CN110484602A

CN110484602A - 一种单分子计数检测基因组中dna损伤的荧光化学传感器、方法和应用

Info

Publication number: CN110484602A
Application number: CN201910642557.8A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 张艳; 华若男
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110484602B

Abstract

本发明提供一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器、方法和应用，属于分子生物学与生物检测技术领域。本发明利用模板非依赖型的TdT聚合酶取代传统的模板依赖性聚合酶进行损伤位点的标记，可以用任意的Biotin‑dNTP来检测任意的DNA损伤碱基，而无需考虑必须使用与要检测的损伤碱基互补配对；本发明既可以检测孤立的DNA损伤位点又可以检测聚集的DNA损伤位点，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器、方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学与生物检测技术领域，具体涉及一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器、方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细胞DNA不断暴露于各种外源性/内源性威胁，导致各种DNA损伤。孤立的DNA损伤是两个损伤位点距离比较远，通常情况下比较容易修复。聚集的DNA损伤是在一个或两个螺旋内含有两个或多个损伤位点，这些损伤位点由于距离太近更难以修复，在某些情况下是不可修复的。DNA损伤可导致点突变的产生，而且DNA损伤的累积可能导致过早衰老、癌症和神经退行性疾病。因此，基因组中的DNA损伤水平可作为风险评估、早期临床诊断和治疗的重要生物标志物。

目前可用于DNA损伤检测的技术通常涉及到各种色谱分析法及其与质谱或电化学检测相结合的方法。发明人发现，尽管这些方法可以区分特定的碱基损伤，但是分析损伤的步骤非常繁琐，且费用较高。很多时候需要把DNA序列切割成单个碱基，这个过程会导致额外的损伤从而造成DNA损伤水平的不准确。彗星试验是一种成本较低的方法，可用于评估细胞中的DNA损伤水平，但是这种方法不能提供是哪种碱基发生了损伤。非天然核苷碱基类似物可与双链体中的特定损伤碱基形成碱基对，特异性地检测某种类型的DNA损伤，但是灵敏度较差。纳米孔和DNA适配体也可用于检测DNA损伤位点，但是只适用于检测单链DNA中的损伤位点。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器、方法和应用。本发明利用模板非依赖型的TdT聚合酶取代传统的模板依赖性聚合酶进行损伤位点的标记，可以用任意的生物素标记的dNTP(Biotin-dNTP)来检测任意的DNA损伤碱基，而无需考虑必须使用与要检测的损伤碱基互补配对；既可以检测孤立的DNA损伤位点又可以检测聚集的DNA损伤位点，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括末端转移酶(TdT)、生物素化的双脱氧核苷酸(Biotin-ddATP)、生物素化的核苷酸(Biotin-dNTP)、荧光标记的核苷酸(优选为Cy5-ddUTP)、DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1(APE1)。

所述DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应；

如当检测8-oxoG引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)；

如当检测尿嘧啶引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)；

如当检测脱氧肌苷引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)。

进一步的，所述荧光化学传感器还包括链霉抗生物素蛋白包被的磁珠。

进一步的，所述DNA损伤包括孤立的损伤位点和聚集的损伤位点。

本发明的第二个方面，提供基于上述荧光化学传感器检测基因组中DNA损伤的方法，所述方法包括：

S1、向待测物中加入生物素化的双脱氧核苷酸(Biotin-ddATP)和末端转移酶(TDT)进行孵育，然后加入链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行分离；

S2、加入DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1(APE1)进行孵育处理；

S3、加入Biotin-dNTP和末端转移酶进行孵育处理；

S4、向分离的生物素化的DNA链中加入荧光核苷酸和末端转移酶避光孵育处理，经磁分离和外切酶消化，进行单分子成像。

本发明的第三个方面，提供上述荧光化学传感器和/或检测方法在DNA损伤检测中的应用。

本发明有益效果：

1、本发明利用模板非依赖性的TdT聚合酶代替传统的模板依赖性DNA聚合酶，不仅可以检测基因组中单个受损碱基，而且可以检测聚集的多个损伤位点。

2、本发明可以检测各种DNA损伤类型，如8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG)，尿嘧啶和脱氧肌苷等。

