CN112941156A - 一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用 - Google Patents

一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用 Download PDF

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CN112941156A CN202110083574.XA CN202110083574A CN112941156A CN 112941156 A CN112941156 A CN 112941156A CN 202110083574 A CN202110083574 A CN 202110083574A CN 112941156 A CN112941156 A CN 112941156A
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Abstract

本发明公开了一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用，属于分析检测领域。利用末端脱氧核苷酸转移酶TdT催化核酸标记荧光染料FITC‑dUTP聚合到DNA链3’‑OH的末端，并利用纤维素纸有限尺寸的孔道结构对聚合反应的程度进行有效控制，实现了TdT对DNA链3’‑OH末端的有限聚合。与溶液中聚合反应的均一性较差相比，纤维素纸孔道中的聚合反应更加均一，且聚合FITC‑dUTP的数量随孔径的减小而减小，聚合度不随DNA序列而改变，方法具有普适性。损伤的基因组可经DNA修复酶作用转化为3’‑OH断裂类型的损伤，在纤维素纸中对该末端进行荧光标记可实现绝对定量检测，同时利用该方法也可实现对细胞修复能力的评估。

Description

一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方 法与应用
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用。
背景技术
末端脱氧核苷酸转移酶TdT是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子的3’-OH末端均可作为TdT的底物被重复添加脱氧核苷酸。可利用TdT能聚合脱氧核糖核苷酸特性作为检测DNA分子3’-OH断裂的一种潜在方法。
纤维素纸基器件因其便携、简单、便宜、多孔等特点广泛应用于核酸检测领域。一般超灵敏检测目标DNA的方法是利用模板依赖性的DNA聚合酶通过核酸扩增技术实现。但是这些方法不能对基因组随机位点的损伤进行有效的检测。
基因组有多种损伤形式，常见的有DNA分子3’-OH类型的断裂、DNA 3’-PO4 -类型的断裂、碱基烷基化、碱基氧化、碱基脱氨基，这些损伤均可以利用细胞内碱基切除修复通路所涉及的DNA修复酶转化为DNA 3’-OH断裂类型。传统DNA损伤的检测方法步骤繁琐、耗时长、需要多种大型仪器，这极大的限制了在临床诊断等方面的应用。除此之外，大多数方法只能实现DNA损伤的半定量分析，而无法对DNA损伤位点的个数进行绝对定量，给污染物的毒性效应评价工作带来了巨大的挑战。因此，利用纸芯片作为检测平台并结合TdT可识别基因组任意位点暴露出的3’-OH末端特性可建立准确、快速的定量检测方法，对于临床诊断、食品安全、环境监测等方面至关重要。
发明内容
本发明为了解决现有的技术问题，利用多孔纤维素纸作为检测平台，提供了一种可绝对定量检测DNA损伤的方法。纤维素纸有限的孔道结构可抑制TdT在DNA的3’-OH末端重复添加脱氧核糖核苷酸。利用上述原理，在纸芯片上将具有特异性识别DNA 3’-OH末端的TdT与多孔的纤维素纸相结合，通过荧光法对基因组的损伤位点进行绝对定量检测，可扩大DNA检测的实用价值。
本发明为解决上述技术问题，提供了一种通过控制多孔纤维素纸孔径来实现对TdT聚合能力控制的方法。
一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法，包括如下步骤：
(1)通过喷蜡打印机制备纸芯片器件；
(2)将具有3’-OH断裂损伤类型的待检测基因组DNA加入到纸芯片器件的反应区进行孵育干燥；
(3)孵育完成后，向纸芯片器件的反应区加入反应液，孵育一段时间后，加入乙二胺四乙酸终止反应，用PBS洗涤后，拍照检测荧光强度，以实现基因组DNA损伤位点数定量检测；所述反应液为末端脱氧核苷酸转移酶与核酸标记荧光染料FITC-dUTP的混合溶液，其中核酸标记荧光染料FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500。
