JP2003535567A - 核酸ハイブリッドの検出 - Google Patents

核酸ハイブリッドの検出

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JP2003535567A JP2000599903A JP2000599903A JP2003535567A JP 2003535567 A JP2003535567 A JP 2003535567A JP 2000599903 A JP2000599903 A JP 2000599903A JP 2000599903 A JP2000599903 A JP 2000599903A JP 2003535567 A JP2003535567 A JP 2003535567A
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ルイス，マーティン・ケイ
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ローズ，リチャード・ビー
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ハートネット，ジェームズ・ロバート
グ，トレント
オルソン，ライアン・ジェイ
ウッド，キース・ヴイ
ウェルチ，ロイ
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プロメガ・コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 所定の内因性核酸の存在を定性的および定量的に分析するための核酸ハイブリッドの脱重合を用いた方法を開示する。これらの方法の適用には、１ヌクレオチド多形の検出、１塩基変化の識別、種形成、ウイルス負荷の測定、遺伝子タイピング、医学的マーカー診断等が包含される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は核酸の検出に関する。より詳細には本発明は核酸標的ハイブリッド中
の標的設定された所定の内因性の核酸配列の検出、および、その検出の種々の用
途に関する。
【０００２】 発明の背景 核酸を検出するため、および、目的の特定の核酸を検出するための方法は広範
で急速に成長する分子生物学の分野を構築する基礎となる。代替となる方法およ
び製品の必要性は一定して存在している。ある方法を他の方法から選別して使用
する理由は様々であり、放射性物質を回避すること、方法を使用する免許がない
こと、試薬または装置の費用または入手しやすさ、所要時間または工程数の最小
限化を望むこと、特定の用途に対する精度または感度、分析の容易さ、または、
操作の自動化能が包含される。
【０００３】 核酸または特定の核酸の検出はそれ自体が最終目標であるよりはむしろある過
程の一部である場合が多い。当該分野においては核酸の検出には多くの用途があ
り、新しい用途が常時開発されている。核酸を検出し、定量する能力は、微生物
、ウィルスおよび生体分子の検出において有用であり、このため、医療および獣
医学分野、食品加工および環境試験を含む多くの分野に影響する。更にまた、生
物学的試料（例えば組織、喀痰物、尿、血液、精液、唾液）由来の特定の生体分
子の検出および／または定量は犯罪科学における用途、例えば犯罪容疑者の識別
および除外および父子鑑定試験並びに医療診断の用途も有する。
【０００４】 核酸を検出するための幾つかの一般的方法は核酸配列の演繹的な知識に依存し
ていない。配列特異的ではないがＲＮＡ特異的である核酸検出方法が米国特許４
，７３５，８９７号に記載されており、これはホスフェートの存在下にポリヌク
レオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）を用いるか、または、リボヌクレアーゼを用
いてＲＮＡを脱重合している。ＰＮＰは、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ウィ
ルスＲＮＡおよびｍＲＮＡのメッセージ部分に共通して観察される、場合により
一本鎖ＲＮＡの二次構造の形態で二本鎖ＲＮＡセグメントに遭遇した時点で脱重
合を停止する。無機リン酸エステルの存在下のｍＲＮＡのポリアデニル化末端の
ＰＮＰ脱重合によりＡＤＰが形成する。或いは、リボヌクレアーゼを用いた脱重
合によりＡＭＰを形成する。形成されたＡＭＰはミオキナーゼによりＡＤＰに変
換され、そしてＡＤＰはピルベートキナーゼまたはクレアチンホスホキナーゼに
よりＡＴＰに変換される。ＡＴＰまたは有機ホスフェート共反応体（ピルベート
またはクレアチン）由来の副生成物の何れかがｍＲＮＡの検出の間接的方法とし
て検出される。
【０００５】 米国特許４，７３５，８９７号において、ＡＴＰはルシフェラーゼ検出系によ
り検出されている。ＡＴＰおよび酸素の存在下で、ルシフェラーゼはルシフェリ
ンの酸化を触媒し、発生した光をルミノメーターで定量する。他の反応生成物は
ＡＭＰ、ピロホスフェートおよびオキシルシフェリンである。
【０００６】 重複ＤＮＡは臭化エチジウムのような挿入染料を用いて検出することができる
。このような染料はまたハイブリッドの形成を検出するためにも使用される。 核酸を検出するためのハイブリダイゼーション法は核酸配列の知識に依存して
いる。多くの既知の核酸検出法はオリゴヌクレオチドプローブを試料中またはブ
ロット上の核酸にハイブリダイズまたはアニーリングし、ハイブリダイズされた
プローブを検出する特定の核酸ハイブリダイゼーションに依存している。
【０００７】 ハイブリダイズされた核酸の検出のための伝統的形式の方法は標識された核酸
プローブを用いて核酸試料にハイブリダイズしている。例えばサザンブロット法
においては、核酸試料を大きさによりアガロースゲル上で分離し、膜に固定し、
変性し、そしてハイブリダイズ条件下で標識された核酸プローブに曝露する。標
識された核酸プローブがブロット上の核酸とハイブリッドを形成する場合、標識
は膜に結合する。サザンブロットに用いるプローブは放射性物質、蛍光染料、ジ
ゴキシゲニン、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよ
びアクリジニウムエステルにより標識されている。
【０００８】 ハイブリダイズされた核酸を検出する別のタイプの方法はポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）を利用している。ＰＣＲ法は当該分野でよく知られている（米国特
許４，６８３，１９５、４，６８３，２０２および４，８００，１５９）。ＰＣ
Ｒを簡単に説明すると、核酸増幅標的配列の対向する鎖に相補的な核酸プライマ
ーを変性された試料にアニ−リングさせる。ＤＮＡポリメラーゼ（典型的には熱
安定性）はハイブリダイズされたプライマーからＤＮＡ二本鎖を伸長させる。こ
の過程を反復することにより核酸標的を増幅させる。核酸プライマーが試料にハ
イブリダイズしない場合は、相当する増幅されたＰＣＲ産物が存在しないことに
なる。この場合、ＰＣＲプライマーはハイブリダイゼーションプローブとして機
能する。ＰＣＲに基づく方法は未知の配列の核酸の検出のために限られた用途で
ある。
【０００９】 ＰＣＲ法においては、増幅された核酸産物は多くの方法、例えば標識されたプ
ライマーを用いて増幅された鎖に標識されたヌクレオチドを導入することにより
検出される。ＰＣＲに使用されるプライマーは放射性物質、蛍光染料、ジゴキシ
ゲニン、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アクリジ
ニウムエステル、ビオチンおよびタチナタマメウレアーゼで標識されている。未
標識のプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物は他の方法、例えば電気泳動によ
るゲル分離、ついで染料による可視化により検出される。
【００１０】 蛍光法もまた核酸ハイブリッドの検出のための知られた方法である。米国特許
５，６９１，１４６号は標的核酸配列にハイブリダイズされない限り蛍光クエン
チングされている蛍光ハイブリダイゼーションプローブの使用を記載している。
米国特許５，７２３，５９１号は標的核酸配列にハイブリダイズされるまで、ま
たは、プローブが消化されるまで、蛍光クエンチングされている蛍光ハイブリダ
イゼーションプローブを記載している。このような方法はハイブリダイゼーショ
ンに関する情報を提供し、配列中の一塩基変異の測定のための様々な程度の有用
性を有している。一部の蛍光法は５’→３’方向の核酸ハイブリッドの消化を行
なって蛍光クエンチャー、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ；米国特許５，６９１，１４６および５，８７６，９３０）の近傍から
蛍光シグナルを放出する。
【００１１】 ３’→５’脱重合活性が報告されている鋳型特異的ポリメラーゼ活性を有する
酵素としては、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｕｔｓｕｃｈｅｒ ａ
ｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４（１１）：３０１
９−２８（１９６９））、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：５２６−３７（１９９１）；Ｔａｂｏｒ ａ
ｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８３２２−２
８（１９９０）），Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｐｃｈｅｍ．Ｊ．２２４：６４５−５０（１９９４））、
ＡＭＶおよびＲＬＶ逆転写酵素（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｍｏｄａｋ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０００−４（１９８０））およびＨＩＶ逆
転写酵素（Ｚｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２
４１９５−２０２（１９９４））が挙げられる。ＤＮＡハイブリッドのミスマッ
チ末端上の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が報告されている鋳型依存性ポリ
メラーゼはファージ２９ＤＮＡポリメラーゼである（ｄｅ Ｖｅｇａ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：１１８２−１１９２，１９９６）。
【００１２】 ゲノムＤＮＡ中に存在する１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出のために現在
種々の方法が存在している。ＳＮＰは集団において測定可能な頻度で存在するＤ
ＮＡ点突然変異または挿入／欠失である。ＳＮＰはゲノムにおける最も一般的な
変異である。ＳＮＰはゲノム内の定義された位置において生じ、遺伝子マッピン
グ、集団構造の定義、および機能的試験の実施のために用いることができる。多
くの知られた遺伝病が点突然変異および挿入／欠失により生じることから、ＳＮ
Ｐはマーカーとして有用である。
【００１３】 ＳＮＰが偶発的制限酵素認識配列を変化させる稀な場合において、切断に対す
る増幅ＤＮＡの異なる感受性を用いてＳＮＰを検出する。この方法では、制限エ
ンドヌクレアーゼによる示差的認識のためには適切な配列内に適切な制限酵素部
位が存在するか導入されることが必要となる。増幅後、産物を適切な制限エンド
ヌクレアーゼで切断し、産物をゲル電気泳動およびその後の染色により分析する
。この方法は、ＳＮＰを正確に測定することができるまでには試料のプロセシン
グ、ゲル分析および多大なデータ解釈を要することから、分析の処理量が限定さ
れる。
【００１４】 一本鎖コンホーメーション多型（ＳＳＣＰ）は増幅されたＤＮＡセグメント内
に存在するＳＮＰを検出することのできる第２の方法である（Ｈａｙａｓｈｉ，
Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｔｅｃｈｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ９：７３−７９，１９９２）。この方法においては、ニ本
鎖増幅産物を変性し、次に、両鎖を非変性ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動
の間にリアニーリングさせる。分離された鎖は分子内塩基対形成に基づいて特異
的に折り曲げられたコンホーメーションを有すると推定される。核鎖の電気泳動
特性は折り曲げられたコンホーメーションに依存している。配列内の１ヌクレオ
チド変化の存在は、野生型の試料と比較した場合に、増幅試料のコンホーメーシ
ョンおよび電気泳動移行の検出可能な変化を起こすことができ、ＳＮＰを識別可
能とする。恐らくはゲルに基づいた方法による限定されたスループットに加えて
、ＳＳＣＰ系の実験の設計および解釈は困難である。同じＳＳＣＰ反応における
複数試料の多重分析は極めて大胆である。突然変異の検出および分析において必
要とされる感度のために殆どの研究者はこの方法のために放射標識ＰＣＲ産物を
使うようになった。
【００１５】 増幅不応突然変異系（ＡＲＭＳ，対立遺伝子特異的ＰＣＲ、即ちＡＳＰＣＲと
しても知られている）において、２つの増幅反応を用いてＤＮＡ試料中にＳＮＰ
が存在するかどうか調べている（Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ １７：２５０３，１９８９，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ８６：
２７５７，１９８９）。両方の増幅反応は目的とする標的のための共通のプライ
マーを含んでいる。第１の反応は野生型遺伝子が試料中に存在する場合にはＰＣ
Ｒ産物を与える野生型産物に特異的な第２のプライマーを含んでいる。第２のＰ
ＣＲ反応はＤＮＡの突然変異型に存在する塩基の変化を示す３’末端或いはその
近傍の１ヌクレオチド変化を有するプライマーを含む。第２のプライマーは共通
のプライマーと共に、ゲノムＤＮＡの突然変異型を含むゲノムＤＮＡが存在する
場合にＰＣＲにおいて機能するのみである。この方法は重複増幅反応を行なって
遺伝子の突然変異型が存在するかどうかを確認するために電気泳動により分析す
ることを必要とする。更に、データはマニュアルで解析しなければならない。
【００１６】 １塩基伸長は捕獲されたＤＮＡ標的に一本鎖ＤＮＡプローブをハイブリダイズ
することによりＳＮＰの検出を可能にする方法である（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ Ｔ
．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４１６７−４１７５）
。いったん、ハイブリダイズされると、一本鎖プローブは標識されたジデオキシ
ヌクレオチドを持った１塩基によって伸長される。標識され、伸長された産物は
比色法または蛍光法により検出される。
【００１７】 リアルタイム（または動的）ＰＣＲに関連する種々の技法がＳＮＰ検出の実施
に応用されている。これらの系の多くはプラットホーム系のものであり、特殊な
装置、複雑なプライマー設計、および、高価な補助的材料をＳＮＰ検出のために
必要とする。一方、本発明の方法はエンドユーザーの処理量の要求に適した種々
の機材を使用することのできるモジュール的方法として設計されている。更にま
た、ルシフェラーゼ検出感度を標準的なオリゴヌクレオチド化学および十分確立
された酵素学的方法と組み合わせたことによりフレキシブルでオープンなシステ
ムの構築ができた。代替としての分析検出方法、例えば質量スペクトル分析、Ｈ
ＰＬＣおよび蛍光検出法もまた本発明の方法では使用することができ、これによ
り、更に試験のフレキシビリティーが向上する。
【００１８】 リアルタイム増幅を用いるＳＮＰ検出は増幅反応中にそのままの状態で核酸の
増幅されたセグメントを検出する能力に依存している。３種の基本的なリアルタ
イムＳＮＰ検出方法、即ち、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ特異的染料結合の増大した蛍光
、（ｉｉ）増幅中の蛍光の低減されたクエンチング、および、（ｉｉｉ）増幅中
の増大した蛍光エネルギー転移が存在している（Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ ｅｔ ａ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８，１９９７）。これらの
方法の全ては非ゲル系であり、各手法を簡単に説明する。
【００１９】 種々の染料が結合二本鎖ＤＮＡに応答して蛍光の増大を示すことが知られてい
る。この性質を上記した増幅不応突然変異系と組み合わせて用いることによりＳ
ＮＰの存在を検出する。ＰＣＲ産物を含む野生型または突然変異の生産は、それ
らが蓄積するＰＣＲ産物に結合するにつれて臭化エチジウムまたはＳＹＢＥＲ
Ｇｒｅｅｎのような染料の蛍光が増大することにより連続的にモニタリングされ
る。染料の結合はＰＣＲ産物の配列に対して選択的ではなく、高い非特異的バッ
クグラウンドはこの方法では誤シグナルを生じる場合があることに留意しなけれ
ばならない。
【００２０】 一般的にエキソヌクレアーゼプライマー（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ
）として知られているリアルタイムＰＣＲのための第２のＳＮＰ検出方法は、増
幅反応中に存在する２本標識プローブを切断するためにＴａｑのような熱安定性
ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用している（Ｗｉｔｔｗｅｒ，
Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８，１９９７
；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８８：７２７６−７２８０，
１９９１）。ＰＣＲ産物と相補的であるが、この試験で使用するプローブはＰＣ
Ｒプライマーとは異なっており、蛍光発生可能な分子と蛍光クエンチング可能な
分子の両方で二重標識されている。プローブが未損傷の場合は、ＤＮＡプローブ
内の蛍光シグナルの分子内クエンチングによりシグナルの発生は低下する。増幅
中Ｔａｑのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光分子が遊離する場合は、クエンチ
ングは大幅に減少し、蛍光シグナルが増大する。
【００２１】 リアルタイムＰＣＲの別の形態もまた束縛されたクエンチング部分を使用する
ことにより蛍光分子の分子内クエンチングを利用している。分子ビーコン技術は
目的のＤＮＡ標的に結合することにより自分の蛍光が再生される内部クエンチン
グ蛍光団を有するヘアピン型の分子を利用している（Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８，１９９６）。
蓄積するＰＣＲ産物に対する分子ビーコンプローブの結合の増大を用いてゲノム
ＤＮＡ中に存在するＳＮＰを特異的に検出することができる。
【００２２】 リアルタイムでＳＮＰを検出するために用いる最終的な全般的蛍光検出法は蛍
光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）として知られている方法と共にハイブリダイ
ゼーションプローブとして知られている合成ＤＮＡセグメントを利用している（
Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−
１３８，１９９７；Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ
ｌ．１５３：１０５５−１０６１，１９９８）。この方法は標的配列上の標識さ
れたＤＮＡプローブの独立した結合に依存している。標的配列上の２つのプロー
ブの近接により一方のプローブからもう一方への共鳴エネルギーの転移が増大し
、その結果、独特の蛍光シグナルが生じる。何れかのプローブの結合を妨害する
ＳＮＰにより生じたミスマッチを用いてＤＮＡ試料中に存在する突然変異配列を
検出することができる。
【００２３】 多くの遺伝子レベルの欠陥がヒトの疾患の病因に関わるとされている。これら
の疾患の状態を防止または診断するために上記遺伝子の突然変異を検出する幾つ
かの方法が研究者により使用されている。Ｖａｎ Ｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ ［
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３４：８０５−１２（１９９７）］によれば、Ｄｕｃ
ｈｅｎｎｅ型およびＢａｃｋｅｒ型の筋ジストロフィー患者の６５〜７０％でサ
ザンブロッティングまたは多重ＰＣＲで検出されるジスロトフィン遺伝子内の転
位を観察している。これらの２つの形態の筋ジストロフィーの微小損傷は典型的
には一本鎖コンフォーメーション分析、ヘテロ重複分析および蛋白トランケーシ
ョン試験を用いて検出される。
