CN109097452B

CN109097452B - 检测细胞质遗传的方法和设备

Info

Publication number: CN109097452B
Application number: CN201811084547.9A
Authority: CN
Inventors: 沈佳; 张跃建; 寿伟松
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: CN109097452A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测细胞质遗传的方法和设备。本发明所提供的检测细胞质遗传的方法包括：(1)基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；(2)基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；(3)基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传。同时还相应地提供了一种检测细胞质遗传的装置。通过本发明提供的方法和装置，用于检测细胞质遗传的特点，取样灵活，而且具有高分辨率，避免模板之间存在的竞争效应；同时具有极高的灵敏度。

Description

检测细胞质遗传的方法和设备

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测细胞质遗传的方法和设备。

背景技术

细胞质遗传是指细胞核以外的遗传因子所决定的遗传现象，被称为非孟德尔遗传或核外遗传。动物中的细胞质遗传主要是线粒体遗传，而植物中的细胞质遗传包括线粒体遗传和质体遗传。植物中，最早的非孟德尔遗传现象报道与1909年，Baur等在研究天竺葵的“叶斑”遗传时，发现子代对双亲叶斑的遗传并不表现出孟德尔遗传的方式(Baur,1909)。由于细胞质遗传方式与植物细胞质雄性不育、质体或线粒体基因组突变引起的生长发育迟缓等现象密切相关。因此，深入研究细胞质遗传方式对于理解细胞质非孟德尔遗传背后的机理，甚至指导农业的生产都具有十分重要的意义。

植物细胞质遗传的研究是建立在细胞学观察的基础上进行的。早期，Kuroiwa在研究衣藻的叶绿体遗传时，利用荧光显微镜结合DAPI染色的方法发现雄配子一方的叶绿体拟核(叶绿体DNA和蛋白的复合体)在合子形成后约1h内发生消失的现象(Kuroiwa et al.,1982)。这种细胞学的方法很快被用来检测被子植物花粉发育过程中生殖细胞或精细胞中细胞器DNA的变化情况。研究者们也同样发现了质体和线粒体拟核消失的现象，并且拟核的消失与细胞器DNA的遗传方式显示了较强的相关性。这一发现简化了植物细胞质非孟德尔遗传的研究，使得确定某物种的细胞质遗传方式变得容易起来，同时也使得大量地研究被子植物非孟德尔遗传成为可能。因此，细胞学观察对于明确植物细胞质遗传方式提供了重要的指导意义。因此，随后对植物细胞质遗传的研究主要是运用这些细胞学的方法来进行。

Corriveau对235种植物的花粉进行了DAPI压片检测，发现那些被遗传实验证实为质体双亲遗传植物的生殖细胞或精细胞中都含有细胞器DNA，而那些被证实为母系遗传植物的生殖细胞或精细胞中都不包含有细胞器DNA(Corriveau and Coleman,1988)。随后，张泉等人(2003)在对295种植物的调查中，又确认了大量植物的细胞质遗传模式。这种对质体的研究方法很快就被应用到了对线粒体的研究上。由于压片的方法并不能很好地区分生殖细胞或精细胞中的荧光点是属于质体还是线粒体的，于是建立了新的方法(Nagata etal.,1999；Sodmergen et al.,2002)，包括DiOC/DAPI双染色技术、压片结合电镜及免疫电镜的技术。借助于这些技术，研究者们虽能快速准确地对某物种的细胞质非孟德尔遗传“潜能”进行判断，但并不能明确非孟德尔遗传的方式。

近年来，随着PCR标记的发展，细胞质DNA的SSR标记被广泛应用于细胞质非孟德尔遗传方式的检测。但由于细胞质DNA多拷贝的特性，传统标记由于模板浓度差异以及存在PCR竞争(Wang et al.,2010)，往往只能检测到来自单一亲本的细胞质DNA，造成误判。

因此，对于细胞质遗传特点和方式的鉴定还需要进一步研究和改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测细胞质遗传的方法，该方法能够快速准确确定生物材料细胞质遗传的方式和特点。

本发明的发明人在研究过程中发现：

随着分子生物学标记的发展，一些特定的技术被应用到研究生物样本或者生物材料的细胞质遗传规律，例如利用细胞质SSR标记技术研究细胞质遗传。但由于技术的缺陷，会造成实验结果的误差。为此，本发明的发明人创造性的发现利用数字PCR技术作为检测细胞质遗传的方法，能够快速灵活实现对于细胞质遗传的检测，而且该方法具有很高的分辨率以及灵敏度。

为此，根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种检测生物材料细胞质遗传的方法，包括：(1)基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；(2)基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；(3)基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传。数字PCR(Droplet Digital PCR，简称dd-PCR)是一种核酸分子绝对定量技术，可以实现基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量。本发明的发明人借助于数字PCR技术，研究生物材料细胞质遗传，能够获得高灵敏度和高精确性的检测结果。本发明所提供的检测生物材料细胞质遗传的方法通过分析父本样本和母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别在父本样本和母本样本中获得不同的多态性位点，这些不同的多态性位点可以用作子代样本细胞质遗传的标记。然后利用数字PCR技术，在子代样本细胞质核酸序列中获得相应的多态性结果，通过对子代样本细胞质核酸序列中的多态性结果进行分析，研究来自于父本样本和来自于母本样本的细胞质遗传物质的多少，从而确定所述生物材料的细胞质遗传特点和规律。根据本发明的实施例，以上所述检测生物材料细胞质遗传的方法可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述细胞质核酸序列包括线粒体核酸序列、叶绿体核酸序列或者质粒核酸序列。利用本发明的方法可以研究动物和植物的细胞质遗传规律，其中动物的细胞质遗传主要表现为线粒体遗传，植物的细胞质遗传主要表现为叶绿体和质粒遗传。