进一步地，上述技术方案中，待检测基因组DNA为碱基烷基化损伤的基因组DNA时，将碱基烷基化损伤的基因组DNA中加入人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1后孵育，将碱基烷基化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA。待检测基因组DNA为碱基氧化损伤的基因组DNA时，将碱基氧化损伤的基因组DNA中加入8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶FPG和碱性磷酸酶CIAP后孵育，将碱基氧化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA。待检测基因组DNA为碱基脱氨基产生尿嘧啶损伤的基因组DNA时，将碱基脱氨基损伤的基因组DNA中加入尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1后孵育，将碱基氧化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中通过喷蜡打印机制备纸芯片器件的具体步骤为：通过喷蜡打印机在滤纸上打印圆形反应区，120～130℃加热2-3min使蜡融进滤纸中，形成疏水屏障。
进一步地，上述技术方案中，所述滤纸包括Whatman Grade 1或Whatman Grade 5。
进一步地，上述技术方案中，步骤(2)所述的孵育的条件为室温孵育5-10min。
进一步地，上述技术方案中，所述末端脱氧核苷酸转移酶的浓度<35nM，所述核酸标记荧光染料FITC-dUTP的浓度为>20μM。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中孵育的条件为室温孵育5-30min。
一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法在定量检测3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA或修复的3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA中的应用。
本发明中，末端脱氧核苷酸转移酶TdT在多孔纤维素纸中的聚合产物长度比在溶液中和界面上的聚合产物长度更加集中可控。
聚合产物的聚合度会随着多孔纤维素纸孔径减小而降低。
聚合产物的聚合度不受序列浓度、特异性、长度的影响。
TdT在多孔纤维素纸中的聚合速率明显快于溶液中。
TdT在Whatman Grade 1纤维素纸(11μm)中聚合产物的平均聚合度为3.1±0.4～5.6±1.4。
不同损伤类型的基因组在DNA修复酶的作用下转化为3’-OH断裂类型。TdT在Whatman Grade 1纤维素纸(11μm)中将FITC-dUTP可控的聚合到基因组损伤位点实现定量检测。
硫酸二甲酯处理细胞产生的N7-甲基鸟嘌呤(7meG)在人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1作用下可转化为3’-OH断裂类型。TdT在Whatman Grade 1纤维素纸(11μm)中将FITC-dUTP可控的聚合到基因组损伤位点实现定量检测。
在硫酸二甲酯处理细胞后，提取细胞不同修复时间的基因组，基因组未修复的7meG损伤在人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1作用下可转化为3’-OH断裂类型。TdT在Whatman Grade 1纤维素纸(11μm)中将FITC-dUTP可控的聚合到基因组损伤位点可实现对细胞修复能力的评估。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以多孔纤维素纸作为检测平台，利用TdT作为DNA损伤位点的识别扩增元件，可对DNA损伤的3’-OH末端实现可控的聚合FITC-dUTP，并进行定量检测。将通过该方法测定的损伤结果与传统的液相色谱-串联四极杆质谱联用仪所测结果进行对比，定量结果一致，说明该方法可以实现对基因组3’-OH断裂类型损伤的定量检测。
附图说明
图1为实施例2中信噪比与FITC-dUTP量的标准曲线图。
图2a为TdT在溶液中或在Grade 1上聚合加到DNA末端的的总FITC-dUTP量与加入DNA量的关系图，b为在溶液中或在Grade 1上反应的总DNA量与加入DNA量的关系图。
图3为实施例2中加入的底物浓度与聚合度DP的关系图，图中，a为不同浓度pA20对溶液中(F-pA20)平均DP的影响，b为不同浓度pA20对Grade 1中(P-pA20)平均DP的影响。
图4为实施例2中用不同孔径的纤维素纸对TdT合成的产物进行dPAGE分析图。
图5为实施例2中用不同孔径的纤维素纸对TdT合成的产物分布与聚合度分析图。
图6为实施例2中纤维素纸上序列特异性与聚合度DP的关系图。
图7为实施例2中序列长度对TdT合成的产物分布的影响图；图中a为不同长度的DNA在纤维素纸(左)和溶液(右)中的TdT扩增产物图，b为纤维素纸上序列长度与聚合度DP的关系图。
图8为实施例2所述纸界面反应产物图；图中a为硝基纤维膜表面S-pA20的TdT扩增，b为TdT对S-pA20扩增产物的dPAGE分析，c为硝基纤维膜表面S-pA20浓度与聚合度DP的关系图。
图9为实施例2所述聚合FITC-dUTP数作为时间的函数图，比较了F-pA20和P-pA20的反应速率。
图10为实施例3所述利用纸芯片和液相色谱-串联四极杆质谱联用仪绝对定量7meG图。
