CN103333888B - 硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针及其在核酸酶检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针及其在核酸酶检测中的应用。该硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针具有茎环结构,其环部为单链结构,由4-8个核苷酸残基组成,而茎部则由8-15对核苷酸残基组成,探针的部分磷酸二酯键中的O-被S-取代,根据待测核酸酶的活性功能分为非限制性核酸内切酶探针、核酸外切酶探针和脱嘌呤/脱嘧啶位点裂解酶探针三种。本发明可用于实时检测核酸酶活性、选择性强、灵敏度高、速度快、成本低、准确可靠的分析方法,以克服现有技术中的诸多局限。
Description
技术领域
本发明涉及非限制性核酸内切酶、外切酶、脱嘌呤/脱嘧啶位点(APsite)内切酶等多种核酸酶的检测,更具体地,涉及三种硫代(硫酰化)修饰寡聚核苷酸荧光探针,以及利用这三种荧光探针对实际生物体系中核酸酶进行检测。
背景技术
DNA是生命体遗传信息的载体,核酸酶确保了基因复制的准确性和遗传的稳定性。核酸酶广泛存在于生物体系。核酸与核酸酶之间的相互作用是传递遗传信息的重要过程,包括复制,重组和修复。不正常的酶活动通常会导致疾病,核酸酶组学研究的更重要的意义在于疾病的诊断和药物的研发。因此,发展灵敏度高且选择性强的检测核酸酶的技术成为现代分子生物学和药物研发的一项重要任务。
对于核酸酶的检测分析,传统方法一般是利用凝胶电泳、液相色谱等手段来分析核酸酶与底物反应后的产物,这些方法都操作繁琐,无法快速、方便地获取分析结果,而且通常还需要采用放射性元素标记,对环境不友好。另外,酶联免疫吸附分析法(ELISA)也被用于酶切反应的研究。但是这种方法需要大量的时间来制备抗体,而且很难发展成为均相检测体系。近几年来,利用荧光核酸探针来检测核酸酶在该领域得到了广泛的应用。这种探针具备实时检测核酸酶活性的能力,免除放射性标记,而且由于是荧光方法,所以灵敏度一般比传统方法要高。这种探针的工作原理主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA与核酸酶反应前后体系荧光的变化进行实时的监测。这种探针的结构类似于分子信标(MolecularBeacon)——呈发夹结构的短链DNA,一端标记荧光基团,一端标记猝灭基团。在进行核酸酶活性分析中,探针与核酸酶相互作用导致分子信标的结构发生变化,从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。但是由于很多复杂的生物体系有多种核酸酶共存,这种分子信标结构的探针可以与多种核酸酶同时发生相互作用,导致很难找出目标酶的信号。虽然我们可以通过设计对照探针来区分假阳性信号,但这样会大大降低探针的灵敏度,而且如果目标酶的含量低,采用对照探针也达不到区分的目的。在这种情况下,往往还是需要对酶反应的产物进行分析,这样不仅增加了设计成本和工作量,而且丧失了荧光核酸探针的检测优势。因此,迫切需要开发出灵敏度高、选择性好、快速、实时、成本低、准确可靠的核酸酶实时检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于实时检测核酸酶活性、选择性好、灵敏度高、速度快、成本低、准确可靠的分析方法,以克服现有技术中的诸多局限。
本发明的技术方案是,利用硫代核酸骨架对核酸酶的抑制作用,设计硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针,来实现对不同核酸酶的特异性检测。这些探针的信号产生是依赖于荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移(FRET)作用。在没有目标酶存在时,荧光基团与猝灭基团靠近,荧光处于猝灭状态。当目标酶与荧光探针发生反应时,探针结构发生变化,导致两个基团分离,从而荧光恢复。
所谓硫代核酸骨架是指:DNA的磷酸二酯键中的O-被S-取代。核酸酶与DNA的反应一般都包含磷酸二酯键的水解,水解机理涉及到游离水分子的氧进攻DNA的磷酸二酯键中的磷。当这种硫代骨架存在时,由于磷酸二酯键中的磷的电负性发生变化,亲电能力变差,因此酯键在核酸酶的存在下不能被水解。而DNA中未硫酰化的部分仍然可以被相应的核酸酶水解。利用这一性质,我们针对不同的核酸酶的性质,设计优化了部分硫酰化的三种探针分别用于对三类核酸酶进行特异性检测。
由于大部分核酸酶都识别DNA双链结构,本发明设计了硫代修饰的自杂交发夹型双标记探针(简称硫代探针),其中环部为单链结构,由4-8个核苷酸组成,而茎部结构较长,由8-15对核苷酸组成,以利于核酸酶的识别和水解作用。根据待测核酸酶的活性功能分为非限制性核酸内切酶探针、核酸外切酶探针和脱嘌呤/脱嘧啶位点(APsite)内切酶探针三种设计(参见图1):
1)非限制性核酸内切酶探针