在本发明的一些实施例中，所述核酸序列为DNA。

在本发明的一些实施例中，所述多态性位点选自单核苷酸多态性位点(SNP)，插入缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV，Structure Variation)位点和拷贝数变异位点(CNV，copy number variation)中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，步骤(1)进一步包括：(1-1)对比分析所述父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，以便确定所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；(1-2)基于所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别利用第一特异性引物和第二特异性引物在所述父本样本和所述母本样本中获得不同的多态性位点，分别利用第一探针和第二探针检测所述父母样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；其中所述第一特异性引物用来获得所述父本样本的细胞质核酸序列，所述第二特异性引物用来获得所述母本样本的细胞质核酸序列，所述第一探针用来检测所述父本样本细胞质核酸序列的多态性，所述第二探针用来检测所述母本样本细胞质核酸序列的多态性。通过对比分析父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，在父本样本和母本样本细胞质核酸序列中找到不同的多态性位点，然后分别根据这些多态性位点，设计特异性的引物和探针，用来扩增含有多态性位点的核酸序列，同时来检测这些多态性位点。其中，对于已经有文献报道的拥有多态性线粒体基因的材料，可以直接使用Primer Express 3.1软件，针对多态性位点分别设计父本、母本材料的引物及探针；对于未见关于线粒体基因组多态性文献报道的材料，可以通过测序获得线粒体基因组数据，然后经Bowtie 2分别比对到参考线粒体基因组，生成bam文件；进一步将bam文件载入到IGV 2.4.5，根据测序对比查找有效的多态性位点，并使用Primer Express 3.1软件，针对多态性位点分别设计父本、母本材料的引物及探针。

在本发明的一些实施例中，所述第一探针和所述第二探针上均带有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和所述第二探针上的荧光基团不同。通过探针上所带有的不同的荧光基团，然后结合荧光物质的量，检测所得到的细胞质核酸序列的拷贝数以及检测细胞质核酸序列的多态性结果，实现精准定量。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)进一步包括：(2-1)基于所述第一特异性引物和所述第二特异性引物以及所述第一探针和所述第二探针，利用数字PCR技术获得所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成；(2-2)基于所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成，确定所述子代样本细胞质核酸序列的多态性结果。本发明中所述子代样本细胞质核酸序列组成指的是：来自于父本样本细胞质遗传物质的拷贝数和来自于母本样本细胞质遗传物质的拷贝数。利用两对引物以及两条探针在同一个反应中对子代样本进行操作，可以避免取样误差，所获得的双亲中遗传物质的比例结果更加准确。

在本发明的一些实施例中，利用第一特异性引物和第一探针获得所述父本样本中的多态性位点，利用第二特异性引物和第二探针获得所述母本样本中的多态性位点。

在本发明的一些实施例中，所述生物材料包括植物或动物。当所述生物材料为植物样本时，所用到的子代材料或者子代样本可以是子代材料植株体本身，包括子叶、真叶或茎等，但不包含种皮。在亲本材料杂交过程中，种皮来自母本材料，而种皮内的胚才是亲本材料精子和卵子受精后由受精卵发育而来的。在受精过程中，受精卵接收了来自亲本材料一双或者双方的细胞质。

在本发明的一些实施例中，所述植物为真核生物。

在本发明的一些实施例中，所述植物选自甜瓜、黄瓜、拟南芥、烟草、水稻、辣椒、番茄或玉米中的至少一种。

在一些实施例中，所述植物为拟南芥，所述亲本线粒体基因组多态性序列为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，所述第一、第二特异性引物一致，为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所述第一探针为SEQ ID NO:5，所述第二探针为SEQ ID NO:6。在另外一些实施例中，所述植物为黄瓜，所述亲本线粒体基因组多态性序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，所述第一特异性引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，所述第一探针为SEQ ID NO:11，所述第二特异性引物为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，所述第二探针为SEQ ID NO:14。

在本发明的一些实施例中，所述数字PCR的退火温度为53.7～56.3摄氏度。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中所述子代样本的细胞核酸物质的使用量为10～50ng。利用数字PCR技术对于子代材料进行检测时，所用到的DNA的浓度过高会导致结果爆板，超出数字PCR的检测范围；过低可能检测不到，例如10ng总DNA里面含有双亲的细胞质DNA分别是10个和100个，但如果仅仅使用1ng总DNA，一个亲本可能是1个或者没有(取样误差就可以导致如此结果)，另一个可能是10个左右。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种检测生物材料细胞质遗传的设备，包括：亲本样本多态性分析模块，所述亲本样本多态性分析模块基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；子代样本多态性分析模块，所述子代样本多态性分析模块与所述亲本样本多态性分析模块相连，所述子代样本多态性分析模块基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；结果确定模块，所述结果确定模块与所述子代样本多态性分析模块相连，所述结果确定模块基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传。

根据本发明的实施例，以上所述检测生物材料细胞质遗传的设备可以进一步附加如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述细胞质核酸序列包括线粒体核酸序列、叶绿体核酸序列或者质粒核酸序列。

