CN105203515A - 一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光生物传感器的制备方法及其应用，使用携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光作用，利用G-四连体和铜纳米粒子之间产生光诱导电子转移使铜纳米粒子的发光产生猝灭的现象，制备出基于携带胸腺嘧啶DNA为模板的铜纳米粒子与光诱导电子转移体系构建荧光传感器，利用目标(HBV基因)和探针结合形成结构紧凑的体系拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离的原理，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。

Description

一种荧光生物传感器的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于荧光传感器制备技术领域，具体涉及一种荧光生物传感器的制备方法及其应用，是一种基于无标记的携带聚胸腺嘧啶的单链DNA为模板的铜纳米粒子与目标调节的光诱导电子转移体系构建的荧光生物传感器，在检测HBV基因的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，可通过血液、精液和其他体液进行传播，是全球最常见的传染性很强传染病之一，可能会导致慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。
全世界大约有二十亿人已经感染此病毒,大约有3.5亿人处于感染阶段，各国均面临由HBV病毒感染引发的挑战和威胁，早期诊断HBV基因带来的致命性突变显得尤为紧迫。
目前对于HBV基因在实际样品中的检测多涉及复杂和耗时冗长的检测过程，或是涉及到外部荧光信号分子的标记，因此开发高选择性、高灵敏性、简单无标记的荧光生物传感器检测HBV基因至关重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光生物传感器的制备方法，基于无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目标调节的光诱导电子转移构建的荧光生物传感器，利用无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA模板，产生铜纳米粒子发光体，构建由HBV基因调节的光诱导电子转移的荧光传感器。
本发明还提供了一种荧光生物传感器的应用，利用制备的荧光生物传感器，不同浓度的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。
本发明提供的一种荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将ssDNA溶液加入缓冲溶液中、然后加入HBV基因溶液，一段时间后，加入hemin(血晶素)溶液和KCl溶液，培养，得到混合溶液；
(2)、在步骤(1)制备的混合溶液中，加入CuSO4溶液和抗坏血酸钠溶液，培养10分钟，利用ssDNA上的探针和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。
步骤(1)中体积比ssDNA溶液：缓冲溶液：HBV基因溶液：hemin溶液：KCl溶液＝2:160:2:1:10。
进一步的，步骤(1)具体为：将2μL的ssDNA溶液加入160μL的10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，然后加入2μLHBV基因溶液，5min后，加入1μL的hemin溶液和10μL的KCl溶液，培养，得到混合溶液；
进一步的，所述培养的条件为37℃培养2h。
进一步的，所述ssDNA溶液制备方法为：将ssDNA序列溶解在10mMMOPSPH＝7.6的缓冲溶液中，ssDNA基因序列的浓度为500nM。
进一步的，所述ssDNA序列为携带聚胸腺嘧啶的单链DNA序列：GGGTTGGG-polyT30-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACTGGGTAGGG，其中含有polyT30、被拆分成两部分的G4序列和探针序列：TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT；所述polyT30是由30个T碱基构成的DNA序列。
进一步的，步骤(1)中所述hemin溶液浓度为1.0μM溶液；所述KCl溶液浓度为50mM。
进一步的，步骤(2)具体为：在步骤(1)制备的混合溶液中，加入10μL的CuSO4溶液和240μL抗坏血酸钠溶液，培养，利用ssDNA上的探针部分会和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。
进一步的，步骤(2)中所述培养，为20℃培养5min。
进一步的，步骤(2)中所述CuSO4溶液浓度为10mM、所述抗坏血酸钠溶液浓度为100mM。
本发明提供的一种荧光生物传感器的应用，检测HBV基因的应用。
进一步的，检测HBV基因的应用，具体为：利用制备的荧光生物传感器，不同浓度的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对荧光生物传感器灵敏性、特异性的检测。
本发明提供的无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目标调节的光诱导电子转移构建的荧光生物传感器，可应用于HBV基因的检测。本发明使用携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光作用，利用G-四连体和铜纳米粒子之间产生光诱导电子转移使铜纳米粒子的发光产生猝灭的现象，制备出基于携带胸腺嘧啶DNA为模板的铜纳米粒子与光诱导电子转移体系构建荧光传感器，利用目标(HBV基因)和探针结合形成结构紧凑的体系拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离的原理，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。
