CN110609020A

CN110609020A - 基于回文分子信标检测atp的生物传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110609020A
Application number: CN201910754057.3A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 李莎莎; 刘素; 黄加栋; 徐艺城; 张儒峰; 赵一菡; 瞿晓南; 孙文玉; 王业茹
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110609020B

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于回文分子信标检测三磷酸腺苷（ATP）的生物传感器，包括回文分子信标MB、ATP适配体（劈开的适配体探针AP1、AP2）、目标物ATP、Bst DNA聚合酶、UDG、核酸内切酶IV和缓冲液；基于核酸适配体与目标物的特异性识别，从而使两个劈开的适配体片段尾部序列邻近，将回文分子信标MB的发夹结构打开产生荧光，与此同时预锁定的回文序列被释放，进行分子间的杂交，从而触发自发聚合、修复、内切、循环过程，实现荧光信号的放大，从而构建了适体生物传感器，该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点。

Description

基于回文分子信标检测ATP的生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于回文分子信标检测ATP的生物传感器，还涉及其制备方法和应用。

背景技术

三磷酸腺苷（ATP）存在于从微生物到高等动植物所有的生物体中，是细胞的主要能量来源，在细胞内新陈代谢、合成和生物化学过程中起着重要作用。ATP在体内含量并不高，在细胞中摩尔浓度通常为1-10 mM，死亡的细胞将不能检测到ATP，癌细胞的ATP代谢特别活跃。通常，异常的ATP浓度与许多疾病密切相关，如低血糖、心血管病、帕金森、组织缺氧等。因此，迅速而准确地测定ATP，对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程、进行药物敏感实验以及相关的疾病分析具有非常重要的意义。

目前，常用的ATP检测方法包括质谱，高效液相色谱等，这些方法往往存在工序繁琐、分析周期长、设备昂贵、检测费用高等问题，远远不能满足ATP检测方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，急需建立一种快速、准确、简便且特异性高的ATP检测方法。近几年，DNA生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注。其中，荧光技术的基础理论研究日益成熟，它在生物学、医学等领域中所扮演的角色越来越重要。相对于其他几种光学检测手段，荧光技术具有显著的优势，如灵敏度高、特异性强、价格低廉、无需样品预处理等。

发明内容

为了解决以上现有技术中检测ATP的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种基于回文片段介导的双向酶修复放大的荧光生物传感器用于检测ATP。目标物ATP与适配体的特异性识，使两个劈开的适配体片段邻近，从而激发后续的双向酶修复放大反应，具有一定的特异性；回文片段的引入实现了双向酶修复放大，提高灵敏度的同时降低了背景信号，此外该生物传感器还有成本低、检测速度快等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测ATP的生物传感器，包括回文分子信标MB、ATP适配体AP1、ATP适配体AP2、目标物ATP、Bst DNA聚合酶、UDG、dNTPs、核酸内切酶IV和缓冲液；

所述的dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dUTP；

所述的AP1碱基序列如SEQ No.1所示；

所述的AP2碱基序列如SEQ No.2所示；

所述的MB碱基序列如SEQ No.3所示。

上述的检测ATP的方法，包括以下步骤：

（1）均相反应：将ATP、缓冲液、AP1、AP2、MB、Bst DNA聚合酶、UDG、dNTPs、核酸内切酶IV，混和均匀后孵育；

（2）荧光仪检测荧光强度。

所述的步骤（1）均相反应操作步骤如下：

将AP1、AP2、MB、Bst DNA聚合酶、UDG、核酸内切酶IV、缓冲液和ATP加入离心管中，震荡30s，于50℃下水浴90 min。

优选地，所述的步骤（1）均相反应操作步骤如下：

将AP1、AP2、MB、Bst DNA聚合酶、UDG、核酸内切酶IV、dNTPs、缓冲液、ATP，混合震荡30s，于50℃下水浴90 min。

所述的步骤（2）荧光仪设置的激发波长为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm。

上述生物传感器在药物敏感实验中检测微量ATP。

上述生物传感器在食品卫生监控中检测微量ATP。

AP1: 5’-ACCTGGGGGAGTATGCAAGTAGAACGAA-3’

AP2: 5’-AGAGAGCGCCTTGCTGCGGAGGAAGGT-3’

MB:5’-TTCGTTCTGCGCTCTCTAGCCCTCCTTCTGTCCTTCTTCTTCCGTGAGAGCGCTC-3’。

本申请的机理为：

其中回文分子信标MB下划线部分是回文序列，黑色加粗字体部分(T1)是与劈开的适配体AP1、AP2黑色加粗字体部分互补的序列，黑色斜体部分(T1^＊)的互补序列（T1）能够打开MB。当目标物存在时，目标物和适配体特异性识别，使AP1和AP2尾部序列邻近，从而将MB的发夹结构打开，产生荧光。与此同时预锁定的回文序列被释放，进行分子间的杂交，在BstDNA聚合酶、UDG及核酸内切酶IV的辅助下以MB为模板，以邻近的AP1和AP2尾部序列为引物，进行DNA链的延长、修复、内切，从而实现AP1、AP2复合体的循环，同时产生大量的T1、T2（T2^＊的互补序列），产生的T1、T2序列又可进一步打开MB，进行下一个循环，通过上述无限次循环实现指数放大，实现荧光信号的放大。从而通过测量荧光强度来定量检测ATP。