在本发明的一些实施例中，所述核酸序列为DNA。

在本发明的一些实施例中，所述多态性选自单核苷酸多态性位点、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，所述亲本样本多态性分析模块进一步包括：亲本样本多态性确定单元，所述亲本样本多态性确定单元基于对比分析所述父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，以便确定所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；亲本样本多态性获得单元，所述亲本样本多态性获得单元与所述亲本样本多态性确定单元相连，所述亲本样本多态性获得单元基于所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别利用第一特异性引物和第二特异性引物在所述父本样本和所述母本样本中获得不同的多态性位点，分别利用第一探针和第二探针检测所述父母样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，其中所述第一特异性引物用来获得所述父本样本的细胞质核酸序列，所述第二特异性引物用来获得所述母本样本的细胞质核酸序列，所述第一探针用来检测所述父本样本细胞质核酸序列的多态性，所述第二探针用来检测所述母本样本细胞质核酸序列的多态性。

在本发明的一些实施例中，所述第一探针和所述第二探针上带有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和所述第二探针的荧光基团不同。

在本发明的一些实施例中，所述子代样本多态性分析模块进一步包括：子代样本细胞质核酸序列确定单元，所述子代样本细胞质核酸序列确定单元基于特异性引物和探针，利用数字PCR技术获得所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成；子代样本多态性确定单元，所述子代样本多态性确定单元与所述子代样本细胞质核酸序列确定单元相连，所述子代样本多态性确定单元基于所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成，确定所述子代样本细胞质核酸序列的多态性结果。

优选地，所述生物材料包括植物或动物；任选地，所述生物材料为真核生物材料；在本发明的一些实施例中，所述植物选自甜瓜、黄瓜、拟南芥、烟草、水稻、辣椒、番茄或玉米中的至少一种。

本发明所取得的有益效果为：采用本发明的方法鉴定细胞质遗传，具有如下优点：(1)取样灵活，无细胞学方法对实验样品有发育时期的限制；(2)高分辨率，避免模板之间存在的竞争效应；(3)高灵敏度，使用亲本双探针，具有良好的特异性，能检测单拷贝的细胞质DNA。本发明方法可广泛应用于植物细胞质遗传方式的检测。

附图说明

图1显示了拟南芥亲本材料C24和Col的线粒体DNA特异性引物及探针的序列及位置信息；从图中可以看出，亲本多态性仅含有一个SNP位点；两者前后引物一致，扩增片段大小也一致；亲本间的探针5’端为SNP位点，3’端相差1个碱基；其中C24的特异探针(atmt05-1P)标记了FAM荧光基团，而Col的特异探针(atmt05-2P)标记HEX荧光基团。

图2为线粒体SSR引物在亲本材料中的PCR凝胶电泳图；从图中可以看到，亲本C24和Col两者均为单一条带，且PCR产物大小一致，阴性对照无条带。

图3为探针在两亲本材料中的特异性检测结果图，其中3a图中检测的是FAM荧光信号，3b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。图中E12、E09为PCR板上对应的PCR反应孔。3a中显示的是探针atmt05-1P在拟南芥C24和Col中的检测结果，在C24中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号，而Col中只有本底信号；3b中显示的是探针atmt05-2P在拟南芥C24和Col中的检测结果，在C24中除开本底信号外无非特异性扩增的信号，而Col中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号。两条MGB探针特异性较好，区分度明显。

图4为拟南芥中子代线粒体DNA来源及比例检测结果图。4a图中检测的是FAM荧光信号，4b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果，4c图为FAM和HEX检测结果的数量。4a中可以看到在父本材料C24中检测到了阳性荧光信号，在母本材料Col中并未检测到阳性荧光信号，而在子代材料Col×C24中也未检测到阳性荧光信号。4b中可以看到在父本材料C24中并未检测到阳性荧光信号，在母本材料Col中检测了到阳性荧光信号，在子代材料Col×C24中检测到了阳性荧光信号。从图4a和4b中可以看到，在子代材料Col×C24中仅有HEX阳性荧光信号而无FAM阳性荧光信号，也就是说子代材料Col×C24中的线粒体DNA完全来自母本Col。4c图显示了亲本和子代材料中线粒体DNA的比例。从图中可以看到，两次实验重复性很好，数据接近。父本材料C24中仅含有FAM类型的线粒体DNA，含量为1614-1619copies/μL；母本材料Col中仅含有HEX类型的线粒体DNA，含量为727-731copies/μL；而子代材料Col×C24仅含HEX类型的线粒体DNA，含量为351-354copies/μL。也就是说，拟南芥材料Col×C24杂交过程中，线粒体DNA表现为绝对的母系遗传，这与已知文献报道一致。

图5是根据本发明的实施例提供的亲本材料‘9930’和‘B’的线粒体DNA特异性引物及探针的序列及位置信息；从图中可以看出，亲本多态性包含了一个Indel以及多个SNP位点；亲本间前引物位置相差8个碱基，亲本B的前引物跨越了Indel位点，因此序列不同，而后引物完全相同；亲本间的探针位置相差1个碱基，跨越了多个SNP位点，其中9930的特异探针(csmt01P)标记了FAM荧光基团，而B的特异探针(csmt02P)标记了HEX荧光基团。

