях

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU