CN104894222B - 一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测t4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法，它是通过以下步骤实现的：一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T碱基的序列；二、将上述探针用Tris‑HCl缓冲溶液稀释到浓度为100～1000nM，并把一定量T4 PNKP、Klenow Fragment、dNTPs与之混合，37℃反应40～150min；三、将上述反应液稀释为MOPS缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，室温下反应1～30min；四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，得到体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系，本发明方法操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好，能够定量检测并筛选T4 PNKP及其抑制剂，为其他末端修饰酶检测方法的建立和分子生物学诊断提供了潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法。
背景技术
DNA 3′磷酸酶在细胞内的多种活动，如核酸代谢、DNA损伤修复、DNA复制和DNA重组中都起着至关重要的作用。T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNKP)是其中的典型代表。1965年Richards等在研究T4噬菌体侵袭大肠杆菌过程时首次发现了T4PNKP。T4 PNKP具有核酸5′端激酶活性以及3′端磷酸酯酶活性，可以催化生物体系中核酸的5′端磷酸化和3′端去磷酸化反应，在核酸的损伤修复和核酸的复制过程中发挥着重要的作用，因此其对生物体的正常生长、发育和繁衍有重要意义。由于其在DNA链断裂修复和损伤修复以及进一步探究DNA修复机理中的重要作用，因而，高灵敏度而且选择性的检测T4PNKP尤为重要。
检测T4 PNKP的传统方法有基态同位素32P标记法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和射线自显迹法。但是，这些传统方法或是实验步骤繁琐、耗时并需要特殊的仪器，或是选择性和灵敏度不高，有的还需要同位素标记，从而限制了其应用的范围。近年来，发展了一系列检测T4 PNKP的分子信标检测方法，虽然此类方法灵敏度较高，但是分子信标设计较为复杂，成本较高，其应用也受到一定程度的限制。综上所述，发展新型、简单方便的T4 PNKP分析检测方法十分必要。
另外，金属纳米团簇以其优异的光电特性和优良的生物相容性，已经成为目前纳米材料研究的热门方向之一，能够作为潜在的荧光材料应用于光谱研究、生物标记、光学成像以及生物化学传感等领域。其中，成本低、生物安全性高、操作简单、反应条件温和的铜簇更是受到研究者的热力追捧。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好的基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的生物传感方法。
为实现上述发明目的，本发明基于以富含T碱基单链DNA为模版制备的铜纳米颗粒设计了一种检测T4 PNKP的新方法，该方法的检测原理示意图见图1。富含T碱基的单链DNA能够作为模板制备出荧光铜纳米颗粒，而在T4 PNKP的存在下，T4 PNKP能够催化富含T碱基DNA发夹探针3′端的去磷酸化反应，在聚合酶的作用下使探针从3′端到5′端延伸得到长茎端发夹产物，单链T部分转换为双链结构，因双链结构无法合成荧光铜纳米颗粒，荧光强度降低，从而实现对T4 PNKP的测定。本发明所采用的具体技术方案为：
步骤一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T碱基的序列；
步骤二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释到浓度为200～1000nM，并把一定量T4 PNKP、Klenow Fragment、dNTPs与之混合，37℃反应60～120min；
步骤三、在上述反应液中再加入MOPS缓冲溶液、硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应1～30min；
步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，从而得到体系荧光强度与T4PNKP浓度之间的对应关系。
上述探针设计的5′端胸腺嘧啶碱基个数为大于等于20；
上述探针在体系中的浓度为200～1000nM；
上述Klenow Fragment在体系中的用量为10～1000U/mL；
上述dNTPs在体系中的用量为100～5000μM；
上述T4 PNKP在体系中用量为0～50U/mL；
上述抗坏血酸钠在体系中用量为1mM～1μM；
上述硫酸铜在体系中用量为50μM～20mM；
上述探针与T4 PNKP、Klenow Fragment等酶的反应时间为60～120min；
上述步骤三荧光铜纳米颗粒的合成时间为1～30min，优选10min。
上述所用试剂的浓度都是在体系中的终浓度。
上述荧光检测时的激发波长为340nm，发射波长为615～630nM，狭缝宽度为5～10nm，PMT电压为700～950V。
本发明不仅可以定量检测T4 PNKP，还可以定量检测其抑制剂肝素，同时也在另一个方面验证了本发明的正确性和可靠性。肝素可抑制T4 PNKP的活性，使体系荧光逐渐得到恢复，从而达到定量检测的目的，具体技术方案为：
步骤一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T碱基的序列；
步骤二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释为所需浓度，并把一定量肝素、T4PNKP、Klenow Fragment、dNTPs与之混合，37℃反应60～120min；
步骤三、在上述反应液中再加入MOPS缓冲溶液、硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应1～30min；
步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，从而得到体系荧光强度恢复与肝素浓度之间的关系；
其中肝素的用量为0～25μg/mL，设计探针5′端胸腺嘧啶碱基个数、探针的浓度、Klenow Fragmen、T4 PNKP、dNTPs、抗坏血酸钠、硫酸铜的用量，探针与肝素、T4 PNKP、Klenow Fragment等酶的反应时间，荧光铜纳米颗粒的合成优选时间等参数与上述检测T4PNKP时相同。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
1.成本大大降低，操作简便，不需要实验人员具有较高的操作水平及复杂昂贵的仪器，且灵敏度高、选择性好；
2.不需要复杂的探针设计、染料修饰和同位素标记等复杂的操作；
3.能够定量检测并筛选T4 PNKP的抑制剂；
4.为其他末端修饰酶检测方法的建立和分子生物学诊断提供了潜在的应用价值。