图6是根据本发明的实施例提供的引物在亲本材料中的PCR结果的凝胶电泳图。从图中可以看到，引物Csmt01在亲本材料‘9930’和‘B’中都能扩增出条带，阴性对照无条带，且‘B’中的扩增条带略小于‘9930’中的扩增条带。推测引物Csmt01在‘B’中能扩增出条带的原因是，Csmt01的前引物与亲本‘B’除开最后一个碱基错配外，其余完全互补，因此造成了非特异性扩增。引物Csmt02仅能在‘B’中扩增出条带，在‘9930’中不能扩增出条带，阴性对照也无条带。

图7是根据本发明的实施例提供的探针在两亲本材料特异性检测。7a图中检测的是FAM荧光信号，7b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。图中F01、F02为PCR板上对应的PCR反应孔。7a中显示的是探针csmt01P在黄瓜材料‘9930’和‘B’中的扩增结果，在‘9930’中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号，而‘B’中只有本底信号；7b中显示的是探针csmt02P在黄瓜材料‘9930’和‘B’中的扩增结果，在‘9930’中除开本底信号外还有部分非特异性扩增的信号，但是强度明显较弱，接近本底信号，而‘B’中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号。

图8是根据本发明的实施例提供的数字PCR温度梯度实验结果。8a图中检测的是FAM荧光信号，8b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。8a中显示的是以亲本‘9930’为模板，Csmt01为引物，csmt01P为探针，在52.5-61.5℃范围以1.2℃为间隔的8个梯度退火温度中检测结果。8b中显示的是以亲本‘B’为模板，Csmt02为引物，csmt02P为探针，在52.5-61.5℃范围以1.2℃为间隔的8个梯度退火温度中检测结果。从8a和8b图中都可以看到，随着温度的上升，本底信号随着温度上升而升高，而阳性的荧光信号则表现为先上升后下降。因此，中间温度53.7-56.3℃是较为合适的退火温度。

图9是根据本发明的实施例提供的黄瓜中子代线粒体DNA来源及比例检测结果图。9a图中检测的是FAM荧光信号，9b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果，9c图为FAM和HEX检测结果的数量。9a中可以看到在父本材料‘9930’中检测到了阳性荧光信号，在母本材料‘B’中并未检测到阳性荧光信号，而在子代材料‘B×9930’中检测到了阳性荧光信号。9b中可以看到在父本材料‘9930’中并未检测到阳性荧光信号，在母本材料‘B’中检测了到阳性荧光信号，同时在子代材料‘B×9930’中检测到了阳性荧光信号。从图9a和9b中可以看到，在子代材料‘B×9930’中的FAM阳性荧光信号强度高于HEX阳性荧光信号，也就是说子代材料‘B×9930’中的线粒体DNA绝大多数来源于父本‘9930’，但也有部分来自于母本材料‘B’。9c图显示了亲本和子代材料中线粒体DNA的比例。从图中可以看到，两次实验重复性很好，数据接近。父本材料‘9930’中仅含有FAM类型的线粒体DNA，含量为1314-1321copies/μL；母本材料‘B’中仅含有HEX类型的线粒体DNA，含量为1613-1619copies/μL；而子代材料‘B×9930’同时具有FAM类型和HEX类型的线粒体DNA，含量分别是1490-1504copies/μL和21.9-22.5copies/μL。也就是说，黄瓜材料‘B×9930’中同时具有父本和母本的线粒体DNA，比例大致为70：1。

图10为线粒体SSR引物CsmtSSR01在亲本以及子代材料红的检测结果。父本材料‘9930’扩增片段较母本材料‘B’明显较大，而子代材料‘B×9930’中仅能检测到与父本一致的条带，并未检测到较低拷贝数母本条带。

图11是本发明提供的一个检测生物材料细胞质遗传的设备示意图。

图12是本发明提供的亲本样本多态性分析模块的示意图。

图13是本发明提供的子代样本多态性分析模块的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

检测细胞质遗传的方法

本发明提供了一种检测细胞质遗传的方法，包括：分别针对双亲材料的细胞质DNA的多态性序列设计并合成特异性引物及探针；然后使用数字PCR同时检测子代材料中双亲细胞质DNA的拷贝数及比例，通过对子代材料中来自于双亲细胞质DNA的拷贝数和比例进行分析，获得细胞质遗传的规律。

为此，根据本发明的一种具体实施方式，本发明提供了一种检测生物材料细胞质遗传的方法，包括：(1)基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；(2)基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；(3)基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传。

通过本发明所提供的方法获得生物材料细胞质遗传的规律，不仅为深入研究细胞质非孟德尔遗传机制奠定基础，而且为研究作物核质互作，特别是核质互作雄性不育在作物育种上的应用提供指导，从而可以应用于作物育种和培育上。

根据本发明的实施例，基于数字PCR技术，可以将子代样本的细胞质遗传物质物理分成约20000份，利用特异性引物和探针，检测子代样本中所存在的亲本样本的细胞质DNA的含量和比例，以此来精确检测双亲细胞质遗传到子代的数量及其比例。

在本发明的一种具体实施方式中，所述多态性位点选自单核苷酸多态性位点、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点中的至少一种。

检测生物材料细胞质遗传的设备

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测生物材料细胞质遗传的设备，如图11所示，包括：亲本样本多态性分析模块，所述亲本样本多态性分析模块基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；子代样本多态性分析模块，所述子代样本多态性分析模块与所述亲本样本多态性分析模块相连，所述子代样本多态性分析模块基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；结果确定模块，所述结果确定模块与所述子代样本多态性分析模块相连，所述结果确定模块基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传。