【００２４】 Ｃａｌｖａｎｏ ｅｔ ａｌ．［Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．５２：１７−２２（
１９９７）］はＤｕｃｈｅｎｎｅ型およびＢａｃｋｅｒ型の筋ジストロフィーの
女性キャリアの検出のために蛍光プローブとして使用されるＰＣＲ断片の使用を
報告している。Ｊｏｎｇｐｉｐｕｔｖａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．［Ｊ．Ｍｅｄ．
Ａｓｓｏｃ．Ｔｈａｉ．７９（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ１５−２１（１９９６）］は
Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー家系における診断およびキャリア発見のた
めの多重ＰＣＲおよびマイクロサテライトまたはＳＴＲ分析の使用を報告してい
る。Ｐａｓｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｖｅｓ １０：
１２９−３７（１９９６）］はＤｕｃｈｅｎｎｅ型およびＢａｃｋｅｒ型の筋ジ
ストロフィーのマクロデリーションキャリアの発見のために放射標識ＰＣＲ産物
を使用する定量的ＰＣＲ分析法を開発している。Ｋａｔａｙａｍａ ｅｔ ａｌ
．［Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．９：３７９−８４（１９９４）］はＤ
ｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの出生前診断のためのＰＣＲの効能を検討し
ている。これらの研究者はＰＣＲ−制限断片長多型分析、多重ＰＣＲおよびジヌ
クレオチド反復多型分析を用いて、最初の３ヶ月間に罹患雄性胎児を診断しキャ
リア雌性胎児を検出している。
【００２５】 ヒトギャップ結合蛋白コネキシン３７における多型はアテローム性動脈硬化症
の予後マーカーとして検討されている。Ｂｏｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒ
ｎ．Ｍｅｄ ２４６：２１１−２１８（１９９９）。コネキシン３７遺伝子のプ
ロリン変異体における制限断片長多型を用いてこの対立遺伝子がアテローム性動
脈硬化症プラークを有する患者において過剰に発現していることを示している。
Ｓｈｏｈｅｔ ｅｔ ａｌ．［Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａ
ｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１９７５−７８（１９９９）］は冠動脈疾患を有する白
人男性において肝リパーゼの−５１４Ｔ対立遺伝子の出現頻度を報告している。
この集団において、ヘパリン処理後血漿中肝リパーゼ活性は、対照群と比較して
、異型接合において１５〜２０％低値であり、そして同型接合において３０％低
値であった。プレセニリン−１遺伝子における新しいミスセンス突然変異は老年
前親族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）のある親族内に発見されている。Ｓｕｇｉ
ｙａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔ １４：９０（１９９０）。これらの研究者
の報告によれば、プレセニリン−１遺伝子における５０を超えるこのようなミス
センス突然変異がＦＡＤ親族内に報告されている。上記したものおよび他の遺伝
子レベルの欠陥の高感度の信頼できる検査法はヒトおよび動物の医療において幾
つかの潜在的な診断および予防の用途を有している。
【００２６】 要約すると、核酸ハイブリッドの検出のための代替法が必要とされている。何
らか別の状態で存在するとおもわれる配列とは僅かに異なる核酸配列の存在また
は非存在を測定するための上記したような方法が強く望まれている。試料中の特
定の物質に独特の配列の存在または非存在を測定する方法が強く望まれている。
更にまた既知の方法よりも高い感度を有し、高い再生性および自動化能を有する
方法が強く望まれている。
【００２７】 興味深い所定の標的ヌクレオチド配列または対立遺伝子変異体の存在を検出す
るために別の方法が使用できるとすれば好都合である。このような方法がマイク
ログラム〜ピコグラムの規模の試料量で操作できるとすれば更に好都合である。
さらにまた、このような検出方法が単一の試験において複数の分析を可能にする
とすれば好都合である（多重試験）。以下の記載はこのような方法を提供する。 発明の簡単な概要 本発明の方法を用いて核酸試料中の所定の（既知の）内因性核酸標的配列の存
在または非存在を測定する。このような方法は核酸標的配列にハイブリダイズさ
れたオリゴヌクレオチドプローブの３’−末端を脱重合して、後に存在を測定す
ることの可能な識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ヌクレオチド１つ以上を放出す
ることのできる酵素を利用する。
【００２８】 本発明の１つの実施態様は核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在また
は非存在を測定するための方法を意図している。即ち、所定の内因性核酸標的配
列の少なくとも１つの存在または非存在を測定しようとするものである。１つよ
り多いこのような所定の内因性核酸標的配列もまた試験すべき試料中に存在する
場合もあり、１つより多い所定の内因性核酸標的配列の存在または非存在を測定
することができる。実施態様は以下の工程を包含する。
【００２９】 ３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを含有する核酸プローブとハイブリダイ
ズされた所定の内因性核酸標的配列を含むと考えられる処理された試料を準備す
る。処理された試料は、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−末端からヌ
クレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合し、処理され
た反応混合物を形成する。処理された反応混合物は、酵素がハイブリダイズされ
た核酸を脱重合してこれより識別子ヌクレオチドを放出することができるのに十
分な時間、脱重合条件下に維持する。
【００３０】 分析出力は放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在を分析すること
により得られる。分析出力は所定の領域のヌクレオチドの存在または非存在を示
すものであり、これにより、第１の核酸標的の存在または非存在を示すものとな
る。分析出力は本明細書に記載する種々の方法で得られる。
【００３１】 本発明の方法の分析出力は種々の方法で得ることができる。分析出力は発光ス
ペクトル分析により確認することができる。一部の好ましい実施態様においては
、放出された３’−末端領域のインジケーターヌクレオチドの分析には、ルシフ
ェラーゼ検出系（発光スペクトル分析）またはＮＡＤＨ検出系（吸光度スペクト
ル分析）の何れかによるＡＴＰの検出が行なわれる。より高い感度が望まれる特
に好ましい実施態様においては、脱重合工程により生成したヌクレオシドトリホ
スフェートからＡＤＰの存在下例えばＮＤＰＫのような酵素を用いてホスフェー
ト転移工程によりＡＴＰ分子を形成する。一部の実施態様においては、ＡＴＰを
増幅して複数のＡＴＰ分子を形成する。ＡＴＰ検出実施態様においては、典型的
にはヌクレオチドおよび添加したＡＤＰをＡＴＰに変換するための酵素（ＮＤＰ
Ｋ）が脱重合酵素による脱重合反応において存在し、そしてそれらが同時に存在
する場合は、それらは「１段階」法と称される。
【００３２】 別の実施態様において、分析出力は蛍光スペクトル分析により得られる。種々
の蛍光検出法の使用を意図している。意図される１つの方法においては、識別子
ヌクレオチドは蛍光標識を含む。識別子ヌクレオチドは識別子ヌクレオチドの放
出の前または後に蛍光標識されることができる。放出された識別子ヌクレオチド
以外のものが蛍光タグを含むことも意図される。このような実施態様においては
、本発明の方法におけるヌクレオチドの放出は、例えばプローブの５’−末端ま
たは３’−末端領域以外の領域における蛍光タグにより画像化されるキャピラリ
−電気泳動によりポリヌクレオチドプローブの長さの差を測定することにより確
認される。
【００３３】 別の実施態様においては、分析出力は質量スペクトルにより得られる。ここで
は識別子ヌクレオチドはヌクレオチド類縁体または標識ヌクレオチドであり、そ
のヌクレオチドの通常の形態の質量とは異なる分子質量を有することが好ましい
が、質量の差は要求されない。蛍光標識識別子ヌクレオチドを用いた場合、分析
出力は質量スペクトル分析により得ることもできる。更にまた、放出されたヌク
レオチドの分析は、本発明の方法の脱重合工程の後にプローブの質量の差を確認
することにより行ってもよい。
【００３４】 更に別の実施態様においては、分析出力は吸光度スペクトル分析により得られ
る。このような分析は吸収物質の存在を測定するためにスペクトルの紫外部およ
び可視光線部の光の吸収をモニターする。このような方法の１つの特徴において
、放出されたヌクレオチドはクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、またはＧＣ
）または電気泳動（例えばＰＡＧＥまたはキャピラリー電気泳動）によりハイブ
リダイズされた核酸および他のポリヌクレオチドから分離される。放出された識
別子ヌクレオチドまたはプローブの残余の何れかを分析して本発明の方法におけ
る識別子ヌクレオチドの放出を確認することができる。このような方法の別の特
徴において、分析される核酸に標識を導入してもよい。
【００３５】 意図される実施態様において、試験対象となる試料は１つ以上の核酸プローブ
とハイブリダイズ条件下にて混合され、ハイブリダイゼーション組成物を形成す
る。核酸プローブの３’−末端領域は、核酸標的配列が試料中に存在する場合に
は、その配列に部分的または全体的な相補性でハイブリダイズする。核酸プロー
ブの３’−末端領域は識別子ヌクレオチドを含んでいる。ハイブリダイゼーショ
ン組成物は核酸プローブとハイブリダイズした上記所定の核酸標的配列を含むと
考えられる処理された試料を形成するのに十分な時間、ハイブリダイズ条件下に
維持される。処理された試料は、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−末
端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合し、
処理された反応混合物を形成する。処理された反応混合物は、酵素がハイブリダ
イズされた核酸を脱重合してそれより識別子ヌクレオチドを放出することができ
るのに十分な時間、脱重合条件下に維持される。放出された識別子ヌクレオチド
の存在を分析して分析出力を得るが、その分析出力は核酸標的配列の存在または
非存在を示すものである。分析出力は上記した種々の方法により得てよい。
【００３６】 本発明の１つの方法は測定すべき試料中の核酸標的配列中の特定の塩基の存在
または非存在を調査することを意図しており、以下の工程を包含する。 ハイブリダイゼーション組成物は、ハイブリダイズ条件下、核酸プローブ１つ
以上を試験すべき試料と混合することにより形成する。試験すべき試料は調査す
べき核酸標的配列を含んでいると考えられる。核酸標的は存在または非存在を確
認すべき塩基少なくとも１つを含んでいる。ハイブリダイゼーション組成物は、
核酸標的配列と実質的に相補的であり、調査位置に所定のヌクレオチド少なくと
も１つ、および、３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを有する核酸プローブ少
なくとも１つを含んでいる。
【００３７】 処理された試料は、調査位置のプローブヌクレオチドが標的配列中の識別すべ
き塩基と並置される場合に塩基対形成が起こるのに十分な時間、ハイブリダイゼ
ーション組成物をハイブリダイズ条件下に維持することにより形成される。処理
された反応混合物は、処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブの
３’−末端から識別子ヌクレオチド１つ以上を放出してハイブリッドを脱重合す
る活性を有する酵素と混合することにより形成される。処理された反応混合物は
、酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出する
のに十分な時間、脱重合条件下に維持される。
【００３８】 分析出力は放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在を分析すること
により得られる。分析出力は識別すべき特定の塩基の存在または非存在を示すも
のである。分析出力は本明細書に記載する種々の方法により得られる。好ましく
は、識別子ヌクレオチドは調査位置にある。
【００３９】 本発明の方法の１つの特徴において、核酸標的配列はデオキシリボ核酸および
リボ核酸よりなる群から選択される。 調査位置に存在する特定の塩基を識別する方法は、場合により、第１のプロー
ブ、第２のプローブ、第３のプローブおよび第４のプローブを包含する。第１の
プローブの調査位置はデオキシアデノシンまたはアデノシンの残基である核酸残
基を含んでいる。第２のプローブの調査位置はデオキシチミジンまたはウリジン
の残基である核酸残基を含んでいる。第３のプローブの調査位置はデオキシグア
ノシンまたはグアノシンの残基である核酸残基を含んでいる。第４の核酸プロー
ブの調査位置はデオキシシトシンまたはシトシンの残基である核酸残基を含んで
いる。
【００４０】 本発明の別の特徴においては、複数の標的核酸配列を含む試料を、複数の核酸
プローブと混合する。幾つかの分析出力は上記した多重試験から得ることができ
る。第１の実施態様においては、核酸プローブ少なくとも１つが標的核酸配列１
つと部分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力は核酸プローブ全
てがそれらの対応する核酸標的配列と全体的相補性でハイブリダイズする場合の
分析出力より大きい。第２の実施態様においては、核酸プローブ少なくとも１つ
が標的核酸配列１つと部分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力
は核酸プローブ全てがそれらの対応する核酸標的配列と全体的相補性でハイブリ
ダイズする場合の分析出力より小さい。第３の実施態様においては、核酸プロー
ブ少なくとも１つが標的核酸配列１つと全体的相補的にハイブリダイズする場合
に得られる分析出力は核酸プローブ全てがそれらの対応する核酸標的配列と部分
相補性でハイブリダイズする場合の分析出力より大きい。第４の実施態様におい
ては、核酸プローブ少なくとも１つが標的核酸配列１つと全体的相補性でハイブ
リダイズする場合に得られる分析出力は核酸プローブ全てがそれらの対応する核
酸標的配列と部分相補性でハイブリダイズする場合の分析出力より小さい。脱重
合酵素は本明細書に記載するとおりである。
【００４１】 本発明の更に別の実施態様は、第１の内因性核酸標的を含むと考えられる、或
いは、実質的に同一の第２の標的を含むと考えられる核酸中の該標的の存在また
は非存在を測定するための方法を意図する。例えば、第２の標的は第１の核酸標
的と比較した場合に塩基の置換、欠失または付加を有している。本実施態様は以
下の工程を包含する。
【００４２】 試験すべき試料をハイブリダイズ条件下、核酸プローブ１つ以上と混合してハ
イブリダイゼーション組成物を形成する。第１および第２の核酸標的は各々、標
的間で異なる所定の位置に少なくとも単一のヌクレオチドを除いて配列同一の領
域を含んでいる。核酸プローブは配列同一の核酸標的領域に実質的に相補的であ
り、調査位置に少なくとも１つのヌクレオチドを有する。プローブの調査位置は
、標的とプローブがハイブリダイズされる場合に、標的の所定の位置と並置され
る。プローブはまた３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを含んでいる。
【００４３】 ハイブリダイゼーション組成物は、プローブの調査位置のヌクレオチドが標的
の同一領域内の所定の位置のヌクレオチドと並置されている、処理された試料を
形成するのに十分な時間ハイブリダイズ条件下に維持される。
【００４４】 処理された反応混合物は、処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プロ
ーブの３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重
合量と混合することにより形成される。反応混合物は、酵素がハイブリダイズさ
れた核酸を脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条
件下に維持される。
【００４５】 分析出力は放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在を分析すること
により得られる。分析出力は所定の領域のヌクレオチドの存在または非存在を示
すものであり、これにより、第１の核酸標的の存在または非存在を示す。
【００４６】 上記方法の１つの特徴は第１のプローブおよび第２のプローブよりなる。第１
のプローブは所定の位置の第１の核酸標的に相補的な調査位置のヌクレオチドを
有する。第２のプローブは所定の位置の第２の核酸標的に相補的な調査位置のヌ
クレオチドを有する。
【００４７】 本発明の方法の１つの特徴において、ヌクレオチドを放出する活性を有する脱
重合酵素は鋳型依存性のポリメラーゼであり、その活性は、その３’−末端ヌク
レオチドがマッチしているハイブリダイズされた核酸を、３’→５’の方向に、
ピロホスフェート存在下で脱重合し、ヌクレオチド１つ以上を放出することであ
る。即ち、酵素の活性はハイブリダイズされた核酸を脱重合し、脱重合条件下に
ヌクレオチドを放出することである。好ましくは、この酵素はプローブの３’−
末端領域内のその塩基が核酸標的の相当する塩基と全体的な相補性をもってマッ
チするハイブリダイズされた核酸を脱重合する。酵素は適切な対となった塩基を
、３’−末端から放出し続け、そしてミスマッチの塩基に酵素が到達した時点で
停止する。
【００４８】 操作法（方法）の別の特徴において、ヌクレオチドを放出する活性を有する脱
重合酵素は、ハイブリダイズされたプローブの３’−末端にミスマッチ塩基１つ
以上を有するハイブリダイズされた核酸が脱重合されるような３’→５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を示す。即ち、酵素の活性はハイブリダイズされた核酸を脱重
合し、脱重合条件下にヌクレオチドを放出することである。この実施態様におい
ては、ハイブリッドは遊離のプローブから分離された後に酵素処理されてよい。
一部の実施態様においては、過剰量の標的を用いることにより、酵素反応におけ
る遊離のプローブの濃度を極めて低くしてもよい。
【００４９】 本発明の方法の更に別の特徴において、脱重合酵素は、ハイブリッドの３’−
末端にマッチ塩基１つ以上を有する二本鎖ＤＮＡ基質に対して３’〜５’のエキ
ソヌクレアーゼ活性を示す。酵素の活性は、脱重合条件下、ハイブリダイズされ
た核酸を脱重合し、５’ホスフェートを有するヌクレオチドを放出することであ
る。
【００５０】 本発明の更に別の実施態様は、１縦列反復（Ｓｉｎｇｌｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒ
ｅｐｅａｔ（ＳＴＲ））検出に用いられる場合のように、核酸試料中の内因性核
酸標的配列中に存在する既知の配列の反復の数を測定するための方法を意図する
。既知の配列の反復の数を測定するための方法は、以下の工程を包含する。複数
の個別の処理試料が準備される。各々の処理された試料は核酸プローブにハイブ
リダイズされた核酸標的配列を含んでいる。核酸標的配列は複数の既知の配列の
反復および下流の非反復領域を含んでいる。各核酸プローブは異なる数の既知配
列の相補反復、３’−末端領域の識別子ヌクレオチド、および、５’−末端ロッ
カー配列を含んでいる。５’−末端ロッカー配列は標的の下流非反復領域に相補
的であり、１〜約２０ヌクレオチド、好ましくは、５〜２０ヌクレオチド、最も
好ましくは１０〜２０ヌクレオチドを含んでいる。種々のプローブが標的核酸の
可能な対立遺伝子に対して相補性となっている。処理された脱重合反応混合物は
、各々の処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−末端か
らヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合すること
により形成される。処理された脱重合反応混合物は、酵素がハイブリダイズされ
た核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱
重合条件下に維持される。放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在に
ついて試料を分析することにより、分析出力が得られる。そのプローブが標的核
