CN103952497A - 一种基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种利用DNAzyme探针来进行定性和定量检测乙肝病毒DNA的方法。本发明针对现有技术的局限性，以PCR扩增为基础检测平台，通过引入3’-氨基修饰的DNAzyme探针，实现了乙肝病毒的一步法定性及定量检测。该技术具有灵敏度高，特异性强，检测线性范围广，成本低廉，准确度高，方便操作等优点，为乙肝病毒提供了简单快速、准确高效、经济实用的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme探针的乙肝病毒DNA定性及定量检测的方法。
背景技术
目前应用最为广泛的乙肝病毒DNA检测方法是实时荧光定量PCR方法，荧光定量PCR有很多优势，包括灵敏度高、特异性强，但是该技术需要依赖昂贵的荧光定量PCR仪和荧光探针，检测成本远远高于普通PCR，不利于大范围推广。因此，开发一种简单快速、准确高效、经济实用的乙肝病毒检测方法具有重要的社会意义和科研价值。
脱氧核酶(DNAzyme)是通过体外筛选技术获得的具有催化功能的单链DNA序列，迄今通过体外筛选已经获得多种具有不同催化功能的脱氧核酶，包括能够催化RNA剪切和链接、DNA的剪切和连接、DNA的磷酸化、卟啉的金属化、碳-碳键形成以及氧化等反应。DNAzyme除了具有多功能性，相对于蛋白酶和核酶，还具有合成简单、成本低、易保存、稳定性高等优势。目前，DNAzyme已在生物分析、医学诊断、纳米技术以及基因治疗等领域受到了广泛关注并取得一系列先进的研究成果。因此，基于DNAzyme的独特优势进行乙肝病毒检测方法的开发将有望突破现有技术的一些障碍，为乙肝病毒的检测提供更为经济实用的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单快速、准确高效、经济实用的定性和定量检测乙肝病毒的方法。
本发明具体涉及一种在PCR检测平台上利用DNAzyme探针对乙型肝炎病毒进行检测的方法。方法以乙肝病毒的基因保守区域为待检测的目标核酸序列进行PCR引物及特异性DNAzyme探针的设计。本发明所涉及的DNAzyme探针为一发夹探针，在常温条件、未检测到乙肝病毒时呈封闭的发夹状态，不显示DNAzyme活性，从而无检测信号产生；当用正反向引物对乙肝病毒S区保守序列即目标核酸序列进行扩增时，DNAzyme探针在PCR循环过程中可与目标核酸序列互补，并在引物延伸过程中由于核酸聚合酶5’-3’外切酶活性而被部分消化从而释放出DNAzyme探针中的活性DNAzyme序列。此时，被释放的活性DNAzyme序列便能发挥其活性产生多种可读的检测信号，如肉眼可见的颜色信号及可准确定量的光吸收信号、荧光信号等，从而报告检测结果。
本发明以乙肝病毒S区的基因保守区域设计了相应的引物和特异性DNAzyme探针的设计：（1）正向引物HBV-F:5’-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3’；（2）反向引物HBV-R:5’-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’；（3）特异性的DNAzyme探针：5’-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3’。
本发明具体包括两个操作步骤：（1）PCR扩增目标核酸并释放活性DNAzyme序列；（2）比色/荧光报告检测结果。
与已有的相关检测技术相比，本发明所涉及的DNAzyme探针的3'-端进行了氨基修饰，使得目标核酸的检测可以一步完成，无需在PCR过程中再开盖加探针和补加引物便能获得非常好的检测信号，不仅使得操作过程更为简单，更重要的是避免了PCR过程中开盖将引起的交叉污染。此外，本发明在PCR反应中采用了UNG体系，避免扩增产物的污染，使得检测结果更为真实可靠，也降低了对操作环境的要求。
