CZ308387B6 - Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA - Google Patents
Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308387B6 CZ308387B6 CZ2019-41A CZ201941A CZ308387B6 CZ 308387 B6 CZ308387 B6 CZ 308387B6 CZ 201941 A CZ201941 A CZ 201941A CZ 308387 B6 CZ308387 B6 CZ 308387B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fluorochrome
- oligonucleotide
- dna
- sensors
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení popisuje způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA. Popsaný přístup je založen na inkubaci speciálních senzorů v prostředí obsahujícím enzymy způsobující degradaci DNA a následném měření fluorescenčního signálu, který je produkován aktivitou těchto enzymů. Senzory jsou složeny z částic, avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu a oligonukleotidových sond, které obsahují fluorochrom a molekulu bránící fluorescenci tohoto fluorochromu (zhášeč fluorescence). Pro přístup je zásadní, aby poměr mezi povrchem a objemem jedné takové částice byl větší než 1,2 µma žádný z rozměrů částice nepřesahoval 10 µm. Částice nesou na svém povrchu avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin, které jsou k povrchu částic připojeny kovalentně nebo nekovalentně. V senzorech je k avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu na povrchu senzorů navázán jednořetězcový oligonukleotid a to prostřednictvím biotinu, který je ukotven na jednom jeho konci. Délka tohoto oligonukleotidu s navázaným biotinem je minimálně 6 nukleotidů a maximálně 100 nukleotidů. Tento oligonukleotid současně páruje s jiným jednořetězcovým oligonukleotidem o minimální velikosti 6 nukleotidů a maximální velikosti 100 nukleotidů. Jeden z těchto oligonukleotidů obsahuje fluorochrom a druhý oligonukleotid molekulu, která brání fluorescenci tohoto fluorochromu. Fluorochrom je připojen k oligonukleotidu na 5' nebo 3' konci. Molekula, která brání fluorescenci fluorochromu je navázána na opačném konci, než je navázán fluorochrom. Popsaný systém se vyznačuje vysokou citlivostí a vysokou linearitou měření.
Description
Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká přístupu pro stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA.
Dosavadní stav techniky
Pro stanovení aktivity enzymů, které degradují DNA, např. nukleáz, které štěpí fosfodiesterovou vazbu v DNA řetězcích, je možné použít celou řadu metod. Jedním z příkladů je měření produktů reakce pomocí radioizotopů a elektroforetického dělení nebo chromatografie (J. Biol. Chem., 263, 4450-4459; BMC Mol. Biol., 7, 1-20; Protein Sci., 17(12), 2059-2069). Jedná se sice o senzitivní, ale relativně zdlouhavé a poměrně drahé metody, které navíc vyžadují dodržování pravidel pro práci s radioaktivními látkami. Proto byly vyvinuty další přístupy založené na celé řadě principů. Příkladem je SRED (single radial enzyme diffusion) metoda (Clin. Chem., 39, 448452; Biochem. Biophys. Res. Commun., 269, 481-484) či měření aktivity pomocí hmotnostní spektrometrie (Mech. Ageing Dev., 133, 575-579). Dalšími příklady jsou metoda založená na fluorimetrické analýze a barvivu PicoGreen (Anal. Biochem., 281, 95-97; Nucleic Acids Res., 31(18), el 11), metoda založená na fluorescenčně značené sondě a gelové elektroforéze (J. Vis. Exp., 82, e50722), metody využívající fluorescenční sondu a molekulu, která efektivně zabraňuje fluorescenci fluorescenční sondy (zhášeč fluorescence), pokud se nachází v její blízkosti (Anal. Chem., 85, 9939-9946; Analyst, 135, 2394-2399) nebo metoda založená na nanoklastrech mědi (J. Microbiol. Biotechnol., 28(9), 1467-1472. Přehled dalších metod, které byly vyvinuty je uveden např. v této souhrnné práci (Sensors (Basel), 14(7), 12437-12450).
Dalšími enzymy s degradačními aktivitami jsou enzymy, které se uplatňují při opravách různých poškození DNA a odštěpují jen některé báze. Typickým příkladem jsou DNA glykosylázy, které působí na uracilu a jejichž aktivita vede k přerušení N-glykosidické vazby a k odstranění uracilu z molekuly DNA. DNA glykosylázy však působí i na dalších bázích (Chromosoma, 121, 1-20; Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 43-49). V případě stanovení aktivity DNA glykosyláz je počet používaných přístupů mnohem nižší než v případě nukleáz. Jiným příkladem enzymů degradujících DNA jsou AP (apurinové/apyrimidinové) endonukleázy, které působí na místech v řetězcích DNA, kde chybí báze (abazická místa) (J. Biol. Chem., ΠΊ, 41715-41724). Rovněž v tomto případě je počet technologií používaných ke stanovení jejich aktivity relativně nízký. Příkladem použitelného přístupu pro stanovení aktivity těchto enzymů je technologie založená na upravené molekule DNA, která vytváří speciální sekundární strukturu a současně nese na jednom konci fluorescenční molekulu a na druhém konci molekulu, která brání fluorescenci této sondy (zhášeč fluorescence) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 319(1), 240-246).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA. Popsaný přístup je založen na inkubaci speciálních senzorů v prostředí obsahujícím enzymy způsobující degradaci DNA a následném měření fluorescenčního signálu, který je produkován aktivitou těchto enzymů. Senzory jsou složeny z částic, avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu a oligonukleotidových sond, které obsahují fluorochrom a molekulu bránící fluorescenci tohoto fluorochromu (zhášeč fluorescence). Pro přístup je zásadní, aby poměr mezi povrchem a objemem jedné takové částice byl větší než 1,2 pm-1 a žádný z rozměrů částice nepřesahoval 10 pm.
- 1 CZ 308387 B6
Částice nesou na svém povrchu avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin, které jsou k povrchu částic připojeny kovalentně nebo nekovalentně. V senzorech je k avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu navázán jednořetězcový oligonukleotid, a to prostřednictvím biotinu. Biotin je výhodně připojen k oligonukleotidu na jeho 3' nebo 5' konci. Délka oligonukleotidu s navázaným biotinem je minimálně 6 nukleotidů a maximálně 100 nukleotidů. Tento oligonukleotid současně páruje s jiným jednořetězcovým oligonukleotidem o minimální velikosti 6 nukleotidů a maximální velikosti 100 nukleotidů. Jeden z těchto oligonukleotidů obsahuje fluorochrom a druhý oligonukleotid molekulu, která brání fluorescenci tohoto fluorochromu (zhášeč fluorescence). Fluorochrom je připojen k oligonukleotidu výhodně na 5' nebo 3' konci. Molekula, která brání fluorescenci fluorochromu je pak navázána na opačném konci, než je navázán fluorochrom. Komplex obou oligonukleotidových řetězců pak tvoří sondu.
Enzymy způsobující degradaci DNA (degradační enzymy) mohou být s výhodou DNA glykosylázy např. UNG, SMUG1, MBD4, TDG, OGGI, MYH, MPG, NTHL1, NEIL1, NEIL2, nebo NEIL3 a obecné nukleázy např. DNáza I, exonukleáza III, S1 nukleáza, FEN1, NucA, Endo G, CAD, Nuc, DNase II, colicin E7-9, Casl, Cas2, Cas6, Wm, Mřel 1, Artemis, Dna2, 3' Exo I, 3' Exo X, MutH, Vsr, 5' Exo I, RecJ, UvrC, XPF, XPG, Endo IV, Spoil, RuvC, Endo I, Mus81, Genl, RusA, Endo VII, Rep endonukleáza nebo restrikční endonukleázy nebo AP endonukleázy (nukleázy štěpící DNA na abazickém místě).
V případě, že je stanovována degradační aktivita nukleáz, jsou báze v oligonukleotidech výhodně adenin (A), guanin (G), tymin (T) a cytosin (C). V případě, že je sledována degradační aktivita vyvolaná DNA glykosylázami, obsahuje alespoň jeden z oligonukleotidů tvořících sondu v oblasti, kde dochází ke vzájemnému párování řetězců použitých oligonukleotidů, alespoň jednu bázi, která je substrátem sledované DNA glykosylázy. Příkladem je uracil a/nebo 5-fluorouracil a/nebo 5- hydroxymetyluracil a/nebo etenocytosin a/nebo tymin glykol a/nebo 5-hydroxylcytosin a/nebo 3- metyladenin a/nebo hypoxantin a/nebo 7-metylguanin a/nebo 3-metylguanin a/nebo 5formyl cytosin a/nebo 5-karboxyl cytosin a/nebo 8-oxo-7,8-dihydroguanin a/nebo 2,6-diamino-4hydroxy-5-N-metylformamidopyrimidin. V případě stanovení AP endonukleázové aktivity, obsahuje alespoň jeden z oligonukleotidů tvořících sondu v oblasti, kde dochází ke vzájemnému párování řetězců použitých oligonukleotidů, alespoň jedno abazické místo. Toto místo je výhodně vytvořeno pomocí uracilové DNA glykosylázy ze sondy obsahující uracil.