图11为实施例3所述细胞修复动力学图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，实施例包括纤维素纸孔径对TdT聚合扩增的限制作用和定量分析DNA损伤等。
表1：本发明中使用的核酸序列
Figure BDA0002910173150000051
Figure BDA0002910173150000061
下述实施例中的TdT反应缓冲液(5×TRB)：购买自上海翊圣生物科技有限公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。
下述实施例中的TE洗脱缓冲液(1×)：0.2M NaCl,10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mMEDTA,pH 8.0。
下述实施例中的PBS缓冲液(1×)：购买自生工生物工程(上海)股份有限公司PBS缓冲液。
下述实施例中的2×尿素PAGE上样缓冲液：80mM EDTA,pH 8.0，16M urea,180mMTris-HCl,180mM boric acid,20％(w/v)sucrose,0.05％xylene cyanol,0.05％bromophenol blue。
下述实施例中的杂交缓冲液：50mM Tris-HCl,pH 7.4at 25℃,100mM NaCl,5mMMgCl2，0.02％Tween-20。
实施例1利用多孔纤维素纸作为反应载体验证对TdT标记聚合扩增的抑制作用并定量分析DNA碱基烷基化损伤的技术路线
(1)多孔纤维素纸作为反应载体对TdT标记聚合扩增的抑制作用。底物浓度对TdT标记聚合度的影响，孔径大小对TdT标记聚合度的影响，序列特异性对TdT标记聚合度的影响，序列长度对TdT标记聚合度的影响，界面反应对TdT标记聚合度的影响；反应动力学的比较。
(2)DNA碱基烷基化损伤定量检测。人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1处理过的碱基烷基化损伤基因组在纸芯片上被TdT聚合标记FITC-dUTP，产生荧光信号。分析测试纸芯片的检测能力。
实施例2多孔纤维素纸作为反应载体对TdT标记聚合扩增的抑制作用
纸芯片通过喷蜡打印机(Xerox ColourQube 8570N)分别在滤纸(Whatman Grade1、Whatman Grade 5和Millipore HF120)上打印直径为4mm的圆形反应区，120℃加热2min使蜡融进纸中，形成疏水屏障。溶液中标记聚合的产物在纸上定量时，为了防止产物的丢失，同时为了研究界面反应对TdT标记聚合度的影响时将DNA固定到纸表面，防止DNA进入纸孔内部，将2μL链霉亲和素(1mg/mL)滴入Millipore HF120反应孔中，室温孵育20min。用20μL的1×PBS洗两次。室温干燥。将不同摩尔量的FITC-dUTP(0pmol,0.001pmol,0.01pmol,0.1pmol,1pmol,10pmol和100pmol)分别滴加到Whatman Grade 1打印的圆形反应区中。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。将0pmol FITC-dUTP获得的荧光强度作为对照，可获得FITC-dUTP数量与S/B的标准曲线，xFITC-dUTP＝(-6.63147)/(lnyS/B-4.68102)-1.39527，结果如图1。
(1)底物浓度对TdT标记聚合度的影响。
10μL 1×TRB反应缓冲液含有不同浓度pA20(0nM,0.9nM,9nM,90nM和900nM)，20μMFITC-dUTP和35nM TdT室温孵育30min。90℃加热5min。将5μL的反应液加到MilliporeHF120纸芯片反应区室温孵育30min。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，结果如图2a。
将1μL含有不同浓度的pA20(0nM,0.9nM,9nM,90nM和900nM)分别加到WhatmanGrade 1纸芯片反应区室温孵育5min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到反应区室温孵育30min。5μL 0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，结果如图2a。图2a中黑色柱状表示在溶液中反应加到DNA末端的的总FITC-dUTP量，灰色柱状表示在Grade 1上反应的总FITC-dUTP量。
将10μL含有不同浓度pA20(0nM,0.9nM,9nM,90nM和900nM)，20μM FITC-dUTP和35nMTdT的1×TRB室温孵育30min。90℃加热5min。5μL的反应液与5μL 2×尿素PAGE上样缓冲液混合，20％dPAGE分离产物。1×SYBR Gold4℃染色10min后分析未反应的F-pA20量，结果如图2b。由于加入的DNA终浓度为0.9nM和9nM时无法在20％dPAGE上观察到，考虑到此时TdT/pA20>1,我们认为pA20完全反应。