3、本发明基于单分子检测的分析方法具有超高灵敏度，选择性好，分析时间快，样品消耗低的优点，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明单分子计数分析DNA损伤原理示意图。该方法包括三个步骤：(1)通过修复酶去除损伤碱基，(2)通过TdT聚合酶以模板非依赖性方式在损伤位点掺入随机Biotin-dNTP和Cy5-ddUTP，以及(3)单分子计数。

图2为本发明实施例1中单分子计数法分析DNA损伤相关图。其中，图2(a)为分离的损伤碱基和聚集的损伤碱基的单分子成像图；每个KRAS序列的浓度为100nM。比例尺为2.5μm；图2(b)为分离的损伤碱基和聚集的损伤碱基的单分子成像计数图；图2(c)为通过使用模板依赖性Polβ聚合酶和模板非依赖性TdT聚合酶检测DNA损伤的比较图。每个KRAS序列的浓度为100nM。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图3为本发明实施例1中使用适当的DNA糖基化酶来识别特定的损伤来检测不同类型的DNA损伤相关图；其中，图3(a)为分别在6U的Fpg，6U的hAAG和6U的UDG存在下从KRAS-8-oxoG-Cy5中除去8-oxoG的变性凝胶电泳分析图；图3(b)为分别在6U Fpg，6U hAAG，6U UDG和对照组仅存在反应缓冲液的情况下的KRAS-8-oxoG-5的Cy5计数图；图3(c)为分别使用Fpg糖基化酶与Biotin-dGTP，Biotin-dCTP和Biotin-dUTP组合的KRAS-8-oxoG-5的Cy5计数图；图3(d)为分别使用UDG(6U)和hAAG(6U)与相同的Biotin-dNTP组合的尿嘧啶和脱氧肌苷的Cy5计数图。在实验中使用100nM KRAS-U，100nM KRAS-U-5,100nM KRAS-dI和100nMKRAS-dI-5。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图4为本发明实施例1中氧化损伤水平与Cy5计数以及方法特异性检验相关图；其中，图4(a)为在1×10^-14至1×10^-7M范围内，Cy5计数与KRAS-8-oxoG-5浓度的对数线性相关图；图4(b)为检测KRAS-8-oxoG-5和正常KRAS序列的混合物中的8-oxoG的水平的测量值与实际输入值之间的相关性图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图5为本发明实施例1中检测暴露于不同浓度的H₂O₂的人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)的基因组DNA提取物中的氧化损伤水平相关图；其中，图5(a)为检测各种浓度的H₂O₂的Cy5计数图，基因组DNA的量为10ng；图5(b)为用150μM H₂O₂处理后从HeLa细胞提取的不同量基因组DNA的Cy5计数图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图6为本发明实施例1中检测100nM KRAS-8-oxoG和含有100nM KRAS-8-oxoG和100nM正常KRAS序列混合物的Cy5计数图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图7为本发明实施例1中检测不同浓度的KRAS-8-oxoG-5序列的Cy5计数图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图8为本发明实施例1中检测KRAS-8-oxoG-5序列和正常KRAS序列的混合物中输入的8-oxoG水平测量Cy5计数图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

图9为本发明实施例1中检测从癌细胞系(HeLa细胞，A549细胞和SW480细胞)和正常细胞系(MRC细胞)提取的基因组DNA(10ng)中的氧化损伤水平的Cy5计数图。误差棒代表三次实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如前所述，现有DNA损伤检测的技术通常涉及到各种色谱分析法及其与质谱或电化学检测相结合的方法，分析损伤的步骤非常繁琐，且费用较高，且灵敏度不高、检测不准确，且往往难以对聚集的损伤位点进行检测。