Po umístění senzoru do prostředí obsahujícího pouze nukleázy dochází působením nukleáz v závislosti na složení sond k různé degradaci řetězců. Tato degradace vede postupně k prostorovému oddělení fluorochromu a molekuly bránící jeho fluorescenci. Nárůst fluorescence je přímo úměrný aktivitě nukleáz. Pro nalezení nej vhodnějších podmínek je vhodné před začátkem měření provést optimalizaci podmínek pro daný experiment a danou sondu. Optimalizace se týká především teploty a složení roztoku, zvláště obsahu dvojmocných a jednomocných iontů a pH.
V případě umístění senzoru do prostředí obsahujícího pouze DNA glykosylázy dochází k vyštěpení cílové báze. To destabilizuje párování oligonukleotidů v sondě, dochází k oddělení oligonukleotidů a k nárůstu fluorescence. Destabilizace je přímo úměrná počtu bází, které jsou substrátem DNA glykosylázy. Důležitou roli rovněž hraje celková délka komplementárních úseků oligonukleotidů, teplota a podíl AT párů a GC párů. Např. při délce komplementárního úseku 14 bází a 30% obsahu GC párů je při teplotě 25 °C dostatečná přítomnost jediného uracilu pro oddělení obou oligonukleotidů sondy. Podobně jako v případě nukleáz je vhodné pro nalezení nej vhodnějších podmínek provést optimalizaci teploty a složení roztoku, zvláště obsahu dvojmocných a jednomocných iontů a pH.
V případě umístění senzoru se sondou obsahující abazické místo do prostředí obsahujícího pouze AP endonukleázy dochází k přerušení oligonukleotidu, který obsahuje toto abazické místo. Aby mohlo dojít k nárůstu fluorescence, je třeba volit takovou pozici abazického místa, aby po
-2CZ 308387 B6 působení AP endonukleázy byl vytvořen dostatečně krátký řetězec, který za daných podmínek není schopen dále setrvat v sondě. Tento řetězec musí na svém konci obsahovat buď fluorochrom nebo zhášeč fluorescence. Délka tohoto řetězce je vhodně volena tak, aby tento řetězce byl kratší než 10 nukleotidů. Podobně v případě restrikčních endonukleáz je třeba volit sekvence oligonukleotidů tak, aby štěpení uvolnilo část řetězce s fluorochromem a/nebo zhášečem fluorescence, která je kratší než 10 nukleotidů.
Při konjugaci částic obsahujících avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin je výhodně nejprve provedena inkubace s oligonukleotidem, který obsahuje biotin a následně s oligonukleotidem, který páruje s tímto oligonukleotidem. Výhodným příkladem roztoku pro konjugaci částic s oligonukleotidy je roztok 5 až 100 mmol.l1 tris(hydroxymethyl)aminomethanu (Tris-HCl), pH 6 až 8, 40 až 200 mmol.l1 NaCl, 0,01 až 0,5% (hmotnost/obj.) BSA (hovězí sérový albumin) a 0 až 0,5% (obj./obj.) Tween 20 (polyoxyetylen sorbitan monolaurát). Výhodným příkladem roztoku pro měření degradační aktivity je 2 až 100 mmol.l1 Tris-HCl, pH 6 až 8, 0 až 10 mmol.l1 EDTA (kyselina etylendiamintetraoctová) a 0,1 až 20 mmol.l1 MgCb a/nebo MnCb a/nebo 40 až 150 mmol.l1 NaCl a/nebo KC1.
Pro posouzení jednotlivých aktivit v různorodých systémech je výhodné použít směs různých senzorů obsahujících jednu sondu nebo použít senzory pokryté více druhy sond. V případě použití měřicích systémů dovolujících identifikaci individuálního senzoru (např. mikroskopu), je výhodné použít senzory, které obsahují vlastní identifikátor, např. fluorochrom. V případě, že je použita směs různých senzorů bez vlastního identifikátoru nebo systém měření, který tuto identifikaci nepodporuje nebo je použit jeden senzor s různými sondami, odlišují se jednotlivé sondy použitými fluorochromy. Tyto fluorochromy se vyznačují odlišnými excitačními a/nebo emisními spektry.
Vyvinutý systém poskytuje oproti současným systémům několik výhod. Především se vyznačuje extrémně vysokou senzitivitou, a to i v systémech obsahujících velice heterogenní směsi, jako jsou buněčné lyzáty. Popsaný systém umožňuje např. stanovit aktivitu jedné jednotky rekombinantní uracilové DNA glykosylázy v 1,6 litru roztoku, a to i v případě, že sondy obsahují v řetězci jen jediný uracil. Oproti systému založeném na neukotvené sondě nebo na sondě ukotvené prostřednictvím biotinu a streptavidinu např. na plochu dna černé polystyrénové destičky nebo na částice s poměrem mezi povrchem a objemem alespoň 5x menším než 1,2 pm1 se jednalo o přibližně pěti až desetinásobný nárůst senzitivity. Podobný nárůst senzitivity byl zaznamenán i v případě testování nukleázové aktivity např. u DNázy I nebo exonukleázy III. Současně je patrné, že zatímco vysoká koncentrace neukotvených sond má inhibiční vliv na stanovované reakce, v případě sond ukotvených na částice nebyl vliv vysoké koncentrace pozorován. Námi popsaný systém navíc poskytuje lineární průběh nárůstu signálu v širokém rozmezí koncentrací enzymů po dobu více jak 20 minut. V případě použití neukotvených sond je tento nárůst ve všech testovaných koncentracích lineární pouze po dobu maximálně 5 minut. Signál je výhodně změřen pomocí čtečky destiček.
V případě, že je pro měření signálu použit mikroskop, zobrazují se senzory jako částice, jejichž fluorescence vzrůstá v závislosti na aktivitě degradačních enzymů. To umožňuje, na rozdíl od neukotvených sond nebo obdobných jednoduchých, dříve popsaných sond založených na vlásence (Biochem. Biophys. Res. Commun., 319(1), 240-246), měřit s vysokou přesností aktivitu degradačních enzymů v různých místech studovaného systému. Pro mikroskopické analýzy obsahují sondy fluorochrom vázaný na tom oligonukleotidu, který obsahuje na jednom konci biotin (kotvicí oligonukleotid). Současně obsahují částice výhodně identifikátor, kterým je výhodně fluorochrom odlišný od fluorochromu použitého v sondách. Rovněž výhodně je možné použít směs odlišně velkých senzorů pro měření aktivit různých degradačních enzymů. Identifikátorem je potom velikost senzoru.
Senzory je možné výhodně použít pro testování vlivu složení sond na jednotlivé degradační aktivity studovaných enzymů.
-3 CZ 308387 B6
Částice jsou výhodně magnetické. To poskytuje možnost rychlé a snadné separace částic a zjednodušuje přípravu senzorů s navázanou sondou/sondami. Je možné použít jakékoli magnetické částice, např. částice s obsahem železa a/nebo oxidu železa a/nebo oxidu manganu a/nebo oxidu zinku a/nebo oxidu kobaltu. Tyto částice mohou rovněž výhodně obsahovat další komponenty, např. oxid křemičitý, uhlíkové sloučeniny, nebo zlato nebo albumin nebo polystyren nebo kyselinou hyaluronovou nebo kyselinu alginovou, případně různé bílkoviny, cukry nebo mastné kyseliny. Tyto složky mohou být výhodně součástí i nemagnetických částic.
Výhodně je oligonukleotid, který obsahuje biotin, dlouhý 9 až 50 nukleotidů, výhodněji 25 až 35 nukleotidů. Oligonukleotid, který páruje s oligonukleotidem obsahujícím biotin, je výhodně dlouhý 9 až 35 nukleotidů. V případě stanovení DNA glykosylázové aktivity je výhodně dlouhý 9 až 17 nukleotidů.
V případě, že jsou senzory určeny pro stanovení DNA glykosylázové aktivity, je výhodně oligonukleotid obsahující biotin opatřen fluorochromem nebo molekulou, která zháší fluorescenci fluorochromu v párujícím řetězci na 5' konci nebo jeho blízkosti. Toto uspořádání je vysoce odolné proti exonukleázám.