将1μL含有不同浓度的pA20(0nM,0.9nM,9nM,90nM和900nM)加到Whatman Grade 1纸芯片反应区室温孵育5min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到Whatman Grade 1纸芯片反应区室温孵育30min。90℃终止反应后，100μL TE洗脱缓冲液(1×)震荡30min提取反应产物。乙醇沉淀浓缩反应产物后，用1×SYBR Gold 4℃染色10min后分析未反应的P-pA20量，结果如图2b。其中的纸提取效率(η)为～88％。聚合度DP为总聚合FITC-dUTP与总反应pA20的比值。图2b中黑色柱状表示在溶液中反应的总DNA量，灰色柱状表示在Grade 1上反应的总DNA量。
图3表明随着底物浓度由0.9nM到900nM，溶液中TdT标记聚合度(F-pA20)DP值从149.8±34.9急剧减小到4.5±0.8，而纸中TdT标记聚合产物(P-pA20)更加均一，DP值从5.6±1.4减小到3.1±0.4。
(2)纤维素纸孔径大小对TdT标记聚合度的影响。
5μL的pA20(1μM)分别加到Whatman Grade 1(孔径11μm)与Whatman Grade5(孔径2.5μm)纸芯片反应区，室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育5min，10min，20min，30min。90℃终止反应后，100μL TE洗脱缓冲液(1×)震荡30min提取反应产物。乙醇沉淀浓缩反应产物后，用20％dPAGE分析产物分布，结果如图4和图5。
5μL的pA20(1μM)加到Whatman Grade 1与Whatman Grade 5纸芯片反应区，室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育30min。5μL 0.5M EDTA加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，结果如图5。
图4与图5显示聚合产物的分布随孔径的减小而更加集中。图5显示Grade 1聚合度DP值为3.2±0.2，Grade 5DP值为1.5±0.5。
(3)序列特异性对TdT标记聚合度的影响
20μL的杂交缓冲液中分别包含30nM的pA20/pT20或pG20/pC20。90℃加热5min，冷却至室温20min使双链杂交。5μL的pC20，pT20，pG20，p(AT)20，p(GC)20和DNA pool分别加到WhatmanGrade 1纸芯片反应区，室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育30min。5μL 0.5M EDTA加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，所得产物分别记为P-pT20,P-pC20,P-pG20,P-p(AT)20,P-p(GC)20和DNA pool，结果如图6所示。
图6显示P-pT20,P-pC20,P-pG20,P-p(AT)20,P-p(GC)20和DNA pool的平均聚合度DP值分别是3.3±0.1,3.6±0.3,3.8±0.4,3.7±0.6,3.8±0.3,和3.4±0.2，不同序列不影响平均聚合度DP值。
(4)序列长度对TdT标记聚合度的影响
5μL的pA10,pA20,pA30,pA40(1μM)分别加到Whatman Grade 1纸芯片反应区，室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育30min。90℃终止反应后，100μL TE洗脱缓冲液震荡30min提取反应产物。乙醇沉淀浓缩反应产物后，用20％dPAGE分析产物分布，所得产物分别记为P-pA10，P-pA20，P-pA30，P-pA40。
将10μL分别含有0.5μM不同长度的pA10,pA20,pA30或pA40与20μM FITC-dUTP,35nMTdT的1×TRB室温孵育30min。90℃加热5min。5μL的反应液与5μL 2×尿素PAGE上样缓冲液混合，20％dPAGE分离产物，所得产物分别记为F-pA10，F-pA20，F-pA30，F-pA40结果如图7a所示。
5μL pA10,pA20,pA30,pA40(1μM)分别加到Whatman Grade 1纸芯片反应区，室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育30min。5μL 0.5M EDTA加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。所得产物分别记为P-pA10，P-pA20，P-pA30，P-pA40。结果如图7b所示。
图7显示P-pA10,P-pA30和P-pA40的平均聚合度DP值分别为3.1±0.1,3.6±0.2和3.7±0.3与图3中的3.1±0.4相类似。与溶液中的标记反应相比，在纤维素纸中的标记产物长度更加趋于集中与一致而且TdT标记聚合度DP值不会受序列长度的影响。
(5)界面反应对TdT标记聚合度的影响