非限制性核酸内切酶可以作用于单链DNA、双链DNA、染色质和RNA:DNA杂交链,切割DNA产生二核苷酸、三核苷酸和寡核苷酸产物。本发明中所使用的非限制性内切酶是DNaseI,这种酶与DNA作用产生3’羟基和5’磷酸末端。这种酶的特点是不依赖DNA的特定序列对DNA进行降解。如果核酸中含有人为设计的硫代核酸骨架,则DNaseI从那些非硫酰化的部分开始降解。
针对上述特点,本发明设计的非限制性核酸内切酶探针为茎环结构的单链寡核苷酸,环部有5个碱基,茎部有10对碱基。从5’端部开始有六个碱基之间为硫酰化磷酸二酯键,从3’端开始有七个碱基之间为硫酰化磷酸二酯键。
该探针在3’和5’分别引入硫酰化磷酸骨架旨在防止核酸外切酶的进攻,从而对非限制性核酸内切酶进行特异性识别。该探针的荧光基团FAM标记在5’→3’第五个碱基上,猝灭基团BHQ1标记在3’→5’第六个碱基上,探针形成茎环结构后,两个基团相互靠近,导致荧光猝灭。
该探针与DNaseI反应时,非硫酰化部分的磷酸二酯键被水解,导致环部和茎部结构被破坏。虽然荧光基团和猝灭基团所在碱基并没有被水解,但是由于六对碱基在室温下不能保持互补结构,从而两个基团分离,荧光恢复。这种探针可用于多种非限制性核酸内切酶的检测,不受其他类型的核酸酶的干扰。
2)核酸外切酶探针
具有3’-5’或5’-3’外切活性核酸酶在维持基因稳定性方面发挥非常重要的作用。这类酶从核酸的末端逐步切去单核苷酸。每次酶与底物结合催化,有几个核苷酸被切除掉,从而在DNA分子群内产生渐进缺失。本发明中使用代表酶是核酸外切酶III(ExonucleaseIII)。
针对上述特点,本发明设计的探针为茎环结构的单链寡核苷酸,环部有4个碱基,茎部有8对碱基。为了防止这种探针被非限制性核酸内切酶降解,探针每两个碱基之间的磷酸二酯键全部硫酰化,只有3’末端的碱基与其上标记的荧光基团之间连接的磷酸基团不硫酰化。这一磷酸酯结构作为ExonucleaseIII的识别位点。猝灭基团标记在3’→5’第四个碱基上,从而荧光基团与猝灭基团靠近,荧光处于猝灭状态。
当探针与酶反应时,上述未硫酰化的磷酸酯键被水解,荧光基团离开探针,从而荧光恢复。这种探针能够避免非限制性核酸内切酶和5’-3’方向核酸外切酶的干扰。同时,由于该磷酸酯键外有荧光基团保护,去磷酸酶也不能使这一探针产生信号。这种探针可用于多种具有3’-5’外切活性的核酸酶的检测。
3)脱嘌呤/脱嘧啶位点(APsite)内切酶探针
DNA容易受到外界因素如射线和化学试剂等的影响,从而产生DNA损伤。一旦产生损伤,DNA就容易在复制过程中产生突变。为了防止这种突变,生命体存在着基因修复响应机制。具有脱嘌呤/脱嘧啶(AP)内切活性的核酸酶在基因修复过程中起到重要的作用。本发明中选用的内切酶为核酸内切酶IV(EndonucleaseIV)和人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(HumanAPEndonuclease,简称APE1)。这两种酶都水解DNA上的完整AP位点,切割AP位点5’端的第一个磷酸二酯键,产生3’羟基和5’脱氧核糖磷酸末端。其他常见的AP内切酶包括Apn1和有AP切割活性的Exonuclease等。
针对上述特点,本发明设计的探针为具有AP位点的茎环结构的单链寡核苷酸,环部有8个碱基,茎部有15对碱基。为了防止非限制性核酸内切酶和核酸外切酶的干扰,我们将除AP位点5’以外的磷酸二酯键全部硫酰化。具体标记位置是:AP位点在5’→3’第八个碱基、荧光基团在5’→3’第三个碱基、猝灭基团在3’→5’第二个碱基。探针形成自杂交的发夹结构后,荧光猝灭。内切酶与探针反应时,未硫酰化的磷酸二酯键被水解,带有荧光基团的7个碱基片段离开探针,荧光恢复。由于探针只有一个可供DNase切割的位点,DNase识别困难,所以这种探针与DNase反应不产生信号。
本发明中的荧光基团可以选择FAM、TAMRA、Cy3和Cy5等常用的荧光基团,猝灭基团一般选择猝灭能力强的BHQ系列,如BHQ1或BHQ2。
如本文所用,下列词语/术语具有下列含义,除非另外说明。
“DNA”:脱氧核糖核酸;
“磷酸二酯键”:两个核苷酸分子核苷酸残基的两个羟基分别与同一磷酸基团形成的共价连接键;
“硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针”(简称硫代探针):具有自杂交结构的寡核苷酸序列,探针中的部分磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代。
本发明可快速准确地对三类重要的核酸酶的活性进行分析,具有高灵敏度和高选择性。如果结合多通道实时荧光仪器,可以实现高通量地对样品中酶组成的分析。本方法不仅操作简便,而且设计合成成本较低。利用本方法,可以对于核酸酶与DNA相互作用的特点和机理进行深入研究。另外,由于本方法具有高选择性和高灵敏度,可以对复杂生物样品中的酶组成进行分析和研究,也可以用于细胞中酶的原位荧光成像。本方法在疾病诊断、药物筛选、细胞分子生物学研究等方面均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点,其主要优点包括:
(1)反应与检测的高选择性,有利于抑制假阳性信号。本发明通过将探针的部分磷酸二酯键硫酰化来提高探针对目标酶的特异性。针对目标酶的特点,我们设计可供其催化水解的磷酸二酯键。而其他非目标酶由于硫酰化磷酸二酯键的存在,不与探针反应。
(2)高灵敏度,有利于样品中低含量酶的分析。本发明所有探针中都采用了自杂交的发夹结构,这样使得荧光基团和猝灭基团距离很近,荧光猝灭效率提高,降低了检测背景。另外,探针与酶反应后的产物均是携带有荧光基团的小片段离开探针,与猝灭基团彻底分离,荧光恢复效果好。
(3)检测窗口多样性,可用于多通道对多种酶进行同时检测。由于本发明是利用荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移来产生信号,所以可以更改探针荧光基团的标记种类,使得不同的酶对应不同窗口下的荧光信号。这对复杂生物样品和细胞成像提供了有利手段。
(4)在实际生物样品检测和细胞中酶的原位成像方面表现良好。基于高选择性和高灵敏度两大优点,本方法中的探针能够在少量目标酶和大量非目标酶的共存的体系中检出目标酶的信号。
附图说明
图1是本发明硫代修饰寡核苷酸荧光探针的检测模式示意图。
图2是针对非限制性核酸内切酶的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针对Hela细胞中的酶进行原位荧光成像的结果。
图3是针对核酸外切酶的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针对Hela细胞中的酶进行原位荧光成像的结果。
图4是针对脱嘌呤/脱嘧啶位点内切酶的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针对Hela细胞中的酶进行原位荧光成像的结果。
具体实施方式
下面结合附图,通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1<非限制性核酸内切酶DNaseI活性分析>
在该实施例中,使用硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1进行非限制性核酸内切酶DNaseI活性的检测并与其他酶产生的信号进行比较。
具体步骤如下:
1.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与不同浓度的DNaseI混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针非硫酰化部分的磷酸二酯键在DNaseI的催化下被水解为小片段,导致荧光基团与猝灭基团分离,荧光信号被释放,通过实时荧光PCR仪进行检测。随着反应的进行,被水解的探针增多,荧光信号快速增强,直到反应平衡,荧光强度达到平台值。
2.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与其他酶混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针1没有其他非目标酶的可及位点,荧光信号无明显上升。
在该实施例中,设计的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1序列如下:
5’-C*A*A*C*T*ACATCACTCGGATG*T*A*G*T*T*G-3’
*表示硫酰化磷酸二酯键,粗体字母分别标记荧光基团和猝灭基团。
不同DNaseI的50μL反应体系:硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1浓度为200nM
PCR方案是:37°C1250秒,每5s检测一次荧光强度,荧光增益值设定为10。
检测时使用的检测仪器为Rotor-GeneQ实时荧光PCR仪,激发波长为470nm,发射波长为510nm。
检测结果:
在反应前200s,荧光上升速率随着DNaseI浓度由低到高逐渐增加,酶浓度高于2.4U/ml的体系在5min即达到反应平台,荧光信号趋于稳定;反应20min后,荧光强度增强归一化数据如下表所示:
DNase I浓度(U/ml) | 1.2 | 0.8 | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
荧光增强效率(归一化) | 100% | 100% | 73% | 58% | 17% | 5% |
在20min内,其他酶与探针1的混合体系荧光均没有明显上升,在5min时其他酶以DNaseI反应体系荧光增强效率归一化数据如下表所示:
实施例2<核酸外切酶活性分析>
在该实施例中,使用硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针2进行非限制性核酸内切酶ExonucleaseIII活性的检测并与其他酶产生的信号进行比较。