与现有技术相比，本发明提供的荧光传感器的制备方法，使用的是无标记的DNA,操作简单，成本很低，避免任何化学标记和修饰。通过G-四连体和铜纳米粒子之间的光诱导电子转移作用，能够制备出检测HBV基因的传感器。结果显示此传感器对HBV基因1到500mM有灵敏的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低。
附图说明
图1A为实施例1制备的发荧光的CuNPs和G-四连体荧光猝灭示意图；
图1B为ssDNA/铜纳米粒子和G-四连体在目标调节下光诱导电子转移检测HBV基因的示意图；
图2A为ssDNA/铜纳米粒子的紫外吸收可见图；
图2B为ssDNA/铜纳米粒子的荧光发射光谱；
图2C为荧光发射光谱对应时间关系；
图2D为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜；
图2E为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜结果的统计；
图3A为PolyT30/铜纳米粒子(a)在加入hemin(b)和加入G4(c)及共同加入这两种物质(d)的猝灭现象；
图3B根据图3A构建的柱状图；
图4A为血晶素的紫外可见吸收光谱；
图4B为在血晶素存在的情况下，polyT30/铜纳米粒子和富鸟嘌呤序列的DNA的可见吸收光谱；
图4CpolyT30/铜纳米粒子/玻碳电极在磷酸缓冲溶液(PBS)里的循环伏安(CV)图；
图4D生成后的辣根过氧化物酶/玻碳电极在磷酸缓冲溶液(PBS)里的循环伏安(CV)图；
图4E为polyT30/铜纳米粒子在没有(a)和有富鸟嘌呤序列的DNA和血晶素(b)存在时的荧光寿命；
图5A为在形成G-四连体以后ssDNA/铜纳米粒子的荧光猝灭了(b),在形成G-四连体之前加入HBV基因荧光没有猝灭(a)，若在形成G-四连体之后加入HBV基因(d)的荧光强度。
图5B为电化学研究，关于：ssDNA/铜纳米粒子没有加入HBV基因后，加入G4和hemin形成了形成具有辣根过氧化酶的催化过氧化氢性质(b)和加入HBV基因阻碍G-四连体的形成因而无催化过氧化氢的性质(a)；
图6A为不同浓度HBV基因对应荧光光谱；
图6B为不同浓度HBV基因对应荧光强度；
图6C为荧光强度与不同HBV基因浓度线性关系；
图6D为选择性的检测(在完全互补配对和1错配2错配3错配及全部错配的荧光强度)；
图6E为在实样中的检测(在人血清中加入标液和体外加标液的五组浓度对比)。
具体实施方式
实施例1
验证G-四连体可以猝灭CuNPs：
a、取1μL的polyT30溶液加入到80μL的10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，再加入5μL的CuSO4溶液(10mM)和120μL抗坏血酸钠的溶液(100mM)，得到混合溶液1，得到发荧光的CuNPs，检测荧光强度；
所述polyT30溶液的制备方法为：将polyT30溶解到10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，使polyT30序列终浓度为500nM。
b、取1μL的G4溶液(500nM)和0.5μL的hemin溶液(1.0μM)及5μL的KCl溶液(50mM)到200μL的MOPS(10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中)中，37℃的干燥箱里培养2小时后，得到混合溶液2；(G4基因序列和hemin和K+一起混合形成G-四连体结构，G-四连体也就是辣根过氧化物酶，它具有催化辣根过氧化物的作用。)
所述G4溶液制备方法为：将G4基因序列溶解在10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，G4基因序列终浓度为500nM；G4序列：TTGGGTAGGGCGGGTTGGG。
c、将步骤a制备的混合溶液1与步骤b制备的混合溶液2混合，放10min后，检测荧光强度，明显衰减，证明G-四连体形成的辣根过氧化物酶混合物可以猝灭CuNPs。
制备ssDNA/CuNPs-HRP-DNAzyme(铜纳米粒子辣根过氧化物酶)体系：
取2μL的ssDNA溶液加入到160μL的MOPS(10mM(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中)中，再加入1μL的hemin溶液(1.0μM)和10μL的KCl溶液(50mM)在37℃的干燥箱里培养2小时；继续加入10μL的CuSO4溶液(10mM)和240μL抗坏血酸钠(100mM)的溶液，20℃培养5分钟，得到ssDNA/CuNPs-HRP-DNAzyme(铜纳米粒子辣根过氧化物酶)体系的混合物。
所述ssDNA溶液制备方法为：将ssDNA序列溶解在10mMMOPSPH＝7.6的缓冲溶液中，ssDNA序列的浓度为500nM。
ssDNA序列中的G4基因和hemin和K离子形成G-四连体结构，同时，ssDNA基因序列中的polyT30与CuSO4溶液和抗坏血酸钠形成发荧光的CuNPs,G-四连体结构可以猝灭发荧光的CuNPs。因此，制备得到的体系没有荧光。
一种荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将2μL的ssDNA溶液(500nM)加入到160μL10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，然后加入2μLHBV基因溶液，5min后，加入1μL的hemin溶液(1.0μM)和10μL的KCl溶液(50mM)混合，在37℃的干燥箱里培养2小时，得到混合溶液；