V případě, že jsou senzory určeny pro stanovení aktivity nukleáz, zvláště exonukleáz, je výhodně oligonukleotid obsahující biotin opatřen fluorochromem nebo molekulou, která zháší fluorescenci v párujícím řetězci na 3' konci nebo v jeho blízkosti.
Biotin určený k ukotvení oligonukleotidu na senzory je výhodně připojen na 5' konci nebo 3' konci oligonukleotidu. Biotin je výhodně připojen k 5' nebo 3' konci oligonukleotidu prostřednictvím oddělovacího segmentu, např. uhlíkového řetězce nebo polyetylenglykolového řetězce.
Jako fluorochromy je možné použít jakýkoli fluorochrom, jehož fluorescenci je možné potlačit jinou molekulou (zhášečem). Výhodně jsou jako fluorochromy použity deriváty odvozené od xantenu jako je např. fluorescein nebo fluorescein izothiokyanát (FITC), karboxyfluorescein (izoméry: 5-FAM, 6-FAM) nebo 6-karboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimetoxyfluorescein (JOE) nebo 6hexachloro-fluorescein (HEX) nebo tetrachlorofluorescein (TET) nebo Alexa Fluor barviva. jako např. Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647 (Schéma 1) nebo Oregon Green barviva, např. Oregon Green 488, Oregon Green 514 (Schéma 2) nebo karboxytetrametyl-rodamin (TAMRA, Schéma 3).
-4CZ 308387 B6
A<šsSřSws®$4>'
Schéma 1. Strukturní vzorce některých Alexa Fluor harviv (převzato a upraveno z https://www. atdhio. com/content/34/Alexa-dyes).
Orsgsíi OřW 4SS Otegass Gf e&s 514
Schéma 2. Strukturní vzorce některých Oregon Green harviv (převzato a upraveno z https://wwwthermofisher. com/).
’X s
Schéma 3. Strukturní vzorec barviva TAMRA (převzato a upraveno z https://www. thermofisher, com/).
Rovněž výhodně je možné použít jako fluorochromy cyaninová barviva, např. Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 (Schéma 4).
Schéma 4. Strukturní vzorce některých cyaninových harviv (převzato a upraveno z Šebelová J, Syntéza a modifikace látek zhášejících fluorescenci, Diplomová práce, 2009, KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV, FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ).
Případně je možné použít deriváty 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenu (BODIPY) nebo fluorochromy s kumarinovou strukturou nebo s chinolinovou strukturou jako jsou např. ATTO barviva, např. ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514 (Schéma 5)·
ΛΐΚί#ί·ί Λ»
Schéma 5. Strukturní vzorce některých ATTO barviv (převzato a upraveno z https://www.attotec.com).
Jako molekuly bránící fluorescenci (zhášeče fluorescence) je možné použít různé molekuly, které brání fluorescenci fluorochromu. Výhodně se jedná např. o látky s polyaromatickým azoskeletem jako jsou „Black Hole Quencher“ (BHQ, např. BHQ1, BHQ2, BHQ3, BHQO; Schéma 6) nebo zhášeč BlackBerry™ Quencher 650 (Schéma 7).
-6CZ 308387 B6
8KO3
«S3
Schéma 6. Strukturní vzorce BHQ zhášečů (převzato a upraveno z https://www.atdhio.com/content/35/FRET-fluorescence-quenchers).
Další výhodnou skupinou jsou Iowa Black zhášeče (Schéma 7), nebo látky se strukturním základem 1,4-diaminoanthrachinonu například Disperse Blue zhášeč (Schéma 7).
Disperse Bte BiščkBsoy Qrieseh»
Schéma 7. Strukturní vzorce dalších zhášečů (převzato a upraveno z Šebelová J, Syntéza a ίο modifikace látek zhášejících fluorescenci, Diplomová práce, 2009, KATEDRA FARMACEUTICKÉ
CHEMIE A KONTROLY LÉČIV, FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ).
Vzhledem k uspořádání, kdy jsou fluorochrom a jeho zhášeč v těsném kontaktu, je možné výhodně použít i méně silné zhášeše, jako je např. 4-((4-(dimetylamino)fenyl)azo)benzoovou 15 kyselinu a její deriváty (dabcyl) nebo 4-dimetylaminoazobenzen-4-sulfonyl chlorid a jeho deriváty (dabsyl; Schéma 8).
-7CZ 308387 B6
OH
Schéma 8. Strukturní vzorce zhášečů dabcylu a dabsylu (převzato a upraveno z https://www.aatbio.com/products/dabcvl-acid-4-4-dimethvlamino-vhenvl-azo-benzoic-acid-cas6268-49-1 a z Šebelová J, Syntéza a modifikace látek zhášejících fluorescenci, Diplomová práce, 2009, KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV, FARMACEUTICKÁ
FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ).
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou jako senzory použity superparamagnetické částice pokryté vrstvou avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu. Výhodně je avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin vázán k povrchu částic kovalentně. Výhodně je poměr mezi povrchem a objemem použité částice větší než 3 μπτ1.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je délka oligonukleotidu s navázaným biotinem 9 až 30 nukleotidů. Rovněž ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je délka oligonukleotidu, který páruje s biotinylovaným oligonukleotidem, 9 až 25 nukleotidů. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je fluorochromem 5-FAM nebo 6-FAM a zhášečem fluorescence BHQ1.
V jednom z výhodných provedení předkládaného vynálezu je současně k částicím připojen pomocí biotinu další fluorochrom, který je odlišný od fluorochromu v sondě nebo sondách. Výhodně je tímto fluorochromem cyaninové barvivo, např. Cy5. Tento fluorochrom slouží pro stanovení množství částic v různých vzorcích. Pokud je použit tento druhý fluorochrom pro stanovení množství částic, je nutné, aby jeho spektrální charakteristiky, to je excitační a emisní profil, byly natolik odlišné od excitačního a emisního profilu fluorochromu v sondě nebo sondách, aby dovolily nezávislé stanovení dvou nebo více fluorochromů.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou senzory inkubovány neboje směs senzorů inkubována se vzorkem obsahujícím enzymy degradující DNA, např. exonukleázy, endonukleázy, DNA glykosylázy nebo AP endonukleázy. Vzorkem může být roztok obsahující enzym degradující DNA nebo směs enzymů degradujících DNA nebo buněčný lyzát nebo buňky nebo tkáně. V průběhu této inkubace je v pravidelných časových odstupech, např. po 5 sekundách nebo 1 minutě nebo 2 nebo 4 nebo 10 minutách nebo až po této inkubaci, např. po 5 minutách nebo 10 minutách nebo 40 minutách nebo 120 minutách změřen fluorescenční signál poskytovaný těmito senzory. Naměřené signály slouží ke stanovení rychlosti reakce. Pokud se jedná o heterogenní směsi různých enzymů, např. buněčné lyzáty nebo směsi nukleáz a DNA glykosyláz, jsou výhodně použity dva senzory s odlišnými sondami nebo senzor, který je vybaven dvěma odlišnými sondami. Pokud jsou použity dva různé senzory, sondy se výhodně liší jen obsahem báze, která je terčem glykosylační aktivity použité DNA glykosylázy. Například v případě uracilové DNA glykosylázy pouze jedna z použitých sond obsahuje uracil. V případě, že se sondy nacházejí na stejném senzoru, liší se sondy i sekvencemi bází v oligonukleotidech. Takováto uspořádání pak dovolují rychle stanovit aktivity jednotlivých enzymů díky možnosti stanovit vliv nukleáz na sondu, která je použita pro stanovení DNA glykosylázové aktivity. Výhodně jsou signály poskytované sondou bez báze pro určení DNA glykosylační aktivity odečteny od signálů sondy s touto bází, např. uracilem.
Ve výhodném provedení se předkládaný způsob vyznačuje tím, že
i) částice, které mají poměr mezi povrchem a objemem větší než 1,2 μηΤ1 a jejichž žádný z
- 8 CZ 308387 B6 rozměrů nepřesahuje 10 pm, obsahující na svém povrchu navázaný avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin, přičemž k avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu je navázán prostřednictvím biotinu alespoň jeden jednořetězcový první oligonukleotid o délce od 6 do 100 nukleotidů, pňčemž první oligonukleotid je současně párovaný s druhým jednořetězcovým oligonukleotidem o délce od 6 do 100 nukleotidů, přičemž první nebo druhý oligonukleotid obsahuje fluorochrom a s ním párovaný oligonukleotid obsahuje zhášeč fluorescence, se inkubují v prostředí obsahujícím alespoň jeden enzym způsobující degradaci DNA, s výhodou je enzymem způsobujícím degradaci DNA nukleáza a/nebo DNA glykosyláza;
ii) v průběhu inkubace a/nebo po inkubaci v kroku i) se provede měření fluorescenčního signálu fluorochromu;
iii) stanoví se aktivita enzymu způsobujícího degradaci DNA, přičemž nárůst fluorescence je přímo úměrný aktivitě enzymu způsobujícího degradaci DNA.