有鉴于此，本发明提供一种通用的单分子计数方法来检测基因组DNA中总的损伤水平，包括孤立的损伤位点和聚集损伤位点。本发明利用DNA修复酶去除DNA损伤，并使用末端转移酶(TdT)将生物素化的核苷酸(Biotin-dNTP)和荧光核苷酸(Cy5-ddUTP)以模板不依赖的方式掺入损伤位点(图1)。为了确保所有游离3'-羟基(3'-OH)全部由切除的损伤位点产生，在DNA片段的末端使用TdT聚合酶掺入生物素化的双脱氧核苷酸(Biotin-ddATP)来阻断所有具有游离3'-OH末端的DNA片段。通过用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠分离后，DNA片段中受损的碱基被DNA糖基化酶识别(它可以从磷酸盐骨架中去除受损的碱基)并在DNA链中形成脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点。随后用AP内切核酸酶1(APE1)处理AP位点，在损伤部位产生3'-OH的单核苷酸缺口。当孤立的损伤位点存在时，由于两个损伤位点距离较远，APE1酶处理之后，带有切口的双链DNA是稳定的。当聚集损伤位点的位置在一个超螺旋内时，由于两个损伤位点的距离太近，APE1酶处理之后，带有切口的双链DNA是不稳定的，产生单链DNA。由于TdT聚合酶不需要依赖于模板就可以在DNA序列末端进行聚合反应，因此损伤碱基切除之后形成的带有3'-OH末端的单链DNA和双链DNA都可以在TdT聚合酶的作用下掺入随机的Biotin-dNTP和Cy5-ddUTPs。经过磁分离和Exo I消化后，释放的Cy5荧光团可以通过单分子成像定量。而且由于TdT聚合酶具有模板非依赖性的特性，可以用任意的Biotin-dNTP来检测任意的DNA损伤碱基，而无需考虑必须使用与要检测的损伤碱基互补配对。因此，利用模板非依赖型的TdT聚合酶取代传统的模板依赖性聚合酶进行损伤位点的标记，既可以检测孤立的DNA损伤位点又可以检测聚集的DNA损伤位点，从而可为临床的诊断治疗提供了更好的实验依据。

因此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括末端转移酶(TdT)、生物素化的双脱氧核苷酸(优选为Biotin-ddATP)、生物素化的核苷酸(Biotin-dNTP)、荧光标记的核苷酸(优选为Cy5-ddUTP)、DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1(APE1)。

本发明的又一具体实施方式中，所述DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应。

本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感器还包括链霉抗生物素蛋白包被的磁珠。

本发明的又一具体实施方式中，所述DNA损伤包括孤立的损伤位点和聚集的损伤位点。

本发明的又一具体实施方式中，提供基于上述荧光化学传感器检测基因组中DNA损伤的方法，所述方法包括：

S2、加入DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1(APE1)进行孵育处理；

S3、加入Biotin-dNTP和末端转移酶进行孵育处理；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，

孵育具体条件为：35～40℃(优选37℃)下孵育处理0.5～1.5小时(优选为1小时)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，

DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，

孵育具体条件为：35～40℃(优选37℃)下孵育处理0.4～1小时(优选为0.5小时)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S4中，

避光孵育具体条件为：35～40℃(优选37℃)下孵育处理0.5～1.5小时(优选为1小时)；

所述荧光核苷酸为Cy5修饰的ddUTP(Cy5-ddUTP)；

所述外切酶为Exo I；

所述单分子成像为全内反射荧光(TIRF)单分子成像，640nm激光用于激发Cy5分子，对Cy5分子进行计数从而实现对DNA损伤的定量检测。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述荧光化学传感器和/或检测方法在DNA损伤检测中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1