该发明的检测方式是荧光法检测，通过邻近作用，将MB的发夹结构打开，使得荧光和猝灭基团远离，使得荧光强度的显著增强。通过检测溶液的荧光强度进行目标物的检测。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，从而使两个劈开的适配体片段尾部序列邻近，将回文分子信标MB的发夹结构打开产生荧光，与此同时预锁定的回文序列被释放，进行分子间的杂交，在Bst DNA聚合酶、UDG及核酸内切酶IV的辅助下，进行DNA链的延长、修复、内切，从而实现AP1、AP2复合体的循环，同时产生大量的T1、T2，产生的T1、T2序列又可进一步打开MB，进行下一个循环，实现荧光信号的放大，从而构建了适体生物传感器。该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点，可以弥补ATP现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明中ATP的检测是在均相溶液中实现的，通过Bst DNA聚合酶、UDG和核酸内切酶IV的配合实现三循环，使得信号放大，从而实现ATP的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

本发明的有益效果：

1、检测限低

利用核酸适配体的特异性识别实现了对目标物ATP的高特异性检测；利用ATP对两个适配体的拉近作用，实现了目标物的循环利用，起到了第一步信号增大的作用；利用Bst DNA聚合酶的功能，实现了邻近链的循环利用，起到了第二步信号放大的作用；利用UDG与核酸内切酶IV的共同作用，产生大量的T1、T2，提高了检测的灵敏度，实现对目标物ATP的超灵敏性检测，检测限为1 pM 。

2、方法简单，性能稳定

该传感器的构建仅需一步，有效地避免了多步加入样品可能带来的污染，同时具有操作简便、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

3、可工业化生产

制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。适用于痕量ATP的检测和生物传感器产业化的实际应用。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1 MB浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 UDG浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 反应温度优化检测结果图

图5为实施例4 反应时间优化检测结果图。

图6为实施例5 传感器检测ATP的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将AP1（3μL，1μM），AP2（3μL，1μM），MB（终浓度分别为1.0μM，1.5μM，2.0μM，2.5μM，3.0μM），Bst DNA聚合酶（0.8U），UDG（0.8U），核酸内切酶IV（0.8U），dNTPs（3μL），缓冲液（3 μL）和3 μL ATP（100 nM）加入离心管中，震荡30s，于50℃下水浴90 min。

b、将a步反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在518 nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为486nm，发射波长为518nm，检测范围500 nm-650 nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。

2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着MB的浓度增大而增大，当浓度超过2.0 μM后，荧光强度趋于稳定。所以MB的最佳终浓度为2.0 μM。

实施例2

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将AP1（3μL，1μM），AP2（3μL，1μM），MB（3μL，10μM），Bst DNA聚合酶（0.8U），UDG（0.2U，0.4 U，0.6U， 0.8U，1.0 U，1.2U），核酸内切酶IV（0.8U），dNTPs（3μL），缓冲液（3 μL）和3 μLATP（100 nM）加入离心管中，震荡30s，于50℃下水浴90 min。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着UDG的浓度增大而增大，当浓度超过0.8 U后，荧光强度趋于稳定。所以UDG的最佳终浓度为0.8U。

实施例3

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将AP1（3μL，1μM），AP2（3μL，1μM），MB（3μL，10μM），Bst DNA聚合酶（0.8U），UDG（0.8U），核酸内切酶IV（0.8U），dNTPs（3μL），缓冲液（3 μL）和3 μL ATP（100 nM）加入离心管中，震荡30s，于35 ℃，40℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃，60℃下水浴90 min。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应温度增大而增大，当反应温度超过50 ℃后，荧光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应温度为50 ℃。

实施例4

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将AP1（3μL，1μM），AP2（3μL，1μM），MB（3μL，10μM），Bst DNA聚合酶（0.8U），UDG（0.8U），核酸内切酶IV（0.8U），dNTPs（3μL），缓冲液（3 μL）和3 μL ATP（100 nM）加入离心管中，震荡30s，于50℃下水浴45 min，60min，75 min，90 min，105 min，120min。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果见图5，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应时间的延长而增大，当反应时间超过90 min后，荧光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应时间为90 min。

实施例5

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将AP1（3μL，1μM），AP2（3μL，1μM），MB（3μL，10μM），Bst DNA聚合酶（0.8U），UDG（0.8U），核酸内切酶IV（0.8U），dNTPs（3μL），缓冲液（3 μL）和3 μL ATP（0，1×10^-3 nM，1×10^-2 nM，1×10^-1 nM，1nM，10 nM，100 nM）加入离心管中，震荡30s，于50 ℃下水浴90 min。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

结果见图6，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着ATP浓度的增大而增大，当浓度超过100 nM后，荧光强度趋于稳定。所以ATP的最佳终浓度为100 nM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之。

序列表

<110> 济南大学

<120> 基于回文分子信标检测ATP的生物传感器及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

acctggggga gtatgcaagt agaacgaa 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

agagagcgcc ttgctgcgga ggaaggt 27

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

ttcgttctgc gctctctagc cctccttctg tccttcttct tccgtgagag cgctc 55

Claims

1.一种检测三磷酸腺苷ATP的生物传感器，其特征在于，包括回文分子信标MB、ATP适配体AP1、ATP适配体AP2、目标物ATP、Bst DNA聚合酶、UDG、dNTPs、核酸内切酶IV和缓冲液；

所述的dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dUTP；

所述的AP1碱基序列如SEQ No.1所示；

所述的AP2碱基序列如SEQ No.2所示；

所述的MB碱基序列如SEQ No.3所示。

2.权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）荧光仪检测荧光强度。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）均相反应操作步骤如下：

4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）荧光仪设置的激发波长为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围500 nm-650 nm。

5.权利要求1所述的生物传感器在药物敏感实验中检测微量ATP。

6.权利要求1所述的生物传感器在食品卫生监控中检测微量ATP。