在本发明的一些实施例中，所述亲本样本多态性分析模块如图12所示，进一步包括：亲本样本多态性确定单元和亲本样本多态性获得单元，所述亲本样本多态性确定单元基于对比分析所述父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，以便确定所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；所述亲本样本多态性获得单元与所述亲本样本多态性确定单元相连，所述亲本样本多态性获得单元基于所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别利用第一特异性引物和第二特异性引物在所述父本样本和所述母本样本中获得不同的多态性位点，分别利用第一探针和第二探针检测所述父母样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；其中所述第一特异性引物用来获得所述父本样本的细胞质核酸序列，所述第二特异性引物用来获得所述母本样本的细胞质核酸序列，所述第一探针用来检测所述父本样本细胞质核酸序列的多态性，所述第二探针用来检测所述母本样本细胞质核酸序列的多态性。

在本发明的一些实施例中，所述子代样本多态性分析模块如图13所示，进一步包括：子代样本细胞质核酸序列确定单元和子代样本多态性确定单元，所述子代样本细胞质核酸序列确定单元基于特异性引物和探针，利用数字PCR技术获得所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成；所述子代样本多态性确定单元与所述子代样本细胞质核酸序列确定单元相连，所述子代样本多态性确定单元基于所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成，确定所述子代样本细胞质核酸序列的多态性结果。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中，实施例中所用到的核酸序列如下表1所示：

表1核酸序列

实施例1

拟南芥线粒体DNA遗传方式检测，包括如下步骤：

(1)根据文献报道(Matsushima et al.,2011)，拟南芥生态型C24与Col在线粒体基因matR的基因组序列中存在一个SNP位点。因此针对该SNP位点，使用Primer Express3.1软件，基于TaqMan MGB Allelic Discrimination模式，设计父本、母本材料的引物及探针。

其中，所获得的C24和Col的线粒体基因组序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，两者相比在29bp存在一个SNP(SNP.C29A)。

针对该序列设计的两亲本的前后引物序列一致，分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示，大小分别为26和20bp，扩增片段大小同为68bp。

针对C24所设计的特异性探针序列如SEQ ID NO:5所示，5’端第一个即为SNP位点，两端所带有的基团分别为：FAM荧光基团和MGB(minor groove binder)分子。

同样地，针对Col所设计的特异性探针序列如SEQ ID NO:6所示，5’端第一个即为SNP位点，两端所带有的基团分别为：HEX荧光基团和MGB(minor groove binder)分子。

同时，将这些引物及特异性探针序列用图1进行了说明。图1显示了拟南芥亲本材料C24和Col的线粒体DNA特异性引物及探针的序列及位置信息；从图中可以看出，亲本多态性仅含有一个SNP位点；两者前后引物一致，扩增片段大小也一致；亲本间的探针5’端为SNP位点，3’端相差1个碱基.其中C24的特异探针(atmt05-1P)标记了FAM荧光基团，而Col的特异探针(atmt05-2P)标记HEX荧光基团。

(2)提取亲本材料真叶总DNA，稀释成10～50ng/μL，然后利用引物PCR进行引物特异性检测，

检测结果如图2所示，图2为线粒体SSR引物在亲本材料中的PCR凝胶电泳图。从图中可以看到，亲本C24和Col两者均为单一条带，且PCR产物大小一致，阴性对照无条带。

(3)基于数字PCR技术分别对亲本材料的细胞质DNA进行引物及探针的特异性检测，包括如下步骤：

a、按照ddPCR^TMSupermix for Probes(No dUTP)试剂盒要求，配制PCR反应体系，振荡混匀，离心除气泡；b、将一个新的DG8cartridge放入holder中，并将20μL样品反应体系加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内；c、在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油(DG Oil)；d、盖上胶垫(gasket)，并将holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，微滴生成于cartridge最上面一排孔内；e、使用移液器将生成的微滴转移到96孔PCR板内；f、使用预热好的PX1热封仪对PCR板进行封膜，运行程序为：180℃，5s；g、将封好膜的PCR放入PCR仪上进行PCR反应，程序为95℃预热10min；94℃变性30s，55℃退火及延伸1min，40个循环；98℃灭活10min，4℃保温；h、将完成PCR反应的96孔板放入plate holder中组装好，平稳放入微滴读取仪中；i、打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次Flush System，之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要是设置实验名称、实验类型为ABS、双通道探针荧光信息为FAM和HEX等，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实后保存结果。

检测结果如图3所示，图3为探针在两亲本材料中的特异性检测。3a图中检测的是FAM荧光信号，3b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。图中E12、E09为PCR板上对应的PCR反应孔。3a中显示的是探针atmt05-1P在拟南芥C24和Col中的检测结果，在C24中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号，而Col中只有本底信号；3b中显示的是探针atmt05-2P在拟南芥C24和Col中的检测结果，在C24中除开本底信号外无非特异性扩增的信号，而Col中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号。两条MGB探针特异性较好，区分度明显。