另外，为了验证本发明的适用性和可靠性，设计了复杂生物体系中的T4 PNKP检测实验。将1％细胞裂解液作为检测环境，结果表明，该方法对T4 PNKP具有良好的响应。
附图说明
图1为T4 PNKP的检测原理示意图。
图2为利用该方法对标准溶液中不同浓度T4 PNKP检测时的荧光光谱图(图2a)及其线性对应关系(图2b)。
图3为不同浓度肝素对T4 PNKP抑制作用下体系的相对荧光强度(相对荧光强度＝F/F0，F为体系在一定浓度T4 PNKP、不同浓度肝素的情况下的荧光强度，F0为体系不存在T4PNKP的情况下的荧光强度)。
图4为利用该方法对细胞裂解液中不同浓度T4 PNKP的荧光响应光谱图(图4a)及其线性关系(图4b)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但是本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
步骤一、设计探针序列如下：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTCGC ACC TAA AGG GTG CG-3′(3′端磷酸化修饰)；
步骤二、25μL Tris-HCl缓冲体系(10mM Tris-HCl，10mM MgCl，50mM NaCl，pH7.9)中包含5μL探针(1μM)，1μL KF聚合酶(50U/mL)，2μL dNTPs(200μM)及2μL不同浓度的T4PNKP(0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、25U/mL)，混合均匀，在37℃恒温条件下孵育80min；
步骤三、将上述溶液补充为终体积为100μL的MOPS缓冲溶液(10mM MOPS，150mMNaCl，pH 7.6)，其中包括10μL抗坏血酸钠(2mM)和10μL硫酸铜(200μM)，混合均匀，在室温下孵育10min；
步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到520～660nm的荧光光谱图(见图2a)以及体系荧光强度与T4 PNKP浓度的线性对应关系(见图2b)。
实施例2
步骤一、设计探针序列如下：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTCGC ACC TAA AGG GTG CG-3′(3′端磷酸化修饰)；
步骤二、25μL Tris-HCl缓冲体系(10mM Tris-HCl，10mM MgCl，50mM NaCl，pH7.9)中包含5μL探针(1μM)，1μL KF聚合酶(50U/mL)，2μL dNTPs(200μM)，5μL不同浓度的肝素(0μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL)及2μL T4PNKP(25U/mL)，混合均匀，在37℃恒温条件下孵育80min；
步骤三、将上述溶液补充为终体积为100μL的MOPS缓冲溶液(10mM MOPS，150mMNaCl，pH 7.6)，其中包括10μL抗坏血酸钠(2mM)和10μL硫酸铜(200μM)，混合均匀，在室温下孵育10min；
步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到体系相对荧光强度与肝素浓度的对应关系(见图3)。
实施例3
步骤一、设计探针序列如下：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTCGC ACC TAA AGG GTG CG-3′(3′端磷酸化修饰)；
步骤二、25μL1％肺癌细胞裂解液Tris-HCl缓冲体系(10mM Tris-HCl，10mM MgCl，50mM NaCl，pH 7.9)中包含5μL探针(1μM)，1μL KF聚合酶(50U/mL)，2μL dNTPs(200μM)及2μL不同浓度的T4 PNKP(0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、25U/mL)，混合均匀，在37℃恒温条件下孵育80min；
步骤三、将上述溶液补充为终体积为100μL的MOPS缓冲溶液(10mM MOPS，150mMNaCl，pH 7.6)，其中包括10μL抗坏血酸钠(2mM)和10μL硫酸铜(200μM)，混合均匀，在室温下孵育10min；
步骤四、最终的反应液在340nm的激发波长下得到520～660nm的荧光光谱图(见图4a)以及体系荧光强度与细胞裂解液中T4 PNKP浓度的对应关系(见图4b)。
Claims (2)
1.一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4 多聚核苷酸激酶/ 磷酸酶的新方法，其特征在于：它是通过以下步骤实现的：
步骤一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T 碱基的序列；
步骤二、将上述探针用Tris-HCl 缓冲溶液稀释到浓度为200 ～ 1000nM，并把一定量T4PNKP、Klenow Fragment、dNTPs 与之混合，37℃反应60～120min；
步骤三、将上述反应液稀释为MOPS 缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应1～30min；
步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，确定体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系；
所述的设计探针5′端T碱基个数为大于等于20；所述的探针的浓度为200～1000nM；所述的Klenow Fragment 的用量为10～1000U/mL；所述的dNTPs 的用量为100～5000μM；所述的T4 PNKP 的用量为0～50U/mL；所述的抗坏血酸钠的用量为1mM～1μM；所述的硫酸铜的用量为50μM～20mM。
2.一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4 多聚核苷酸激酶/ 磷酸酶抑制剂的新方法，其特征在于：它是通过以下步骤实现的：
步骤一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T 碱基的序列；
步骤二、将上述探针用Tris-HCl缓冲溶液稀释为所需浓度，并把一定量肝素、T4 PNKP、Klenow Fragment、dNTPs 与之混合，37℃反应60～120min；
步骤三、在上述反应液中再加入MOPS 缓冲溶液、硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应1～ 30min；
步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，确定体系荧光强度恢复与肝素浓度之间的关系；
其中，肝素的用量为0～25μg/mL，所述的设计探针5′端T碱基个数为大于等于20；所述的探针的浓度为200～1000nM；所述的Klenow Fragment 的用量为10～1000U/mL；所述的dNTPs 的用量为100～5000μM；所述的T4 PNKP 的用量为0～50U/mL；所述的抗坏血酸钠的用量为1mM～1μM；所述的硫酸铜的用量为50μM～20mM。
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