CN109097491B

CN109097491B - 一种基于检测hiv基因的荧光探针

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Publication number: CN109097491B
Application number: CN201810834811.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡昌群; 杨军玉; 龚行; 韩云鹏
Original assignee: Xiangtan University
Current assignee: Xiangtan University
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN109097491A

Abstract

本发明涉及一种基于检测HIV基因的荧光探针。该探针包含两种核酸链：一种是与目标物HIV‑DNA互补结合链(cDNA)；另一种是荧光探针的合成链(P)。聚AT的双链DNA(dsDNA)中包含富G序列，富G序列在K⁺等作用下可折叠成G‑四链体。无目标物时，富G序列被cDNA锁住，不能形成G‑四链体，因此合成的铜纳米粒子表现较弱的荧光信号。加入目标物后，目标物可以将cDNA竞争下来，释放出富G序列形成G‑四链体，从而点亮铜纳米粒子的荧光。随着加入的目标物增多，生成的G‑四链体也会越来越多，对铜纳米粒子的作用也就更大，荧光强度也会升高，因此，荧光强度的变化即可反映出目标物浓度的变化。此发明中检测限为130pM。

Description

一种基于检测HIV基因的荧光探针

技术领域

本发明涉及一种基于检测HIV基因的荧光探针，属于分子检测领域。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染并破坏宿主的免疫系统时，免疫系统的功能会逐渐丧失并伴随着许多疾病的发生，严重时还会导致死亡。因此，精确的检测HIV基因对于感染者的及早发现与及时治疗具有重要的意义。

目前，HIV基因的检测方法层出不穷，但还存在一些不足之处，例如，比色法灵敏度较低。电化学法重现性、选择性差，，其应用受到限制。传统荧光法一般需要将探针链两端标记，或者利用荧光共振能量转移(FRET)机理使染料基团发生荧光淬灭。该方法实验体系复杂，费用昂贵。后来，Werner等人发现当AgNCs在接近富含鸟嘌呤(G-rich)的DNA序列时，两者会相互作用，AgNCs较弱的荧光会出现明显增强[Yeh,H.C.；Sharma,J.；Han,J.J.；Martinez,J.S.；Werner,J.H.Nano Lett.2010,10,3106-3110]。这个重要的发现被不断改进，并得到了广泛的应用。然而，该方法一般需要较长的合成时间且需要暗室操作，使其应用受到了严重的限制。本方案发展了一种可解决Werner等人提出的方法所存在的合成时间长、合成条件苛刻等问题。本方案是使用对光稳定的铜纳米粒子替代AgNCs作为检测HIV基因的荧光探针，快速简便且免标记的实现了HIV基因的灵敏检测。

发明内容

本发明的目的在于设计一种简单经济、操作方便的荧光生物探针，高灵敏、高选择性的实现特定HIV基因的检测。

为了实现上述目的，本发明设计了一种双G-四链体点亮铜纳米粒子的荧光探针来检测HIV基因：

(1)荧光探针的制备：

将0.5μM含有聚AT的dsDNA和1μM cDNA加入到10mM的MOPS缓冲液中(150mM NaCl，pH 7.5)。将混合溶液在90℃恒温水浴锅中加热约10分钟，然后缓慢冷却至室温。然后在杂交产物中混入500μM CuSO₄和2mM L-抗坏血酸(AA)，继而在25℃水浴锅中孵育5分钟即可形成。

(2)荧光实验检测方法：

所有的检测实验在10mM的MOPS缓冲液中进行(150mM NaCl，pH 7.5)。在最佳优化条件下，40μL的dsDNA(0.5μM)和40μL的cDNA(1μM)混合在一起，然后在90℃水浴下加热10min后冷却至室温，AA(2mM)和硫酸铜(500μM)加入后开始孵育。随后，将各种浓度的HIV-DNA加入上述溶液反应30min，最后加入20μL的K⁺使最终体积达到200μL。反应60min后，记录荧光强度。

进一步的，检测仪器设置为，激发波长：340nm，发射波长：550nm；激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：10.0nm。