(4)亲本和子代线粒体DNA来源及比例的数字PCR检测，退火温度选择55℃，其余条件保持不变，结果如图4所示。图4为拟南芥中子代线粒体DNA来源及比例检测结果图。4a图中检测的是FAM荧光信号，4b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果，4c图为FAM和HEX检测结果的数量。4a中可以看到在父本材料C24中检测到了阳性荧光信号，在母本材料Col中并未检测到阳性荧光信号，而在子代材料Col×C24中也未检测到阳性荧光信号。4b中可以看到在父本材料C24中并未检测到阳性荧光信号，在母本材料Col中检测了到阳性荧光信号，在子代材料Col×C24中检测到了阳性荧光信号。从图4a和4b中可以看到，在子代材料Col×C24中仅有HEX阳性荧光信号而无FAM阳性荧光信号，也就是说子代材料Col×C24中的线粒体DNA完全来自母本Col。4c图显示了亲本和子代材料中线粒体DNA的比例。从图中可以看到，两次实验重复性很好，数据接近。父本材料C24中仅含有FAM类型的线粒体DNA，含量为1614-1619copies/μL；母本材料Col中仅含有HEX类型的线粒体DNA，含量为727-731copies/μL；而子代材料Col×C24仅含HEX类型的线粒体DNA，含量为351-354copies/μL。也就是说，拟南芥材料Col×C24杂交过程中，线粒体DNA表现为绝对的母系遗传，这与已知文献报道一致。

实施例2

黄瓜线粒体DNA遗传方式的检测，包括如下步骤：

(1)对比分析亲本材料‘9930’和‘B’的线粒体基因组多态性，查找合适的多态性位点，然后针对多态性位点设计合成引物和探针，探针跨越多态性位点并分别标记FAM和HEX荧光基团。其中亲本材料9930和B为实验室保存的自交系材料，其线粒体基因组序列分别通过二代测序获得，经软件Bowtie 2分别比对到已经发表的黄瓜‘Calypso’的参考线粒体基因组，生成bam文件，并将bam文件载入到IGV 2.4.5，根据测序结果对比查找有效的多态性位点。然后使用Primer Express 3.1软件，基于TaqManAllelic Discrimination模式，针对多态性位点分别设计父本、母本材料的引物及探针。

其中，所获得的9930的线粒体基因组序列如SEQ ID NO:7所示，其序列与亲本B的序列相比，第24、25、27、29、30、31、34、35、36个碱基为SNP位点。

针对该9930的线粒体基因组序列所设计的特异性引物序列如SEQ ID NO:8和SEQID NO:9所示，前后引物分别位点SEQ ID NO:7序列的前后两端，都为20bp，扩增片段大小为106bp。所设计的特异性探针序列如SEQ ID NO:10所示，3’端跨越了第31、34、35、36个碱基的SNP位点，其上所带有荧光基团和淬灭基团：FAM荧光基团和BHQ1猝灭基团。

同样地，所获得的样本材料B的线粒体基因组序列如SEQ ID NO:11所示，在第20碱基为Indel位点，存在3个碱基的缺失。

针对该B的线粒体基因组序列所设计的特异性引物序列如SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13所示，其中前引物SEQ ID NO:12序列的3’端跨越了Indel位点以及第24、25、27、29、30、32个碱基的SNP位点，前后引物都为20bp，而后引物SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:9序列相同，扩增片段大小为95bp。所设计的特异性探针序列如SEQ ID NO:14所示，3’端跨越了第34、35、36个碱基的SNP位点，其上所带有荧光基团和淬灭基团：HEX荧光基团和BHQ1猝灭基团。

同时，将这些特异性序列以及特异性引物和探针序列用图5进行了说明。图5显示了亲本材料‘9930’和‘B’的线粒体DNA特异性引物及探针的序列及位置信息；从图中可以看出，亲本多态性包含了一个Indel以及多个SNP位点；亲本间前引物位置相差8个碱基，亲本B的前引物跨越了Indel位点，因此序列不同，而后引物完全相同；亲本间的探针位置相差1个碱基，跨越了多个SNP位点，其中9930的特异探针(csmt01P)标记了FAM荧光基团，而b的特异探针(csmt02P)标记了HEX荧光基团。

检测结果如图6所示，图6为引物在亲本材料中的PCR结果的凝胶电泳图。从图中可以看到，引物Csmt01在亲本材料‘9930’和‘B’中都能扩增出条带，阴性对照无条带，且‘B’中的扩增条带略小于‘9930’中的扩增条带。推测引物Csmt01在‘B’中能扩增出条带的原因是，Csmt01的前引物与亲本‘B’除开最后一个碱基错配外，其余完全互补，因此造成了非特异性扩增。引物Csmt02仅能在‘B’中扩增出条带，在‘9930’中不能扩增出条带，阴性对照也无条带。

(3)基于数字PCR技术分别对亲本材料的细胞质DNA进行引物及探针的特异性检测，包括如下步骤：a、按照ddPCR^TMSupermix for Probes(No dUTP)试剂盒要求，配制PCR反应体系，振荡混匀，离心除气泡；b、将一个新的DG8cartridge放入holder中，并将20μL样品反应体系加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内；c、在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油(DG Oil)；d、盖上胶垫(gasket)，并将holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，微滴生成于cartridge最上面一排孔内；e、使用移液器将生成的微滴转移到96孔PCR板内；f、使用预热好的PX1热封仪对PCR板进行封膜，运行程序为：180℃，5s；g、将封好膜的PCR放入PCR仪上进行PCR反应，程序为95℃预热10min；94℃变性30s，55℃退火及延伸1min，40个循环；98℃灭活10min，4℃保温；h、将完成PCR反应的96孔板放入plate holder中组装好，平稳放入微滴读取仪中；i、打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次Flush System，之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要是设置实验名称、实验类型为ABS、双通道探针荧光信息为FAM和HEX等，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实后保存结果。