(2)、在步骤(1)制备的混合溶液中，加入10μL的CuSO4溶液和240μL抗坏血酸钠溶液，20℃培养5min，利用ssDNA上的探针部分会和HBV基因碱基互补配对，阻碍铜纳米粒子和一半G-四连体之间的光诱导电子转移作用，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。
由于步骤(1)中，HBV基因会和ssDNA中探针部分碱基互补配对，刚性结构就阻碍的G-四连体的形成，从而阻碍了荧光猝灭，ssDNA中polyT30与CuSO4溶液和抗坏血酸钠形成发荧光的CuNPs，可以测得荧光强度。
一种荧光生物传感器的应用，检测HBV基因的应用。
HBV基因序列：ATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCA，
具体检测方法为：
(1)、将2μL的ssDNA溶液(500nM)，分别加入2μL浓度梯度的HBV基因溶液，5min后，加入1μL的hemin溶液(1.0μM)和10μL的KCl溶液(50mM)混合在10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，在37℃的干燥箱里培养此混合溶液2小时，得到混合溶液；
所述浓度梯度的HBV基因溶液的制备方法为：
HBV基因序列溶解在10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，配置成0,1,10,50,100,200,500,1000,2000,4000,6000nM的HBV基因溶液。
(2)、在步骤(1)制备的混合溶液中，加入10μL的CuSO4溶液、240μL抗坏血酸钠溶液，20℃培养5min，测荧光强度。
HBV基因和ssDNA上的探针部分形成一个结构紧凑的体系，拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离，从而使光诱导电子转移的现象不能发生。随着HBV基因浓度的增加，铜纳米粒子的荧光强度会逐渐变强，构建不同HBV基因浓度与荧光强度的线性关系，对不同浓度的HBV基因进行定量检测。
相同条件下，对比其他检测HBV基因的方法，结果如表1
表1
探针合成 信号 检测极限 线性范围 参考文献
双标记 碳量子点 4nM 20-500nM 1
单标记 分子信标 10nM Not mentioned 2
无标记 纳米孔 10pM 100pM-50nM 3
无标记 银纳米簇 14nM 25-1000nM 4
双标记 纳米球 84pM 0.5-10nM 5
无标记 银纳米簇 0.97nM 4-625nM 6
无标记 本实验 0.3nM 1-500nM
本发明试验检测的回收率如下表2
表格2
样本 加入量(n M) 重现(n M) 回收(％) 相对误差(％,n＝3)
1 10 9.670 96.70 4.8
2 50 49.26 98.52 2.8
3 100 101.4 101.4 5.5
上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)、将ssDNA溶液加入缓冲溶液中、然后加入HBV基因溶液，一段时间后，加入hemin溶液和KCl溶液，培养，得到混合溶液；
(2)、在步骤(1)制备的混合溶液中，加入CuSO4溶液和抗坏血酸钠溶液，培养10分钟，利用ssDNA上的探针和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。
2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中体积比ssDNA溶液：缓冲溶液：HBV基因溶液：hemin溶液：KCl溶液＝2:160:2:1:10。
3.根据权利要求1或2所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将2μL的ssDNA溶液加入160μL的10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液中，然后加入2μLHBV基因溶液，5min后，加入1μL的hemin溶液和10μL的KCl溶液，培养，得到混合溶液。
4.根据权利要求1或3所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃培养2h。
5.根据权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述hemin溶液浓度为1.0μM溶液；所述KCl溶液浓度为50mM。
6.根据权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体为：在步骤(1)制备的混合溶液中，加入10μL的CuSO4溶液和240μL抗坏血酸钠溶液，培养，利用ssDNA上的探针部分会和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。
7.根据权利要求1或6所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养，为20℃培养5min。
8.根据权利要求1或6所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述CuSO4溶液浓度为10mM、所述抗坏血酸钠溶液浓度为100mM。
9.一种权利要求1-8任一项所述的荧光生物传感器的应用，其特征在于，检测HBV基因的应用。
10.根据权利要求9所述的荧光生物传感器的应用，其特征在于，应用方法具体为：利用制备的荧光生物传感器，不同浓度的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对荧光生物传感器灵敏性、特异性的检测。
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