CN113046419B - 一种基于双链dna模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于双链dna模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列；制备时，首先设计并合成得到一条含有目标物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列的单链DNA分子，通过DNA分子的变性、退火过程，促使单链DNA自组装成茎环结构的探针，再取探针溶液与目标物反应，利用目标识别序列与目标物的特异性作用诱导探针构型变化，进而生成荧光纳米铜输出检测信号，即形成荧光分子信标；该荧光分子信标可应用于核酸、蛋白质和生物小分子的免标记检测；本发明的荧光分子信标无需标记，操作简单，检测耗时短。

Description

一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体是一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用。
背景技术
经典的荧光分子信标是一种呈发卡结构的DNA探针，主要由茎部分、环部分、有机荧光基团及有机猝灭基团四部分构成。分子信标结构简单、操作方便，通过分子信标与目标分子的相互作用，引起DNA构型的变化，从而输出荧光信号，即可实现对目标物的分析检测。尽管分子信标在生物医学分析领域取得了较为成功的应用，但是经典的分子信标在实际分析操作中仍然具有以下几个方面的缺陷。(1)有机基团修饰复杂、昂贵。在发卡DNA分子上进行荧光基团和猝灭基团的修饰，需要历经繁琐、耗时的化学合成与纯化过程，实验成本较高。(2)生物毒性大。相较于单纯的DNA分子，有机基团修饰后的DNA分子生物毒性大大提高，环境污染风险也随之增大。(3)检测背景较高。分子信标中有机荧光基团与猝灭基团之间的能量传递效率有限，且考虑到检测信号的回升，染料的荧光信号并不会被完全猝灭，不可避免地导致其具有较大的背景干扰。(4)目标物识别效率低。预先标记上的有机基团对分子信标与目标物之间的相互作用会产生一定的位阻影响，致使对目标物的检测识别效率降低。针对上述问题，基于纳米材料的应用构建新型分子信标引起了研究者们的关注。例如，利用金纳米颗粒作为荧光猝灭剂替代经典分子信标中的有机猝灭基团，可取得较好的猝灭效果，有效降低了分子信标的检测背景。但是该策略依然需要进行有机基团的偶联和修饰，并且金纳米颗粒较大的粒径会产生更大的位阻效应，不利于目标物识别效率的提高。近年来，基于DNA功能化银纳米团簇的分子信标引起了新的关注。与经典分子信标相比，其在分析成本、生物毒性、检测背景方面均大大降低。并且，银纳米团簇在DNA杂交后合成的特点，能够有效避免分子信标对目标物识别行为的干扰。
与银纳米团簇相比，DNA模板的荧光纳米铜同样具有较好的生物相容性和可调控性，并且其制备条件更为温和，制备时间大大缩短，操作更为简便。因此，若能将荧光纳米铜引入到分子信标的构建中，以DNA模板化原位生成荧光纳米铜的策略替代传统的修饰有机荧光染料的信号标记方式，有望为分子信标的发展提供新的研究思路和方向，具有重要的研究和应用价值。
发明内容
本发明的目的就是针对目前经典的荧光分子信标存在的上述不足，提供一种基于双链 DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标及其制备方法和应用，本发明的荧光分子信标可高度特异性识别目标物、背景信号低，利用与目标物匹配的荧光分子信标可完成对目标物的高度特异性识别，合成的荧光纳米铜有较强的荧光信号。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中所述寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列，三者可自组装成茎环结构。
本发明还提供了一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的制备方法，包括如下步骤：取发夹DNA溶液与不同浓度的待测物溶液混合制备双链DNA模板溶液；在双链 DNA模板溶液中加入抗坏血酸溶液(AA)和硫酸铜溶液，即可得到荧光纳米铜的荧光分子信标。
具体地，本发明的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的制备方法，它是将50μL浓度为1μM的发夹DNA溶液离心30s，再将其溶解于100mM PBS缓冲溶液中，所述PBS缓冲溶液是由浓度分别为100mM的NaCl、2mM的MgCl2及20mM的KCl配制的pH＝7.4的缓冲溶液；在85℃下保温10min使其变性，然后在室温条件下缓慢退火1h；再将退火后的发夹DNA溶液与待测物溶液混匀后，在室温下轻摇1h即可制备得到双链DNA 模板溶液；在双链DNA模板溶液中加入250μL浓度为10mM的MOPs缓冲溶液，所述MOPs 缓冲溶液是由浓度为150mM的NaCl配制的pH＝7.6的缓冲溶液，完全混匀后加入10μL浓度为40mM的抗坏血酸溶液(AA溶液)和10μL浓度为8mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5min，即得荧光纳米铜的荧光分子信标。
本发明还提供了一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的应用。
进一步地，本发明的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的应用，包括如下步骤：
1)取发夹DNA溶液与不同浓度梯度的待测物溶液混合制备双链DNA模板溶液；所述发夹DNA中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列；
2)在双链DNA模板溶液中加入AA溶液和硫酸铜溶液，制备荧光纳米铜的荧光分子信标；