Výhodně je avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin k povrchu částic navázán kovalentně nebo nekovalentně.
Rovněž výhodně je fluorochrom připojen k prvnímu nebo druhému oligonukleotidu na 5' konci a zhášeč fluorescence je navázán k párujícímu oligonukleotidu na 3' konci nebo fluorochrom je připojen k prvnímu nebo druhému oligonukleotidu na 3' konci a zhášeč fluorescence je navázán k párujícímu oligonukleotidu na 5' konci.
Ve výhodném provedení oligonukleotid obsahuje alespoň jednu bázi, která je substrátem enzymu způsobujícího degradaci DNA, s výhodou je tato báze vybraná ze skupiny zahrnující uracil a/nebo 5-fluorouracil, 5-hydroxymetyluracil, etenocytosin, tymin glykol, 5-hydroxylcytosin, 3metyladenin, hypoxantin, 7-metylguanin, 3-metylguanin, 5-formyl cytosin, 5-karboxyl cytosin, 8oxo-7,8-dihydroguanin, 2,6-diamino-4-hydroxy-5-N-metylfbrmamidopyrimidin.
Ve výhodném provedení obsahuje jeden oligonukleotid alespoň jedno abazické místo. Rovněž výhodně je abazické místo umístěno ve vzdálenosti menší než 10 nukleotidů od fluorochromu.
Ve výhodném provedení jsou částice magnetické.
Fluorochrom je výhodně vybraný ze skupiny zahrnující deriváty xantenu, zejména fluorescein nebo fluorescein izothiokyanát (FITC), karboxyfluorescein, zejména izoméry 5-FAM a 6-FAM, 6- karboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimetoxyfluorescein (JOE), 6-hexachloro-fluorescein (HEX), tetrachlorofluorescein (TET), Alexa Fluor barviva, zejména Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647, Oregon Green barviva, zejména Oregon Green 488, Oregon Green 514, karboxytetrametyl-rodamin, cyaninová barviva, zejména Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, deriváty 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenu (BODIPY), látky s kumarinovou strukturou a látky s chinolinovou strukturou, zejména ATTO barviva, zejména ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514.
Zhášeč fluorescence jsou výhodně látky s polyaromatickým azoskeletem, zejména zhášeče „Black Hole Quencher“, například BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, BHQ-0 nebo zhášeč BlackBerry TM Quencher 650 nebo Iowa Black zhášeče nebo látky se strukturním základem 1,4diaminoanthrachinonu, zejména Disperse Blue zhášeč nebo 4-((4(dimetylamino)fenyl)azo)benzoová kyselina (dabcyl) a její deriváty nebo 4dimetylaminoazobenzen-4-sulfonyl chlorid (dabsyl) a jeho deriváty.
Ve výhodném provedení částice obsahuje alespoň jeden další fluorochrom, který je navázaný na povrchu částice pomocí biotinu, přičemž excitační a/nebo emisní profil tohoto dalšího fluorochromu je odlišný od excitačního a/nebo emisního profilu fluorochromu v oligonukleotidu.
-9CZ 308387 B6
Objasnění výkresů
Obrázek 1 Stanovení glykosylázové aktivity v buněčných lyzátech pomocí senzorů a pomocí nenavázané sondy.
Na obrázku je znázorněn výsledek porovnání aktivity uracilové DNA glykosylázy pomocí senzorů a pomocí nenavázané sondy. Senzory obsahovaly fluorochrom 6-FAM. K připraveným sondám navázaným nebo nenavázaným na částicích byl přidán jaderný lyzát připravený z HeLa buněk, který obsahoval 2 pg.ml1 proteinů. Signál byl měřen pomocí čtečky destiček (excitační vlnová délka: 488 nm; emisní vlnová délka: 520 nm). Signál byl měřen lOx, a to každé 2 minuty, při teplotě 25 °C.
Obrázek 2 Stanovení aktivity uracilové DNA glykosylázy v roztoku
Na obrázku je znázorněn výsledek měření aktivity uracilové DNA glykosylázy (UNG) dle postupu popsaném v příkladu 2. K připraveným senzorům se sondami s fluorochromem 6-FAM a současně značeným fluorochromem Cy5 byl přidán roztok rekombinantní UNG v ředění 1:125 000 (specifická aktivita neředěného enzymu byla 5 U.pl1). Signál byl měřen pomocí čtečky destiček (excitační vlnová délka: 488 nm; emisní vlnová délka: 520 nm, 6-FAM a excitační vlnová délka: 630 nm; emisní vlnová délka: 680 nm, Cy5). Signály byly měřeny lOx každé 4 minuty, při teplotě 25 °C. Signál 6-FAM byl dělen signálem Cy5.
Seznam použitých zkratek
EDTA kyselina etylendiamintetraoctová
BSA hovězí sérový albumin
Tris-HCl roztok tris(hydroxymehyl)aminometanu
Tween 20 polyoxyetylen sorbitan monolaurát
BHQ Black Hole Quencher
UNG uracilová DNA glykosyláza
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava senzorů s navázanou sondou/sondami.
Následující postup popisuje přípravu senzorů s navázanou sondou/sondami. Pro jejich přípravu byly použity částice pokryté streptavidinem a/nebo avidinem a/nebo neutravidinem a oligonukleotidové sondy.
Streptavidinem pokryté magnetické částice měly průměr 23 pm nebo 10 pm nebo 6 pm nebo 4,5 pm nebo 3 pm nebo 2,8 pm nebo 1 pm nebo 500 nm nebo 200 nm 100 nm nebo 50 nm. Avidinem pokryté částice měly průměr 8 pm nebo 4,5 pm nebo 1 pm. Neutravidinem pokryté částice měly průměr 3 pm nebo 1 pm. V některých provedeních byly použity streptavidinem pokryté magnetické částice, kterých povrch byl rovněž přímo fluorescenčně značen a které měly průměr 3 pm nebo 1 pm. Strepavidinem pokryté nemagnetické částice měly průměr 1 pm nebo 500 nm nebo 200 nm 100 nm nebo 50 nm, avidinem pokryté nemagnetické částice měly průměr 1 pm a neutravidinem pokryté nemagnetické částice měly průměr 1 pm.
Oligonukleotidové sondy obsahovaly kotvicí oligonukleotid a komplementární oligonukleotid. V
- 10 CZ 308387 B6 tabulce 1 jsou uvedeny některé z použitých kotvicích oligonukleotidů a v tabulce 2 některé z použitých komplementárních oligonukleotidů. Obě tabulky zahrnují sekvenci jednotlivých oligonukleotidů psanou ve směru 5' - 3' a rovněž použité modifikace. Některé z oligonukleotidů obsahovaly ve svém řetězci uracil místo tymidinu.
Tabulka 1 Kotvicí oligonukleotidy
| i i 1 | Mm...... | CG | c μγτχν áá | Γ V A A ACČUC | A< G'A C A | M | ||
| .¾ Γ í? Π (A | A|O | Td | ď TAM | |||||
| FAM | CG | ϊΧΜΜ t:g | v | |||||
| 1 | v r | V’AiA;G t gV | * ξ ϊ : >: > ϊ ϊ | ιχχχ^χχχχχΧχχχΛ.Χ* X.XV.SW4.V.VJ 1 s ř · > > | | FÁM | |||
| 1 1 1 1 | .ZbS:Í1 | V G | úg.ááf | GyW <.,»AG;A | w | do | Q bšAri | |
| vívXÁ vÁ5c | t'; A Μ V Xs CXýAjA | aí Γ T CT ΓΑ | ||||||
| FÁM | ť G | τ tRáa v vide | CňVCCA C\A. | e| bMM | ||||
| bhm | CG | qGTÁV ΑΌ | cv;Á;Á | αγμ c t V | A | AG | q FAM | |
| V.a|GC O C id A A | Aš O C F ΐ A |
Tabulka 2 Komplementární oligonukleotidy
| 1 | wáiteg T | |||||||||
| 1 | Τ'ΑίΑίη A AŠVhldAVG ; | ^TTTTr | ......... 8 | ......BÉH...... | ||||||
| i | BHQM jvýC | ÁÁÁMATcMlÁhMÁ; ) ' Γ | ||||||||
| i | h | ΕΛ-AO A ATnklAAAG ' š | J.SSSS | |||||||
| I i | mám lve | ΑΧ'.ΓΤ A V V | Αμπγττ : ' : | Λ X X . V X . | $ | |||||
| hd | lM .VG A AjV | Uck'V G s ! | J: ϊ s < .; | |||||||
| i | BHQM d' | Áv dqÁÁ;G | a>kw : ' i | it.. | 5 í | Ϊ .... | ||||
| 1 | ____ FÁM .Ca' | tIáIáxMáX | 1 VpAAMš ' s | ...... i i; | ||||||
| 1 | aRá''Ť.a'ÁG | ÁÁInrf - : 5 | $ ' | |||||||
| 1 | AšldýCAVd ; Η d | ; i ' | ||||||||
| 1 | AiV'TiT'A ÁgK l· ' ’ ; í | ·. ; | .... | |||||||
| -GV | AdT'Ť:A-ÁdAíAhšt t ' í $ | i | ||||||||
| 1 | _____XIL | Ch>T V'GiC'G | ΟΠΠΊΤ A AdAÍA | i\dÁ.VA> |
A) K 1 ml pufru A (složení viz část Použité roztoky a chemikálie) ve zkumavce o objemu 2 ml byl přidán 1 mg částic.