1nmol的pA20和30μL 1mg/mL的链霉亲和素加入到300μL 1×PBS中，室温孵育2h。30K的膜5000g过滤10min。用100μL的1×PBS洗两次。将截留物溶解到ddH2O中。
5μL溶解了截留物的ddH2O加到Millipore HF120纸芯片反应区，室温干燥。浸入1×PBS中20min并洗两次。室温干燥。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μMFITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育5min，10min，20min，30min。90℃终止反应后，100μLTE洗脱缓冲液震荡30min提取反应产物。乙醇沉淀浓缩反应产物后，用20％dPAGE分析产物分布，结果如图8b。
溶解了截留物的ddH2O经过稀释，各取5μL含有不同浓度的截留物(0nM,0.9nM,9nM,90nM和900nM)分别加到Millipore HF120纸芯片反应区，室温干燥。浸入1×PBS中20min并洗两次。室温干燥。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到纸芯片反应区室温孵育30min。5μL 0.5M EDTA加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量，结果如图8c。
图8a形象的说明了在界面处TdT标记的反应过程。图8显示随着时间的增长，产品的长度不断增加。随着S-pA20浓度从0.9nM增加到900nM，平均聚合度DP值从106±10下降到2.1±0.5。
(6)反应动力学的比较
10μL反应液(50nM pA20,35nM TdT,20μM FITC-dUTP,1×TRB)室温分别孵育1,3,5,10,20,30,60和120min，90℃加热5min。反应液加到Millipore HF120纸芯片反应区孵育30min。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。
10μL 50nM pA20加到Whatman Grade 1纸芯片反应区室温孵育10min。10μL反应液(1μL 10×TRB,1μL 350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加入反应孔中室温孵育1,3,5,7,10,20,30min。5μL 0.5M EDTA加到反应区终止反应。用20μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。
图9显示TdT能在120分钟内将2.7pmol FITC-dUTP聚合到F-pA20，在30分钟内聚合1.7pmol FITC-dUTP到P-pA20后达到稳定水平。因此，F-pA20的初始速率为0.06min-1，P-pA20的初始速率为0.32min-1。(附图中的P-指的是在纸孔中反应(Grade1与Grade 5上相关的反应)、F-指的是在溶液中的反应、S-指的是在界面的反应)。
实施例3 DNA碱基烷基化损伤定量检测
在含10％胎牛血清(FBS)、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中的斑马鱼肝细胞(1×107)(ATCC,CRL-2643TM)0℃暴露于0,0.5,0.8,1,2,3,10mM硫酸二甲酯中30min，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技(北京)有限公司，DP304)提取斑马鱼肝基因组。
在纸芯片上定量检测碱基烷基化损伤(PAT)。13.5μg斑马鱼肝基因组，20U人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和20U人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1加入100μL的1×TRB中37℃孵育60min。取2μL加到Whatman Grade 1纸芯片反应区，15μL 1×TRB反应液(1μL350nM TdT,2μL 100μM FITC-dUTP)加到反应区室温孵育30min。用50μL的1×PBS洗两次。利用ImageQuant软件对反应区的荧光强度扫描并定量。
13.5μg斑马鱼肝基因组，20U AAG加入100μL的1×TRB中37℃孵育60min。3K的膜5000g过滤30min。用100μL的1×PBS洗两次。收集的滤液用液相色谱-串联四极杆质谱联用仪QQQ LC/MS2(Agilent 6410B)分析。
图10显示暴露于0,0.5,0.8,1,2,3,10mM DMS中每纳克DNA所含有的7meG量分别为(4±0.4)×108,(5±0.2)×108,(6.8±0.3)×108,(8.8±0.1)×108,(11±0.2)×108和(13.5±0.8)×108与液相色谱-串联四极杆质谱联用仪的结果相一致。
实施例4 DNA碱基烷基化修复定量检测