检测方法步骤

通过所提出的方法在合成的KARS序列中标记8-oxoG，尿嘧啶和脱氧肌苷：为了阻断DNA链的3'羟基，在10μL体系中将1μL含有受损碱基的合成KARS序列，1μM Biotin-ddATP，1×TDT缓冲液，0.25mM CoCl₂和8U TDT在37℃下孵育1小时。将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(MB)加入到反应混合物中以除去过量的ddATP。为了切除8-oxoG，将含有ddATP封闭的KARS序列，1×NEB缓冲液1,1×BSA和6U Fpg，1×NEB缓冲液4和8U APE1在10ul体系中混合，反应混合物在37℃下孵育1小时。为了切除尿嘧啶，将10μL含有ddATP封闭的KARS序列，1×UDG反应缓冲液和6U UDG，1×NEB缓冲液4和8U APE1的反应混合物在37℃温育1小时。为了切除脱氧肌苷，将含有ddATP封闭的KARS序列，1×NEB缓冲液4,6U的hAAG和8U的APE1的10μL反应混合物在37℃下孵育1小时。最后，将1μM Biotin-dGTP，1×TDT缓冲液，0.25mM CoCl₂和8U TDT加入到反应混合物中，总体积为25μL，并在37℃下孵育30分钟。然后通过磁力分离将混合物洗涤三次以除去酶，过量的Biotin-dGTP和反应缓冲液。将分离的生物素化的DNA链加入10μL含有0.5μM Cy5-ddUTP，1×TDT缓冲液，0.25mM CoCl₂和8U TDT的反应混合物中，并在37℃下在黑暗中温育1小时。通过磁力分离将该混合物在黑暗中洗涤三次以除去过量的酶，Cy5-ddUTP和反应缓冲液。磁力分离后，将剩余的缀合物重悬于10μL含有1×Exo I缓冲液，8U Exo I的反应混合物中，然后在37℃下在黑暗中孵育1小时。将上清液稀释至50μL，然后对溶液进行单分子成像。

以不同比例稀释8-oxoG：为了研究所提出的方法在混合物中能特异性检测8-oxoG水平的能力，用正常KRAS序列与连续稀释含有两个损伤8-oxoG(KRAS-8-oxoG-5)的KRAS序列混合。KRAS-8-oxoG-5和正常KRAS的总浓度为100pM，混合物中分别包含0.001％，0.01％，0.1％，1％，10％和100％的KRAS-8-oxoG-5序列。检测出的8-oxoG水平根据等式(1)计算。

其中L是所提出的方法含8-oxoG的DNA的量，N是正常KRAS的量。

细胞培养和基因组DNA的提取：将人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)，人肺腺癌细胞系(A549细胞)，人结肠癌细胞(SW480细胞)和人胚肺纤维细胞(MRC-5细胞)在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Gibco，USA)中补充10％胎牛血清(FBS；Gibco，USA)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen，USA)在37℃，含5％CO₂的培养箱中培养。然后用PBS缓冲液洗涤细胞，并在37℃，5％CO₂的培养箱中用不同浓度的H₂O₂处理1小时。根据制造商的方案，使用QIAamp DNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)提取基因组DNA。按照制造商的方案，用dsDNA片段酶将基因组DNA消化至50-200bp。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，U.S.A.)测定基因组DNA的浓度。