酸中に存在するものと同数の配列反復を含んでいる試料の分析出力は、核酸標的
中に存在する配列反復の数を示しており、これを測定したものである。
【００５１】 本発明の１つの特徴において、核酸試料は１つの遺伝子座に２つの核酸標的提
示対立遺伝子を含んでおり、そして２つの対立遺伝子の既知配列反復の数に関し
て同型接合である。本発明の別の方法においては核酸試料は遺伝子座の２つの対
立遺伝子に関して異型接合である。本発明の別の方法においては、識別子ヌクレ
オチドは反復配列を含む領域の部分であるヌクレオチドである。本発明の別の方
法においては、プローブ配列の識別子ヌクレオチドは反復既知配列の５’側の標
的核酸内に位置するものと相補的である非反復配列を含む領域の一部である。こ
の後者の特徴の方法の場合、識別子ヌクレオチドは既知配列反復の３’側のプロ
ーブに位置する標的核酸の非反復配列に相補的な１〜約２０核酸を含む配列中に
存在する。核酸標的配列中に存在する反復既知配列は典型的には反復当たり約２
〜約２４塩基の長さを有する。
【００５２】 本発明の別の実施態様は核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列少なくとも１
つの存在または非存在を測定するための脱重合酵素として熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼを使用する方法であり、そして以下の工程を包含する。
【００５３】 その３’−末端領域が所定の核酸標的配列に相補的であり３’−末端領域に識
別子ヌクレオチドを含んでいる核酸プローブにハイブリダイズされた所定の内因
性核酸標的配列を含むと思われる処理された試料を準備する。処理された脱重合
反応混合物は、処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−
末端から識別子ヌクレオチドを放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合する
ことにより形成される。好ましい１段階実施態様において、脱重合酵素は熱安定
性であり、より好ましくは、処理された反応混合物もまた（ｉ）アデノシン５’
ジホスフェート、（ｉｉ）ピロホスフェート、および、（ｉｉｉ）熱安定性ヌク
レオシドジホスフェートキナーゼ（ＮＤＰＫ）を含有する。
【００５４】 処理された試料は、約４℃〜約９０℃の温度、より好ましくは約２０℃〜約９
０℃の温度、最も好ましくは約２５℃〜約８０℃の温度で、脱重合酵素がハイブ
リダイズされた核酸プローブを脱重合し、ヌクレオシドトリホスフェートとして
識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持する。好ま
しい１段階反応においては、ＮＤＰＫ酵素が放出されたヌクレオシドトリホスフ
ェートから添加したＡＤＰにホスフェートを転移させ、これによりＡＴＰを形成
するのに十分な時間とする。核酸標的配列の存在または非存在はＡＴＰを用いて
得られる分析出力から測定される。本発明の好ましい方法においては、分析出力
は発光スペクトル分析により得る。
【００５５】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的試料の存在または非存在を測定するため
の熱安定性酵素１段階法の別の特徴において、処理された試料は以下の追加的工
程により形成する。ハイブリダイゼーション組成物は、試験すべき試料を核酸プ
ローブ１つ以上とハイブリダイズ条件下に混合することにより形成する。核酸プ
ローブの３’−末端領域は（ｉ）核酸標的配列が試料中に存在する場合には該配
列と部分的または全体的な相補性でハイブリダイズし、そして（ｉｉ）識別子ヌ
クレオチドを含んでいる。処理された試料は、所定の内因性核酸標的配列が核酸
プローブとハイブリダイズするのに十分な時間、ハイブリダイズ条件下にハイブ
リダイズ組成物を維持することにより形成される。
【００５６】 好ましくは、脱重合酵素は、Ｔｎｅ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ
ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔｖｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、および、
Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを包含する好熱性ＤＮＡポリメラーゼの群から選択
する。Ｔｎｅ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼは好ましい好熱性酵素であり、後
に詳述する。方法の別の特徴において、ＮＤＰＫは好熱性細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）によりコードされるものである。
【００５７】 本発明の更に別の方法は、遺伝子座における２つの対立遺伝子に対して同型接
合または異型接合である遺伝子座から生じる核酸試料中の核酸標的配列の存在ま
たは非存在を測定することを意図している。この方法は以下の工程よりなる。複
数の個別の処理された試料を準備する。各試料は核酸プローブにハイブリダイズ
した核酸標的配列を含むものとする。核酸標的配列は、核酸標的の第１の対立遺
伝子、第２の対立遺伝子、または、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子の混合
物の何れかよりなる。対立遺伝子は調査位置における配列が異なる。核酸プロー
ブはプローブと標的がハイブリダイズされる場合に、標的配列の調査ヌクレオチ
ド位置に並置される３’−末端領域の識別子ヌクレオチドを含んでいる。
【００５８】 処理された反応混合物は各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プ
ローブの３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出させる活性を有する酵素の
脱重合量と混合することにより形成する。処理された反応混合物は、酵素がハイ
ブリダイズされた核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するのに
十分な時間、脱重合条件下に維持する。放出された識別子ヌクレオチドの存在ま
たは非存在について試料を分析することにより、分析出力を得る。分析出力は定
量可能なものであり、これにより、適切な対照群の分析出力と比較した場合に、
試料が同型接合であるか異型接合であるかを測定する。
【００５９】 本実施態様の多重版もまた意図され、ここでは２つ以上の対立遺伝子に対する
プローブが１反応において提供され、各プローブは識別可能であるが、好ましく
は各プローブは同じ長さを有する。次に、本発明に従ってハイブリダイゼーショ
ン、脱重合および分析を行った後、種々の識別可能な識別子ヌクレオチドまたは
残存するプローブに対する相対的な分析出力が、試料が同型接合か異型接合か、
そしていずれの対立遺伝子対してそうであるかを示すものとなる。本実施態様の
別の多重版も意図され、ここでは、複数の遺伝子座における対立遺伝子に対する
プローブが与えられる。好ましくは、異なる遺伝子座は実質的に異なる標的配列
を有する。各遺伝子座における種々の対立遺伝子に対するプローブは好ましくは
同じ長さのものである。プローブの各々は放出された識別子ヌクレオチドの分析
により、または、脱重合後に残存するプローブの分析により、識別可能でなけれ
ばならない。
【００６０】 本発明の別の実施態様は以下の工程を包含する対立遺伝子の遺伝子座の異型接
合性の損失（ＬＯＨ）を測定するための方法を意図している。 複数の個別の処理された試料は、各々の試料が核酸プローブにハイブリダイズ
された核酸標的配列を含有するように準備される。核酸標的配列は核酸標的の第
１の対立遺伝子、または第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子の混合物のもので
あり、ここで対立遺伝子は配列が異なっている。核酸プローブはプローブと標的
がハイブリダイズされる場合に標的配列にハイブリダイズする３’−末端領域を
含んでいる。
【００６１】 各々の処理された試料は、ハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末端
からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合される
ことにより、処理された反応混合物を形成する。処理された反応混合物は、ハイ
ブリダイズされた核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するのに
十分な時間、脱重合条件下に維持する。次に放出された識別子ヌクレオチドの量
について試料を分析することにより分析出力を得るが、この分析出力は核酸試料
中の核酸標的配列が対立遺伝子の遺伝子座において異型接合性を失っているかど
うかを示すものである。
【００６２】 好ましいＬＯＨ実施態様において、分析出力は発光スペクトル分析、吸光度ス
ペクトル分析、質量スペクトル分析または蛍光スペクトル分析により得られる。
別の好ましい実施態様においては、放出された識別子ヌクレオチドは蛍光標識を
含んでいる。識別子ヌクレオチドは場合によりハイブリッドから放出された後に
蛍光標識される。
【００６３】 上記分析法において、放出された識別子ヌクレオチドまたはプローブの残余の
何れかを評価することにより、識別子ヌクレオチドが上記した通り放出されてい
るかどうかを調べることを意図している。
【００６４】 別の好ましいＬＯＨ実施態様において、ヌクレオチドを放出する活性を有する
酵素は、その３’−末端領域の塩基が核酸標的の塩基に全体的に相補的であるハ
イブリダイズされた核酸をピロホスフェートイオンの存在下で脱重合する鋳型依
存性ポリメラーゼである。脱重合はプローブの３’−末端ヌクレオチドから始ま
り、相当する標的塩基に対して相補的ではない塩基に到達した時点で停止する。
【００６５】 ＬＯＨ実施態様の１つの特徴において、第１の対立遺伝子に対する放出された
識別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の対照群試料の第１の対立遺伝子に
対する放出された識別子ヌクレオチドの量より実質的に少なく、そして、第２の
対立遺伝子に対する放出された識別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の対
照群試料の第２の対立遺伝子に対する放出された識別子ヌクレオチドの量と実質
的に同じであり、第１の対立遺伝子の遺伝子座における異型接合性の損失を示し
ている。
【００６６】 ＬＯＨ実施態様の別の特徴において、第２の対立遺伝子に対する放出された識
別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の対照群試料の第２の対立遺伝子に対
する放出された識別子ヌクレオチドの量より実質的に少なく、そして、第１の対
立遺伝子に対する放出された識別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の対照
群試料の第１の対立遺伝子に対する放出された識別子ヌクレオチドの量と実質的
に同じであり、第２の対立遺伝子の遺伝子座における異型接合性の損失を示して
いる。既知の異型接合性の対照群は約１：１の比で試料中に対立遺伝子１および
２が存在することを示す、その処理された試料に関する分析出力を有する。異型
接合性の損失のある試料は既知の異型接合の対照群試料の分析出力と比較した場
合に、それぞれ１：０または０：１の比で対立遺伝子１および２が試料中に存在
することを示す、処理された試料に関する分析出力を有する。
【００６７】 本発明の更に別の好ましい実施態様は、以下の工程を包含する対立遺伝子のト
リソミーの存在を測定するための方法を意図する。 複数の個別の処理された試料を、各資料が核酸プローブとハイブリダイズされ
た核酸標的配列を含有するように準備する。核酸標的配列は核酸標的の第１の対
立遺伝子、第２の対立遺伝子、または、第１および第２の対立遺伝子の混合物の
ものである。対立遺伝子は調査位置の配列が異なる。核酸プローブはプローブと
標的がハイブリダイズされる場合に調査ヌクレオチド位置を含む核酸標的配列の
領域にハイブリダイズする３’−末端領域を含んでいる。核酸プローブはまた識
別子ヌクレオチドを含んでいる。
【００６８】 各々の処理された試料は、ハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末端
からヌクレオチド１つ以上を放出する脱重合条件下の活性を有する酵素の脱重合
量と混合され、これにより、処理された反応混合物を形成する。処理された反応
混合物は、ハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチド
を放出するのに十分な時間、維持される。放出された識別子ヌクレオチドに関し
て試料を分析し、分析出力を得るが、適切な対照試料の分析出力に対する相対的
な分析出力の大きさが、核酸標的配列中にトリソミーが存在するかどうかを示し
ている。
【００６９】 トリソミーの分析のためには、好ましくは、分析出力は発光スペクトル分析、
吸光度スペクトル分析、蛍光スペクトル分析または質量スペクトル分析により得
られる。１つの好ましい実施態様においては、放出された識別子ヌクレオチドは
蛍光標識を含んでいる。識別子ヌクレオチドは場合によりハイブリッドから放出
された後に蛍光標識される。
【００７０】 トリソミー分析の好ましい実施態様において、ヌクレオチドを放出する活性を
有する酵素は、その３’−末端領域の塩基が上記核酸標的の塩基に全体的に相補
的であるハイブリダイズされた核酸をピロホスフェートの存在下に脱重合する鋳
型依存性のポリメラーゼである。
【００７１】 １つの実施態様において、第１の対立遺伝子に対して放出された識別子ヌクレ
オチドの量は、第１の対立遺伝子に対して同型接合の対照試料の放出された識別
子ヌクレオチドの量よりも実質的に多く、核酸標的配列がトリソミーを有してい
ることを示している。好ましくは、放出された識別子ヌクレオチドの量は比で表
す。例えば、正常な異型接合は約１：１の２つの対立遺伝子の分析出力を有する
。トリソミーが何れの対立遺伝子に対しても同型接合である場合は、比は、もう
一方の対立遺伝子を全く有さない正常な異型接合におけるその対立遺伝子の値の
約３倍となる。トリソミーが異型接合である場合は、対照異型接合の分析出力と
比較して、比は一方の対立遺伝子と他方とが約２：１となる。
【００７２】 更に別の本発明の実施態様は標的にハイブリダイズされ、その後変性されてヘ
アピン構造を形成することができるようになるプローブを用いて核酸試料中の核
酸標的配列の存在または非存在を測定することを意図する。本実施態様は以下の
工程を包含する。
【００７３】 核酸プローブとハイブリダイズされた調査位置を有する核酸標的配列を含むと
思われる核酸試料を含有するように処理された試料を準備する。プローブは少な
くとも２つの区分を有する。第１の区分はプローブの３’−末端の約１０〜約３
０ヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチドは調査位置の下流約１〜約３０ヌ
クレオチドから始まる位置の標的鎖配列と相補的である。プローブの第２の区分
はプローブの５’−末端領域に位置し、標的配列の約１０〜約２０ヌクレオチド
を含んでいる。この配列は調査位置またはそのすぐ上流（５’）からプローブの
３’−末端ヌクレオチドが標的アニーリングする個所のすぐ上流のヌクレオチド
まで、標的領域を広げている。０〜約５０、好ましくは約０〜約２０ヌクレオチ
ドの長さであり、第１および第２の何れの区分ともハイブリダイズしない配列を
有するプローブの任意の第３の区分は、プローブの第１の区分と第２の区分の間
に位置する。
【００７４】 処理された試料のプローブは、ｄＮＴＰおよび鋳型依存性ポリメラーゼトの混
合により、少なくとも調査位置を通って鋳型依存的に伸長され、これにより伸長
されたプローブ／標的ハイブリッドを形成する。好ましい実施態様においては、
プローブの伸長の長さは調査位置の上流に存在し、調査位置の３’−エンドに相
補的なヌクレオチドの間には存在しない標的配列のヌクレオチドに相補的なｄＮ
ＴＰの伸長反応からの離脱により制限される。
【００７５】 伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは如何なる未反応のｄＮＴＰからも分
離される。伸長されたプローブ／標的ハイブリッドを変性して鎖を分離する。伸
張したプローブ鎖はヘアピン構造を形成できるようになる。
【００７６】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を、伸長されたプローブヘ
アピン構造の３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素
の脱重合量と混合することにより形成される。反応混合物は、脱重合酵素が３’
−末端ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、次に
放出された識別子ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸標的
配列の存在または非存在を示すものである。
【００７７】 更に別の本発明の実施態様は、ＲＥＡＰＥＲ（商標名）と称するものであり、
ヘアピン構造を利用している。この方法は核酸試料中の核酸標的配列または標的
配列内の特定の塩基の存在または非存在を測定することを意図しており、以下の
工程を包含する。処理された試料は、第１の核酸プローブ鎖にハイブリダイズさ
れた核酸標的配列を含むと思われる核酸試料を含有するように準備する。
【００７８】 ハイブリッドは第１のハイブリッドと称する。第１のプローブは少なくとも２
つの区分よりなる。第１の区分は、標的調査位置の下流約５〜約３０ヌクレオチ
ドから始まる位置の標的核酸配列に相補的なプローブ３’−末端約１０〜約３０
ヌクレオチドを含んでいる。第１のプローブの第２の区分は、調査位置から調査
位置の下流約１０〜約３０ヌクレオチドまでの標的配列の反復であり、プローブ
の第１の区分とはハイブリダイズしない、約５〜約３０ヌクレオチドを含んでい
る。プローブの任意の第３の区分はプローブの第１の区分と第２の区分の間に位
置し、０〜約５０、好ましくは約２０ヌクレオチド以下の長さを有し、第１およ
び第２の区分の何れともハイブリダイズしない配列を有する。
【００７９】 処理された試料中の第１のハイブリッドは第１のプローブの３’−末端におい
て伸長され、これにより、第１のプローブは調査位置を通過して伸長し、その配
列が調査位置を含む伸長された第１のハイブリッドを形成する。伸長された第１
のハイブリッドは元の標的核酸および伸張された第１のプローブよりなる。次に
伸張された第１のハイブリッドは水性組成物中で変性され、ハイブリダイズされ
た２重体の２つの核酸鎖を分離し、分離された標的核酸および分離された伸長さ
れた第１のプローブを含有する水溶液を形成する。
【００８０】 長さが約１０〜約２０００、好ましくは約１０〜約２００、最も好ましくは約
１０〜約３０ヌクレオチドであり、伸長された第１のプローブの調査位置の下流
約５〜約２０００、好ましくは約５〜約２００ヌクレオチドから始まる位置の伸
長された第１のプローブに相補的である第２のプローブを伸長された第１のプロ
ーブとアニーリングし、これにより、第２のハイブリッドを形成する。第２のハ
イブリッドは、伸長された第１のプローブの５’−エンドに伸長が到達するまで
、第２のプローブの３’−エンドにおいて伸長され、これによりその３’−エン
ド領域が識別子ヌクレオチドを含む第２の伸長されたハイブリッドが形成される
。好ましい実施態様においては、両方の身長のための伸長ポリメラーゼは鋳型中
に相当する相補ヌクレオチドを有さない３’−エンドにはヌクレオチドを付加し
ない。
【００８１】 伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して２つの核酸鎖を分離す
る。このようにして形成された水性組成物を冷却すると、元の核酸試料中に標的
配列が存在する場合には、分離された伸長された第２のプローブから「ヘアピン
構造」が形成される。
【００８２】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を核酸ハイブリッドの３’
−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合
することにより形成される。反応混合物は、３’−末端領域識別子ヌクレオチド
を放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、その後、放出された識別
子ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸標的配列の存在また
は非存在を示すものである。
【００８３】 本発明は多くの利点と好都合な特徴を有するが、その一部を以下に記載する。 本発明の１つの利点は、一部の実施態様において、核酸ハイブリッドが放射性
物質や電気泳動を必要とすることなく、きわめて高い感度で検出される点である
。