3)利用荧光光谱仪激发荧光纳米铜的荧光分子信标，获得荧光光谱图；
4)根据测得的荧光强度与待测物浓度对数之间的线性关系，实现对目标物的定量分析。
具体地，本发明的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的应用，包括如下步骤：取50μL发夹DNA溶液离心30s，再将其溶解于100mM PBS缓冲溶液中，所述 PBS缓冲溶液是由浓度分别为100mM的NaCl、2mM的MgCl2及20mM的KCl配制的 pH＝7.4的缓冲溶液；在85℃下保温10min使其变性，然后在室温条件下缓慢退火1h；再将退火后的发夹DNA溶液分别加入50μL不同浓度梯度的待测物溶液，混匀后在室温下反应1 h，然后在上述溶液中加入250μL浓度为10mM的MOPs缓冲溶液，所述MOPs缓冲溶液是由浓度为150mM的NaCl配制的pH＝7.6的缓冲溶液，混匀后加入10μL浓度为40mM的AA溶液和10μL浓度为8mM硫酸铜溶液，再次振荡混匀后在室温中避光静置5min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标；利用荧光光谱仪激发荧光纳米铜，获得荧光光谱图，其中测定荧光光谱的激发波长345nm，发射波长扫描范围为480-680nm；根据测得的荧光光谱的强度与待测物浓度对数之间的线性关系，实现对目标物的定量分析。
优选地，本发明中所述待测物的浓度梯度为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM。
优选地，本发明中所述待测物包括核酸、蛋白质和生物小分子。
优选地，本发明中所述核酸是DNA和RNA。
优选地，本发明中所述蛋白质是凝血酶。
优选地，本发明中所述生物小分子是三磷酸腺苷(ATP)。
本发明的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标，其检测原理参见附图1，所述荧光分子信标包括：一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中的寡核苷酸链中含有目标物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列。目标物不存在时，寡核苷酸链中的目标识别序列与辅助序列部分杂交，阻碍了荧光纳米铜模板的形成，无荧光纳米铜的荧光分子信标产生；引入目标物后，目标识别序列与目标物的特异性作用诱导DNA的构型变化，形成荧光纳米铜模板，加入AA溶液和硫酸铜溶液，得到荧光纳米铜的荧光分子信标。利用荧光光谱仪测定纳米铜的荧光强度，根据荧光强度与待测物浓度对数之间的线性关系，实现对目标物的定量分析。若改变探针中的识别序列，即可得到对不同目标物响应的荧光分子信标，进而能够实现对不同目标物的检测。
与现有技术相比，本发明有如下特点和优点：
1)本发明的荧光分子信标合成快，操作简单，可在较短时间内完成对目标物的检测。
2)本发明可高度特异性识别目标物、背景信号低，利用与目标物匹配的荧光分子信标可完成对目标物的高度特异性识别，合成的荧光纳米铜的荧光分子信标有较强的荧光信号。
3)本发明生物相容性高、灵敏度高、毒性低，是一种环境友好型材料。
附图说明
图1为本发明的荧光分子信标的工作原理图；
图2(A)为荧光分子信标对不同浓度T1归一化的荧光光谱图；
图2(B)为归一化荧光强度关于T1浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内T1浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式；
图3为H1(泳道1)和H1+T1(泳道2)的凝胶电泳图；
图4(A)为荧光分子信标对不同浓度microRNA-21归一化的荧光光谱图；
图4(B)为归一化荧光强度关于microRNA-21浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内microRNA-21浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式；
图5(A)为荧光分子信标对不同浓度凝血酶归一化的荧光光谱图；
图5(B)为归一化荧光强度关于凝血酶浓度的散点图和在1nM～1μM范围内凝血酶浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式；
图6是荧光分子信标对凝血酶等不同物质的选择性；
图7(A)为荧光分子信标对不同浓度ATP归一化的荧光光谱图；
图7(B)为归一化荧光强度关于ATP浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内ATP浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式；
图8为荧光分子信标检测ATP在缓冲溶液和不同浓度人体血清中的归一化荧光光谱图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标的应用，取浓度为1μL 发夹DNA溶液(H1)离心30s，再将其溶解于100mM PBS缓冲溶液中，在85℃下保温10 min使其变性，然后在室温条件下缓慢退火1h。取5份50μL H1与50μL浓度梯度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM的待测DNA溶液(T1)混匀，在室温下轻摇1h得到双链DNA模板溶液，在上述模板溶液中分别加入浓度为10mM的250μL MOPs缓冲溶液，完全混匀后再分别加入10μL浓度为40mM的AA溶液和10μL浓度为8mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标，其中H1和T1的5’至3’的碱基序列参见表1。采用荧光光谱仪测得荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标对待测DNA溶液(T1)的检测效果。
