CN103276096A - 基于切刻内切酶恒温扩增技术的atp或nad的系统及检测方法 - Google Patents

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夏昆
陈汉春
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Abstract

本发明涉及一种基于切刻内切酶恒温扩增技术的ATP或NAD的系统及检测方法。分析使用的系统由分子信标核酸探针，核酸片段，切刻内切酶以及以ATP或NAD为辅酶的核酸连接酶在相应的缓冲溶液中组成；ATP的分析在无ATP的缓冲液中进行，NAD的分析在无NAD的缓冲液中进行，分析在相应的连接体系缓冲液中加入分子信标、连接酶、切刻内切酶和两条配对的核酸链，在37℃温育，监测荧光强度，待荧光稳定后加入待测的ATP或NAD，记录荧光强度的变化。本发明对辅酶ATP和NAD的检测分析快速、灵敏、准确、操作简单、投入少，具有重要的科学价值和广阔的市场前景，有较大的社会效益和经济效益。

Description

基于切刻内切酶恒温扩增技术的ATP或NAD的系统及检测方法
技术领域
本发明涉及到生物化学领域中的检测方法，具体涉及ATP与NAD检测系统和方法。
背景技术
三磷酸腺苷（ATP）存在于从微生物到高等动植物等生物体的细胞中，主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要能源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用；ATP含量的多少，可以直接反映细胞活性，细胞死亡后由于细胞内有ATP酶的存在，ATP迅速水解，因此测定内源性ATP的含量可以反映活细胞的数量；在体外测定经不同浓度化疗药物直接杀伤的培养肿瘤细胞中的ATP含量，即可判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。在环境分析方面，ATP含量的多少还可反映微生物的数量即污泥活性，检测微生物代谢产生的ATP已经成为化妆品、食品、药品等许多行业中生产商关注的焦点；另外细胞内的ATP还可作为上皮细胞的一个信号分子，在细胞死亡模式（凋亡或坏死）的辨别过程中起着非常重要的作用。传统上，ATP的检测方法有电泳法、高效液相色谱法、同位素示踪法和荧光素法等。在电泳法测定中，样品需经滤纸电泳分离，再利用紫外分光光度计进行比色，操作复杂，灵敏度也不够高；采用高效液相色谱法，仪器、试剂昂贵，操作过程繁琐；同位素示踪法中放射性同位素对人体有危害；荧光素法灵敏度较高，但同时存在首期投入大（需要购买相关仪器）以及操作和结果分析较传统的平板培养法复杂等缺点。
NAD作为目前已知的300多种脱氢酶的辅酶，存在于一切动物、植物和微生物的细胞中，是生物发酵、生命和生理过程参与能量代谢的一种重要物质。目前NAD、NADH的检测包括其相关酶的分析方法大都利用一些酶将NAD转化为NADH，然后利用NADH在360nm紫外光区有最大吸收建立了其紫外吸收光度法或利用NADH的荧光进行直接荧光测定，还有电化学方法、高效毛细管电泳法及高效毛细管电泳-电化学方法联用，但是文献报道的方法NAD的检测限一般仅为10-7M-10-8M，最近报道发展了NAD（H）流动注射分析方法，检测限才达1pmol，上述方法的检测线性范围一般在两个数量级左右。上述方法灵敏度不够，使得对微小体系及极微量体系的分析受到了限制；同时容易受其它物质的干扰，不利于生物活体分析。
因此，建立快速、灵敏和准确的ATP与NAD分析方法不仅有助于推动生命过程的研究，同时对于临床诊断、药物分析等领域也有着重要的实际意义。
发明内容
本发明旨在发展一种快速高灵敏的ATP或NAD的检测系统和方法，以解决当前分析方法存在的灵敏度不高及操作复杂等问题。为它们的分析及应用提供了一种全新的途径。
基于切刻内切酶恒温扩增技术的ATP或NAD的系统，该系统由尾部一端带有荧光标记、另一端带有荧光标记或者荧光熄灭基团的分子信标核酸探针，与分子信标环部配对的两个核酸片段、DNA或RNA核酸连接酶、以及切刻内切酶在缓冲溶液中组成。
检测ATP的体系配制如下：在含有66mM pH8.0的Tris-HCl、6.6mM MgCl2和10mM DTT的100μL反应缓冲液中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTCTGA GTG CAT TCC AGT ACG GAGAGG-(DABCYL)（DABCYL：荧光熄灭基团4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸）-3'、1.4U的T4DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶,200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGTACT GGA-3'；
检测NAD的体系配制如下：在含有30mM pH8.0Tris-HCl、2.5mM CaCl2、5mM DTT、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05﹪BSA的100μL反应缓冲液中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTC TGA GTG CAT TCC AGT ACG GAGAGG-(DABCYL)-3'、6.0U的E.coli DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶，200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT ACT GGA-3'。
采用所述的系统检测ATP或NAD的方法：
将缓冲体系在37℃温育，同时监测荧光强度，待荧光稳定后加入ATP或NAD样品，观察并记录荧光强度的变化。
荧光检测所用波长根据分子信标修饰的荧光染料来选择，激发波长为338-560nm,发射波长为500-660nm。
本发明提出了一种基于切刻内切酶循环放大检测ATP或NAD的方法，此方法设计简单，灵敏度高，特异性强。与常规分析方法相比，ATP检测灵敏度提高了2-3个数量级，NAD检测灵敏度提高了3-4个数量级。该方法可望为临床诊断、药毒物分析、食品及环境监测等提供一个通用技术平台。
下面结合附图和具体实施方式详述本发明，不会限制本发明。
附图说明
图1为本发明的检测方法的原理图；
图2为本发明检测ATP的实验结果；
图3为本发明检测ATP选择性的实验结果；
图4为本发明检测NAD的实验结果；
图5为本发明检测NAD选择性的实验结果。
如图1所示意，本发明的检测体系由分子信标、两条核酸片段、核酸连接酶、以及切刻内切酶所组成，其中两条核酸片段分别与分子信标环状部分的一半杂交。当ATP或NAD存在时，核酸连接酶将两条核酸片段连接形成一长链的连接产物，该连接产物与分子信标环部的杂交将分子信标打开，产生明显的荧光信号；同时，连接后形成切刻内切酶位点，切刻内切酶特异性切割分子信标链，切割后的分子信标两部分片段与未切割的完整的分子信标相比，解链温度低，在切刻内切酶酶切反应温度下会与连接的产物片段分离，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的产物片段杂交，形成新一轮的切刻内切酶切割循环，这一过程使荧光信号逐渐增强，这样就实现了对ATP或NAD的酶循环放大高灵敏检测。
具体实施方式
实施例1（ATP分析检测）
在100μL反应缓冲液（66mM Tris-HCl(PH8.0)、6.6mM MgCl2、10mM DTT）中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTC TGA GTG CAT TCC AGT ACG GAGAGG-(DABCYL)-3'、1.4U的T4DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶,200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT ACT GGA-3'，在37℃温育，同时用荧光仪F-2500监测荧光强度，激发波长521nm，发射波长578nm，待荧光稳定后加入不同浓度的ATP，得到荧光强度实时扫描曲线。将连接初速度对ATP浓度作图得到图2，从图中数据得到ATP检测下限为0.05nM，线性分析范围为0.05-10nM。
该方法的选择性考察是在上述缓冲液中分别加入10nM的ATP、UTP、GTP、CTP、ADP和AMP，记录样品的荧光强度变化，分别求得各个样品的荧光增强初速度，再以ATP样品为基准作归一化处理，结果如图3所示，UTP、GTP、CTP、ADP和AMP等都没有明显荧光增强信号，该方法具有很高的选择性。
荧光检测所用波长根据分子信标修饰的荧光染料来选择（见表1）。
表1.常用荧光染料及其最大吸收和发射波长
Figure BDA00003322597200061
注：为避免激发光对发射光的影响，在具体测量时根据实际情况适当调整。
实施例2（NAD分析检测）
在100μL反应缓冲液（30mM Tris-HCl（PH8.0）、2.5mM CaCl2、5mM DTT、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05﹪BSA）中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTC TGA GTG CAT TCC AGT ACG GAGAGG-(DABCYL)-3'、6.0U的E.coli DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶，200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT ACT GGA-3'，在37℃温育，同时用荧光仪F-2500监测荧光强度，激发波长521nm，发射波长578nm，待荧光稳定后加入不同浓度的NAD，得到荧光强度实时扫描曲线。将连接初速度对NAD浓度作图得到图4，从图中数据得到NAD最低检测浓度为3×10-11M（S/N=3），与文献比较提高3-4个数量级；最低检测量为3×10-15mol，检测线性范围为0.04-6nM。
该方法的选择性考察是在上述缓冲液中分别加入6nM的NAD、NADH、NADP、NADPH和ATP，记录样品的荧光强度变化，分别求得各个样品的荧光增强初速度，再以NAD样品为基准作归一化处理，结果如图5所示，除加入NADH有少量荧光增强外，NADP、NADPH和ATP等都没有明显荧光增强信号，该方法具有很高的选择性。
Figure IDA00003322598000011