【００８４】 本発明の好都合な特徴は、標的核酸１つ以上の存在または非存在が、高い信頼
性、再現性で、そして高感度で検出できる点である。 本発明の別の利点は、試料中の標的核酸配列の量に関する定量的なデータが得
られる点である。
【００８５】 本発明の別の好都合な点は、１ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のような核酸配列
の極めて僅かな差も検出できる点である。 本発明の更に別の利点は、多くの標的核酸配列の存在または非存在が同じ試験
で測定できる点である。
【００８６】 本発明の更に別の好都合な特徴は標的核酸の存在または非存在が小数の試薬お
よび操作で測定できる点である。 本発明の更に別の利点は方法が自動化できる点である。
【００８７】 本発明の更に別の利点は、例えば核酸中の突然変異、転移およびＳＮＰ（遺伝
病にかかわるものを含む）の検出、ウィルス負荷の測定、種の識別、試料の汚染
および法医学的試料の分析を含む、多くの異なる種類の用途および試験における
、その多用途性である。
【００８８】 本発明の更に別の利点および好都合な特徴は以下に記載する明細書の内容およ
び請求項により明らかとなる。定義 本発明をより理解するために、多くの用語を以下の通り定義する。
【００８９】 「ヌクレオシド」とは、本明細書においては、ペントースに共有結合したプリ
ン［グアニン（Ｇ）グアニンアアデニン（Ａ）］またはピリミジン［チミン（Ｔ
）、ウリジン（Ｕ）ウリジンまたはシチジン（Ｃ）］塩基よりなる化合物を指し
、「ヌクレオチド」とはそのペントースヒドロキシル基の１つにおいてホスホリ
ル化されたヌクレオシドを指すものとする。「ＸＴＰ」、「ＸＤＰ」および「Ｘ
ＮＰ」はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドに対する遺伝子表示
であり、「ＴＰ」とはトリホスフェート、「ＤＰ」とはジホスフェート、そして
、「ＭＰ」とはモノホスフェートであり、当該分野の標準的使用法と合致してい
る。リボヌクレオチドに関する下位の一般的表示は「ＮＭＰ」、「ＮＤＰ」また
は「ＮＴＰ」 であり、デオキシリボヌクレオチドに関する下位の一般的表示は
「ｄＮＭＰ」、「ｄＮＤＰ」または「ｄＮＴＰ」である。更にまた本明細書にお
いて「ヌクレオシド」に包含されるものは、上記したヌクレオシドの代替として
一般的に使用されている物質、例えば、これらの塩基の修飾型（例えばメチルグ
アニン）または当該分野でよく知られた合成物質、例えばイノシンである。
【００９０】 「核酸」という用語は、本明細書においては、ヌクレオチドのペントースの３
’位が次のペントースの５’位にホスホジエステル基により連結されている、そ
して、ヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列、即ちヌクレオチドの一次的順序
で連結されている、ヌクレオチドの共有結合的に連結された配列である。「ポリ
ヌクレオチド」とは、本明細書においては、約１００ヌクレオチド長より長い配
列を有する核酸である。「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書においては、短
いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分である。オリゴヌクレオチド
は典型的には約２〜約１００の塩基の配列を含む。「オリゴ」という用語を「オ
リゴヌクレオチド」という用語の代わりに用いる場合もある。
【００９１】 塩基の「位置」とは本明細書においては、核酸内の所定の塩基またはヌクレオ
チド残基の位置を指す。 「目的の核酸」とは、本明細書においては、研究対象となる試料中の何れかの
特定の核酸である。
【００９２】 「単離された」という用語は、核酸または蛋白に関連して使用される場合は、
識別された核酸配列または蛋白であって、その天然の入手元において通常それと
伴って存在している少なくとも１種の夾雑物（それぞれ核酸または蛋白）から分
離されているものを指すものとする。単離された核酸または蛋白はそれが天然に
存在する場合とは異なる形態または環境で存在する。一方、非単離の核酸または
蛋白はそれらが天然に存在する状態において存在する。
【００９３】 本明細書において、「精製された」または「精製すべき」という用語は目的の
成分、例えば蛋白または核酸から何らかの夾雑物を除去する何らかの操作法の結
果を意味する。これにより試料中の精製された成分のパーセントは増大する。
【００９４】 「野生型」という用語は、本明細書においては、集団中に最も頻繁に観察され
、このため便宜上「性状」または「野生型」の遺伝子形態とされる遺伝子または
遺伝子産物の特徴を有するそのような遺伝子または遺伝子産物を指す。一方、「
修飾された」または「突然変異」という用語は、本明細書においては、野生型の
遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および／または機能的特性におい
て変化（即ち変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００９５】 核酸は種々の突然変異を含むことが知られている。本明細書においては、「点
」突然変異とは、１塩基位置におけるヌクレオチドの配列における変化を指す。
「損傷（ｌｅｓｉｏｎ）」とは、本明細書においては、核酸配列が野生型の配列
と異なるように欠失または挿入により塩基１つ以上が突然変異している核酸内の
個所を指す。
【００９６】 「１ヌクレオチド多形」、即ちＳＮＰとは、本明細書においては、特定の核酸
位置において最も頻繁に存在する塩基からの変化である。 異なる種に由来する相同遺伝子または対立遺伝子もまた配列が変動することが
知られている。異なる種に由来する相同遺伝子または対立遺伝子の領域は本質的
には配列は同一である。このような領域は本明細書においては「同一の領域」と
賞する。本明細書においては、「実質的に同一の領域」は、同一の領域における
同じ位置の塩基が異なるいくつかの「ミスマッチ」を含むことができるものとす
る。この塩基の位置は本明細書では「ミスマッチ位置」と称する。
【００９７】 ＤＮＡ分子は、「５’−末端（terminus）」（５’エンド（end））および「
３’−末端」（３’エンド）を有するとされているが、その理由は、核酸ホスホ
ジエステル結合が置換基モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素および３’
炭素で生じるためである。新しい結合が５’炭素に対するものとなるポリヌクレ
オチドのエンドが、その５’末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素に
対するものとなるポリヌクレオチドの末端がその３’末端ヌクレオチドである。
末端ヌクレオチドとは、本明細書においては、３’−または５’−末端のエンド
の位置におけるヌクレオチドである。本明細書において、核酸配列は、より大き
いオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部である場合であっても、５
’−および３’−エンドを有するということができる。例えば、より大きい染色
体配列内に位置する遺伝子配列もなお５’−および３’−エンドを有するという
ことができる。
【００９８】 本明細書においては、核酸プローブの３’−末端領域は３’−末端位置から約
１０残基内にあるヌクレオチドを含むプローブの領域を指す。 直鎖状または環状のＤＮＡ分子の何れかにおいて、個々の要素は、それらがそ
の要素の５’−エンドに結合しているか、結合されることになる場合、その要素
に対して「上流」または「５’」であるとする。同様に、個々の要素は、それら
がその要素の３’−エンドに結合するかそのようになる場合、その要素に対して
「下流」または「３’」であるとする。転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’に
進行する。このことは、ＲＮＡが、成長中の鎖の３’−末端にリボヌクレオチド
−５’−トリホスフェートを順次付加することにより（ピロホスフェートを脱離
させながら）形成されることを意味している。
【００９９】 本明細書においては、「標的核酸」または「核酸標的」という用語は目的の特
定の核酸配列を指すものとする。即ち、「標的」は他の核酸分子の存在下、また
は、より大きい核酸分子内に存在することができる。
【０１００】 本明細書においては、「核酸プローブ」という用語は、目的の別の核酸にハイ
ブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す
ものとする。核酸プローブは精製された制限消化物として天然に存在するもので
あるか、または、合成により、組み換えにより、または、ＰＣＲ増幅により調製
されるものであってよい。本明細書においては、「核酸プローブ」という用語は
本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指すもの
とする。その同じオリゴヌクレオチドを例えば重合用のプライマーとしてＰＣＲ
法で使用することもできるが、本明細書においては、そのようなオリゴヌクレオ
チドは「プライマー」と称することとする。ここでオリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含んでいてよい。
【０１０１】 本明細書においては、「相補的」または「相補性」とは、ＡはＴと対になり、
ＣはＧと対になるというよく知られた塩基対形成の規則により関連付けられる核
酸（すなわちヌクレオチド配列）に対応して用いられる。例えば、配列５’−Ａ
−Ｇ−Ｔ−３’は配列３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’と相補的である。相補性は「部分
的」であることができ、この場合核酸塩基の一部のみが塩基対形成規則に従って
マッチしている。一方、塩基の全てが塩基対形成規則に従ってマッチしている場
合は、核酸鎖間には「完全な」または「全体的な」相補性があるとする。核酸鎖
間の相補性の程度は当該分野で知られているとおり、核酸鎖間のハイブリダイゼ
ーションの効率と強度に対して大きな影響を有している。このことは、本発明の
場合のように核酸間の結合に依存している検出方法においては特に重要である。
「実質的に相補的」という用語は、後に記載する低いストリンジェンシーの条件
下、または、好ましくは、９５℃に加熱され、その後室温に冷却されるポリメラ
ーゼ反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１９５Ａ）中、標的核酸配列の一方または
両方の鎖にハイブリダイズできる何れかのプローブを指すものとする。本明細書
においては、核酸プローブを標的核酸に対して部分的または全体的に相補的であ
ると称する場合は、このことはプローブの３’−末端領域 （即ち、３’−末端
ヌクレオチド位置の約１０ヌクレオチド内）を指すものとする。
【０１０２】 本明細書においては、「ハイブリダイゼーション」という用語は相補核酸鎖の
対形成に対応して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ションの強度（即ち核酸鎖間の結合性の強度）は、当該分野でよく知られている
多くの要因、例えば核酸間の相補性の程度、塩の濃度のような条件により影響さ
れる関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ（融点
）、他の成分の存在（例えばポリエチレングリコールの有無）、ハイブリダイズ
する鎖のモル度、および、核酸鎖のＧ：Ｃ含有量により影響される。
【０１０３】 本明細書においては、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダ
イゼーションを行なう際の温度条件、イオン濃度、および他の成分の存在に対応
して用いられる。「高いストリンジェンシー」条件では、核酸塩基対形成は高い
頻度の相補塩基配列を有する核酸断片の間にのみ起こる。即ち、「弱い」または
「低い」ストリンジェンシーの条件は、お互いに完全には相補的でない核酸同士
をハイブリダイズまたはアニーリングすることが望まれる場合に、しばしば必要
となる。当該分野でよく知られるとおり、多くの等価な条件を用いて低いストリ
ンジェンシーの条件を得ることができる。
【０１０４】 本明細書においては、「Ｔｍ」という用語は「融点」に対応して用いるものと
する。融点とは二本鎖核酸分子の集団の５０％が解離して一本鎖になる温度であ
る。核酸のＴｍを計算するための式は当該分野でよく知られている。ハイブリッ
ド核酸のＴｍはしばしば、１Ｍ塩中のハイブリダイゼーション試験から採用され
、そしてＰＣＲプライマーのＴｍを計算するために一般的に用いられている式：
［（Ａ＋Ｔの数）ｘ２℃ ＋（Ｇ＋Ｃの数）ｘ４℃］を用いて推定される。Ｃ．
Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ，２ｎｄ Ｅｄ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７），ｐ２４。この式は、２０ヌクレ
オチドより長いプライマーでは不正確であることが解かっている。他のより高度
な計算法が当該分野に存在するが、これは構造と配列の特徴をともに考慮してＴ
ｍを計算している。計算されたＴｍは単なる推定値であり、最適温度は一般的に
は実験的に決定されている。
【０１０５】 「相同性」という用語は本明細書においては、相補性の程度を指す。部分的相
同性または完全な相同性（即ち同一性）があり得る。標的核酸に完全相補配列が
ハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する部分相補配列は「実質的に
相同性の」という機能的用語を用いて指すこととする。
【０１０６】 ｃＤＮＡまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に対応して使用する場
合は、「実質的に相同性の」という用語は、本明細書においては、低いストリン
ジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の１つの鎖にハイブリダイズできるプロー
ブを指すものとする。
【０１０７】 一本鎖核酸配列に対応して用いる場合は、「実質的に相同性の」という用語は
、本明細書においては、低いストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型にハ
イブリダイズできる（即ちこれと相補である）プローブを指すものとする。
【０１０８】 「調査位置」という用語は、本明細書においては、核酸プローブ内の目的の所
定の塩基の位置を指すものとする。例えば、ＳＮＰの分析において、プローブの
「調査位置」は、野生型から変わっていると考えられる標的の単一のヌクレオチ
ドに相補的な位置にある。本発明の方法で得られる分析出力はプローブの調査位
置に相補的な標的核酸の核酸残基に関する情報を与える。調査位置は核酸プロー
ブの実際の３’−末端ヌクレオチドの約１０塩基内にあるが、３’−末端ヌクレ
オチド位置にある必要はない。標的核酸配列の調査位置は、標的とプローブ核酸
がハイブリダイズされる場合、プローブの調査位置の逆側となる。
【０１０９】 「識別子ヌクレオチド」という用語は、本明細書においては、脱重合反応が起
こったことを確認するために本発明の方法においてその存在が検出されるべきヌ
クレオチドを指す。本発明の方法の特定の用途は、どの残基が識別子ヌクレオチ
ドと考えられるかに影響する。分析中、ＮＤＰＫのような酵素を用いて脱重合で
放出されたヌクレオチド全てをＡＴＰに「変換」する、ＡＴＰ検出（例えばルシ
フェラーゼ／ルシフェリンまたはＮＡＤＨ）を用いる方法の場合は、放出された
全てのヌクレオチドが識別子ヌクレオチドである。同様に、ヌクレオチド間を識
別しない吸光度検出を用いる方法では、全ての放出されたヌクレオチドが識別子
ヌクレオチドである。全ての放出されたヌクレオチドが分析される質量スペクト
ル分析による検出の場合は、全ての放出されたヌクレオチドが識別子ヌクレオチ
ドであり得るが、別法として特定のヌクレオチド（例えば固有の質量を有するヌ
クレオチド類縁体）を検出することもできる。蛍光による検出の場合、蛍光標識
されたヌクレオチドが識別子ヌクレオチドである。ヌクレオチドは核酸から放出
される前または後に標識してよい。ラジオグラフィーによる検出の場合は、放射
標識ヌクレオチドが識別子ヌクレオチドである。場合により、識別子ヌクレオチ
ドの放出は本発明の脱重合の後のプローブの残余を分析することにより推定され
る。このような分析は一般的に残余プローブの大きさまたは質量の測定により行
なわれ、上記した分析方法（例えばキャピラリー電気泳動により分子量をモニタ
リングするためのプローブの５’−末端上の蛍光タグ）によることができる。
【０１１０】 本明細書においては、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という
用語はあるクラスの酵素を指し、そのおのおのは二本鎖ＤＮＡを切断する。一部
の制限エンドヌクレアーゼは、例えば二本鎖配列５’ＧＧＡＴＣＣ３’を認識す
るＢａｍＨ Ｉと一般的に称される酵素のように、特定のヌクレオチド配列また
はその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する。しかしながら、このような酵素の他の代
表例は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼＤＮＡｓｅ Ｉのように非特異的な態様でＤ
ＮＡを切断する。
【０１１１】 「試料」という用語は、本明細書においては、その広範な意味において使用す
る。核酸を含有することが予測される試料は細胞、細胞より単離した染色体（例
えば分裂中期の染色体の群）、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を包含する。
【０１１２】 「検出」という用語は、本明細書においては、試料中のヌクレオチドまたは核
酸を定量的または定性的に識別することを指す。 「脱重合」という用語は、本明細書においては、核酸の３’−末端からのヌク
レオチドの除去を指すものとする。
【０１１３】 「対立遺伝子」という用語は、本明細書においては、遺伝子の別の形態を指し
、「遺伝子座」という用語は、本明細書においては、核酸分子上の特定の位置を
指すものとする。 発明の詳細な説明 本発明の方法は核酸試料中の所定の（既知の）内因性核酸標的配列少なくとも
１つの存在または非存在を測定するために用いられる。核酸標的は、その標的と
ハイブリダイズするプローブを設計できるようにその配列が知られていなければ
ならないという点において、「所定の（predetermined）」ものである。しかし
ながら、核酸標的配列は、本発明の方法に関して使用する場合は、存在を測定し
たいと考える異なる核酸の存在のシグナルを与えるレポーターとして機能するの
みでよい。このような目的の他の核酸は所定の配列を有する必要はない。更にま
た、多くの実施態様において、本発明の方法は、プローブの３’−末端領域にお
いて部分的な相補性でその標的にハイブリダイズするプローブを設計するのに十
分であるのみの配列が知られているような標的内の塩基の同一性を調べるのに有
用である。
【０１１４】 このような方法は、核酸標的配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプ
ローブの３’−末端を脱重合して、標的配列の存在または非存在を示す分析出力
としてその存在または非存在が後に測定できるような識別子ヌクレオチド１つ以
上を放出することのできる酵素を利用する。
【０１１５】 核酸標的配列は、核酸プローブがその核酸標的配列に部分的または全体的に相
補的であるように準備される点において、所定（既知）のものである。核酸標的
配列は、その標的配列が試料中に存在する場合に、プローブがハイブリダイズす
る核酸試料中の部分である。
【０１１６】 核酸標的は、それが試験対象となる試料の天然の部分である場合、「内因性」
とされる。例えば、ヒト身体試料の遺伝的特性を確認するためのその分析（例え
ばトリソミーまたはＤｕｃｈｅｎｎｅｓ筋ジストロフィー分析）は内因性核酸標
的を有する。一方、ウィルス性病原物質の存在を調べるためのヒト身体試料の分
析は外因性の標的を有する。しかしながら、微生物学的試料の遺伝的特性を測定
するためのその分析（例えば種形成）は内因性標的を有する。
【０１１７】 方法の第１の工程は、試験すべき試料を核酸プローブ１つ以上と混合すること
である。第１の工程の混合は典型的には低いストリンジェンシーのハイブリダイ
ズ条件下で行ない、これによりハイブリダイゼーション組成物を得る。このよう
なハイブリダイゼーション組成物において、核酸プローブの３’−末端領域は（
ｉ）試料中に存在すると思われる核酸標的配列に部分的または全体的な相補性で
ハイブリダイズし；そして（ｉｉ）３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを含む
。
【０１１８】 好ましくは、核酸プローブは、標的核酸へのプローブの３’−末端領域のハイ
ブリダイゼーションを妨害するようにそれ自体とハイブリダイズしてヘアピン構
造を形成することのないように設計する。プローブの設計の参考となるパラメー