B) Částice ve zkumavce byly přeneseny na magnetický separátor a byly zde ponechány 2 minuty, aby došlo k separaci částic z pufru. Pufir byl pomocí pipety odstraněn, zkumavky byly přeneseny na běžný, nemagnetický stojan a k částicím byl přidán 1 ml pufru A. Vzorky byly promíchány. Tento krok byl ještě 3x zopakován.
C) Částice ve zkumavce byly přeneseny na magnetický separátor a byly zde ponechány 2 minuty, aby došlo k separaci částic z pufru. Pufir byl pomocí pipety odstraněn, zkumavky byly přeneseny na běžný, nemagnetický stojan a k částicím byl přidán 1 ml roztoku, který obsahoval např. 2,5 pmol.l1 oligonukleotidu „A“ nebo „B“ nebo „C“ nebo „D“ nebo „E“ nebo „F“ nebo „G“ nebo „H“ nebo „I“ (viz Tabulka 1), případně současně oligonukleotid „A“ a oligonukleotid „I“ v pufru A. Směs v některých případech obsahovala i 0,25 pmol.l1 fluorochromu Cy5 nebo 6FAM nebo Cy3, přičemž tyto fluorochromy byly konjugovány s biotinem. Fluorochromy konjugované s biotinem sloužily jako identifikátory částic. V některých provedeních byly použity streptavidinem pokryté magnetické částice, kterých povrch byl rovněž přímo fluorescenčně značen. Vzorky byly promíchány.
- 11 CZ 308387 B6
D) Vzorky byly inkubovány 60 minut na třepačce při 300 rpm na pokojové teplotě.
E) Následně byly částice v roztoku přeneseny na magnetický separátor a byly zde ponechány 2 minuty, aby došlo k separaci částic z roztoku. Roztok byl pomocí pipety odstraněn, zkumavky byly přeneseny na běžný, nemagnetický stojan a k částicím byl přidán 1 ml pufru A. Vzorky byly promíchány. Tento krok byl ještě 2x zopakován.
F) Částice ve zkumavce byly přeneseny na magnetický separátor a byly zde ponechány 2 minuty, aby došlo k separaci částic z pufru. Pufir byl pomocí pipety odstraněn, zkumavky byly přeneseny na běžný, nemagnetický stojan a k částicím byl přidán 1 ml 5 pmol.l1 roztoku oligonukleotidu „a“ nebo „b“ nebo „c“ nebo „d“ nebo „e“ nebo „f ‘ nebo „g“ nebo „h“ nebo „i“ nebo ,j“ nebo „k“ nebo „1“ nebo současně „a“ i „k“ v pufru A s 0,02 % (hmotnost/obj.) azidem sodným. Vhodné kombinace oligonukleotidů v sondách pro měření DNA glykosylázové aktivity, obecné nukleázové aktivity a nukleázové aktivity na abazických místech jsou uvedeny v tabulce 3. Vzorky byly promíchány.
G) Vzorky byly inkubovány 60 minut na třepačce při 300 rpm na pokojové teplotě.
H) Připravené senzory s navázanými sondami byly uchovány při 4 °C až do doby použití.
V některých provedeních byly použity nemagnetické částice. V tomto případě byly částice zpracovány stejně jako magnetické částice s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3000xg, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku.
V některých provedeních byly použity oligonukleotidy, které obsahovaly namísto tyminu uracil a/nebo 5-fluorouracil a/nebo 5-hydroxymetyluracil a/nebo etenocytosin a/nebo tymin glykol a/nebo 5-hydroxylcytosin a/nebo 3-metyladenin a/nebo hypoxantin a/nebo 7-metylguanin a/nebo 3-metylguanin a/nebo 5-formyl cytosin a/nebo 5-karboxyl cytosin a/nebo 8-oxo-7,8dihydroguanin a/nebo 2,6-diamino-4-hydroxy-5-N-metylformamidopyrimidin.
V některých provedeních byl použit jako zhášeč BHQ-3 nebo BHQ-0 nebo zhášeč BlackBerry TM Quencher 650 nebo Iowa Black zhášeče nebo Disperse Blue zhášeč nebo dabcyl nebo dabsyl a jako fluorochrom byly použity např. 5-FAM nebo 6-FAM nebo JOE nebo HEX nebo TET nebo Alexa Fluor barviva nebo Oregon Green barviva nebo cyaninová barviva nebo ATTO barviva.
Tabulka 3. Kombinace oligonukleotidů v sondách a vhodnost jejich použití. Vhodné = +; nevhodné = vhodnost je přímo úměrná počtu +.
- 12 CZ 308387 B6
Příklad 2
Měření aktivity uracilové DNA glykosylázy pomocí čtečky destiček.
Následující postup popisuje stanovení uracilové DNA glykosylázové aktivity v různých roztocích pomocí čtečky destiček. Roztoky byly roztoky obsahující rekombinantní uracil DNA glykosylázu, směsi různých enzymů nebo buněčné lyzáty. V postupu byly použity senzory připravené dle příkladu 1 nebo další připravené senzory, které obsahovaly alespoň jednu sondu obsahující uracil. Příklady vhodných sond jsou uvedeny v tabulce 3. V některých případech byly použity i senzory se sondami, které neobsahovaly uracil. Výhodně byly tyto sondy sekvenčně podobné sondám s uracilem. V některých provedeních byly rovněž použity senzory obsahující jak sondy s uracilem, tak bez uracilu. Tyto sondy se lišily použitým fluorochromem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, pňčemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev. V některých provedeních byl porovnán výsledek se senzory s výsledkem, kdy byly použity jen samotné nenavázané sondy.
A) 10 pl roztoku s připravenými senzory bylo přidáno k 1 ml pufru B (složení viz část Použité roztoky a chemikálie) ve zkumavce o objemu 2 ml.
B) Roztok ve zkumavce byl přenesen na magnetický separátor a byl zde ponechán 2 minuty, aby došlo k separaci částic z pufru. Pufr byl pomocí pipety odstraněn, zkumavky byly přeneseny na běžný, nemagnetický stojan a k částicím byl přidán 1 ml pufru B. Vzorky byly promíchány. Tento krok byl ještě jednou zopakován.
C) Roztok senzorů byl přenesen do černé 384-jamkové destičky. Na každý vzorek bylo použito 6 jamek. Do jedné jamky bylo přeneseno 0,05 ml roztoku senzorů. K roztoku senzorů v jamkách bylo přidáno 0,05 ml stanovovaného roztoku. Roztok byl promíchán opakovaným pipeto váním.
D) Destička byla vložena do čtečky destiček a byl snímán signál pro použité fluorochromy. Signál byl snímán celkem lOx, vždy po 4 minutách nebo po 2 minutách. Měření bylo snímáno při 25 stupních.
V některých provedeních byl signál snímán až po inkubaci. Inkubace pak trvala 5 minut nebo 20 minut nebo 60 minut.
E) Signál fluorochromu, který byl použit pro značení oligonukleotidů, byl zpravidla dělen signálem fluorochromu, který byl použit jako identifikátor částic a signály z jamek obsahující stejný senzor byly zprůměrovány. Od takto upraveného signálu pocházejícího ze senzoru se sondou obsahující uracil byl odečten signál pocházející ze senzoru se sondou bez uracilu. V některých případech nebyl signál fluorochromu použitého pro značení oligonukleotidu dělen signálem fluorochromu, který byl použit jako identifikátor a/nebo nebyl odečten signál pocházející ze senzoru se sondou bez uracilu. Jednalo se převážně o případy, kdy stanovovaný roztok obsahoval jen uracilovou DNA glykosylázovou aktivitu.