本发明所涉及的DNAzyme是一种能够产生信号的、具有催化功能的DNA序列。目前所发现的DNAzyme分为5大类：切割DNA的DNAzyme、切割RNA的DNAzyme、与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme、具有连接酶功能的DNAzyme、具有激酶活力的DNAzyme。
本发明所涉及的DNAzyme是与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme时，当DNAzyme释放后，（1）通过加入hemin、显色底物（ABTS、DAB等）、H2O2，在室温下显色，直接用肉眼观察颜色变化或用分光光度计测得一定波长下的吸光值来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在。当显色底物为ABTS时，存在目标核酸序列的样品显绿色，当显色底物为DAB时，存在目标核酸序列的样品显棕红色，不存在目标核酸序列的样品都为无色；（2）向体系中加入hemin、盐酸酪胺（Tyramine·HCl）、H2O2，以320nm为激发光激发反应产物，即可在410nm处观察到检测结果，从而实现对样本的准确定量检测。
本发明所涉及的DNAzyme为可与锌原卟啉、结晶紫或孔雀石绿等荧光底物结合的DNAzyme时，当DNAzyme释放后，可与体系中的荧光底物结合，通过DNAzyme与荧光底物结合与否的荧光强度变化可实现样本的定量检测。
本发明所申请保护的技术虽是针对乙肝病毒检测的，但也适用于其他核酸样本的检测。
本发明所涉及的核酸聚合酶是一种具有5’-3’外切酶活性的耐热性聚合酶。
本发明对待测核酸样品的长度没有限制，但对PCR反应中扩增的特异性序列长度有一定的限制，扩增片段不宜过长，通常为200个碱基以内。
如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
“DNAzyme”：脱氧核酶(deoxyribozyme，Catalytic DNA)是人工合成的、利用体外分子进化技术筛选的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。据催化功能的不同，可以将脱氧核酶分为5大类：切割RNA的脱氧核酶、切割DNA的脱氧核酶、具有激酶活力的脱氧核酶、具有连接酶功能的脱氧核酶、催化卟啉环金属螯合反应的脱氧核酶。
“UNG体系”：在PCR体系中，为了防止扩增产物的污染，以dUTP代替dTTP进行PCR，使PCR产物都是含有dU的DNA链。当在这种“dU”取代“dT”PCR体系中加入尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶），在PCR扩增前一定温度下保温5-10min，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解。在随后热变性的过程中DNA链断裂，从而消除可能污染到的上一轮的扩增产物，以保证扩增结果的特异性、准确性。同时，热变性还使UNG酶失活，无法再对新的扩增产物进行降解。这样的PCR体系即为“UNG体系。
“Hemin”：血红素，即卟啉铁。
“ABTS”：2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)。
“DAB”：Diaminobenzidine，二氨基联苯胺。
本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
1.简便性。本发明通过对DNAzyme探针进行改进，使得整个检测反应可以一步完成，大大降低了操作复杂性。
2.准确性。本发明的一步法操作及UNG体系，最大程度避免了样品间的交叉污染和来自扩增产物的污染，使得检测结果更为准确，可信度更高。
3.快速性。本发明用于检测很快速，3-4小时即可得到检测结果。
4.通用性。本发明所涉及的PCR检测方法，适用于各种基因型的乙肝病毒样本的检测，也可用于检测其它核酸样本.