检测结果如图7所示，图7为探针在两亲本材料特异性检测。7a图中检测的是FAM荧光信号，7b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。图中F01、F02为PCR板上对应的PCR反应孔。7a中显示的是探针csmt01P在黄瓜材料‘9930’和‘B’中的检测结果，在‘9930’中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号，而‘B’中只有本底信号；7b中显示的是探针csmt02P在黄瓜材料‘9930’和‘B’中的检测结果，在‘9930’中除开本底信号外还有部分非特异性扩增的信号，但是强度明显较弱，接近本底信号，而‘B’中除了本底信号外有大量明显强烈的荧光信号。

(4)亲本材料授粉杂交并采种，获得子代待料真叶总DNA，然后稀释成10～50ng/μL，进行数字PCR温度梯度实验，基于本底及目标荧光值选择合适的退火温度，如图8所示；图8为数字PCR温度梯度实验结果。图中显示的是以子代‘B×9930’为模板，Csmt01和Csmt02为引物，csmt01P和csmt02P为探针，在52.5-61.5℃范围以1.2℃为间隔的8个梯度退火温度中检测结果，其中F03-F10为PCR板上对应的PCR反应孔。8a图中检测的是FAM荧光信号，8b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果。从8a和8b图中都可以看到，随着温度的上升，本底信号随着温度上升而升高，而阳性的荧光信号则表现为先上升后下降。因此，中间温度53.7-56.3℃是较为合适的退火温度。

(5)亲本和子代线粒体DNA来源及比例的数字PCR检测，退火温度选择56.3℃，其余条件保持不变，结果如图9所示。图9为黄瓜中子代线粒体DNA来源及比例检测结果图。9a图中检测的是FAM荧光信号，9b图中检测的是HEX信号，两者为同时检测的双通道检测结果，9c图为FAM和HEX检测结果的数量。9a中可以看到在父本材料‘9930’中检测到了阳性荧光信号，在母本材料‘B’中并未检测到阳性荧光信号，而在子代材料‘B×9930’中检测到了FAM阳性荧光信号。9b中可以看到在父本材料‘9930’中并未检测到HEX阳性荧光信号，在母本材料‘B’中检测到了HEX阳性荧光信号，同时在子代材料‘B×9930’中检测到了HEX阳性荧光信号。从图9a和9b中可以看到，在子代材料‘B×9930’中的FAM阳性荧光信号强度高于HEX阳性荧光信号，也就是说子代材料‘B×9930’中的线粒体DNA绝大多数来源于父本‘9930’，但也有部分来自于母本材料‘B’。9c图显示了亲本和子代材料中线粒体DNA的比例。从图中可以看到，两次实验重复性很好，数据接近。父本材料‘9930’中仅含有FAM类型的线粒体DNA，含量为1314-1321copies/μL；母本材料‘B’中仅含有HEX类型的线粒体DNA，含量为1613-1619copies/μL；而子代材料‘B×9930’同时具有FAM类型和HEX类型的线粒体DNA，含量分别是1490-1504copies/μL和21.9-22.5copies/μL。也就是说，黄瓜材料‘B×9930’中同时具有父本和母本的线粒体DNA，比例大致为70：1。

对比例1

分子标记SSR(微卫星DNA，简单重复序列)检测黄瓜线粒体DNA遗传方式，包括如下步骤：

(1)通过二代测序分别获得亲本材料‘9930’和‘B’的线粒体基因组序列，经软件Bowtie 2分别比对到已经发表的黄瓜‘Calypso’的参考线粒体基因组，生成bam文件，并将bam文件载入到IGV 2.4.5，根据测序结果对比查找选取两者多态性的SSR位点。然后使用Primer Premier 6软件，针对多态性位点两侧的保守序列设计并合成SSR引物。

其中，所获得的‘9930’多态性序列为SEQ ID NO:15，所获得的‘B’多态性序列为SEQ ID NO:16。

引物序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，前后引物分别为19和20bp，在其扩增片段中，材料‘B’缺少了一个‘TATAT’重复单元，因此在亲本材料‘9930’和‘B’中的扩增片段大小分别为107和102bp。

(2)亲本材料授粉杂交并采种；

(3)提取亲本和子代材料真叶总DNA，稀释成20ng/μL；

(4)采用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18序列为引物，亲本及子代材料DNA为模板，并基于Touch-down PCR程序，进行PCR扩增检测；

(5)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染检测子代材料线粒体DNA来源并拍照。

检测结果如图10，图10为线粒体SSR引物CsmtSSR01在亲本以及子代材料红的检测结果。父本材料‘9930’扩增片段较母本材料‘B’明显较大，而子代材料‘B×9930’中仅能检测到与父本一致的条带，并未检测到较低拷贝数母本条带。