试验结果如图2所示，其中(A)图为荧光分子信标对不同浓度T1归一化的荧光光谱图， T1的浓度范围在0.1nM～1μM，荧光强度随着T1浓度的增加而变强。(B)图为归一化荧光强度关于T1浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内T1浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式：y＝1.602+0.1444lgx(0.1nM～1μM)，线性相关系数R2＝0.9908。根据线性拟合结果以及空白溶液的3倍标准偏差计算出检测限为85pM(n＝9)。根据线性曲线，通过实验测量实际样品的荧光强度可以很好的反演得到T1的浓度，进而实现利用双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标对DNA进行检测。
除此之外，本实施例还通过凝胶电泳实验进一步验证了荧光分子信标的可行性，具体步骤为：用100×SYBR Green I将待测DNA溶液着色，接着用1×TAE缓冲制备质量分数为 3％的琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲中用100V的电压进行凝胶电泳实验，最后在凝胶成像仪上得到凝胶电泳图。
结果如图3所示，H(DNA)与T1的混合溶液形成的条带1比H(DNA)形成的条带2 低，证明目标物DNA的引入可以诱导发夹DNA的构型转换，最终得到延伸的双链DNA，进一步验证了荧光分子信标的可行性。
表1实施例1-4的碱基序列表
Figure BDA0002998011830000071
实施例2
为了考察本发明的荧光分子信标对RNA检测的可行性，本实施例设计了microRNA-21 的互补序列作为发夹DNA(H(RNA)目标识别序列，其中H(RNA)和microRNA-21的5’至3’的碱基序列参见表1，实验步骤具体为：
先将浓度为1μL的H(RNA)离心30s，再将H(RNA)溶解于浓度为100mM的Tris-HCl 缓冲溶液和DEPC水中，然后在85℃下保温10min使其变性后缓慢退火1h。取5份50μL H(RNA)与50μL浓度梯度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM的microRNA-21 在室温下轻摇1h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中加入浓度为10mM的250μL MOPs缓冲溶液，完全混匀后分别加入10μL浓度为40mM的AA溶液和10μL浓度为8mM 的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标。采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光分子信标的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标检测RNA的效果。
结果如图4所示，其中(A)图为荧光分子信标对不同浓度microRNA-21归一化的荧光光谱图，microRNA-21的浓度范围在0.1nM～1μM，荧光强度随着microRNA-21浓度的增加而变强。(B)图为归一化荧光强度关于microRNA-21浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内microRNA-21浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式：y＝2.020+0.1797lgx(0.1nM～1 μM)，线性相关系数R2＝0.9952。根据线性拟合结果以及空白溶液的3倍标准偏差计算出检测限为62pM(n＝9)。根据线性曲线，通过实验测量实际样品的荧光强度可以很好的反演得到microRNA-21的浓度，进而实现利用双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标对RNA进行检测，同时也证实本发明的荧光分子信标在RNA检测中的优良性能。
实施例3
为进一步探究本发明的荧光分子信标在非核酸类物质检测中的应用，本实施例设计了荧光分子信标检测蛋白质类物质的实验，凝血酶作为待测物，并以凝血酶的互补序列作为发夹 DNA(H(Thrombin))的目标识别序列，其中H(Thrombin)的5’至3’的碱基序列参见表1，实验步骤具体为：
先将浓度为1μL的H(Thrombin)离心30s，再将H(Thrombin)溶解于浓度为100mM 的Tris-HCl缓冲溶液中，然后在85℃下保温10min使其变性后缓慢退火1h。取5份50μL H(Thrombin)与50μL浓度梯度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM的凝血酶在室温下轻摇1h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中加入浓度为10mM的250μL MOPs 缓冲溶液，完全混匀后分别加入10μL浓度为40mM的AA溶液和10μL浓度为8mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标。采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标对凝血酶的检测效果。