在含10％胎牛血清(FBS)、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中的斑马鱼肝细胞(1×107)0℃暴露于2mM硫酸二甲酯中30min。细胞分别在37℃培养0min，30min，60min后提取基因组。定量过程同实施例3。
图11显示细胞将近45％的烷基化损伤在60min内被修复。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用
<130> 2021
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
aaaaaaaaaa 10
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
tttttttttt tttttttttt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
gggggggggg gggggggggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
cccccccccc cccccccccc 20
<210> 8
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(61)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
caggtccatc gagtggtagg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
ntcgcactgc tcctgaacgt ac 82
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20

Claims (8)

1.一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过喷蜡打印机制备纸芯片器件；
(2)将具有3’-OH断裂损伤类型的待检测基因组DNA加入到纸芯片器件的反应区进行孵育干燥；
(3)孵育完成后，向纸芯片器件的反应区加入反应液，孵育一段时间后，加入乙二胺四乙酸终止反应，用PBS洗涤后，拍照检测荧光强度，以实现基因组DNA损伤位点数绝对定量检测；所述反应液为末端脱氧核苷酸转移酶与核酸标记荧光染料FITC-dUTP的混合溶液，其中核酸标记荧光染料FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待检测基因组DNA为碱基烷基化损伤的基因组DNA时，将碱基烷基化损伤的基因组DNA中加入人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶AAG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1后孵育，将碱基烷基化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA；待检测基因组DNA为碱基氧化损伤的基因组DNA时，将碱基氧化损伤的基因组DNA中加入8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶FPG和碱性磷酸酶CIAP后孵育，将碱基氧化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA；待检测基因组DNA为碱基脱氨基产生尿嘧啶损伤的基因组DNA时，将碱基脱氨基损伤的基因组DNA中加入尿嘧啶DNA糖基化酶UDG和人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶APE 1后孵育，将碱基氧化损伤的基因组DNA转化为具有3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中通过喷蜡打印机制备纸芯片器件的具体步骤为：通过喷蜡打印机在滤纸上打印圆形反应区，120～130℃加热2-3min使蜡融进滤纸中。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述滤纸包括Whatman Grade 1或Whatman Grade 5。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的孵育的条件为室温孵育5-10min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述末端脱氧核苷酸转移酶的浓度为<35nM，所述核酸标记荧光染料FITC-dUTP的浓度为>20μM。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中孵育的条件为室温孵育5-30min。
8.权利要求1-7中任一项所述的检测方法在定量检测3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA或修复的3’-OH断裂损伤类型的基因组DNA中的应用。
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