F) Vypočtené hodnoty byly vyneseny do grafu (Obrázek 1 a 2).
V některých provedeních byly použity senzory s nemagnetickými částicemi. V tomto případě byly senzory zpracovány stejně jako senzory s magnetickými částicemi s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3000xg, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku.
- 13 CZ 308387 B6
V jiných provedeních byla měřena DNA glykosylační aktivita enzymů pomocí senzorů s oligonukleotidy, které obsahovaly namísto tyminu uracil a/nebo 5-fluorouracil a/nebo 5hydroxymetyluracil a/nebo etenocytosin a/nebo tymin glykol a/nebo 5-hydroxylcytosin a/nebo 3metyladenin a/nebo hypoxantin a/nebo 7-metylguanin a/nebo 3-metylguanin a/nebo 5-formyl cytosin a/nebo 5-karboxyl cytosin a/nebo 8-oxo-7,8-dihydroguanin a/nebo 2,6-diamino-4hydroxy-5 -N -metylformamidopyrimidin.
Příklad 3
Měření aktivity uracilové DNA glykosylázy pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Následující postup popisuje stanovení uracilové DNA glykosylázové aktivity v různých roztocích nebo tkáních nebo buňkách pomocí fluorescenčního mikroskopu. Roztoky byly roztoky obsahující rekombinantní uracil DNA glykosylázu, směsi různých enzymů nebo buněčné lyzáty. V postupu byly použity senzory připraveny dle příkladu 1 nebo další připravené senzory, které obsahovaly alespoň jednu sondu obsahující uracil. Příklady vhodných sond jsou uvedeny v tabulce 3. V některých případech byly použity i senzory se sondami, které neobsahovaly uracil. Výhodně byly tyto sondy sekvenčně podobné sondám s uracilem. V některých provedeních byly rovněž použity senzory obsahující jak sondy s uracilem, tak bez uracilu. Tyto sondy se lišily použitým fluorochromem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Bylo postupováno podle příkladu 2 s tím rozdílem, že v bodu C) byla použita 96-jamková destička se skleněným dnem a bylo použito 0,1 ml roztoku senzorů a 0,1 ml stanovovaného roztoku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky položeny na neodymový magnet na dobu 2 minut. Následně byla snímána fluorescence senzorů pomocí CCD kamery po dobu 40 minut. Byly použity excitační a emisní filtry vhodné pro použité fluorochromy.
V některých provedeních byly senzory vpraveny do buněk nebo tkání a následně byla sledována vnitrobuněčná aktivita uracilových DNA glykosyláz.
V některých provedeních byly použity senzory s nemagnetickými částicemi. V tomto případě byly senzory zpracovány stejně jako senzory s magnetickými částicemi s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3000xg, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky centrifugovány (3000xg, 2 minuty).
V jiných provedeních byla měřena DNA glykosylační aktivita enzymů pomocí senzorů s oligonukleotidy, které obsahovaly namísto tyminu uracil a/nebo 5-fluorouracil a/nebo 5hydroxymetyluracil a/nebo etenocytosin a/nebo tymin glykol a/nebo 5-hydroxylcytosin a/nebo 3metyladenin a/nebo hypoxantin a/nebo 7-metylguanin a/nebo 3-metylguanin a/nebo 5-formyl cytosin a/nebo 5-karboxyl cytosin a/nebo 8-oxo-7,8-dihydroguanin a/nebo 2,6-diamino-4hydroxy-5 -N -metylformamidopyrimidin.
Příklad 4
Měření obecné nukleázové aktivity pomocí čtečky destiček.
Následující postup popisuje stanovení obecné nukleázové aktivity v různých roztocích pomocí čtečky destiček. Roztoky byly roztoky obsahující rekombinantní exonukleázu a endonukleázu, nebo jen exonukleázu nebo jen endonukleázu, směsi různých enzymů nebo buněčné lyzáty. V postupu byly použity senzory připraveny dle příkladu 1 nebo další připravené senzory. Příklady vhodných sond jsou uvedeny v tabulce 3. V některých provedeních byly rovněž použity senzory
- 14 CZ 308387 B6 obsahující jak sondy s uracilem, tak bez uracilu. Tyto sondy se lišily použitým fluorochromem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Bylo postupováno podle příkladu 2 s tím rozdílem, že byly použity pouze senzory obsahující sondy bez uracilu. Pouze v případech, kdy nebyla v stanovovaném roztoku žádná uracilová DNA glykosylázová aktivita, byly použity i sondy s uracilem.
V některých provedeních byly použity senzory s nemagnetickými částicemi. V tomto případě byly senzory zpracovány stejně jako senzory s magnetickými částicemi s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3 OOOx g, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky (3OOOx g, 2 minuty).
Příklad 5
Měření obecné nukleázové aktivity pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Následující postup popisuje stanovení obecné nukleázové aktivity v různých roztocích a tkáních a buňkách pomocí fluorescenčního mikroskopu. Roztoky byly roztoky obsahující rekombinantní exonukleázu a endonukleázu, nebo jen exonukleázu nebo jen endonukleázu, směsi různých enzymů nebo buněčné lyzáty. V postupu byly použity senzory připraveny dle příkladu 1 nebo další připravené senzory. Příklady vhodných sond jsou uvedeny v tabulce 3. V některých provedeních byly rovněž použity senzory obsahující jak sondy s uracilem, tak bez uracilu. Tyto sondy se lišily použitým fluorochromem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Bylo postupováno stejně jako v příkladu 2 a 4 s tím rozdílem, že v bodu C) byla použita 96jamková destička se skleněným dnem a bylo použito 0,1 ml roztoku senzorů a 0,1 ml stanovovaného roztoku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky položeny na neodymový magnet na dobu 2 minut. Následně byla snímána fluorescence senzorů pomocí CCD kamery po dobu 40 minut. Byly použity excitační a emisní filtry vhodné pro použité fluorochromy.
V některých provedeních byly senzory vpraveny do buněk nebo tkání a následně byla sledována vnitrobuněčná aktivita obecných nukleáz.
V některých provedeních byly použity senzory s nemagnetickými částicemi. V tomto případě byly senzory zpracovány stejně jako senzory s magnetickými částicemi s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3 OOOx g, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky (3 OOOx g, 2 minuty).
Příklad 6
Měření nukleázové aktivity na abazických místech pomocí čtečky destiček.
Následující postup popisuje stanovení obecné nukleázové aktivity v různých roztocích pomocí čtečky destiček. Roztoky byly roztoky obsahující enzymy pracující na abazických místech (např. AP endonukleáza 1), směsi různých enzymů nebo buněčné lyzáty. V postupu byly použity senzory připravené dle příkladu 1 nebo další připravené senzory, které obsahovaly alespoň jednu sondu obsahující uracil. Příklady vhodných sond jsou uvedeny v tabulce 3. V některých případech byly použity i senzory se sondami, které neobsahovaly uracil. Výhodně byly tyto
- 15 CZ 308387 B6 sondy sekvenčně podobné sondám s uracilem. V některých provedeních byly rovněž použity senzory obsahující jak sondy s uracilem, tak bez uracilu. Tyto sondy se lišily použitým fluorochromem. Není-li uvedeno jinak, veškeré kroky byly prováděny při teplotě místnosti, přičemž kroky následovaly po sobě bez dalších prodlev.
Bylo postupováno podle příkladu 2 s tím rozdílem, že byl použit senzor se sondou „Ai“ (viz tabulka 3). V některých provedeních byl současně použit senzor se sondou, která se lišila od sondy „Ai“ tím, že namísto uracilu obsahovala tymin. V případě provedení, kdy stanovovaný roztok neobsahoval uracil DNA glykosylázu, byl tento enzym rovněž přidán do směsi.
V některých provedeních byly použity senzory s nemagnetickými částicemi. V tomto případě byly senzory zpracovány stejně jako senzory s magnetickými částicemi s tím rozdílem, že místo magnetického separátoru byly částice v jednotlivých krocích separovány pomocí centrifugace (3000xg, 15 minut). Po centrifugaci byl supernatant odebrán a nahrazen roztokem dle příslušného kroku. Po smíchání roztoku senzorů a stanovovaného roztoku byly destičky (3000x g, 2 minuty).