结果如图5所示，其中(A)图为荧光分子信标对不同浓度凝血酶归一化的荧光光谱图，凝血酶的浓度范围在0.1nM～1μM，荧光强度随着凝血酶浓度的增加而变强。(B)图为归一化荧光强度关于凝血酶浓度的散点图和在1nM～1μM范围内凝血酶浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式：y＝2.561+0.2578lgx(1nM～1μM)，线性相关系数R2＝0.9921。图6 是荧光分子信标对凝血酶等不同物质的选择性，由图可知，相较于空白溶液，荧光分子信标仅对凝血酶产生明显的荧光信号，对其他物质没有荧光信号，说明适配体对凝血酶可高度特异性识别。根据线性拟合结果以及空白溶液的3倍标准偏差计算出检测限为0.52nM(n＝9)。根据线性曲线，通过实验测量实际样品的荧光强度可以很好的反演得到凝血酶的浓度，进而实现利用荧光分子信标对凝血酶进行快速、免标记检测，同时也验证了本发明的荧光分子信标可以检测蛋白质类物质。
实施例4
本实施例设计了荧光分子信标检测生物小分子类的实验，ATP作为待测物，在H(ATP) 中嵌入ATP的适配体作为目标识别片段，其中H(ATP)的5’至3’的碱基序列参见表1，具体方案如下：
先将浓度为1μM的H(ATP)离心30s，再将H(ATP)溶解于浓度为100mM的PBS 缓冲溶液中，然后在85℃下保温10min使其变性后缓慢退火1h。取5份50μL H(ATP)与 50μL浓度梯度分别为0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM的ATP在室温下轻摇1h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中分别加入250μL浓度为10mM MOPs缓冲溶液，完全混匀后分别加入10μL浓度为40mM的AA溶液和10μL浓度为8mM硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标。采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标检测ATP的效果。
结果如图7所示，其中(A)图为荧光分子信标对不同浓度ATP归一化的荧光光谱图，ATP的浓度范围在0.1nM～1μM，荧光强度随着ATP浓度的增加而变强。(B)图为归一化荧光强度关于ATP浓度的散点图和在0.1nM～1μM范围内ATP浓度对数与归一化荧光强度的线性关系式：y＝2.112+0.1842lgx(0.1nM～1μM)，线性相关系数R2＝0.9959。图8为荧光分子信标检测ATP分别在缓冲溶液和不同浓度的人体血清中的归一化荧光光谱图，从图中可清晰看到，在不同浓度的人体血清中与在不同浓度缓冲溶液中检测到的荧光信号强度没有差别。根据线性拟合结果以及空白溶液的3倍标准偏差计算出检测限为45pM(n＝9)。根据线性曲线，通过实验测量实际样品的荧光强度可以很好的反演得到ATP的浓度，进而实现利用双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标对ATP进行快速检测，验证了本发明的荧光分子信标的抗干扰能力及其多功能化。

Claims (4)

1.一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标在检测DNA中的应用，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中所述寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列，三者可自组装成茎环结构，其特征在于包括如下步骤：
取浓度为1 mL发夹DNA溶液（H1）离心30 s，再将其溶解于100 mM PBS缓冲溶液中，在85℃下保温10 min使其变性，然后在室温条件下缓慢退火1 h；取5份50 mL发夹DNA溶液（H1）与50 mL浓度梯度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 mM的待测DNA溶液（T1）混匀，在室温下轻摇1 h得到双链DNA模板溶液，在上述模板溶液中分别加入浓度为10 mM的250 mLMOPs缓冲溶液，完全混匀后再分别加入10 mL浓度为40 mM的 AA溶液和10 mL浓度为8 mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5 min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标，所述发夹DNA溶液（H1）5’至3’的碱基序列为：ATATATTTATATATATATATTTATCGCGGAATAACATGACCTGGATAAATATATATATATAAATATATTGCAGCCAGGTCATGTTATTCCGCG；待测DNA溶液（T1）的5’至3’的碱基序列为：CGCGGAATAACATGACCTGGCTGCA；采用荧光光谱仪测得荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标对待测DNA溶液（T1）的检测效果。
2.一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标在检测RNA中的应用，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中所述寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列，三者可自组装成茎环结构，其特征在于包括如下步骤：