通过所提出的方法标记基因组DNA中的8-oxoG：为了减少DNA制备过程中自发的8-oxoG形成，在所有反应中使用抗氧化剂(100mM去铁胺，100mM丁基化羟基甲苯)直至氧化损伤切除步骤。将基因组DNA片段用8UAPE 1在1×NEBuffer4中处理，总体积为10μL，在37℃孵育1小时以除去无碱基位点。然后加入生物素化的双脱氧核苷酸(biton-ddATP，终浓度10μM)，10U TDT，1×TDT缓冲液，0.25mM CoCl₂，并在37℃温育30分钟以阻断DNA片段中的缺口和末端核苷酸。将链霉抗生物素蛋白包被的磁珠(MB)加入到反应混合物中以除去过量的ddATP。为了切除8-oxoG，将含有ddATP封闭的DNA片段，1×NEB缓冲液1,6U Fpg，8U APE1和1×NEBuffer4的反应混合物在10μL中混合，37℃下孵育1小时。随后，将10μM Biotin-dGTP，0.25mM CoCl₂和10U TDT加入到反应混合物中，总体积为25μL，并在37℃下孵育30分钟。通过磁力分离将混合物洗涤三次。然后将分离的生物素化的DNA链加入10μL含有2μM Cy5-ddUTP，1×TDT缓冲液，0.25mM CoCl₂和8U TDT的反应混合物中，并在37℃下避光孵育1小时。磁力分离后，将剩余的缀合物重悬于10μL含有1×Exo I缓冲液，8U Exo I的反应混合物中，然后在37℃下在黑暗中孵育1小时。将上清液稀释至50μL，然后对溶液进行单分子成像。

全内反射荧光(TIRF)单分子成像：通过全内反射荧光显微镜(TIRF)(Nikon，Ti-E，Japan)获得单分子的图像。将1μL Exo I消化稀释后的反应产物稀释至100μL，然后将10μL反应产物涂布在玻璃盖玻片上进行TIRF成像。640nm激光用于激发Cy5分子。使用油浸100×物镜收集光子。将来自Cy5的光子成像到EMCCD相机上(Photometrics，Evolve 512)。对于数据分析，通过图像J软件对Cy5分子进行计数，在每帧中计数600×600像素的成像区域。

凝胶电泳分析：使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析合适的糖基化酶(Fpg)和两种不相关的糖基化酶(包括尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)对8-oxoG的去除影响。通过在室内温度110V恒定电压下在1×Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液(9mM Tris-HCl，9mM硼酸，0.2mM EDTA，pH7.9)中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析产物40分钟。通过Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统(Hercules，CA，U.S.A.)使凝胶电泳可视化。

表1.实施例所需核苷酸序列^α

α带下划线的粗体G表示8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG)。带下划线的粗体U碱基表示尿嘧啶，带下划线的粗体dI碱基表示脱氧肌苷。

试验结果分析

可行性试验：8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤(8-oxoG)是由活性氧(ROS)氧化鸟嘌呤(G)杂环产生的突出的氧化性碱加合物，它可以诱导G的颠换突变。甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)和APE1可用于去除8-oxoG，在间隙位点产生游离3'-OH的间隙。研究了所提出的方法使用含有一个8-oxoG碱基(KRAS-8-oxoG)和两个8-oxoG碱基的合成KRAS序列检测分离的和聚集的损伤碱基的能力(KRAS-8-oxoG-5)和13个核苷酸(KRAS-8-oxoG-13)。在存在孤立的损伤碱基(图2a(II)和图2b)和无论两个损伤基础是否在一个(图2a(III)和图2b)或两个(图2a(IV)和图2b)DNA的螺旋转角的聚集损伤碱基时均观察到显着的Cy5计数。但是，在没有损伤碱基(正常KRAS序列)的情况下没有观察到Cy5计数(图2a(I)和图2b)。通过使用模板依赖性Polβ聚合酶和模板非依赖性TdT聚合酶比较检测DNA损伤的水平。通过使用Polβ聚合酶介导的标记方法响应于分离的损伤碱基(KRAS-8-oxoG)的Cy5计数与通过使用TdT聚合酶介导的损伤位点标记的方法类似(图2c)。然而，通过使用Polβ聚合酶介导的标记方法响应于聚集的损伤碱基(KRAS-8-oxoG-5)的Cy5计数远小于使用TdT聚合酶介导的损伤位点的标记方法的计数(图2c)。这些结果表明，当聚集的损伤碱基的位置在DNA的一个螺旋转角内时，裂解的5聚体双链体是不稳定的并且可以从双链体解离，阻断模板依赖性Polβ聚合酶介导的Biotin-dNTP的掺入。此外，KRAS-8-oxoG-5的Cy5计数与对KRAS-8-oxoG-5和正常KRAS的混合物的响应相似(图6)，表明存在大量正常DNA链不会影响损伤基础的检测。