通过荧光光谱法，测得其对HIV基因的检出限为130PM。

附图说明

【图1】为本发明的检测目标物方法的工作原理图。

【图2】为荧光光谱可行性分析图。

【图3】为圆二色谱表征图。

【图4】为紫外-可见光谱可行性分析图。

【图5】为实验条件优化图。

【图6】为荧光光谱图。

【图7】为线性关系图。

【图8】为选择性验证图

【图9】为人血清样品的加标回收率表。

【图10】为本实验中所需的探针序列

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1

一种基于检测HIV基因的荧光探针的原理设计

如图1所示，该探针包含两种核酸链：一个是与目标物HIV-DNA互补结合链，在这项工作中被指定为“cDNA”。另一种是荧光探针的合成链，命名为“P”，聚AT的dsDNA中一部分包含了丰富的鸟嘌呤序列，在K⁺等作用下可折叠成G-四链体。起初，cDNA与富G序列通过碱基错配而不能折叠，序列成锁住状态。在无目标物的情况下，G-四链体不发挥作用，因此合成的铜纳米粒子表现较弱的荧光信号。当加入目标物后，目标物HIV-DNA可以将cDNA竞争下来，从而释放出的富G序列就可以折叠成G-四链体，G-四链体具有点亮铜纳米粒子荧光的能力。随着加入的目标物越来越多，释放的G-四链体也会越来越多，对铜纳米粒子的作用也就更大，荧光就会随着HIV-DNA的加入而升高。因此，荧光强度的变化即可影射出目标物的变化，并通过公式可计算出最低检测限。

实施例2

一种基于检测HIV基因的荧光探针的可行性测定

(1)荧光光谱测试

测试环境在10mM的MOPS缓冲液中进行(150mM NaCl，pH 7.5)。最佳优化条件下，40μL的dsDNA(0.5μM)和40μL的cDNA(1μM)混合在一起。在90℃水浴加热10分钟后冷却至室温，AA(2mM)和硫酸铜(500μM)加入后开始孵育。随后，各种浓度的HIV-DNA进入溶液反应30分钟，20μL的K⁺最后加入使最终体积达到200μL。最后，反应60分钟后记录荧光强度。检测条件：激发波长：340nm，发射波长：550nm；激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：10.0nm。如图2所示，由下至上，当只对dsDNA-CuNPs的荧光进行分析时，得到了一种微弱的荧光强度。当加入钾离子时，荧光强度基本没有变化，这表明cDNA已经比较稳固的锁定了富G序列。当目标物和K⁺同时加入到溶液中时，荧光强度显著增加。这表明HIV-DNA成功竞争cDNA，并释放富G序列，富G序列在钾离子的存在下折叠成G-四链体，从而增强了dsDNA-CuNPs的荧光强度。因此，可以证明我们的策略是合理的。

(2)圆二色谱(CD)测定

圆二色谱在CD旋光仪上进行表征(Chirascan，Applied Photophysics，UK)。在MOPS(10nM的MOPS，150mM NaCl，pH 7.5)缓冲溶液中制备一组cDNA/探针双螺旋杂交链(2μM)，另一组为加入HIV-DNA的cDNA/探针双螺旋杂交链(2μM)。在200和350nm之间记录两组数据。条件：1mm的光比色皿光谱，记录速度100nm/min，响应时间为0.5秒钟，带宽为1nm。三次测量每个样品，平均3次扫描光谱。如图3所示，没有目标物的时候，cDNA/探针杂交双链表现出的特征峰为正270nm和负245nm，这是由于cDNA与P部分杂交，使部分G序列呈游离状态。在目标HIV-DNA加入后，CD上正负特征峰的强度增加，这是由于形成了目标/cDNA双螺旋，从而释放出更多的富G序列形成了G-四链体。

(3)紫外吸收光谱测定

如图4所示，比较双链+AA和双链+AA+Cu²⁺的紫外吸收光谱可以发现：后者在340nm处有特定且明显的吸收峰，而前者在该区域没有明显的峰谱出现，该紫外表征图说明合成dsDNA-CuNPs的条件是双链DNA、Cu²⁺和AA，且三者缺一不可

实施例3

一种基于检测HIV基因的荧光探针的优化性实验

如图5所示，为了使设计的实验方案达到最佳的传感性能，该实验对反应的pH值、反应时间、AA浓度、Cu²⁺浓度、K⁺浓度等进行了优化。在酸性条件下，只检测到微弱的荧光强度，而在pH值为7.5时获得了dsDNA-CuNPs最佳的荧光强度。AA作为合成铜纳米粒子的还原剂，在整个合成过程中是个关键因素，结果表明，随着AA浓度的增加，铜纳米粒子的荧光强度明显增强，并在AA的浓度为2mM时达到最高值。因此，在这项研究中使用2nM的AA为最佳。此外，Cu²⁺浓度也是合成荧光铜纳米粒子的一个重要影响因素，结果显示，分别用100μM，200μM，300μM，400μM，500μM，600μM的Cu²⁺进行反应时，合成的荧光探针强度先上升后下降，当Cu²⁺浓度高于500μM，dsDNA-CuNPs的荧光强度明显下降。荧光强度最高时对应的Cu²⁺的浓度为500μM。G-四链体在整个实验过程中充当一个能量的作用，它能增强铜纳米粒子的荧光强度。所以在优化好合成dsDNA-CuNPs的条件后，对G-四链体的效应也做了考察。G-四链体的堆叠与Pb²⁺、K⁺等的作用密切相关，正向平行的G-四链体是由于Pb²⁺的影响，而反向平行结构是K⁺引起的堆叠效应。在本实验中，为了建立一个环境友好型的荧光探针，选用K⁺构建反向平行的G-四链体。图中显示了K⁺的浓度对荧光探针的荧光强度差值影响。进而反映出最具效应的G-四链体是在K⁺的浓度为10mM时为最佳。(I₀表示没有加入K⁺时dsDNA-CuNPs的荧光强度；I表示加入K⁺后dsDNA-CuNPs的荧光强度)。当在探针中加入目标物后，目标物对cDNA的竞争需要一段时间，为了得到最佳的分析结果，在室温环境下，500nM的探针加入500nM的HIV-DNA后，每隔一段时间检测荧光值的变化。结果表明，60分钟后荧光强度基本不再上升，达到一个稳定值，因此选择60分钟作为反应的最佳时间。