具体步骤如下:
1.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针2起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与不同浓度的ExonucleaseIII混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针3’连接荧光基团的磷酸二酯键在ExonucleaseIII催化下水解,导致荧光基团离开探针,与猝灭基团分离,荧光信号被释放,通过实时荧光PCR仪进行检测。随着反应的进行,被水解的探针增多,荧光信号快速增强,直到反应平衡,荧光强度达到平台值。
2.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针2起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与其他酶混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针2没有其他非目标酶的可及位点,荧光信号无明显上升。
在该实施例中,设计的硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针2序列如下:
5‘-A*C*A*T*C*T*T*T*A*C*G*C*A*A*G*A*T*G*A*T-3‘
*表示硫酰化磷酸二酯键,粗体字母表示猝灭基团,3‘第一个碱基通过磷酸二酯键连接荧光基团。
不同ExonucleaseIII的50μL反应体系:硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针2浓度为200nM
PCR方案是:37°C,1250秒,每5s检测一次荧光强度,荧光增益为10。
检测时使用的检测仪器为Rotor-GeneQ实时荧光PCR仪,激发波长为470nm,发射波长为510nm。
检测结果:
在反应前200s,荧光上升速率随着ExonucleaseIII酶浓度由低到高逐渐增加,ExonucleaseIII酶浓度高于2U/ml的体系在5min即达到反应平台,荧光信号趋于稳定;反应20min后,荧光强度增强归一化数据如下表所示:
Exonuclease III浓度(U/ml) | 2 | 1 | 0.2 | 0.04 | 0.01 | 0.004 | 0.002 |
荧光增强效率(归一化) | 100% | 82% | 37% | 8% | 1.8% | 0.6% | 0.3% |
在20min内,其他酶与探针2的混合体系荧光均没有明显上升,在20min时其他酶以ExonucleaseIII反应体系荧光增强效率归一化数据如下表所示:
实施例3<脱嘌呤/脱嘧啶位点内切酶活性分析>
在该实施例中,使用硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针3进行脱嘌呤/脱嘧啶位点内切酶EndonucleaseIV活性的检测并与其他酶产生的信号进行比较。
具体步骤如下:
1.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针3起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与不同浓度的EndonucleaseIV混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针AP位点5’的磷酸二酯键在催化下被水解,带有荧光基团的小片段寡核苷酸离开探针,荧光基团与猝灭基团分离,荧光信号被释放,通过实时荧光PCR仪进行检测。随着反应的进行,被水解的探针增多,荧光信号快速增强,直到反应平衡,荧光强度达到平台值。
2.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针3起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与其他酶混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。探针3没有其他非目标酶的可及位点,荧光信号无明显上升。
在该实施例中,设计的硫代修饰的寡聚核苷酸荧光探针3序列如下:
5’-A*A*T*G*G*A*GX*G*A*A*G*G*G*A*T*T*T*A*G*A*G*G*T*C*C*C*T*T*C*A*C*T*C*C*A*T*T*-3’
*表示硫酰化磷酸二酯键,粗体字母分别标记荧光基团和猝灭基团,X表示APsite。
不同EndonucleaseIV的50μL反应体系:硫代修饰的寡聚核苷酸荧光探针3浓度为100nM
PCR方案是:37°C1250秒,每5s检测一次荧光强度,荧光增益为10。