Použité roztoky a chemikálie:
1. PufrA nebo 25 nebo 100 mmol.l1 Tris-HCl, pH 7,5 nebo 20 nebo 150 nebo 200 mmol.l1 NaCl
0,1 nebo 0,5 % (hmotnost/obj.) BSA nebo 0,05 nebo 0,5 % (obj./obj.) Tween 20
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě.
2. Pufr B nebo 10 nebo 20 nebo 50 mmol.l1 Tris-HCl, pH 7,5
0,1 nebo 1 nebo 5 mmol.l1 EDTA nebo 0,3 nebo 2 nebo 4 nebo 20 mmol.l1 MgCb
Uvedené složky byly rozpuštěny v destilované vodě.
Průmyslová využitelnost:
Přístup je využitelný v laboratořích, pro které je důležité přesné a citlivé stanovení aktivity enzymů, které degradují DNA a v laboratořích, které se zabývají výzkumem oprav DNA. Předkládaný přístup je rovněž využitelný při hledání nových inhibitorů aktivity těchto enzymů a při sledování procesů, kterých se účastní tyto enzymy.
- 16 CZ 308387 B6
Seznam sekvencí <H0> Univerzito Patockehs v Ofomotici <1.2δ> Způsob stanovém ea^ynitoíekých aktivit zpíiSi>bujfefch degradaci DNA <í3P> 20,01.2019 <160 21 <Γ70> Patem!» version 3,5
- 17 CZ 308387 B6 <21Ó> 1 <2H> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> umělá sekvence s modifikaci na 5’ konci (§-FAM) a & modifikací na 3' koiici (bmtinTEG) <400 1 cgtgaartct iaaacegega cgacatccgc < 2H> 2 < 211> 30 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> umělá sekvence s modifikací na 5‘ konci (biotínTEG) a s modifikací na 3' taa«á (€-FAM) <400> 2 cgcctacagc agc-gceaaat tcttasgtgc < 2I0> 3 < 2H> 9 < 212> DNA < 213> Artificial Sequence <220>
< 223> umělá sekvence s modifikací na 5’ konci (6-FÁM) a a modifikací na 3’ konci (bioiinTEG)
- 18 CZ 308387 B6 <400 3 cgtgaattc <210> 4 <211> 9 <212> DNA <213> artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikací na S’ konci. (biotmTEG) a s modifikací na 3' konci (6-FAM) <400 4 cttasgtgc 9 <210 5 <2H> 30 <2I2> DNA <213'··- artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikaci na 5* konci (BHQ-1) a s modifikací na 3’ konci (biotinTEG) <400> 5
Cgtgaattet taaaccgcga cgacafccgc 30· <210> 6 <21l> 30 <2Í2> DNA <213> artšfic ial. sequence <220>
- 19 CZ 308387 B6 <223> umělá sekvence s modifikaci na 5' konci (biotínTEG) as modifikací M afemeí CBHQ-I) egmacagc agegccaaat tctíaagtgc <2I0> 7 <2Í1> 30 <2I2> DNA <213> artificial sequence <22 0>
<223> umělá sekvence s modifikaci' na S* konci (i$~FÁM) a s modifikaci na 3' hrnci (bkWT.BGX vřet&ei je jeden tymidin aahmcn deoxyuridmeín. (ni) <22O>
<221> modified Jrnse <222> (6).48) <223> deosywídme <220 <221 > modified baae <322> (6).48) <223> dsoxntrídin <400> 7 cgigaamtet íáassegcga egacatcCgc <210 S <211> 30 <210 DNA <213> artificial sequence
-20 CZ 308387 B6 <220 <223> umělá sekvence s modifikací na 5* kanci (biotinTEG) a s modifikací na S’konci (6-FAM), v řetězci je jeden tymidín nahrazen deoxyurídincm (m) <220 <22l> modifiedjtase <222> (23)..(25) <220 deoxyurídin <4 90 8 cgcctacagc aacgcenaat tctmaagtge <210> 9 <2H> 30 <212> DNA <2I3> artificial sequence <220 <220 umělá sekvence $ modifikací na 5’ konci (biotinTEG) a s modifikací na 3‘ konci (cyaninS) <400 9 cgcčiacagc agcgccaaat tcttaagtgc <210 10 <2H> 14 <212> DNA <213> artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikací na 3' kcaci (BHQ* 1), v řetězci je
-21 CZ 308387 B6 jeden tymidíři nahrazen deexyuridíneni (m) <220>
<221 > modifiedjme <:22> (8)..(10) <223> deoxyuridm <40G> 10 ttiaagaamt cacg <210> U <2H> M <212> ON A <213> artificial sequence <220>
<223> umělá sekvence s modifíkaeí na 5’ konci (BHQ«l)s v řetězci je jeden tymldin. nahrazen deoxywídinem (m) <220 <22i> modifiedjbase <222> (5)..(7} <223> deaxyaridin <400> Π gcaetmsaga síti 14 <2I0> 12 <21l> 14 <212> DNA <213> artificial sequence
-22 CZ 308387 B6 <220 <223> umélá sekvence s modifikaci na 3’ kond (BHQ-1) <400 12 tůaagaatt eacg <210 13 <211> 14 <212> DMA <213> artificial sequence <220 <223> umélá sekvence s modifikaci na 5' konci (BHQ4) <400 13 gcactíaaga attt 14 <2.1O 14 <2.1 i > 14 <212> DNA <213> artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikaci na 3’ konci (BHQ-ll v řetěxci jsou číyři tymšdíny nahmeny čtyřmi deoxyuddiny (m) <220 <221> modified base <222> (1)44) <223> deoxy uridine <220 <221 > modifedjbsse
-23 CZ 308387 B6 <222> (8).,(11) <2 2 ?· > depxyuridine <400 14 tomagaamm cacg <7 $ 0> ? 5 <211 > 14 <2-2> DNA <2I3> artificial sequence <220 <223> umělá Sekvence s modifikací na 5’ konci (B.H.Q-1), v řetězci jaw čtyři tymidihy nahrazeny ětyňni depxyuridíny (m) <220>
<221 > modifiedjwe <222> ¢4).,(7) <223> deoxyrjridin <220 <221> mcdifieObase <222> (11)..(14) <223> tteoxyuridiii <40O> 15 gcacmmaags ammt <210 16 <21I> 14 <2I2> DNA <2I3> artificial seqnenee sekvence Ih
-24 CZ 308387 B6 <220 <223> umělá sekvence s modifikací na 3' konci (6-F AM), v řetězci je jeden tynfidin nahrazen deexyuridinem (m) <220 <221> medifiedjwe <222> ¢0),,(10) <223> deaxyuridin <400 1.6 tftaagaamt caeg <210 I?
<2H> 14 <2I2> DNA <2I3> artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikací na 5’ konci (6-FAM) <400 1?
gcaettaagá attt 14 <210 18 <211> O <2I2> DNA <213> artificial sequence <220 <223> umW sekvence $ modifikací m 3f kanciv řetězci je jeden tymidin nalimen. deoxyuridinem (m)
-25 CZ 308387 B6 <OC>
<221 '> modifiedJiase <222> 0).-(5) <223> decxyufidm <400> 18 ga&mtcacg <210 19 <2I1> 9 <212> DNA <2T3> artificial sequence <220 <223> umělá sekvence s modifikací «a 5’ konci (B.HQ-1) <400 19 geacttaag <210 29 <2H> 14 <210 DNA <213> artificial sequence <220 <223> tmidlá sekvence š modifikaci na 5’ konci (BHQ-3) <4ďO> 20 gcacttaaga aítí 14 <2IO 21 <211> 24 <212> DNA
-26 CZ 308387 B6 <2D> artióml sequence
223> umělá sekvsace s modifikací oa 3' konci (BHQ-I), v je jeden tywdin oahweii deoxyundmem (m) <221> modiSsd^bas® <222> (18).,(20) <223> <tecywMia <40O> 21.