通过使用适当的DNA糖基化酶来识别特定的损伤来检测不同类型的DNA损伤：使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了适当的糖基化酶(Fpg)和两种不相关的糖基化酶(包括尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG))对8-oxoG的去除效果。只有适当的糖基化酶可以消除特定的损伤碱基(图3a)。仅在存在合适的Fpg糖基化酶的情况下观察到显着的Cy5计数，但在不相关的糖基化酶UDG和hAAG存在下未检测到明显的荧光团信号(图3b)。由于TdT聚合酶的模板独立能力，任何Biotin-dNTP都可以标记目标受损碱基，而不需要适当的dNTP与损伤碱基位置的相反链碱基配对。为了证明概念，分别使用Fpg糖基化酶与Biotin-dGTP，Biotin-dCTP和Biotin-dUTP结合检测8-oxoG。在Biotin-dGTP，Biotin-dCTP和Biotin-dUTP存在下分别观察到响应于KRAS-8-oxoG-5的相同的Cy5计数，表明通过使用适当的糖基化酶可与随机dNTPs(图3c)结合使用实现对受损碱基的检测。尿嘧啶(U)来自DNA复制过程中的错误掺入或胞嘧啶的自发脱氨作用，和脱氧肌苷(dI)来自腺苷的氧化脱氨作用。UDG和hAAG分别可以切除尿嘧啶和脱氧肌苷碱，使这些位置可用于通过TdT聚合酶掺入随机Biotin-dNTP和Cy5-ddUTPs。无论是孤立的损伤还是聚集的损伤，分别观察到对尿嘧啶和脱氧肌苷的显着Cy5计数(图3d)。这些结果清楚地表明，通过使用适当的DNA糖基化酶和相同的Biotin-dNTP，该方法可以扩展到检测广泛的受损碱基。

使用已知浓度的KRAS-8-oxoG-5逐级稀释来建立标准曲线N＝4510.22+295.66log₁₀C。该方法可以检测到1×10^-14M-1×10^-7M范围内的聚集8-oxoG碱基，检测限为3.3×10^-15M(图7和图4a)。该方法的灵敏度比非天然核苷类似物标记方法(1×10^-10M)高出5个数量级，比基于适体的荧光传感器高出5个数量级(3×10^-9M)。此外，该方法可准确定量低至0.001％的8-oxoG水平(图8)，优于COLD-PCR(0.01％)。测得的8-oxoG水平与实际输入的8-oxoG水平没有受到大量正常DNA序列的干扰(图4b)。

检测暴露于不同浓度的H₂O₂的人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)的基因组DNA提取物中的氧化损伤水平：随着H₂O₂浓度从0增加到150μM，Cy5计数增强，表明内源性氧化损伤碱基水平随着H₂O₂浓度的增加而增加(图5a)。进一步检测了用150μM H₂O₂处理的HeLa细胞中不同量的基因组DNA的氧化损伤水平。随着基因组DNA的量从0.05增加到10ng，Cy5计数增强(图5b)。根据获得的标准曲线(图4a)，计算出单细胞中基因组DNA中的氧化损伤碱基数为7328-7406(表2)。值得注意的是，癌细胞中的氧化性DNA损伤水平高于正常细胞(图9)。