实施例4

一种基于检测HIV基因的荧光探针的灵敏性分析

在最佳优化条件下，对该方案的灵敏度进行考察。在500nM的探针中，加入不同浓度的HIV-DNA进行评估来确定该探针的感应能力。荧光光谱图(图6)显示，随着目标物浓度的增加，所测得的荧光信号也呈现逐渐增加的趋势。当加入的HIV-DNA浓度从1nM增加到1000nM时，我们得到两个较宽的线性范围。如图7，在1～200nM范围内，一个线性回归方程为Y＝0.44c+8.27，R²＝0.998。另一个线性回归方程为Y＝0.17c+61.26，R²＝0.997，线性范围是250-1000nM，检测限是130pM。(I₀表示没有目标物时探针的荧光强度，I表示加入HIV-DNA后探针的荧光强度)

实施例5

一种基于检测HIV基因的荧光探针的选择性测定

为了证明该荧光探针能特异性地检测HIV-DNA，我们选择与目标物类似的双错配(HIV-D1)和三错配(HIV-D2)序列进行选择性实验。如图8所示，在相同的实验条件下，只有HIV-DNA可以使荧光值大幅度增加，表明该荧光探针具有很好的选择性。

实施例5

一种基于检测HIV基因的荧光探针用于血清样品的测定

将线性方程中的三组不同浓度的目标物加入到人类血清样品中进行检测。实验结果如图9，不同浓度的目标物的回收率分别为121.00％，108.10％和101.39％，由此表明此方案可应用于人类实际样品中检测。

序列表

<110> 湘潭大学

<120> 一种基于检测HIV基因的荧光探针

<130> CN 109097491 A

<140> 201810834811.X

<141> 2018-07-26

<150> 201810834811.X

<151> 2018-07-26

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atatatatat atatatatat atatgggttg gggagggctg ggccttgg 48

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atatatatat atatatatat atatgggttg ggtagggctg ggccttgg 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatatatat atatatatat atatgggttg ggttgggctg ggccttgg 48

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaaggccca gccctcacac a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtgtgaggg ctgggccttg g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgtgaaag ctgggccttg g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtgtgaaat ctgggccttg g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

actgctagag attttccaca t 21

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atatatatat atgggttggg ttgggctggg ccttgg 36

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atatatatat atatatatgg gttgggttgg gctgggcctt gg 42

Claims

1.一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于以下合成步骤：

(1)将0.5μM含有聚AT的dsDNA和1μM cDNA加入到10mM的含150mM NaCl,pH为7.5的MOPS缓冲液中，

cDNA序列为：

5'-CCAAGGCCCAGCCCTCACACA-3'

聚AT的dsDNA由两段AT-G序列组成，AT-G的序列为：

5'-ATATATATATATATATATATATATGGGTTGGGTTGGGCTGGGCCTTGG-3'，其中序列5'-GGGTTGGGTTGGGCTGGGCCTTGG-3'为富G序列；

(2)将混合溶液在90℃恒温水浴锅中加热约10分钟，然后缓慢冷却至室温；

(3)在杂交产物中混入500μM CuSO₄和2mM L-抗坏血酸(AA)，继而在25℃水浴锅中孵育5分钟即可形成。

2.根据权利要求1所述的一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于检测方法为：

在pH为7.5的条件下，40μL的0.5μM dsDNA和140μL的1μM cDNA混合在一起，然后在90℃水浴下加热10min后冷却至室温，2mM AA和500μM硫酸铜加入后孵育5min；随后，向上述溶液中加入各种浓度的HIV-DNA溶液，并反应30min，最后加入20μL的10mM K⁺使最终体积达到200μL，反应60min后进行测定，

HIV-DNA序列为：

5'-TGTGTGAGGGCTGGGCCTTGG-3'。

3.根据权利要求1所述的一种基于检测HIV基因的荧光探针，其特征在于荧光检测条件设置为：

激发波长：340nm；发射波长：550nm；激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：10.0nm。