先将浓度为1 mL的H（RNA）离心30 s，再将H（RNA）溶解于浓度为100 mM的Tris-HCl缓冲溶液和DEPC水中，然后在85 ℃下保温10 min使其变性后缓慢退火1 h；取5份50 mL H（RNA）与50 mL浓度梯度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 mM的microRNA-21在室温下轻摇1h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中加入浓度为10 mM的250 mL MOPs缓冲溶液，完全混匀后分别加入10 mL 浓度为40 mM的AA溶液和10 mL浓度为8 mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5 min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标，其中H（RNA）5’至3’的碱基序列为：ATATATTTATATATATATATTTATTAGCTTATCAGACTGATATAAATATATATATATAAATATATTCAACATCAGTCTGATAAGCTA，microRNA-21的5’至3’的碱基序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光分子信标的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标检测RNA的效果。
3.一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标在检测凝血酶中的应用，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中所述寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列，三者可自组装成茎环结构，其特征在于包括如下步骤：
先将浓度为1 mL的H（Thrombin）离心30 s，再将H（Thrombin）溶解于浓度为100 mM的Tris-HCl缓冲溶液中，然后在85℃下保温10 min使其变性后缓慢退火1 h；取5份50 mL H（Thrombin）与50 mL浓度梯度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 mM的凝血酶在室温下轻摇1 h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中加入浓度为10 mM的250 mL MOPs缓冲溶液，完全混匀后分别加入10 mL 浓度为40 mM的AA溶液和10 mL浓度为8 mM的硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5 min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标，所述H（Thrombin）5’至3’的碱基序列为：ATATATTTATATATATATATTTATAGTCACCCCAACCTGCCCTAATAAATATATATATATAAATATATAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标对凝血酶的检测效果。
4.一种基于双链DNA模板荧光纳米铜的荧光分子信标在检测ATP中的应用，所述荧光分子信标包括一条寡核苷酸链、抗坏血酸试剂和硫酸铜试剂，其中所述寡核苷酸链中含有待测物识别序列、荧光纳米铜模板序列和辅助序列，三者可自组装成茎环结构，其特征在于包括如下步骤：
先将浓度为1 mM的H（ATP）离心30 s，再将H（ATP）溶解于浓度为100 mM的PBS缓冲溶液中，然后在85℃下保温10 min使其变性后缓慢退火1 h；取5份50 mL H（ATP）与50 mL浓度梯度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 mM的ATP在室温下轻摇1 h，得到双链DNA模板溶液，在上述混合液中分别加入250 mL浓度为10 mM MOPs缓冲溶液，完全混匀后分别加入10mL浓度为40 mM的 AA溶液和10 mL浓度为8 mM硫酸铜溶液，再次振荡混匀，在室温中避光静置5 min即得双链DNA模板化的荧光纳米铜的荧光分子信标，所述H（ATP）5’至3’的碱基序列为：ATATATTTATATATATATATTTATCTTCCTCCGCAATACTCCCATAAATATATATATATAAATATATACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT；采用荧光光谱仪测得制备荧光纳米铜的荧光光谱图，观察荧光纳米铜的荧光相对强度及最大吸收峰，验证双链DNA模板化的荧光纳米铜作为荧光分子信标检测ATP的效果。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106282175B (zh) * 2015-06-07 2019-12-20 复旦大学 荧光纳米铜簇的发卡式dna模板及其应用
CN104894222B (zh) * 2015-06-11 2018-06-12 郑州大学 一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测t4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法
KR101769239B1 (ko) * 2016-03-03 2017-08-30 연세대학교 산학협력단 역헤어핀 구조의 분자 비컨 및 이를 이용한 표적 분자 탐지 방법
CN106442446B (zh) * 2016-09-21 2019-06-25 安徽师范大学 荧光生物传感器，其制备方法及其用途
CN107012228A (zh) * 2017-04-21 2017-08-04 绍兴汉耀生物科技股份有限公司 一种检测肿瘤标志物的方法
CN109097491B (zh) * 2018-07-26 2021-11-19 湘潭大学 一种基于检测hiv基因的荧光探针
CN109097444A (zh) * 2018-08-13 2018-12-28 上海理工大学 一种基于y型dna模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法

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