5.实用性。现有的实时荧光PCR技术通常对检测设备和检测条件具有较高的要求，从而使检测具有一定的局限性，而本发明检测方法仅需要普通PCR仪。再加上本发明是基于DNAzyme而开发的技术，能够进行比色检测，肉眼即可观察到检测结果。因此，方法本身对检测条件要求低，实用性强，使得乙肝病毒检测变得更加简单、实用、经济、方便。
6.经济性。现有的实时荧光PCR技术，试剂和探针的合成费用都较高，而本发明中所涉及的DNAzyme探针序列和标记物都由普通的核苷酸组成，合成方便，试剂较为廉价，因此，大大降低了检测成本。
附图说明
图1为乙肝病毒血清样本的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1、2、3分别为阴性乙肝血清样本、受试乙肝血清样本以及乙肝阳性对照的PCR扩增产物，扩增片段大小为116bp；泳道M为DL-2000分子量Marker，片段从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图2是乙肝病毒血清样本的比色检测结果，其中：1为阴性对照，阴性乙肝血清标本；2为阳性乙肝血清标本；3为阳性对照，含S区基因质粒。
图3是对101-107乙肝病毒DNA拷贝数的标准品进行PCR扩增后1-13min显色反应的动力学检测曲线图。其中，横坐标代表显色反应检测时间，纵坐标代表414nm处的吸收光强度。
图4是从图3中选取第4min时101-108拷贝8个梯度的吸收值绘制的乙肝血清标准曲线。其中，横坐标代表乙肝血清样本中乙肝病毒DNA拷贝数，纵坐标代表414nm处的吸收光强度。
图5为使用本发明所述方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）与Taqman方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）的折线图。横坐标代表乙肝血清样本编号，纵坐标代表测定的乙肝血清临床样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）。“◇”表示本发明所述检测方法测得的样本值。“□”表示Taqman方法测得的样本值。
图6为该显色方法测定乙肝血清样本与Taqman方法测定乙肝血清样本测定值的相关曲线。横坐标代表该显色方法测定的乙肝血清样本的拷贝数（lg值），纵坐标代表Taqman方法测定的乙肝血清样本的拷贝数（lg值）。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、乙肝血清标本的定性检测
1.PCR反应
扩增条件：94℃2min；94℃30s，60℃90s，35-40个循环。
2.显色反应；
在PCR产物中加入400mM NaCl，94℃加热1min，室温放置30min，加2μM hemin、2.4mM ABTS、2mM H2O2，用肉眼观察颜色变化。
3.检测结果
图1为乙肝病毒血清样本的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中泳道1、2、3分别为阴性乙肝血清样本、受试乙肝血清样本以及乙肝阳性对照（含S区基因质粒）的PCR扩增产物，扩增片段大小为116bp；泳道M为DL-2000分子量Marker，片段从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。可以看到，在阴性乙肝血清样本中没有116bp的扩增条带，而在受试乙肝血清样本和乙肝阳性对照中均有明显扩增条带。
图2为与图1相对应的乙肝病毒血清样本的比色检测结果，其中：1为阴性对照，阴性乙肝血清标本；2为阳性乙肝血清标本；3为阳性对照，含S区基因质粒。由图可见，阴性对照不显色，乙肝血清样本与阳性对照都可见明显绿色。说明检测结果的颜色信息与琼脂糖凝胶电泳的结果一致，真实地反映了样本信息。
实施例2、乙肝血清标本的定量检测
1、标准曲线的制备
将定量确定乙肝病毒DNA拷贝数的乙肝临床样本用乙肝阴性血清稀释形成101-108拷贝的8个浓度梯度的检测标准品作为受试样本进行扩增、检测，每一样本设三个重复。
（1）PCR扩增
dNTPs1.2mM(600μM dUTP,200μM dATP,200μM dCTP,200μM dGTP)；
扩增条件：20℃10min；95℃2min；94℃30s，60℃90s，35-40个循环。
（2）比色检测及标准曲线的绘制
在按步骤（1）得到的PCR产物中加400mM NaCl，94℃加热1min，室温放置30min，加2μM hemin、2.4mM ABTS、2mM H2O2，使用Thermo Varioskan Flash多功能读数器，在414nm每隔1min读取紫外吸收值，取三个平行重复样本的紫外吸收值的平均值绘制不同浓度梯度的动力学曲线（图3）。最后选取第4min的光吸收值为纵坐标、乙肝病毒DNA拷贝数为横坐标做标准曲线（图4）。
图3为对101-108拷贝的乙肝血清样本标准品进行PCR扩增后0-13min显色反应的动力学检测曲线图，横坐标代表显色反应检测时间，纵坐标代表414nm测得的吸收光强度。由图可见，随着样本中乙肝病毒拷贝数增加，414nm处的吸收光强度也呈递增趋势，且各样本的检测信号具有显著的区分度，检测范围也很宽。