ターは当該分野でよく知られている。
【０１１９】 ハイブリダイゼーション組成物は、核酸プローブにハイブリダイズした所定の
核酸標的配列すくなくとも１つを含有すると思われる処理された試料を形成する
のに十分な時間、ハイブリダイズ条件下に維持される。
【０１２０】 試験すべき試料がプローブのハイブリダイズ相手となる標的配列を含んでいな
い場合は、ハイブリダイゼーションは起こらない。本発明の方法を用いて試験す
べき試料中に特定の標的配列が存在するかしないかを調べる場合は、得られる処
理された試料は本発明の酵素の基質を含有してはならない。その結果、３’−末
端領域の識別子ヌクレオチドは放出されず、分析出力はバックグラウンド値また
はその近傍となる。
【０１２１】 処理された試料を、核酸標的にハイブリダイズするプローブの３’−末端領域
から識別子ヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合
し、脱重合反応混合物を形成する。方法で使用する酵素の選択により、３’−末
端ヌクレオチドのマッチまたはミスマッチがその３’−末端ヌクレオチドの放出
をもたらすかどうかを決定する。特定の酵素反応条件に関わるその他の情報は後
に詳述する。
【０１２２】 脱重合反応混合物は、酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合し、それより
識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間脱重合条件下に維持し、これによ
り処理された反応混合物を形成する。
【０１２３】 放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在をその後測定して分析出力
を得る。分析出力は核酸標的配列少なくとも１つの存在または非存在を示すもの
である。
【０１２４】 本発明の方法はまた、プローブの３’−末端領域への標的のハイブリダイゼー
ションの程度に関わっている。後に記載する実施例は、１ミスマッチが３’−末
端領域の位置からより上流の位置にあるほど、マッチおよびミスマッチの塩基の
間の相違が顕著でなくなることを示している。１ミスマッチが３’−末端ヌクレ
オチド位置から１０〜１２残基にある場合にはマッチとミスマッチとの間の差が
際立って小さくなるのに対し、１ミスマッチが３’−末端にある場合は大きな差
が観察される。従って、標的核酸配列にハイブリダイズした核酸プローブの相補
性の程度（部分的または全体的な相補性）をここで識別子ヌクレオチドに関して
使用する場合、これは３’−末端位置から約１０残基までの３’−末端領域内を
指すものと理解することとする。
【０１２５】 ハイブリダイゼーションのための時間の充足度は、種々のハイブリダイゼーシ
ョン条件および核酸プローブ／標的の組み合わせについて、対照試料について実
験的に確認することができる。例示される維持時間および条件は後に記載する特
定の実施例において示され、そして典型的には低いストリンジェンシーのハイブ
リダイゼーション条件を反映している。実際は、所定のセットのプローブについ
て適当なセットのハイブリダイゼーション条件および維持時間がわかった後は、
これらの条件を用いて試験することにより、核酸標的配列が存在する場合には、
正しい結果が得られる。典型的な維持時間早く５〜約６０分である。
【０１２６】 ＰＣＲにおけるＰＣＲプライマーの鋳型核酸へのハイブリダイゼーションに関
する条件および検討事項は、本発明の方法における標的配列への核酸プローブの
ハイブリダイゼーションに適用できる。このようなハイブリダイゼーション条件
は当該分野でよく知られており、とりわけ核酸プローブおよび標的核酸の配列［
配列の同一性（相同性）、長さおよびＧ＋Ｃ含有量］、存在する核酸のモル量、
緩衝液、塩含有量および二本鎖のＴｍ等を含む要因に応じた日常的な実験の問題
である。
【０１２７】 本発明の方法は感度が高く、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件（例えば温度０〜４℃）で十分であるが、中程度のストリンジェンシーの
条件（即ち４０〜６０℃の温度）でもハイブリダイゼーションが可能であり、許
容できる結果を与える。このことは全ての本発明の方法に同様に当てはまる。
【０１２８】 本発明の１つの意図する実施態様において、ハイブリダイズされた核酸を脱重
合してプローブの３’−末端からヌクレオチドを放出する活性を有する酵素は鋳
型依存性のポリメラーゼである。このような実施態様においては、ポリメラーゼ
反応の逆を用いて核酸プローブを脱重合し、核酸プローブの３’−末端ヌクレオ
チドがその核酸標的配列に全体的な相補性でハイブリダイズする場合に、識別子
ヌクレオチドが放出される。本発明の方法により検出されるべき核酸プローブに
十分相補的である配列を有する核酸標的配列の存在がシグナルにより確認される
。
【０１２９】 核酸プローブを脱重合するためにクレノーまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（
これらの酵素に限定されるわけではない）のようなポリメラーゼの３’→５’エ
キソヌクレアーゼ活性を利用する実施態様においては、識別子ヌクレオチドは、
核酸プローブの３’−末端残基がミスマッチであり、このためその核酸標的配列
に対して核酸プローブの３’−末端が部分的にのみ相補性を有する場合に、放出
される。本実施態様において、バックグラウンド値を最小限にするためには、ハ
イブリッドは典型的には識別子ヌクレオチドを放出する酵素反応よりも前に、未
アニーリングの核酸から精製される。核酸プローブに全体的には相補的でない核
酸標的配列の存在がシグナルにより確認される。
【０１３０】 核酸プローブを脱重合するためにエキソヌクレアーゼＩＩＩの３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を利用する実施態様においては、識別子ヌクレオチドは、核
酸プローブの３’−末端残基がハイブリッドの標的核酸にマッチする場合に、放
出される。放出された識別子ヌクレオチドにおいてプローブに相補的である核酸
標的の存在がシグナルにより確認される。
【０１３１】 即ち、ハイブリダイゼーションおよび脱重合により、プローブ：標的ハイブリ
ッドが３’−末端領域においてマッチまたはミスマッチの何れであるかに応じて
、インジケーターヌクレオチドが放出されるか、または、このようなヌクレオチ
ドが僅かのみ或いは全く放出されないという結果になる。これはまた使用する酵
素の種類および脱重合活性のために酵素が必要とするマッチまたはミスマッチの
末端の種類にも応じて変動する。
【０１３２】 定義された条件下の意図する分析出力の大きさは、放出されたヌクレオチドの
量により異なる。識別子ヌクレオチドが放出される場合は、バックグラウンドよ
り高値の分析出力が与えられる。元の試料中標的配列が存在しないためか、また
は、選択したプローブと脱重合酵素が標的が存在する場合に３’−末端ヌクレオ
チドの放出をもたらさないためかの何れかにより識別子ヌクレオチドが放出され
ない場合、または３’−末端ヌクレオチドのマッチ／ミスマッチの状態が３’−
末端ヌクレオチドオ放出に用いられる酵素に必要とされるものとマッチしなかっ
た場合、分析出力は実質的にバックグラウンド値となる。
【０１３３】 バックグラウンド値を扱う例において、分析出力の正味の相対的な光の値は典
型的には以下の通り計算する。最初にマッチ試料の結果を平均し、次にマッチお
よびミスマッチの試料の正味の光生成を測定し、マッチ反応の正味の光生成をミ
スマッチ反応で観察されたもので割る。正味の光生成は、生成した全体の光から
反応中に存在するプローブと鋳型に由来する推定された光の寄与度を差し引くこ
とにより求めた。鋳型の反応に由来する光生成は鋳型が特異的に寄与するものと
種々の反応成分由来の夾雑ＡＴＰが寄与するものの合計であると考えた。プロー
ブ単独のみの正味の増大分は、プローブの値から平均の「非標的ＤＮＡ」値を差
し引くことにより計算したが、その理由はこれによりプローブの値から夾雑ＡＴ
Ｐの寄与分を差し引くためである。即ち、反応による正味の光生成の測定のため
に使用した式は以下の通りである。 正味の光＝全体の光‐［（標的単独）＋（プローブ単独‐非ＤＮＡ）］ 例えば、２つの対立遺伝子のうち何れが存在しているかを測定する試験の場合
、正味の光の値を用い、第２の対立遺伝子のプローブ由来のシグナルで第１位の
対立遺伝子のプローブ由来のシグナルを割ることにより、シグナル比を測定する
。
【０１３４】 極めて異なる検出比が２セットのプローブから計算されるが、異なる標的の遺
伝子型に由来するシグナル比は容易に識別可能であることがわかっている。更に
また、ミスマッチの対立遺伝子のプローブは低い濃度のクレノーｅｘｏ−を用い
た場合に核酸標的の非存在下では比較的低値の光シグナルを与えた。このような
操作を用いない場合、プローブのみによる光シグナルがプローブを含有する試料
の全体的シグナルに大きく寄与することとなり、感度の高い対立遺伝子の判別が
より困難になる。
【０１３５】 脱重合反応およびこのような反応に使用される酵素を以下に記載する。 脱重合 核酸ポリメラーゼは一般的に核酸鎖の長鎖化を触媒する。反応は各ヌクレオチ
ドが添加される際に放出されるピロホスフェートの切断により駆動される。各ヌ
クレオシド‐５’‐トリホスフェートはリボースまたはデオキシリボース糖の５
位炭素に連結した３個のホスフェート基を有する。ヌクレオチドを成長中の核酸
に添加することにより、ヌクレオシド内ホスホジエステル結合が形成される。こ
の結合はリボースまたはデオキシリボースの３位炭素に対して３’結合を、そし
て、リボースまたはデオキシリボースの５位炭素に対して５’結合を有するとい
う特徴がある。各々のヌクレオチドは新しい３’→５’連結の形成を介して付加
され、これにより核酸鎖は５’から３’の方向に成長する。
【０１３６】 その最も厳密な意味における脱重合は、現在の意味においては、ヌクレオチド
内ホスホジエステル結合がピロホスフェートおよびポリメラーゼ酵素の存在下に
２つの３’−末端塩基の間で破壊され、１ヌクレオチド分短い核酸とヌクレオシ
ドトリホスフェートが形成されるような重合の逆転を意味している。本発明では
より広い定義を意図するものとする。その定義に従って、３’−末端ヌクレオチ
ドを酵素の触媒する反応において核酸から除去するが、形成されたヌクレオチド
はモノホスフェートであることができ、必ずしもピロホスフェートが求められる
わけではない。
【０１３７】 前者の反応は本明細書においてはピロホスホロリシス反応と称し、後者の反応
はエキソヌクレアーゼ反応と称する。これらの２種の脱重合について以下に説明
する。
【０１３８】 本発明で目的とする脱重合反応は核酸プローブの３’−末端領域で起こるその
ような脱重合であるものとする。この脱重合反応により、本明細書に記載する通
り、識別子ヌクレオチドが放出される。 Ａ．ピロホスホロリシス 本発明の一部の実施態様において、方法は、５’オーバーハングを有する二本
鎖ＤＮＡ上における以下の反応に示すとおり、ピロホスフェートまたはその類縁
体の存在下に末端ヌクレオシド内ホスホジエステル結合を酵素的に切断してＸＴ
Ｐを形成することにより３’−末端ヌクレオチドにおいて核酸（ＮＡ）を脱重合
することを包含する。
【０１３９】
【表１】 幾つかのポリメラーゼは重合過程の逆を触媒することが知られている。この逆
反応は「ピロホスホロリシス」といわれている。ＤＮＡポリメラーゼのこのピロ
ホスホロリシス活性はＤｅｕｔｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４：３０１９−２８（１９６９）に記載されている。
ピロホスホロリシスが可能な他の鋳型依存性核酸ポリメラーゼは、例えばＤＮＡ
ポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポ
リメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｎｅ ３重突然変異ポリメラーゼ、Ｔｔｈ
ポリメラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ
、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノー断片、クレノーエキソマイナ
ス（ｅｘｏ−）、ＡＭＶ 逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびＭＭＬＶ逆転
写酵素が挙げられる。しかしながら全てのポリメラーゼがピロホスホロリシス活
性を有していることが解かっているわけではない。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラ
ーゼはピロホスホリル化を触媒しないと報告されている（Ｓｉｐｐｅｌ，Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：３１−４０（１９７３））。
【０１４０】 ピロホスホロリシスの機序はＲＮＡポリメラーゼに関して示唆されている。機
序の理解は本発明の使用には必要ではないが、Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２４：６４５−５０（１９８４）に記載されてい
る通り、攻撃するピロホスフェートからＲＮＡのヌクレオシド内ホスホジエステ
ル結合のホスフェートへのＭｇ2+イオンの部分的移行がピロホスフェートの親核
反応性およびジエステルの親電子性を増大させると考えられている。ヌクレオシ
ド内ホスホジエステル結合はピロホスフェートの添加により酵素的に切断されて
ヌクレオシド５’ホスフェートとなり、新しいホスホジエステル結合がピロホス
フェートとヌクレオシドモノホスフェートとの間に形成される。
【０１４１】 ピロホスホロリシス反応は以下の通りまとめることができる。 反応１：ＮＡn＋ＰＰiＮＡn-1＋ＸＴＰ 式中、ＮＡは核酸、ｎはヌクレオチド塩基の数、ＰＰiはピロホスフェート、そ
してＸＴＰはｄＮＴＰ分子またはＮＴＰ分子の何れかである。次に反応を反復さ
せることにより少なくとも２つのＸＴＰ分子を生成する。ここで反応は同じ核酸
分子に対して、または、複数の異なる核酸分子に対して反復することができるも
のとする。
【０１４２】 ポリメラーゼ活性の逆転（ピロホスホロリシス）の好ましい実施態様において
、好ましい基質は、３’−末端領域の識別子残基を含む、その３’−末端におい
て全体的な相補性で核酸標的配列にハイブリダイズしたＤＮＡプローブである。
この好ましい実施態様の１つの例において、核酸プローブの３’−末端ヌクレオ
チドにおいて１塩基ミスマッチがあるように核酸標的配列に核酸プローブをハイ
ブリダイズする場合、核酸プローブは逆重合反応を介して非効率的に脱重合され
る。すなわち、このような基質は脱重合のための理想的な基質ではない。
【０１４３】 重合反応の逆転を介した脱重合のための基質の非理想性は、核酸プローブの３
’−末端から約１０残基までは１塩基ミスマッチにより認識される。プローブの
３’−末端から１２残基の１塩基ミスマッチでは、脱重合反応は、ミスマッチが
なく核酸プローブが核酸標的配列に全体的に相補的である場合と概ね同様の範囲
まで起こり得る。
【０１４４】 即ち、脱重合反応の反応性は基質の効率に関連する因子である。部分的に相補
的なハイブリッドは重合反応の逆転のためには全体的に相補的なハイブリッドよ
りも効率の低い脱重合基質である。この反応性の差を用いて特定の位置（例えば
長鎖位置）におけるマッチとミスマッチの間の相違を顕著化使用とするものであ
る。基質ハイブリッドが全体的に相補的である場合は、かなり高い分析出力が得
られる。ミスマッチは基質ハイブリッドを脱安定化するために意図的に導入する
ことができる。このような脱安定化は脱安定化塩基位置とは異なる調査位置にお
いて置換された塩基間の分析出力の差を大きくすることができる。
【０１４５】 幾つかの化合物がピロホスホロリシス反応におけるピロホスフェートを代替す
るものとして当該分野で知られている。Ｒｏｚｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２４：６４５−６５０（１９８４）。例示される化合
物およびその放出されたヌクレオチド産物をピロホスホロリシスのヌクレオチド
産物（リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドは「Ｎｕｃ」と記載す
る）と共に以下の表に示す。
【０１４６】
【表２】 分析する各核酸ポリメラーゼのための適当な緩衝液を含む、ピロホスホロリシ
スによる脱重合のための好ましい反応混合物は、実施例において詳細に説明する
。典型的には、これらの条件下、十分なＮＴＰまたはｄＮＴＰが放出され、きわ
めて少量（例えば約５〜１０００ピコグラム）の核酸を正確に検出することがで
きる。分析前にＮＤＰＫ（ＡＤＰ存在下）のような酵素によりＸＴＰからの変換
によりＡＴＰが生成されるか、または、ＡＴＰは分析前に更に増幅されることが
できる。
【０１４７】 ピロホスホロリシスによる重合および脱重合のための好ましい反応条件は同様
であるものの、これらの反応の速度は大きく変動できる。例えば、ＡＭＶおよび
ＲＬＶ逆転写酵素はＳｒｉｖａｓｔａｖａｎ ａｎｄ Ｍｏｄａｋ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２２５（５）：２０００−０４（１９８０）において示された
重合よりも約５０〜１００倍低い速度で最適条件下ピロホスホロリシスを触媒す
る。即ち、ピロホスホロリシス反応の高い効率は予測されなかったものであり、
遥かに多い量のＤＮＡを用いて行なわれる以前のＤＮＡピロホスホロリシス試験
とは対照的に、きわめて低い濃度のＤＮＡ基質に関係すると考えられる。
【０１４８】 理論に制約されるわけではないが、この作用の考えられる説明として、極めて
低いＤＮＡ濃度で生成される遊離のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート
のモル濃度が極めて低いと推定されることが挙げられる。実際、これらの濃度は
酵素のミカエリス定数（Ｋｍ）よりも遥かに低値であると推定される。すなわち
、放出されたｄＮＴＰの再取り込みは極めて少量であると推定される。
【０１４９】 異なる核酸ポリメラーゼのピロホスホロリシス活性もまた変動する。例えば、
Ｔ４ポリメラーゼおよびＴｎｅ ＤＮＡポリメラーゼは、ピロホスホロリシスに
より生成されるＡＴＰをルシフェラーゼ活性により測定した場合に、極めて高い
ピロホスホロリシス活性を有している。Ｔ４ポリメラーゼを用いたピロホスホロ
リシスはＭＭＬＶ−ＲＴと比較して光生成が約１０倍増大しており、Ｔａｑポリ
メラーゼと比較して光生成が４倍増大している。
【０１５０】 親出願に開示される本発明の開発の間、低いピコグラム水準の一部の核酸の検
出は一般的に核酸を断片化または部分的消化することにより促進できるというこ
とがわかった。好ましくは、断片化は核酸の超音波処理または制限酵素消化によ
り行なうことができ、これにより、複数のより小型の核酸断片を得ることができ
る。本発明を実施するために機序を理解することは必要ないが、この工程は恐ら
くは、ピロホスホロリシス反応が核酸エンドから進行するのみであることから、
検出を促進していると思われる。より多くの核酸エンドを与えることにより、一
回でより多くの反応を起こすことができる。
【０１５１】 ＤＮＡ末端は分子内および直鎖状ＤＮＡ断片のエンドに存在することができる
。例えば、ポリメラーゼはＤＮＡセグメントのギャップまたはニックからピロホ
スホロリシスを触媒することができる。ピロホスホロリシス反応に用いる酵素と
基質の種類が断片化が必要であるかどうかを決定する。
【０１５２】 制限酵素消化により生じるＤＮＡ末端の種類もまた種々の核酸ポリメラーゼの
ピロホスホロリシス活性に影響する。例えば、クレノーｅｘｏ−、ＭＭＬＶ−Ｒ
ＴおよびＴａｑポリメラーゼは５’‐オーバーハングを持つ、そして、平滑末端
を持つＤＮＡ断片のピロホスホロリシスは触媒するが、３’‐オーバーハングで
はピロホスホロリシス活性は殆どまたは全くない。一方、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼは３’‐および５’‐エンドのオーバーハングの両方および平滑末端の媒介
するピロホスホロリシスを触媒する。即ち、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは３’−
オーバーハングを有するハイブリッドのピロホスホロリシスには好ましい酵素で
ある。制限酵素処理ＤＮＡのピロホスホロリシスのために他の核酸ポリメラーゼ
を用いる場合は、制限エンドヌクレアーゼにより創製されたエンドの種類にポリ
メラーゼのエンドの特異性をマッチできるように注意しなければならない。この
ような注意は当該分野でよく知られていることである。
【０１５３】 Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
５（１４）：８３２２−２８（１９９０）は、鎖終止法によるＴ７ ＤＮＡポリ
メラーゼ触媒ＤＮＡ配列決定により媒介される望ましくないピロホスホロリシス
を報告している。上記研究者等によれば、最も感受性の高い部位においても、望
ましくないピロホスホロリシスの速度は重合速度よりも少なくとも１００，００
０倍遅い。