Claims (4)

1.基于切刻内切酶恒温扩增技术的ATP或NAD的系统，其特征在于，该系统由尾部一端带有荧光标记、另一端带有荧光标记或者荧光熄灭基团的分子信标核酸探针，与分子信标环部配对的两个核酸片段、DNA或RNA核酸连接酶、以及切刻内切酶在缓冲溶液中组成。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，检测ATP的体系配制如下：在含有66mM pH8.0的Tris-HCl、6.6mM MgCl2和10mM DTT的100μL反应缓冲液中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTC TGA GTG CAT TCC AGT ACGGAGAGG-(DABCYL)-3'、1.4U的T4DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶,200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT ACTGGA-3'；
检测NAD的体系配制如下：在含有30mM pH8.0Tris-HCl、2.5mM CaCl2、5mM DTT、10mM MgCl2、1.2mM EDTA和0.05﹪BSA的100μL反应缓冲液中加入300nM分子信标5'-(TAMRA)–CCTCTC TGA GTG CAT TCC AGT ACG GAGAGG-(DABCYL)-3'、6.0U的E.coli DNA连接酶，4U的Nb.Bsm I切刻内切酶，200nM核酸片段5'-ATG CAC TC-3'和200nM另一核酸片段5'-CGT ACT GGA-3'。
3.采用权利要求1或2所述的系统检测ATP或NAD的方法，其特征在于：
将缓冲体系在37℃温育，同时监测荧光强度，待荧光稳定后加入ATP或NAD样品，观察并记录荧光强度的变化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，荧光检测所用波长根据分子信标修饰的荧光染料来选择，激发波长为338-560nm,发射波长为500-660nm。
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