图4是从图3中选取第4min时101-108拷贝8个梯度的吸收值绘制的乙肝血清标准曲线。其中，横坐标代表乙肝血清样本中乙肝病毒DNA拷贝数，纵坐标代表414nm处的吸收光强度。
（3）乙肝临床血清样本的定量检测及方法学比较
按照步骤（1）和（2）测定7例不同浓度的阳性乙肝临床血清样本得到其吸收值。并根据图4中乙肝血清标准曲线的相关方程，计算出样本拷贝数（lg值）。将利用本发明所述方法（Colorimetric assay）测得的7例阳性乙肝临床血清样本乙肝病毒DNA拷贝数与使用Taqman方法测定的同样的7例样本得到的乙肝病毒DNA拷贝数（lg值）进行比较（图5），得到两种方法间测定值的相关系数（图6）。
图5为使用本发明所述方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）与Taqman方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）的折线图。横坐标代表乙肝血清样本编号，纵坐标代表乙肝血清临床样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）。“◇”表示本发明所述检测方法测得的样本值。“□”表示Taqman方法测得的样本值。
图6为本发明所述方法与Taqman方法测定乙肝血清样本的测定值的相关曲线。横坐标代表本发明所述方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值），纵坐标代表Taqman方法测定的乙肝血清样本中乙肝病毒DNA的拷贝数（lg值）。其相关方程为y=0.9091x+0.8262，相关系数为0.913。
Claims (8)
1.一种基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：在PCR体系中加入检测乙型肝炎病毒基因保守区域的特异性引物和DNAzyme探针对乙肝病毒基因保守区域进行扩增，扩增过程中利用核酸聚合酶5’-3’外切酶活性对DNAzyme探针进行部分消化使其产生大量活性DNAzyme序列，最终通过检测由活性DNAzyme序列产生的比色或荧光信号实现对乙肝病毒感染样本的定性和定量检测；该方法还适用于其他核酸样本的检测。
2.根据权利要求1所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：所述DNAzyme探针为一发夹探针，在常温下或未检测到乙肝病毒基因序列时，通过探针的DNA碱基互补作用，活性DNAzyme序列被封闭在发夹中，不产生检测信号；而在PCR过程中检测到乙肝病毒基因序列时，DNAzyme探针打开并与目标核酸序列互补，引物延伸时核酸聚合酶利用其5’-3’外切酶活性部分消化与目标核酸序列互补的DNAzyme探针并产生大量活性DNAzyme序列，从而获得可检测的颜色或荧光信号。
3.根据权利要求1所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：所述DNAzyme探针为经3’-端氨基修饰的探针。
4.根据权利要求1、3所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：一步反应即可完成样本检测，大大降低了操作复杂性，提高了方法的可靠性和实用性。
5.根据权利要求1所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：当待扩增的目标核酸序列为乙肝病毒S区的基因保守区域时，其特异性的正反向引物可以是（1）正向引物HBV-F:5’-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3’；（2）反向引物HBV-R:5’-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’。
6.根据权利要求1、3所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：当待扩增的目标核酸序列为乙肝病毒S区的基因保守区域时，其特异性的DNAzyme探针可以是5’-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3’。
7.根据权利要求1所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是引入了UNG防污染体系，进一步提高了方法的可靠性和实用性。
8.根据权利要求1所述的基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法，其特征是：当活性DNAzyme为与hemin结合可以发挥具有过氧化物酶活性的DNAzyme时，可在乙肝病毒样本的扩增产物中加入hemin以及如ABTS这样的显色底物和H2O2，利用DNAzyme/hemin复合物催化H2O2氧化显色底物发生颜色变化，通过观察颜色差异对乙肝病毒进行定性检测，也可通过测定溶液在414nm处的光吸收值进行定量检测。
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