【０１５４】 定義によれば、ＤＮＡ配列決定は既知のＤＮＡ配列の検出よりはむしろ、未知
のＤＮＡ配列を確認することを目的としている。鎖終止法によりＤＮＡ配列決定
において、オリゴヌクレオチドプライマーは外因性ｄＮＴＰおよびジデオキシＮ
ＴＰを添加されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ジデオキシＮＴ
Ｐが長鎖化されているプライマーに組み込まれる場合、それ以上の重合は起こり
得ない。その後このようなジデオキシ末端断片はＤＮＡ配列決定ゲル上で分割さ
れる。しかしながら、特定の場合には、望ましくないピロホスホロリシスにより
長鎖化されたプライマーから３’−末端ジデオキシヌクレオチドが放出され、こ
れによリＴ７ ＤＮＡポリメラーゼが更に重合を触媒できるようになる。この余
計な重合はＤＮＡ配列決定ゲル上の特定のジデオキシヌクレオチド末端断片の分
解（損失）をもたらす。言いかえれば、形成されるＤＮＡ配列決定ゲルはＤＮＡ
配列が測定できない「ホール」またはギャップを示すことになる。
【０１５５】 上記したＴａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎによれば、ｄＮＴＰが高
濃度で存在する場合、これらのピロホスホロリシス部位は数千ヌクレオチド中一
箇所のみ存在する。上記研究者等はｄＩＴＰがｄＧＴＰと置き換わっているピロ
ホスホロリシスに特に感受性の高い正式な配列である５’ｄＩｄＡｄＮ1ｄｄＮ2 ３’を発見している。この望ましくないＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ媒介ピロホス
ホロリシス反応はＤＮＡ配列決定反応混合物からＰＰiを排除するピロホスフェ
ートの添加により回避することができる。ピロホスファターゼはＤＮＡ配列決定
ゲル中のギャップを排除し、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ媒介ジデオキシ配列決定
を用いたＤＮＡ配列の正確な測定法を可能にすると報告されている。
【０１５６】 一方本発明は、この逆反応が起こるための条件を最適化することにより、ＤＮ
Ａポリメラーゼ媒介ピロホスホロリシスを利用しようとするものである。本発明
は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を用いて未知の核酸配列を確認するよ
りはむしろ、標的核酸における既知配列の検出を目的としている。
【０１５７】 ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎにより報告されているピロホスホロリ
シスは特定の核酸配列を検出することはできない。実際、ジデオキシ法によるＤ
ＮＡ配列決定は長鎖化プライマーへのジデオキシヌクレオチドの取りこみに依存
している。上記研究者等の報告したＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ媒介ピロホスホロ
リシスは、上記正式な配列を優先しているとされているものの、同様に無作為で
ある。Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎによれば、ピロホスファター
ゼの非存在下では、ＤＮＡ配列決定ゲルにおけるギャップを観察するのみであり
、これらのギャップはこれらのギャップにおけるＤＮＡ配列に関する如何なる情
報も与えない。従って、報告されたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ媒介ピロホスホロ
リシスによる３’ジデオキシヌクレオチドの放出を確認するための方法は開示さ
れていない。
【０１５８】 更に、ピロホスホロリシス反応に使用されるポリメラーゼの種類は最良の結果
を得るためには正しい核酸基質とマッチさせることを意図する。一般的に、ＤＮ
Ａポリメラーゼおよび逆転写酵素はＤＮＡの脱重合に好ましく用いられ、ＲＮＡ
ポリメラーゼはＲＮＡの脱重合に好ましく用いられる。逆転写酵素または逆転写
酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡ‐ＤＮＡハイブリッドの脱重合に
好ましく用いられる。
【０１５９】 本出願において、ポリ（Ａ）ポリメラーゼはピロホスホロリシスを触媒できる
ことが意外にも判明したが、このような反応はこれまで報告されていない。実際
、ポリ（Ａ）ポリメラーゼはピロホスホロリシスを触媒しないことが広く報告さ
れている（例えばＳｉｐｐｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：３１−
４０（１９７３）およびＳａｎｏ ａｎｄ Ｆｅｉｘ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，７１：５７７−８３（１９７６）参照）。本出願に開示した本発明のこ
れらの好ましい実施態様においては、前に報告した緩衝液中に存在する塩化マン
ガンは省略し、塩化ナトリウムの濃度は低下させ、そして、ｐＨ値は約８．０か
ら約７．５に低下させている。更にまた、ポリ（Ａ）ポリメラーゼピロホスホロ
リシス反応緩衝液は約５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2，５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＮａＰＰi（ピロリン酸ナトリウム）
を含む。
【０１６０】 脱重合反応は重合反応の逆であることに注意することが重要である。したがっ
て、漸増する遊離のヌクレオシドトリホスフェートが脱重合により生産されるに
従い、理論的には重合と脱重合の反応が均衡する平衡状態に達する。或いは、少
量の核酸が検出される場合は、反応は平衡に達することなく本質的に完了するこ
とができる（即ち、核酸標的は５０％より多くその構成成分であるサブユニット
ヌクレオチドにまで脱重合される）。この要因が定量的測定において重要である
理由は、放出されたヌクレオチドの総量が検出試験で発生するシグナルの量と比
例しているためである。
【０１６１】 核酸の定量的検出に用いる場合は、ヌクレオチドの閾値が得られる限り、反応
が平衡に達したり、または、本質的に完了に至る必要はない。好ましい実施態様
においては、脱重合により生成したヌクレオシドトリホスフェート分子の混合物
を好ましくは以下に記載する通りＡＴＰに変換する。定量的または定性的な検出
の何れかにおいて、典型的なルシフェラーゼ試験における光検出のためには、試
料１００μＬ中約１ｘ１０-12モルの検出可能な閾値ＡＴＰ濃度を得るのが好ま
しい。
【０１６２】 いくつかの好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドプローブは典型
的には脱重合反応２０μＬ当たり約１００ｎｇ〜約１μｇで使用する。この量は
約２００：１〜約１，０００：１のプローブの標的に対する重量比を与える。
【０１６３】 本発明の好ましい実施態様においては、核酸ポリメラーゼおよびピロホスフェ
ート（ＰＰi）またはその類縁体を、標的核酸約１００μｇ未満〜核酸約１０ｐ
ｇ未満を含有するハイブリダイズされた試料に添加する。典型的な標的核酸は試
験すべき試料中約１〜約５ｎｇ存在し、標的核酸の長さは約３０〜約１０００ｂ
ｐが好ましい。
【０１６４】 次に、ハイブリダイズされた核酸をピロホスホロリシスにより分解（脱重合）
し、遊離のＮＴＰまたはｄＮＴＰを放出する。ピロホスホロリシス反応に有用な
酵素は、例えば、以前に挙げた以下のポリメラーゼ、即ち、ＡＭＶ逆転写酵素、
ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼαおよびβ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ
ｎｅポリメラーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ｔｎｅ３重突然
変異ポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ、クレノー断片、クレノーエキソマイナス、Ｔｔｈポリメラーゼおよびポ
リ（Ａ）ポリメラーゼである。
【０１６５】 最も好ましくは、５’オーバーハングＤＮＡ末端の効率的な利用から、ＤＮＡ
ピロホスホロリシス反応にはクレノーエキソマイナス（クレノーｅｘｏ−）また
はＴｎｅ３重突然変異ポリメラーゼが用いられる。
【０１６６】 ５’オーバーハング基質を利用する酵素を用いる場合は、標的核酸の３’エン
ドは核酸プローブの５’エンドを超えて伸長していることが好ましい。このよう
にすることにより、唯一の５’オーバーハング基質は、標的核酸の５’エンドが
核酸プローブの３’末端領域よりオーバーハングしている個所となる。脱重合を
核酸プローブに限定するための別の方法は、例えば標的核酸の３’−末端におい
てホスホロチオエート結合を形成するなど、試料中の他の核酸の末端の化学修飾
である。
【０１６７】 脱重合酵素は好ましくはハイブリダイズされた標的：プローブを脱重合するの
に十分な量で存在する。この量は、当該分野でよく知られるとおり、使用する酵
素、脱重合温度、緩衝液等により変化する。２０μＬの容量中で行なう典型的な
反応の場合は、クレノーｅｘｏ−のような酵素約０．２５〜約１他に（Ｕ）を用
いる。より高い温度での脱重合では、熱安定性酵素約１〜約５Ｕを用いる。
【０１６８】 好ましいＡＴＰ検出系の部分であるルシフェラーゼはＰＰiにより阻害される
。好ましい実施態様においては、高度に阻害量のＰＰiがＡＴＰ検出反応に移行
することがないよう注意しなければならない。好ましくは、ＡＴＰ検出反応に供
されるＰＰiの量は、約１００μＭより低いルシフェラーゼ検出反応中のＰＰi濃
度をもたらすものとするが、約１０μｍより低濃度が望ましい。従って、ピロホ
スホロリシス反応中に用いるＰＰiの量はルシフェラーゼ検出系で用いるために
取られる分量により決定される。分量は使用する試験系により変動するが、ルシ
フェラーゼ検出反応に移行する、または、供されるＰＰiの量は、ＰＰiの濃度が
少なくとも約１００μＭ未満、好ましくは約１０μＭ未満となるような、上記し
たＰＰi濃度パラメーターに相当するものとする。
【０１６９】 本発明の１つの好ましくは実施態様において、脱重合活性を有する酵素は鋳型
依存性ポリメラーゼである。脱重合反応は重合反応の逆行である。意図する実施
態様において、重合反応はピロホスホロリシスと称される反応中ピロホスフェー
トの存在下で逆行される。
【０１７０】 いくつかの好ましい実施態様において、反応条件は、その標的核酸配列よりも
高濃度の核酸プローブを与えることによりその標的核酸配列とハイブリダイズす
る核酸プローブの脱重合に更に好都合なように調節するのが好ましい。
【０１７１】 プローブ：標的のハイブリッドの脱重合に好都合な１つの戦略は、２重標的核
酸の変性後にハイブリダイゼーション工程において核酸標的より過剰にプローブ
を存在させることである。
【０１７２】 プローブ：標的のハイブリッドの脱重合に好都合な別の戦略は、プローブが相
補的である核酸標的の鎖のみを単離することである。この目的を達成するために
用いることのできる幾つかの技法がある。
【０１７３】 １つの技法においては、標的核酸増幅プライマー配列の５’‐末端において、
例えば、１〜約１０個の５’のほとんどの残基において、ホスホロチオエート結
合を用いる。標的のＰＣＲ増幅により、プライマーのホスホロチオエート結合は
相補鎖の対の一方として増幅された標的核酸に取りこまれる。二本鎖を与える分
子をＴ７ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ６で処理することにより、非ホスホロ
チオエート含有鎖が除去される。この技法は後に記載する実施例において詳細に
説明する。
【０１７４】 別の技法においては、鎖の単離は、標識されていない伸長された核酸鎖（本発
明で有用な核酸プローブはこれにハイブリダイズするように設計される）に取り
こまれたＰＣＲプライマーを用いて標的核酸を増幅することにより達成されるが
、相補鎖に対するプライマーは、例えばビオチンで標識される。次に。増幅され
た核酸を変性し、固相支持体に連結されたストレプトアビジンに添加される。有
用な物質はＳｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（登録商標）
常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｚ５４８Ａ）であり、その際、そのビオチニル化
された相補鎖から所望の標的核酸鎖を分離するために磁石を用いることができる
。 Ｂ．エキソヌクレアーゼ消化 本発明の別の実施態様において、方法は５’‐オーバーハングを有する二本鎖
ＤＮＡに対する以下の反応により説明されるとおり、末端ヌクレオシド内ホスホ
ジエステル結合を酵素的に切断してＸＮＰを形成することにより３’−末端ヌク
レオチドにおいて核酸を脱重合することを包含する。
【０１７５】
【表３】 例えば、このような加水分解反応はＮＴＰの存在下または非存在下、クレノー
またはエキソヌクレアーゼＩＩＩにより触媒される。
【０１７６】 いくつかの実施態様（例えば核酸の定量的試験）においては、検出感度を上げ
るために、脱重合工程は本質的に完了するか平衡となるまで反復して最低３個の
ヌクレオチドの鎖から少なくとも２個のヌクレオチド分子を得る。別の実施態様
（例えばＤＮＡの定性的検出）においては、シグナルを生成するのに十分な核酸
分子が存在すれば脱重合工程を反復する必要はない。
【０１７７】 本発明の別の実施態様においては、以下の反応に従ってエキソヌクレアーゼ消
化により、末端がミスマッチのハイブリダイズされた核酸プローブをまず脱重合
してＮＭＰまたはｄＮＭＰとする。 反応２：ＮＡn＋Ｈ2Ｏ→ＮＡn-1 ＋ ＸＮＰ 式中、ＮＡnは核酸、ＸＮＰはｄＮＭＰまたはＮＭＰであり、そしてｎは核酸中
のヌクレオチドの数である。
【０１７８】 この脱重合反応は５’−オーバーハングおよびミスマッチ塩基を３’−末端に
有する二本鎖ＤＮＡに対する以下の反応においてより詳しく説明される。
【０１７９】
【表４】 例えば、このような脱重合反応はＮＴＰの非存在下、バクテリオファージＴ４
ポリメラーゼにより触媒される。好ましい実施態様においては、放出されたヌク
レオチド、ＸＮＰはヌクレアーゼ消化により生成される。
【０１８０】 ヌクレアーゼ消化は、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ ３１、ヤエナ
リ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびリボ
ヌクレアーゼＨを含む、５’ホスフェートによりヌクレオチドを放出させる種々
のヌクレアーゼにより行なうことができる。ヌクレアーゼ消化条件および緩衝液
は当該分野で知られている。ヌクレアーゼおよびそれを用いるための緩衝液は市
販されている。
【０１８１】 プリンおよびピリミジンモノヌクレオチドの生合成において、ホスホリボシル
−１−ピロホスフェート（ＰＲＰＰ）は必須のリボース−５’−ホスフェート供
与体である。ＰＲＰＰそのものはＡＴＰからリボース−５’−ホスフェートへの
ピロホスフェートの転移を介してＰＲＰＰ合成酵素により触媒される反応におい
て形成される。この反応はＳａｂｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２
３：１１９３−９５（１９８４）に記載されるとおり、可逆であることが解かっ
ている。
【０１８２】 本発明の一部の実施態様において、ヌクレアーゼ消化により生成されたＮＭＰ
またはｄＮＭＰは、以下の反応において酵素ＰＲＰＰ合成酵素によりＮＴＰまた
はｄＮＴＰに直接変換するのが好ましい。 反応３：ＸＮＰ＋ＰＲＰＰ→ＸＴＰ＋リボース−５’−ＰＯ4 式中、ＸＮＰはＡＭＰまたはｄＡＭＰの何れかであり、そして、ＸＴＰはＡＴＰ
またはｄＡＴＰの何れかである。好ましくは、個の反応は試料１００μＬ中約１
ｘ１０-12Ｍの閾値ＡＴＰ濃度を与える。
【０１８３】 本反応において、ＰＲＰＰのピロホスフェート基は酵素的にＸＮＰ分子に転移
され、ＸＴＰ分子を形成する。適する反応条件および緩衝液の例は本明細書の何
れかの個所に記載する。
【０１８４】 本発明の核酸検出系におけるＰＲＰＰ反応の利用は以前に報告されている方法
よりも好都合である。例えば、ＡＭＰまたはｄＡＭＰをＡＴＰまたはｄＡＴＰに
変換するためには１工程のみを必要とし、これにより検出系を簡略化できる。更
にまた、以前に報告されている方法と比較して本発明の方法を用いた場合、外因
性のＡＴＰ、ＡＤＰまたはＡＭＰで検出反応が汚染される可能性が低い。
【０１８５】 脱重合酵素が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す実施態様においては、
基質は３’−ヒドロキシル末端を有する二本鎖または一本鎖の核酸である。本発
明の方法で用いられる３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素にはＥ．
ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ，クレノー断片およびバクテリオファージＴ４
ＤＮＡポリメラーゼが包含される。Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼＩホロ
酵素は、３’−末端におけるハイブリダイゼーションの程度に関わらずプローブ
：標的ハイブリッドを分解する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を回避するこ
とが望ましい観点から、本発明の方法では好ましくない。バクテリオファージλ
エキソヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のみを有しており、こ
のため、これは意図される酵素ではない。同様に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
は極めて低い水準の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有している。エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）は平滑末端を持つ基質または５’−オーバー
ハングまたはニックを３’−ヒロドキシル基とともに有するものに対して３’エ
キソヌクレアーゼ活性を有し、このため、マッチした３’−末端ヌクレオチドを
有するハイブリッドを脱重合するための本発明の方法において有用である。しか
しながら、ＥｘｏＩＩＩは部分的にのみ相補的な３’−末端を有するハイブリッ
ドに限定されず、ニ本鎖末端、即ちマッチした末端ヌクレオチドを必要とする。
【０１８６】 酵素活性が３’→５’エキソヌクレアーゼ活性である本発明の実施態様におい
て、ハイブリダイズされた核酸プローブはその３’−末端ヌクレオチドから脱重
合される。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のポリメラーゼの場合の本発明の
実施態様において、好ましい基質はその３’−末端領域において部分的な相補性
で核酸標的配列にハイブリダイズされた核酸プローブであり、最も好ましくは、
識別子ヌクレオチドである３’−末端残基においてミスマッチを有するものであ
る。
【０１８７】 意図する方法は、複数の所定の内因性核酸配列の１つ以上が試料中に存在する
か存在しないかを調べるために複数のプローブを用いる多重試験環境において特
に有用である。このような多重試験のために特に有用な分野は、通常の分析出力
が目標とする遺伝子標的が存在しないことを示すスクリーニング試験である。
【０１８８】 １つの例示される実施態様において、核酸試料は複数の所定の突然変異遺伝子
の存在についてスクリーニングされる。この実施態様においては、突然変異体は
通常は存在せず、そして、分析出力は例えば、突然変異が存在しない限り、概ね
バックグラウンド値となる。別の実施態様においては、複数の試料について、微
生物特異的な遺伝子の有無を調べる。ここでもまた、健康な個体、動物または恐
らくは滅菌されている食品の集団を試料とする場合、目標とする遺伝子が存在し
ないことは、概ねバックグラウンド値の分析出力を与えるものであり、そして、
バックグラウンド出力より高値が出現するのは稀な場合のみである。
【０１８９】 上記方法の多重実施態様において、試料は、好ましくは必要に応じて複数の核
酸標的の増幅の後、複数の異なる核酸プローブと混合される。本発明のこの実施
態様においては、プローブの１つによる特定の結果の分析出力は、全てのプロー
ブによる逆の結果から得られる分析出力と識別可能である。
【０１９０】 好ましい実施態様において、ＡＤＰ存在下の放出ヌクレオチドのＮＤＰＫ変換
を介して生成したＡＴＰは、ルシフェラーゼ検出系またはＮＡＤＨ検出系により
検出される。更に別の本発明の実施態様において、ピロホスフェート転移工程お
よびホスフェート転移工程は１段階反応において実施される。別の好ましい実施
態様において、より高い感度が必要である場合は、ＡＴＰ分子を増幅することが
できる。
【０１９１】 意図する多重実施態様において、複数の内因性核酸標的配列の存在または非存
在に関する情報は、種々の内因性核酸標的のための複数の核酸プローブと試料を
混合することにより、単一の核酸試料に対して本発明の方法を用いることにより