表2.用150μMH₂O₂处理的HeLa细胞中计算的氧化损伤碱基数

计算基因组中的氧化损伤数：为了确保仅由切除的氧化损伤位点产生的所有游离3'-OH，用APE1处理片段化的DNA以除去无碱基位点，然后通过掺入Biotin-ddATP阻断所有游离的3'-OH末端。通过修复酶去除损伤碱基并通过TdT聚合酶在损伤位点掺入Biotin-dNTP和Cy5-ddUTP后，通过单分子计数分析氧化性DNA损伤水平。测量的Cy5计数与氧化损伤水平成比例。8-oxoG和FapyG是最常见的氧化性DNA损伤之一。在该研究中，通过稀释已知浓度的含有两个8-oxoG碱基(KRAS-8-oxoG-5)的合成KRAS序列建立标准曲线。获得的对数线性回归方程为N＝4510.22+295.66log₁₀C，其中N是测量的Cy5计数，C是KRAS-8-oxoG-5的浓度(图3a)。检测了用150μM H₂O₂处理的HeLa细胞中不同量的基因组DNA的氧化损伤。随着基因组DNA量的增加，Cy5计数增强，并且在Cy5计数和基因组DNA量的对数之间获得0.1至100ng范围内的线性相关性。标准曲线用于计算人类基因组中的绝对氧化损伤水平。单个HeLa细胞基因组中的氧化损伤位点的数量计算如下：

(1)将获得的基因组DNA中的Cy5计数(图4a)分别代入标准曲线N＝4510.22+295.66log₁₀C。因此，回归方程是：获得的Cy5计数＝4510.22+295.66log₁₀C，并且可以计算浓度C。

(2)基因组DNA中的氧化损伤碱基数(N-损伤)为：N-损伤＝计算浓度C×2(标准曲线中的KRAS-8-oxoG-5含有两个8-oxoG碱基)×反应体积(10μL)×Avogadro数＝基因组DNA中计算浓度C(mol/L)×2×10×10^-6L×6.02×10²³。

(3)单细胞基因组DNA中氧化损伤碱基的数量计算如下：计算的N-损伤/细胞数对应的基因组DNA量。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器、方法和应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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<212> DNA

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Claims

1.一种单分子计数检测基因组中DNA损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器至少包括末端转移酶、生物素化的双脱氧核苷酸、生物素化的核苷酸、荧光标记的核苷酸、DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1。

2.如权利要求1所述的荧光化学传感器，其特征在于，所述DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应；

优选的，

当检测8-oxoG引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶；

当检测尿嘧啶引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为尿嘧啶DNA糖基化酶；

当检测脱氧肌苷引起的DNA损伤时，所述DNA糖基化酶为人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶。

3.如权利要求1所述的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器还包括链霉抗生物素蛋白包被的磁珠。

4.如权利要求1所述的荧光化学传感器，其特征在于，所述DNA损伤包括孤立的损伤位点和聚集的损伤位点。

5.基于权利要求1-4任一项所述荧光化学传感器检测基因组中DNA损伤的方法，所述方法包括：

S1、向待测物中加入生物素化的双脱氧核苷酸和末端转移酶进行孵育，然后加入链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行分离；

S2、加入DNA糖基化酶和AP内切核酸酶1进行孵育处理；

S3、加入生物素化的核苷酸和末端转移酶进行孵育处理；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，

孵育具体条件为：35～40℃(优选37℃)下孵育处理0.5～1.5小时(优选为1小时)。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所所述步骤S2中，

DNA糖基化酶与待测DNA损伤具体类型相对应；

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，

孵育具体条件为：35～40℃(优选37℃)下孵育处理0.4～1小时(优选为0.5小时)。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，

优选的，所述荧光核苷酸为Cy5修饰的ddUTP；

优选的，所述外切酶为Exo I；

优选的，所述单分子成像为全内反射荧光单分子成像，640nm激光用于激发Cy5分子，对Cy5分子进行计数从而实现对DNA损伤的定量检测。

10.权利要求1-4任一项所述荧光化学传感器和/或权利要求5-9任一项所述检测方法在DNA损伤检测中的应用。