gtegtegegg tttaagaamt caeg 24
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA, vyznačující se tím, že:i) částice, které mají poměr mezi povrchem a objemem větší než 1,2 pm1 a jejichž žádný z rozměrů nepřesahuje 10 pm, obsahující na svém povrchu navázaný avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin, přičemž k avidinu a/nebo streptavidinu a/nebo neutravidinu je navázán prostřednictvím biotinu alespoň jeden jednořetězcový první oligonukleotid o délce od 6 do 100 nukleotidů, přičemž první oligonukleotid je současně párovaný s druhým jednořetězcovým oligonukleotidem o délce od 6 do 100 nukleotidů, přičemž první nebo druhý oligonukleotid obsahuje fluorochrom a s ním párovaný oligonukleotid obsahuje zhášeč fluorescence, se inkubují v prostředí obsahujícím alespoň jeden enzym způsobující degradaci DNA, s výhodou je enzymem způsobujícím degradaci DNA nukleáza a/nebo DNA glykosyláza;ii) v průběhu inkubace a/nebo po inkubaci v kroku i) se provede měření fluorescenčního signálu fluorochromu;iii) stanoví se aktivita enzymu způsobujícího degradaci DNA, přičemž nárůst fluorescence je přímo úměrný aktivitě enzymu způsobujícího degradaci DNA.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že avidin a/nebo streptavidin a/nebo neutravidin jsou k povrchu částic navázány kovalentně nebo nekovalentně.-27 CZ 308387 B6
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že fluorochrom je připojen k prvnímu nebo druhému oligonukleotidu na 5' konci a zhášeč fluorescence je navázán k párujícímu oligonukleotidu na 3' konci nebo fluorochrom je připojen k prvnímu nebo druhému oligonukleotidu na 3' konci a zhášeč fluorescence je navázán k párujícímu oligonukleotidu na 5' konci.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že alespoň jeden oligonukleotid obsahuje alespoň jednu bázi, která je substrátem enzymu způsobujícího degradaci DNA.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že alespoň jeden oligonukleotid obsahuje alespoň jedno abazické místo.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že abazické místo je umístěno ve vzdálenosti menší než 10 nukleotidů od fluorochromu.
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že částice jsou magnetické.
- 8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že fluorochrom je vybraný ze skupiny zahrnující deriváty xantenu, cyaninová barviva, deriváty 4,4-difluor-4-bora3a,4a-diaza-s-indacenu, látky s kumarinovou strukturou nebo látky s chinolinovou strukturou.
- 9. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že zhášeč fluorescence je vybraný ze skupiny zahrnující látky s polyaromatickým azoskeletem, látky se strukturním základem 1,4-diaminoanthrachinonu, 4-((4-(dimetylamino)fenyl)azo)benzoovou kyselinu a její deriváty nebo 4-dimetylaminoazobenzen-4-sulfonyl chlorid a jeho deriváty.
- 10. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že částice obsahuje alespoň jeden další fluorochrom, který je navázaný na povrchu částice pomocí biotinu, přičemž excitační a/nebo emisní profil tohoto dalšího fluorochromu je odlišný od excitačního a/nebo emisního profilu fluorochromu v oligonukleotidu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-41A CZ201941A3 (cs) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019-41A CZ201941A3 (cs) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ308387B6 true CZ308387B6 (cs) | 2020-07-15 |
| CZ201941A3 CZ201941A3 (cs) | 2020-07-15 |
Family
ID=71524844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019-41A CZ201941A3 (cs) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ201941A3 (cs) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008097340A2 (en) * | 2006-08-28 | 2008-08-14 | Battelle Energy Alliance, Llc | Methods of detecting dna n-glycosylases, methods of determining n-glycosylase activity, and n-glycolsylase assay kits |
| CN102154489A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-08-17 | 北京大学 | 单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法 |
| US20110269129A1 (en) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Binary probe system for sensitive detection of target analytes |
| CN103333888A (zh) * | 2013-06-17 | 2013-10-02 | 北京大学 | 硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针及其在核酸酶检测中的应用 |
-
2019
- 2019-01-28 CZ CZ2019-41A patent/CZ201941A3/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008097340A2 (en) * | 2006-08-28 | 2008-08-14 | Battelle Energy Alliance, Llc | Methods of detecting dna n-glycosylases, methods of determining n-glycosylase activity, and n-glycolsylase assay kits |
| US20110269129A1 (en) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Binary probe system for sensitive detection of target analytes |
| CN102154489A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-08-17 | 北京大学 | 单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法 |
| CN103333888A (zh) * | 2013-06-17 | 2013-10-02 | 北京大学 | 硫代修饰寡聚核苷酸荧光探针及其在核酸酶检测中的应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| DU Y.-C. et al.: „Terminal deoxynucleotidyl transferase and T7 exonuclease-aided amplification strategy for ultrasensitive detection of uracil-DNA glycosylase," Analytical Chemistry, vol. 90, no. 14, 2018, str. 8629 – 8634, ISSN 0003-2700 * |
| HUBER K. et al.: „Short report: Microsatellite sequences as markers for population genetic studies of the mosquito Aedes aegypti, the vector of dengue viruses," American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, vol. 61, no. 6, 1999, str. 1001 – 1003, ISSN 0002-9637 * |
| JUNG J.-W. et al.: „Selective fluorogenic chemosensors for distinct classes of nucleases", ChemBioChem, vol. 14, no. 4, 2013, str. 440 – 444, ISSN 1439-4227 * |
| KOUASSI G. K. et al.: „Magnetic and gold-coated magnetic nanoparticles as a DNA sensor," Analytical Chemistry, vol. 78, no. 10, 2006, str. 3234 – 3241, ISSN 0003-2700 * |
| LANKIEWICZ S. et al.: „Enhanced RACE method using specific enrichment by biotinylated oligonucleotides bound to streptavidin coated megnetic particles," Nucleic Acid Research, vol. 25, no. 10, 1997, str. 2037 – 2038, ISSN 0305-1048 * |
| SVILAR D. et al.: „Quantitative, real-time analysis of base excision activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons," Journal of Visualized Experiments, 2012, no. 66, str. e4168, ISSN 1940-087X * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ201941A3 (cs) | 2020-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cao et al. | Naked-eye sensitive detection of nuclease activity using positively-charged gold nanoparticles as colorimetric probes | |
| Jiang et al. | Amplified detection of DNA ligase and polynucleotide kinase/phosphatase on the basis of enrichment of catalytic G-quadruplex DNAzyme by rolling circle amplification | |
| Chen et al. | Methylation-blocked enzymatic recycling amplification for highly sensitive fluorescence sensing of DNA methyltransferase activity | |
| Ma et al. | Highly sensitive detection of DNA phosphorylation by counting single nanoparticles | |
| JP2003535567A (ja) | 核酸ハイブリッドの検出 | |
| Dorjsuren et al. | Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity | |
| Huang et al. | A gold nanoparticle-enhanced fluorescence polarization biosensor for amplified detection of T4 polynucleotide kinase activity and inhibition | |
| CN105112540B (zh) | 一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法 | |
| US5747247A (en) | Spectroscopic helicase assay | |
| Cheng et al. | Label-free and sensitive detection of T4 polynucleotide kinase activity via coupling DNA strand displacement reaction with enzymatic-aided amplification | |
| Cen et al. | Sensitive fluorescence sensing of T4 polynucleotide kinase activity and inhibition based on DNA/polydopamine nanospheres platform | |
| Zhao et al. | Label-free fluorescent assay of T4 polynucleotide kinase phosphatase activity based on G-quadruplexe− thioflavin T complex | |
| Ling et al. | A ratiometric fluorescent sensor for sensitive detection of UDG using poly (thymine)-templated copper nanoclusters and DAPI with exonuclease III assisted amplification | |
| Xu et al. | An integrated and restructive probe mediated strand displacement amplification strategy for sensitive and specific DNA methyltransferase activity detection | |
| Wu et al. | Label-free fluorescence assay for rapid detection of RNase H activity based on Tb 3+-induced G-quadruplex conjugates | |
| Liu et al. | Amplified detection of T4 polynucleotide kinase activity based on a λ-exonuclease cleavage-induced DNAzyme releasing strategy | |
| Ma et al. | A sensitive strategy for the fluorescence detection of DNA methyltransferase activity based on the graphene oxide platform and T7 exonuclease-assisted cyclic signal amplification | |
| Akopiants et al. | Tracking the processing of damaged DNA double-strand break ends by ligation-mediated PCR: Increased persistence of 3′-phosphoglycolate termini in SCAN1 cells | |
| Tang et al. | A highly sensitive fluorescence assay for methyltransferase activity by exonuclease-aided signal amplification | |
| CZ308387B6 (cs) | Způsob stanovení aktivity enzymu způsobujícího degradaci DNA | |
| Du et al. | Cyclic enzymatic amplification method for highly sensitive detection of nuclear factor-kappa B | |
| Ma et al. | A fluorescence-based assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity based on a terminal transferase-aided photoinduced electron transfer strategy | |
| Zhao et al. | A sensitive cyclic signal amplification fluorescence strategy for determination of methyltransferase activity based on graphene oxide and RNase H | |
| Tang et al. | Label-free one-step fluorescent method for the detection of endonuclease activity based on thioflavin T/G-quadruplex | |
| Gines et al. | A multiplex assay based on encoded microbeads conjugated to DNA NanoBeacons to monitor base excision repair activities by flow cytometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20220128 |