測定される。
【０１９２】 本発明の第１の多重実施態様において、核酸プローブの少なくとも１つがその
標的核酸配列に部分的相補性でハイブリダイズされる場合に得られる分析出力は
、核酸プローブの全てがそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハイブ
リダイズされる場合の分析出力よりも大きい。好ましくは、このような実施態様
においては、ハイブリダイズされた核酸を脱重合してヌクレオチドを放出する活
性を有する酵素は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズさ
れたプローブの３’−末端にミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイズさ
れた核酸を脱重合する。
【０１９３】 本発明の第２の多重実施態様において、上記核酸プローブの少なくとも１つが
その標的核酸配列に部分的相補性でハイブリダイズされる場合に得られる分析出
力は、核酸プローブの全てがそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハ
イブリダイズされる場合の分析出力よりも小さい。好ましくは、このような実施
態様においては、ハイブリダイズされた核酸を脱重合してヌクレオチドを放出す
る活性を有する酵素は鋳型依存性ポリメラーゼである。
【０１９４】 本発明の第３の多重実施態様において、核酸プローブの少なくとも１つがその
核酸標的配列に全体的相補性でハイブリダイズされる場合に得られる分析出力は
、核酸プローブの全てがそれらの対応する核酸標的配列に部分的相補性でハイブ
リダイズされる場合の分析出力よりも大きい。好ましくは、このような実施態様
においては、ハイブリダイズされた核酸を脱重合してヌクレオチドを放出する活
性を有する酵素は鋳型依存性ポリメラーゼである。
【０１９５】 本発明の第４の多重実施態様において、上記核酸プローブの少なくとも１つが
その標的核酸配列に全体的相補性でハイブリダイズされる場合に得られる分析出
力は、核酸プローブの全てがそれらの対応する核酸標的配列に部分的相補性でハ
イブリダイズされる場合の分析出力よりも小さい。好ましくは、このような実施
態様においては、ハイブリダイズされた核酸を脱重合してヌクレオチドを放出す
る活性を有する酵素は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイ
ズされたプローブの３’−末端にミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイ
ズされた核酸を脱重合する。 分析出力 分析出力は放出された識別子産物、即ち放出されたヌクレオチドまたはプロー
ブの残余の何れかを検出ることにより得られる。例示される検出系は、光発光ル
シフェラーゼ検出系、ＮＡＤＨ光吸収検出系（ＮＡＤＨ検出系）、蛍光発光およ
び質量スペクトル分析を包含する。これらの検出系は後に説明する。
【０１９６】 ヌクレオチドが放出されたという事実（定性的測定）または放出されたヌクレ
オチドの数（定量的測定）は脱重合後のプローブの検査を通して推定することが
できる。オリゴヌクレオチドの大きさの測定は当該分野でよく知られている。例
えばゲル分離およびクロマトグラフィー分離はよく知られている。蛍光および吸
光度スペクトル分析を利用したゲル画像化法並びにラジオグラフィーによる方法
も挙げられる。オリゴヌクレオチドの質量スペクトル分析もまたより一般的とな
っている。 Ａ．ＡＴＰの検出 ルシフェラーゼ検出系はＡＴＰの検出のために特に有用である。ＡＴＰと酸素
の存在下、ルシフェラーゼはルシフェリンの酸化を触媒して光を発生させ、これ
が後にルミノメーターにより定量される。反応の別の産物はＡＭＰ、ピロホスフ
ェートおよびオキシルシフェリンである。
【０１９７】 特に好ましい実施態様において、Ｌ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＦＦ２０２１
）と称されるＡＴＰ検出緩衝液を使用する。一部の実施態様においては、ルシフ
ェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ１５２Ａ）をＬ／
Ｌ試薬の代わりに用いる。好ましくは、約５〜１０ｎｇのルシフェラーゼが反応
に用いられる。本発明は特定のルシフェラーゼ濃度に限定されるわけではないが
、より多い量のルシフェラーゼを用いると非特異的バックグラウンドが増大する
傾向がある。
【０１９８】 一部の実施態様においては、ピロホスホロリシスまたはヌクレアーゼ消化によ
り生成したｄＮＴＰまたはＮＴＰはＸＴＰに変換され、次にこれが直接ルシフェ
ラーゼの基質として使用され、これにより核酸の検出を可能にすることを意図し
ている。しかしながら、ルシフェラーゼの好ましい基質は、Ｍｏｙｅｒ ａｎｄ
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３１：１８７−８９（
１９８３）が明らかにしたとおり、ＡＴＰである。ＤＮＡが初期基質である場合
は、以下に示す一般的反応により、ＮＤＰＫを好都合に用いてｄＮＴＰからＡＴ
Ｐへの変換を触媒する。 反応４：ｄＮＴＰ＊ ＋ ＡＤＰ→ｄＮＤＰ ＋ ＡＴＰ＊ 式中、ｄＮＴＰはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの混合物であり、
ｄＮＤＰは相当するデオキシリオヌクレオシドジホスフェートである。反応４に
おいて、ｄＮＴＰの末端５’−トリホスフェート（Ｐ＊）はＡＤＰに転移され、
ＡＴＰが形成される。
【０１９９】 この反応を触媒する酵素は一般的にはヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（
ＮＤＰＫ）として知られている。ＮＤＰＫは偏在する比較的非特異的な酵素であ
る。ＮＤＰＫを検討する際は、Ｐａｒｋｓ ａｎｄ Ａｇａｒｗａｌ，Ｔｈｅ
Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ｐ．Ｂｏｙｅｒ Ｅｄ．（１９７３）を参
照できる。
【０２００】 ＮＤＰＫによるＮＴＰまたはｄＮＴＰからＡＴＰへの変換は好ましくは、ＮＤ
ＰＫおよび、ピロホスホロリシスまたはヌクレアーゼ消化により生じると予測さ
れるＮＴＰまたはｄＮＴＰの量よりモル過剰量のＡＤＰを添加し、その後ＰＲＰ
Ｐ合成酵素によるピロホスホリル化を行なうことにより行なう。ＡＤＰの利用に
は添加したＡＤＰの量を旨適化することが必要である。ＡＤＰの量が多すぎる場
合、高いバックグラウンド値となる。
【０２０１】 幾つかの生物学的入手元から由来するＮＤＰＫ（ＥＣ２．７．４．６）製剤は
幾つかの供給元から販売されている。例えば、酵母ＮＤＰＫはＳｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手でき、ウシＮＤＰＫは
ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡか
ら入手できる。本明細書に記載するほとんどの使用のために選択される特定のＮ
ＤＰＫは典型的には任意に選択される。
【０２０２】 本発明の更に別の実施態様は、１縦列反復（ＳＴＲ）検出に用いられる場合の
ように、核酸試料中の核酸標的配列中に存在する既知の反復配列の数を測定する
ための方法を意図している。反復される既知の配列の数を測定するための方法は
、以下の工程を包含する。複数の個別に処理された試料を準備する。各試料は、
核酸プローブにハイブリダイズされた複数の既知反復配列および非反復領域を含
む核酸標的配列を含んでいる。各核酸プローブは標的核酸の対立遺伝子の異なる
数の相補的な既知反復配列、３’−末端領域の識別子ヌクレオチド、および、標
的の非反復領域に相補的な５’−末端ロッカー配列を含んでいる。処理された反
応混合物は、各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブの３’
−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合
することにより形成される。処理された反応混合物は酵素がハイブリダイズされ
た核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間維持
される。放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在について試料を分析
し、分析出力を得る。そのプローブが標的核酸に存在する数と同じ数の配列反復
を含むような試料の分析出力は、核酸標的中に存在する配列反復の数を示し、こ
れを測定するものである。
【０２０３】 本発明の１つの特徴において、標的核酸は２つの対立遺伝子において反復配列
の数に関して、同型接合である。本発明の別の方法において、標的核酸は反復配
列に対して異型接合である。本発明の別の方法においては、識別子ヌクレオチド
は反復配列を含む領域の部分であるヌクレオチドである。本発明の別の方法にお
いて、プローブ配列の識別子ヌクレオチドは反復配列に対して５’側の標的核酸
中に位置するものに相補的な非反復配列を含む領域の部分である。この後者の特
徴の方法においては、識別子ヌクレオチドは、反復配列の３’側のプローブ中に
位置する標的核酸の非反復配列に相補的な１〜約２０核酸を含む配列中に存在す
る。核酸標的配列中に存在する反復される既知配列は典型的には反復当たり２〜
約２４塩基の長さを有する。ジ−およびトリ−ヌクレオチドの反復は当該分野で
よく知られている。
【０２０４】 Ｐｆｕ ＮＤＰＫのような意図する熱安定性ＮＤＰＫは本発明のいわゆる１工
程または１段階反応において好都合に用いられる。ここでは、３’−末端領域の
識別子ヌクレオチドを含む核酸プローブにハイブリダイズした所定の核酸標的配
列を含むと考えられる処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブ、
アデノシン５’ジホスフェート（ＡＤＰ）、ピロホスフェートおよびＮＤＰＫか
らヌクレオシドトリホスフェートとして識別子ヌクレオチドを放出するピロホス
フェート存在下の活性を有する酵素の脱重合量と混合し、処理された反応混合物
を形成する。このようにして形成された処理された反応混合物を、酵素がプロー
ブを脱重合し、（反応４に示すとおり）ＮＤＰＫが存在するＸＴＰをＡＴＰに変
換できるのに十分な時間、維持する。形成したＡＴＰの量を分析出力の生成によ
り測定するが、その出力は標的核酸配列の存在または非存在を示すものである。
【０２０５】 これらの反応にはコウボ、ウシまたは他のＮＤＰＫを用いることができるが、
Ｐｆｕ ＮＤＰＫのような熱安定性のＮＤＰＫを、熱安定性脱重合酵素、例えば
Ｔｎｅ ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼ（後に記載）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｖ
ｕ ＤＮＡポリメラーゼと共に、約５０℃〜約９０℃の反応温度で用いるのが好
ましい。これらの熱安定性酵素を上記温度で使用することで、方法の感度が高く
なる。
【０２０６】 Ｔｎｅ ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼはＷＯ９６／４１０１４に詳述され
ており、その開示内容は参照により本出願に組み込まれ、そしてその６１０残基
のアミノ酸配列はその記載中に配列番号３５として提示されている。この酵素は
Ｔｎｅ Ｍ２８４（Ｄ３２３Ａ，Ｄ３８９Ａ）としてＷＯ９６／４１０１４に記
載されている。
【０２０７】 簡単に言えば、この酵素は好熱性ユーバクテリウムＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎ
ｅａｐｏｌｉｔａｎａ（ＡＴＣＣ ４９０４９）によりコードされるポリメラー
ゼの３重突然変異体である。天然の配列のアミノ末端の２８３残基は欠失してお
り、天然の配列の３２３および３８９位のアスパラギン酸残基はこの組み換え酵
素ではアラニン残基に置き換えられている。即ちこの組み換え酵素は天然の酵素
の欠失および置き換えによる突然変異体である。
【０２０８】 アミノ末端の配列の欠失により天然の酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性がな
くなり、２個のアスパラギン酸残基の置き換えにより、その存在がエキソヌクレ
アーゼ活性を促進するマグネシウム結合部位がなくなっており、そしてこの３重
突然変異体はまた組み換え天然酵素と比較して３’エキソヌクレアーゼ活性を示
さない。この３重突然変異酵素は９７．５℃での半減期は６６分であるのに対し
、全長の組み換え酵素はその温度で半減期は僅か５分である。
【０２０９】 ＮＤＰＫの関与する反応は約０．０１〜０．５０μＭのＡＤＰ、好ましくは、
約０．０５μＭのＡＤＰを含有する。種々の有用な緩衝液および他の反応成分は
他の個所に記載する。ＮＤＰＫそのものはＡＤＰからＡＴＰへの所望の変換を触
媒するのに十分な量で存在する。２０μＬの脱重合反応から開始する典型的な試
験では、約０．１ＵのＮＤＰＫを使用する。
【０２１０】 より大量の反応体を使用する場合で、標的およびプローブの濃度がほぼ比例し
て高い場合、ＮＤＰＫまたは記載した他の酵素の量は、２０μＬの反応で用いる
量に対して同様の高い比率で使用することができる。実際、２０μＬの反応は約
２倍縮小したり、約２０のファクターで拡大することができる。 Ｂ．ＮＡＤＨ検出 ＮＡＤＨ検出系において、２種の酵素、ホスホグリセレートキナーゼおよびグ
リセルアルデヒドホスフェートデヒドロケナーゼの組み合わせを用いてＡＴＰの
存在下ＮＡＤＨからのＮＡＤの形成を触媒する。ＮＡＤＨは蛍光を有し、ＮＡＤ
は有していないため、ＡＴＰは蛍光強度の損失として測定される。ＮＡＤＨに基
づくＡＴＰの測定の例は米国特許４，７３５，８９７、４，５９５，６５５、４
，４４６，２３１および４，７４３，５６１、および英国特許出願２，０５５，
２００に開示されており、これら全ては参照により本明細書に組み込まれる。 Ｃ．質量スペクトル分析 本発明の１つの方法において、放出されたヌクレオチドの存在は質量スペクト
ル測定により分析する。質量スペクトル測定を用いる本発明法の１つの実施態様
において、処理された反応混合物は、放出された識別子ヌクレオチドの分子量範
囲における処理された反応混合物の全ての成分が測定されるような方法でイオン
化される。分子量のきわめて小さい差も質量スペクトルによる方法を用いれば検
出できる（同じ原子の異なる同位体を検出できる）ため、識別子ヌクレオチド中
の１原子置換（例えば水素原子の代わりにフッ素、または、重水素原子による水
素原子の置き換え）を含む天然核酸からの如何なる変異も、検出可能な差を与え
る。本発明の方法で用いる核酸類縁体は核酸プローブのハイブリダイゼーション
およびハイブリダイズされたプローブの脱重合の何れも妨害してはならない。
【０２１１】 更にまた、質量スペクトル測定はここのヌクレオチドまたはヌクレオシドの間
を識別できる。例えば、本発明で用いる３’−識別子ヌクレオチドがＧヌクレオ
チドであった場合、質量スペクトル測定を用いて、本発明の方法においてそのＧ
ヌクレオチドの放出を検出することができる。同様に、質量スペクトル分析は、
Ａ，ＴまたはＣヌクレオチドの放出を、これらの化合物の原子量の差に基づいて
検出することができる。即ち、本発明の多重実施態様において、質量スペクトル
測定を用いてこれらの３’−識別子ヌクレオチド１つ以上の存在を解析すること
ができる。
【０２１２】 本実施態様の特に有用な特徴において、ＤＩＯＳ（ケイ素上脱着／イオン化）
と称される質量スペクトル法が最近Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９
９：２４３（１９９９）において報告されており、これは特殊な多孔質のケイ素
試料ウェルを使用した市販の質量スペクトル分析器を用いてピコグラムまたはア
タグラムの量で単一または複数の試験を正確に行うことができる。それ以前のよ
く知られたＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析法もまた利用することができる。
【０２１３】 質量スペクトル測定を用いる多重方法の１つの実施態様において、複数の異な
る識別子ヌクレオチドを種々の核酸プローブにおいて用いることができる。この
ような技法を用いることにより、異なる識別子ヌクレオチドの存在は核酸標的配
列の存在の直接の証拠となる。 Ｄ．蛍光スペクトル分析 種々の蛍光検出法をここでは用いることができる。意図される方法の一例では
、識別子ヌクレオチドは蛍光標識を含む。識別子ヌクレオチドは識別子ヌクレオ
チドの放出の前または後に蛍光標識されることができる。ヌクレオチドが蛍光標
識される１つの実施態様において、分析出力は蛍光スペクトル測定により得られ
る。ヌクレオチドを蛍光標識する別の実施態様においては、分析出力は質量スペ
クトル測定により得られる。
【０２１４】 本発明の好ましい実施態様において、蛍光標識はヌクレオチドの蛍光類縁体の
部分である。蛍光ヌクレオチド類縁体は広範に知られており、幾つかの入手元よ
り購入できる。入手元の例は、ＮＥＮ（商標名）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）であり、ここか
らはフルオレセイン、クマリン、テトラメチルローダミン、ナフトフルオレセイ
ン、ピレン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）およびＬｉｓｓａｍｉｎｅ（商標
名）で標識されたジデオキシ、デオキシおよびリボヌクレオチド類縁体が得られ
る。他の入手元はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）
およびＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｉｎｃ．（Ａｍｈｅｒｓｔ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）である。
【０２１５】 蛍光標識および蛍光スペクトル分析を用いることの好都合な点は、複数の異な
る標識が存在する点である。このような異なる標識は本発明の多重実施態様にお
いて特に有用である。放出された識別子ヌクレオチドとして特定の蛍光標識ヌク
レオチド類縁体を検出することにより核酸標的が存在するかを推定できるように
、異なる蛍光標識を異なるプローブにおいて使用する。
【０２１６】 例えば、フルオレセインは４８８ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長
を有するが、ローダミン（テトラメチルローダミンの形態）は５５０ｎｍの励起
波長および５７５ｎｍの発光波長を有する。蛍光検出器は励起光源と発光検出器
を与える。５２０ｎｍと５７５ｎｍの発光波長は蛍光スペクトル測定により容易
に識別できる。
【０２１７】 １分子単位では、蛍光スペクトル測定は吸光度スペクトル測定より約１０倍感
度が高い。単一のチューブ、フローセルおよびマルチウェルプレート用など、蛍
光値を読み取るための極めて多くの種類の蛍光スペクトル測定による検出器が市
販されている。例えば、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ型のマイク
ロプレートリーダーは広範に入手でき、スペクトル範囲４００〜７５０ｎｍ、フ
ィルターは３４０，４０５，４１４，４５０，４９２，５４０，６２０および６
９０ｎｍを用いることができる（例えばＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，
Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｉｎａ）。
【０２１８】 放出された識別子ヌクレオチドは市販の試薬を用いて当該分野でよく知られた
交差結合化学を用いて脱重合の前または後に標識することができることが意図さ
れる。例えばフルオレセインイソチオシアネートおよびローダミンＢイソチオシ
アネートは共にＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から入手できる。生物学的分子を標識する際
のフルオレセインイソチオシアネートの使用についての文献はＮａｔｕｒｅ，１
９３：１６７（１９６２），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６：２８（１
９７２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：２２７（１９７４），Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．，７２：４５９（１９７５）を含む
。
【０２１９】 本発明の多くの実施態様について、放出された蛍光識別子ヌクレオチドをプロ
ーブのようなオリゴヌクレオチドに結合したものと分離することが有用であるこ
とが意図される。即ち、このような実施態様では当該分野でよく知られ上記した
分離技法、例えば蛍光検出器付きＨＰＬＣ等が有用である。他のスペクトル測定
法と比較して蛍光の感度が高いことにより本発明の検出または定量の方法の感度
を高めることができる。 Ｅ．吸光度スペクトル分析 吸光度スペクトル分析工程は分析出力を得るものとして意図されており、これ