检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Rotergene-Q,激发波长为470nm,发射波长为510nm。
检测结果:
在反应前400s,荧光上升速率随着EndonucleaseIV浓度由低到高逐渐增加,酶浓度高于8U/ml的体系在5min即达到反应平台,荧光信号趋于稳定;反应20min后,荧光强度增强归一化数据如下表所示:
Endonuclease IV浓度(U/ml) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.3125 |
荧光增强效率(归一化) | 100% | 100% | 82% | 33% | 18% | 6% |
在20min内,其他酶与探针1的混合体系荧光均没有明显上升,在20min时其他酶以EndonucleaseIV反应体系荧光增强效率归一化数据如下表所示:
实施例4<小鼠血清中核酸酶的分析检测>
在该实施例中,使用硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1和2对小鼠血清中的非限制性核酸内切酶和核酸外切酶的活性进行检测,并且进行加标回收率实验对其准确性进行评价。
具体步骤如下:
1.硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针1和2起始时的荧光信号为猝灭状态,分别与稀释的小鼠血清混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。两个探针分别被血清中对应的酶水解,荧光基团与猝灭基团分离,荧光信号被释放,通过实时荧光PCR仪进行检测。随着反应的进行,被水解的探针增多,荧光信号增强,直到反应平衡,荧光强度达到平台值。
2.将稀释的小鼠血清样品加入不同浓度的标准核酸酶分别与对应的探针进行混合,置于合适的溶液中形成反应体系。随着反应进行,探针被标准核酸酶和血清中存在和酶同时水解,荧光信号上升。
探针1和探针2所用的浓度均为200nM。
PCR方案是:37°C1250秒,每5s检测一次荧光强度,荧光增益为10。
检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Rotergene-Q,激发波长为470nm,发射波长为510nm。
检测结果:
在所有反应体系中,反应初始阶段,荧光上升随与时间成线性关系。随着反应的进行,底物数量的减少,反应速率变慢。在对血清中的酶进行检测和加标实验中,我们取每个反应体系的线性部分进行拟合,得到初始荧光上升速率,这一值与体系中酶的浓度线性相关。这样根据酶的标准曲线就能得到体系中相对于标准核酸酶的含量。下表中给出小鼠血清中核酸非限制性内切酶和核酸外切酶的含量和加标回收率。
上表的数据表明,稀释的小鼠血清中非限制性核酸内切酶和核酸外切酶分别为107和63U/L。根据稀释倍数,我们得到小鼠血清中非限制性核酸内切酶和核酸外切酶分别为85.9U/ml和630U/L。
实施例5<利用硫代修饰寡核苷酸荧光探针对Hela细胞中的酶进行原位荧光成像>
在该实施例中,我们将本发明中涉及到的三种探针分别导入Hela细胞,对细胞中的三类核酸酶进行荧光成像。
具体步骤如下:
1.在含有10%牛血清和1%双抗的DMEM培养液中培养Hela细胞。培养条件为37摄氏度,5%二氧化碳浓度。为了进行荧光成像实验,将细胞预先在96孔微孔板中培养,培养体积为每个孔100μL,细胞个数为5000-10000个。
2.由于寡核苷酸不能自主的进入细胞,所以要在溶血素蛋白(SLO)的辅助下进入细胞。先将SLO干粉溶于灭菌水中溶解,保证蛋白溶液浓度为0.4-1mg/mL。之后向其中加入1:1体积的甘油放入-20℃条件下分装保存备用。进行荧光成像实验时,将SLO溶液与探针溶液混合,溶液中探针浓度为1μM,SLO浓度为1.6U/ml。取出细胞培养液,加入上述溶液,使其与细胞接触5min,然后再换上培养液。0.5h后在荧光显微镜下观察。
在该实施例中,荧光显微镜为OlympusIX71研究型,成像中用的激发波长为460-495nm,发射波长为510-550nm。曝光时间为10ms,EmGain调节至100。
三种硫代修饰寡核苷酸荧光探针的细胞荧光成像结果显示于图2-4。在SLO的作用下,探针1-3分别被导入细胞。在细胞内,探针逐渐被相对应的酶水解,荧光上升。从荧光显微镜可以直接观察荧光的变化,图片是根据荧光强度染色的结果。
Claims (1)
1.一种用于非限制性脱氧核糖核酸内切酶DNaseI检测的硫代探针,具有茎环结构,其环部为单链结构,该探针从5’端部开始有六个碱基之间为硫酰化磷酸二酯键,从3’端开始有七个碱基之间为硫酰化磷酸二酯键,荧光基团FAM标记在5’→3’第五个碱基上,猝灭基团BHQ1标记在3’→5’第六个碱基上,硫代探针序列如下:
5’-C*A*A*C*T*ACATCACTCGGATG*T*A*G*T*T*G-3’
*表示硫酰化磷酸二酯键。
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