在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 检测细胞质遗传的方法和设备

<130> 001

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ccaagttctt ttactccatt cagaaagtat tttccgccgg acgactcgta ggagttgaga 60

ggggccct 68

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ccaagttctt ttactccatt cagaaagtct tttccgccgg acgactcgta ggagttgaga 60

ggggccct 68

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ccaagttctt ttactccatt cagaaa 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

agggcccctc tcaactccta 20

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

cttttccgcc ggacga 16

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

attttccgcc ggacgac 17

<210> 7

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

aggagtggaa gagctcgaca gagaagacga agggaaggag cttcttggcc ggaggtaact 60

aagatgacga cctgatttac cctccttggt cttgcttgca taccgc 106

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

aggagtggaa gagctcgaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

gcggtatgca agcaagacca 20

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

acctccggcc aagaagctcc ttccct 26

<210> 11

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

aagagctcga cgccgtcttt ggtccggagc ttcttggccg gaggtaacta agatgacgac 60

ctgatttacc ctccttggtc ttgcttgcat accgc 95

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

aagagctcga cgccgtcttt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

gcggtatgca agcaagacca 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

cctccggcca agaagctccg gacc 24

<210> 15

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

gtctcagtgc ctggtctgta gtacaggcca gtaataaagt cccaggtaag actttctata 60

ttatattata ttatatgacc attctcagtc tcgcccttgt aagtggt 107

<210> 16

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

gtctcagtgc ctggtctgta gtacaggcca gtaataaagt cccaggtaag actttctata 60

ttatattata tgaccattct cagtctcgcc cttgtaagtg gt 102

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

gtctcagtgc ctggtctgt 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

accacttaca agggcgagac 20

Claims

1.一种检测生物材料细胞质遗传的方法，其特征在于，包括：

(1)基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；

(2)基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；

(3)基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传；

步骤(1)进一步包括：

(1-1)对比分析所述父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，以便确定所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；

(1-2)基于所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别利用第一特异性引物和第二特异性引物在所述父本样本和所述母本样本中获得不同的多态性位点，分别利用第一探针和第二探针检测所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；

其中所述第一特异性引物用来获得所述父本样本的细胞质核酸序列，

所述第二特异性引物用来获得所述母本样本的细胞质核酸序列，

所述第一探针用来检测所述父本样本细胞质核酸序列的多态性，

所述第二探针用来检测所述母本样本细胞质核酸序列的多态性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞质核酸序列包括线粒体核酸序列、叶绿体核酸序列或者质粒核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸序列为DNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多态性位点选自单核苷酸多态性位点、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针上均带有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和所述第二探针上的荧光基团不同。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：

(2-1)基于所述第一特异性引物和所述第二特异性引物以及所述第一探针和所述第二探针，利用数字PCR技术获得所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成；

(2-2)基于所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成，确定所述子代样本细胞质核酸序列的多态性结果。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括植物或动物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料为真核生物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物选自甜瓜、黄瓜、拟南芥、烟草、水稻、辣椒、番茄或玉米中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物为拟南芥，所述第一特异性引物和所述第二特异性引物相同，为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，所述第一探针为SEQ ID NO:5，所述第二探针为SEQ ID NO:6；

所述植物为黄瓜，所述第一特异性引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，所述第二特异性引物为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，所述第一探针为SEQ ID NO:11，所述第二探针为SEQ ID NO:14。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数字PCR的退火温度为53.7～56.3摄氏度。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述子代样本的细胞核酸物质的使用量为10～50ng。

13.一种检测生物材料细胞质遗传的设备，其特征在于，包括：

亲本样本多态性分析模块，所述亲本样本多态性分析模块基于所述生物材料亲本样本细胞质核酸序列的多态性，在所述生物材料亲本样本中分别获得不同的多态性位点，所述亲本样本包括父本样本和母本样本；

子代样本多态性分析模块，所述子代样本多态性分析模块与所述亲本样本多态性分析装置相连，所述子代样本多态性分析模块基于所述不同的多态性位点，利用数字PCR技术获得子代样本细胞质核酸序列的多态性结果；

结果确定模块，所述结果确定模块与所述子代样本多态性分析模块相连，所述结果确定模块基于所述子代样本细胞质中的多态性结果，确定所述生物材料的细胞质遗传；

所述亲本样本多态性分析模块进一步包括：

亲本样本多态性确定单元，所述亲本样本多态性确定单元基于对比分析所述父本样本和母本样本细胞质核酸序列的差异，以便确定所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；

亲本样本多态性获得单元，所述亲本样本多态性获得单元与所述亲本样本多态性确定单元相连，所述亲本样本多态性获得单元基于所述父本样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性，分别利用第一特异性引物和第二特异性引物在所述父本样本和所述母本样本中获得不同的多态性位点，分别利用第一探针和第二探针检测所述父母样本和所述母本样本细胞质核酸序列的多态性；

14.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述细胞质核酸序列包括线粒体核酸序列、叶绿体核酸序列或者质粒核酸序列。

15.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述核酸序列为DNA。

16.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述多态性位点选自单核苷酸多态性位点、插入缺失位点、结构变异位点和拷贝数变异位点中的至少一种。

17.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针上均带有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和所述第二探针的荧光基团不同。

18.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述子代样本多态性分析模块进一步包括：

子代样本细胞质核酸序列确定单元，所述子代样本细胞质核酸序列确定单元基于所述第一特异性引物和所述第二特异性引物以及所述第一探针和所述第二探针，利用数字PCR技术获得所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成；

子代样本多态性确定单元，所述子代样本多态性确定单元与所述子代样本细胞质核酸序列确定单元相连，所述子代样本多态性确定单元基于所述子代样本细胞质核酸序列的拷贝数和组成，确定所述子代样本细胞质核酸序列的多态性结果。

19.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述生物材料包括植物或动物。

20.根据权利要求13所述的设备，其特征在于，所述生物材料为真核生物材料。

21.根据权利要求19所述的设备，其特征在于，所述植物为甜瓜、黄瓜、拟南芥、烟草、水稻、辣椒、番茄或玉米。