により放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在を測定でき、そして、
上記核酸標的配列の存在または非存在を示すことができる。本実施態様は、ハイ
ブリダイズされた核酸の３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を
有する酵素の脱重合量で処理されている反応混合物のクロマトグラフィー的分離
を意図している。
【０２２０】 例示される実施態様において、試料中の幾つかの異なる核酸標的配列の存在を
調べる多重試験を吸光度スペクトル測定により行う。種々の核酸標的配列に対す
る幾つかの標識されたプローブを核酸試料に添加する。プローブ上の標識は各プ
ローブごとに異なる種々のヌクレオチド類縁体であることができる。クレノーｅ
ｘｏ−のような脱重合酵素を添加し、３’−末端ヌクレオチドがマッチする場合
に標的配列にハイブリダイズされたプローブの３’−末端から標識されたヌクレ
オチドおよび他のヌクレオチドを遊離させる。
【０２２１】 反応溶液は予め平衡させておいた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カ
ラムに付し、天然のヌクレオチドからヌクレオチド類縁体を分離する条件下に溶
離する。ヌクレオチド、塩基およびヌクレオシドのクロマトグラフィー分離に有
用な媒体は逆相Ｃ１８カラムまたはＯＤＳ−８０ＴMまたはＯＤＳ−１２０Ｔ
ＴＳＫ−ＧＥＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｐｅ
ｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、アニオン交換媒体、例えばＤＥＡＥ−２５ＳＷまたは
ＳＰ−２５Ｗ ＴＳＫ−ＧＥＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉ
ｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、またはアフィニティー媒体、例えばＢｏ
ｒｏｎａｔｅ−５ＰＷ ＴＳＫ−ＧＥＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅ
ｒｙｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。実施例２０はＨＰＬＣを
用いた本発明の実施態様を説明するものである。
【０２２２】 ＨＰＬＣカラムには吸光度検出器を取りつけてカラムの溶出物をモニタリング
する。したがって、この種の分析用の「吸光度スペクトル測定」となる。ヌクレ
オチドのＨＰＬＣ検出をモニタリングするための典型的な波長は２５０ｎｍ，２
６０ｎｍおよび２８０ｎｍである。このようなヌクレオシドおよびヌクレオチド
の類縁体の分離は当該分野でよく知られている。Ｒｅｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３１７：２８３−３００（１９８４）、お
よび、Ｐｅｒｒｏｎｅ ＆ Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，
３１７：３０１−３１０（１９８４）はｄＮＴＰのＨＰＬＣ分離の例を示してい
る。
【０２２３】 分離されたヌクレオチド類縁体の識別は同じ条件下、同じＨＰＬＣカラム上で
分離されたヌクレオチド類縁体の標品の保持時間（種々の時間における溶出物の
吸光度によりモニタリングした場合）を比較することにより行なうことができる
。あるいは、異なる画分中に採取されたヌクレオチド類縁体の同一性（カラム溶
出液の吸光度を連続的にモニタリングして測定した場合）は核磁気共鳴または元
素分析（Ｈ，Ｃ，Ｎ）のような他の標準的な分析方法により測定できる。
【０２２４】 クレノーｅｘｏ−により脱重合する本例においては、特定のプローブから放出
された識別子ヌクレオチドの存在はそのプローブとハイブリダイズする標的配列
の存在を示している。
【０２２５】 別の実施態様において、脱重合反応混合物から放出されたヌクレオチドはカラ
ム溶出液のモニタリングのための吸光度検出器の取りつけられたガスクロマトグ
ラフィーにより分離される。 カップリングされた反応 一部の実施態様においては、特定の上記反応は１段階反応として行なうことが
できる。「１段階反応（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは触媒
活性を有する酵素少なくとも２種（即ちＥ１およびＥ２）が同じ反応混合物中に
存在し、基質１種以上（即ちＳ１およびＳ２）に対して作用する反応である。一
部の実施態様において、酵素により触媒される反応は同時に起こり、即ち、Ｅ１
がＳ１に対して作用し、そしてＥ２がＳ２に対して作用する。或いは、Ｅ１およ
びＥ２により触媒される反応は段階的またはカップリングされた態様（例えばＥ
１がＳ１に作用して中間体Ｓ２iを生じ、そして次にＥ２がＳ２iに作用する）で
起こり得る。当然ながら、更に別の実施態様においては、このようなカップリン
グされた反応がやはり本質的に同時に起こり得る。
【０２２６】 １段階反応において本発明の酵素の組み合わせまたは混合物を用いることがで
きるという能力は、本発明を用いて達成される核酸検出の極めて低い濃度に鑑み
た場合、予測できなかったことである。この低濃度の検出は一部の酵素を最適条
件未満で使用した場合でも可能である。前述した通り、ルシフェラーゼの阻害を
最小限にするためにピロホスホロリシス反応において用いるＰＰｉの濃度を最適
化することが必要であることが解かった。従って、ＮＭＰ−、ｄＮＭＰ−、ＮＴ
Ｐ−、ｄＮＴＰ−およびＡＴＰ−生産反応の一部を反応生成物の精製を行なうこ
となくルシフェラーゼ検出のためのＬ／Ｌ試薬に直接添加することができる。ル
シフェラーゼ反応は反応の成分により悪影響を受けたり、その他クエンチングさ
れることはない。この望ましい特徴により、時間と手間を最小限に押さえつつ自
動化と高いスループットの分析が可能となり、そして、全体的な検出スキームの
設計において多大な柔軟性が得られるのである。しかしながら、本発明は如何な
る特定の反応条件、試薬または実施態様にも制限されることを意図しない。
【０２２７】 一部の好ましい実施態様においては、ｄＮＴＰを生成するピロホスホロリシス
反応およびＮＴＰまたはｄＮＴＰをＡＴＰに変換するＮＤＰＫ触媒反応は上記実
施態様においては核酸ポリメラーゼ緩衝液中の１段階反応において行なわれる。
ＮＤＰＫ活性はポリメラーゼ緩衝液の条件がＮＤＰＫ活性のためには最適未満で
あった場合でも、ｄＮＴＰからＡＴＰへの変換に十分である。
【０２２８】 ポリメラーゼ酵素およびＮＤＰＫは共に反応において初期より存在することが
できるか、またはＮＤＰＫはＮＴＰまたはｄＮＴＰの生成のために十分なインキ
ュベーション時間の後に反応に直接添加することができる。或いは、核酸ポリメ
ラーゼおよびＮＤＰＫを上記した反応に用いるための同じ容器または混合物中に
準備することもできる。混合物は好ましくは、核酸、ピロホスフェートおよびＡ
ＤＰの存在下にＡＴＰの生成を触媒するのに十分な濃度で核酸ポリメラーゼおよ
びＮＤＰＫを含有する。
【０２２９】 好ましくはポリメラーゼは約０．１〜１００Ｕ／反応（ここでＵとは単位を意
味する）の濃度、最も好ましくは約０．５Ｕ／反応の濃度で準備する．好ましく
は、ＮＤＰＫは０．１〜１００Ｕ／反応、最も好ましくは約０．１Ｕ／反応の濃
度で準備する。更に好ましい実施態様においては、混合物は実質的に夾雑ＡＴＰ
を含有しない。
【０２３０】 同様に、ＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫ反応はＰＲＰＰ合成酵素緩衝液中１
段階反応で行うことができる。ここでもまた、これらの実施態様において、ＮＤ
ＰＫ活性はＮＤＰＫ活性に対する条件が最適未満であっても十分である。
【０２３１】 遊離のＮＭＰおよびｄＮＭＰを含有するヌクレアーゼ消化試料は、ＰＲＰＰ合
成酵素およびＮＤＰＫを予め含有している反応混合物に添加するか、または、Ｐ
ＲＰＰ合成酵素反応に添加した後に、ＮＤＰＫ含有反応混合物に添加してもよい
。一例として、特定の好ましい緩衝液および反応成分を実施例に記載する。しか
しながら、本発明は特定の緩衝液または反応成分には限定されないことを意図し
ている。
【０２３２】 ＰＲＰＰ合成酵素およびＮＤＰＫは上記した反応において用いる同じ容器また
は混合物中に準備することができる。混合物は好ましくはＰＲＰＰおよびＡＤＰ
の存在下のＡＴＰの生成を触媒するのに十分な濃度でＰＲＰＰ合成酵素およびＮ
ＤＰＫを含有する。好ましくは、ＮＤＰＫは０．１〜１００Ｕ／反応、最も好ま
しくは約０．１Ｕ／反応の濃度で準備する。好ましくは、ＰＲＰＰ合成酵素は０
．００１〜１０Ｕ／反応、最も好ましくは約０．０１Ｕ／反応の濃度で準備する
。増幅が望まれる場合は、ＰＲＰＰ合成酵素反応を熱不活性化することが好まし
く、そのようにしない場合ＰＲＰＰ合成酵素が添加されたＡＭＰをＡＴＰに変換
する。
【０２３３】 ピロホスホロリシス反応および増幅反応もまた１段階反応で行なうことができ
る。この１段階反応においては、ポリ（Ａ）ポリメラーゼまたは何らかの適当な
鋳型依存性のポリメラーゼ、例えばＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、Ｄ
ＮＡポリメラーゼαまたはβ、Ｔａｑ ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔ
ｎｅポリメラーゼ、Ｔｎｅ３重突然変異ポリメラーゼ、Ｔｖｕポリメラーゼ、Ａ
ｔｈポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、クレノー断片、クレノーエキソマイナス、または、ポリ（Ａ）ポリメラ
ーゼを用いることができる。
【０２３４】 一部の実施態様においては、ＡＭＰをＡＤＰに変換するための第１の酵素がミ
オキナーゼ（例えばアデニレートキナーゼ）またはＮＭＰＫであり、そして別の
実施態様においては、ＡＤＰをＡＴＰに変換するための第２の酵素がピルベート
キナーゼまたはＮＤＰＫであることができる。更にまた、好ましい実施態様にお
いては、反応は供給されたＡＭＰで行う。特に好ましい実施態様においては、ア
ピラーゼ処理ＡＭＰを用いて夾雑ＡＤＰおよびＡＴＰによるバックグラウンドを
低減する。好ましくは、１Ｕ／μＬアピラーゼ１μＬを１０ｍＭ ＡＭＰ１９μ
Ｌに添加し、その後、室温で３０分間インキュベートし、更に７０℃で１０分間
インキュベートすることによりアピラーゼを熱不活性化する。
【０２３５】 高エネルギーホスフェート供与体もまた反応に添加する。好ましい実施態様に
おいては、ピルベートキナーゼを用いる場合は、ＰＥＰを添加する。他の好まし
い実施態様においては、ＮＤＰＫを利用する場合は、ｄＣＴＰを添加する。好ま
しくは、高エネルギーホスフェート供与体は必須ではないがポリメラーゼを予備
インキュベートした約１５分後に添加する。これらの反応は以下の特徴を有する
。 反応５：
【０２３６】
【表５】 式中ＮＡは核酸、ＸＴＰはヌクレオシドトリホスフェート（デオキシヌクレオシ
ドまたはリボヌクレオシドのトリホスフェートの何れか）であり、ＸＤＰはヌク
レオシドジホスフェート（デオキシヌクレオシドまたはリオヌクレオシドのジホ
スフェートの何れか）であり、そしてＤ−Ｐは高エネルギーホスフェート供与体
である。この反応により、ｄＮＴＰからルシフェラーゼの好ましい基質であるＡ
ＴＰが生成することになる。
【０２３７】 増幅反応は反応５に記載したとおり進行し、試料１００μＬ中約１ｘ１０-12
モルの閾値ＡＴＰ濃度が得られる。好ましくは、ポリメラーゼは約０．１〜１０
０Ｕ／反応、最も好ましくは約０．５Ｕ／反応の濃度で準備する。好ましくは、
ＮＤＰＫは０．１〜１００Ｕ／反応、最も好ましくは約０．１Ｕ／反応の濃度で
準備する。好ましくは、混合物には夾雑ＡＴＰは実質的に存在しない。 プローブ媒介特異的核酸検出 脱重合反応を用いて核酸中の特定の塩基の同一性を調べることができる。例え
ば、核酸中の１塩基点突然変異、欠失または挿入の同一性は以下のとおり測定す
ることができる。
【０２３８】 １つの実施態様においては、点突然変異を含む、または含むことが疑われる標
的核酸に実質的に相補的な核酸プローブを合成する。ハイブリダイゼーションが
起こる際のストリンジェンシーを変えるために種々のハイブリダイゼーション条
件を用いることができる。すなわち、使用する系に応じて、プローブの相補性を
変化させることができる。プローブの長さ、ＧＣ含量、および、ハイブリダイゼ
ーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブは標的核酸と１０個まで
、好ましくは５個未満の塩基のミスマッチを有することができる。最も好ましく
は、プローブは標的核酸と１個のみの塩基のミスマッチを有するか、または、標
的核酸に対して完全に相補的である。
【０２３９】 核酸プローブは一本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有する。プロー
ブは様々な長さのものであることができ、好ましくは約１０〜１００塩基、最も
好ましくは約１０〜３０塩基であることができる。特に好ましい実施態様におい
ては、プローブは核酸プローブの調査位置と３’エンドの間の全ての塩基におい
て標的と相補的である。
【０２４０】 好ましい実施態様において、プローブは調査位置に所定のヌクレオチドを有す
るように設計される。相補的なプローブの塩基が標的核酸に対形成するか、ハイ
ブリダイズする場合、調査位置の塩基は、塩基対形成が起こるような条件下にそ
の同一性を調べる核酸標的における塩基と並置する。調査位置はプローブ内で変
化することができることを意図している。例えば、一部の好ましい実施態様にお
いては、調査位置は好ましくは核酸プローブの３’エンドの１０塩基内にある。
更に別の好ましい実施態様においては、調査位置は核酸プローブの３’エンドの
６塩基内にある。特に好ましい実施態様においては、調査位置は、核酸プローブ
の３’−末端の最後から２番目、または、最後の塩基にある。
【０２４１】 いくつかの好ましい実施態様においては、各々が調査位置において異なるヌク
レオチドを有するような、同じ長さの４種の異なるプローブを合成する。従って
、一部の実施態様においては、１セットのＤＮＡプローブには、調査位置にデオ
キシアデノシン残基を有する第１のプローブ、調査位置にデオキシチミジン残基
を有する第２のプローブ、調査位置にデオキシグアノシン残基を有する第３のプ
ローブ、および、調査位置にデオキシシトシン残基を有する第４のプローブが含
まれることを意図する。同様に、１セットのＲＮＡプローブには、調査位置にア
デノシン残基を有する第１のプローブ、調査位置にウリジン残基を有する第２の
プローブ、調査位置にグアノシン残基を有する第３のプローブ、および、調査位
置にシトシン残基を有する第４のプローブが含まれることも意図する。
【０２４２】 いくつかの実施態様の次の工程では、プローブを別々の反応において標的核酸
にハイブリダイズすることにより、プローブ核酸−標的核酸複合体を形成する。
ハイブリダイゼーション条件はプローブの長さおよび塩基組成に応じて変化する
ことができる。プローブ−標的核酸複合体において、調査位置のヌクレオチドは
核酸中の識別されるべき特定の塩基と並置される。１セットのプローブを用いる
実施態様においては、異なる反応を各々のプローブを用いて実施する。多重実施
態様においては、そのセットのプローブを同時に用いることができる。プローブ
は調査位置において相違があるため、プローブのうち１つのみが、調査位置に並
置される標的核酸の特定の塩基に対して相補的である。
【０２４３】 一部の実施態様の次の工程においては、核酸プローブ−標的核酸複合体は、プ
ローブの脱重合が可能な条件下、個別に反応させる。脱重合のための好ましい反
応条件は上記および後の実施例に記載する通りである。その後ヌクレオチドを検
出する。好ましい実施態様においては、反応４および後の実施例に記載するよう
に、反応混合物はＸＴＰからＡＴＰへの変換を触媒するために必要な試薬も含有
する。一部の好ましい実施態様においては、脱重合反応により生成したヌクレオ
チドおよび／またはＡＴＰをその後ルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系の何れ
かで検出する。核酸標的中の相当する塩基に対する核酸プローブの調査位置にお
ける塩基の相補性は脱重合後にＡＴＰから生じたシグナルの検出により調べる。
【０２４４】 特に好ましい実施態様においては、特定の塩基の同一性は各反応において生成
したＡＴＰの量を比較することにより調べる。プローブの脱重合はその３’−末
端から進行する。調査位置における塩基が核酸の特定の塩基に相補的でない場合
、生成するＡＴＰは極めて少ないか、全くなく、このためシグナルは発生しない
。別の実施態様においては、この方法は１〜４個のプローブを用いて実施するこ
とができる。正のシグナルが発生する（例えば試験した第１のプローブを用いた
場合）場合には複数のプローブ（例えば各々が調査位置に異なる塩基を有するも
の）を利用することが必要でありえることも意図している。
【０２４５】 更に別の好ましい実施態様においては、本発明のプローブ媒介特異的核酸検出
法を用いて目的の核酸を単純に識別または検出することができる。この方法のた
めには、ＲＮＡまたはＤＮＡであることができる標的核酸に実質的に相補的な核
酸プローブ（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いる。特に好ましい実施態様にお
いては、核酸プローブは標的核酸に対して完全に相補的である。核酸プローブは
一本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含有する。プローブは様々な長さを
有することができ、好ましくは約１０〜約１０００塩基、最も好ましくは約１０
〜約１００塩基の長さを有する。検出は前述した通り行なうことができる。核酸
プローブ−核酸標的複合体はＸＴＰの生成をもたらすようなプローブの脱重合を
可能にする条件に曝露する。目的の核酸の検出は生成されたＸＴＰにより発せら
れるシグナルの相違により特性化される。好ましくは、ＸＴＰは前述した通りＡ
ＴＰに変換され、そして、ＡＴＰはルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系により
検出される。
【０２４６】 別の実施態様において、標的核酸における損傷の存在または非存在を検出する
ことができる。損傷は野生型標的核酸における挿入突然変異または欠失突然変異
の何れかであってよい。野生型標的核酸は核酸プローブがハイブリダイズできる
相補性の領域を含んでいる。即ち、野生型標的核酸の相補性の領域は、核酸プロ
ーブの５’エンドおよび３’エンドにより定義される。相補性の領域が損傷を含
んでいる場合は、核酸プローブは標的核酸になおハイブリダイズするが、そのハ
イブリダイゼーションは部分的のみである。損傷の大きさおよび性質に応じて、
プローブの５’エンドまたは３’エンドの何れかが標的核酸にハイブリダイズす
るか、または、ループの存在により特徴付けられるハイブリダイゼーション構造
が形成される。これらの場合の各々において、脱重合は回避される。好ましくは
、検出されるべき損傷がプローブの３’エンドから約１０塩基未満、好ましくは
約６塩基未満に開始するように核酸プローブを設計する。核酸プローブは一本鎖
核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を有する。プローブは様々な長さを有するこ
とができ、好ましくは約１０〜約１０００塩基、最も好ましくは約１０〜約１０
０塩基の長さを有する。
【０２４７】 損傷を有する核酸の検出は生成されたＸＴＰから発せられるシグナルの相違に
より特徴付けされる。好ましくは、ＸＴＰは前述した通りＡＴＰに変換され、そ
して、ＡＴＰはルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系により検出される。
【０２４８】 本発明のプローブ媒介特異的核酸検出法により生成したシグナル（分析出力）
の増大は新しいサイクル法により具現化されることを意図する。本発明のこの実
施態様において、相互に相補的であり、それらが相互にハイブリダイズする際に
各エンドに３’オーバーハングを有するような２つのプローブを設計する。好ま
しい実施態様において、３’オーバーハングが１塩基オーバーハングであるよう
にプローブを設計する。別の実施態様においては、プローブはまた標的核酸にハ
イブリダイズできる。特に好ましい実施態様においては核酸の３’エンドから作
用し、３’オーバーハングを認識しないポリメラーゼ、例えばクレノーｅｘｏ−
を用いて脱重合反応を行なう。
【０２４９】 好ましい実施態様において、反応の第１工程ではポリメラーゼの存在下および
上記した脱重合を可能にする条件下で、プローブのうちの１つの過剰量の標的核
酸へのハイブリダイゼーションを行なう。一部の実施態様においては、３’オー
バーハングが存在せず、脱重合反応はプローブの３’エンドから進行する。一部
の実施態様においては、プローブ−標的核酸複合体を加熱することにより標的核
酸からプローブを分離することにより反応を停止する。平均して、標的核酸に結
合しているプローブからは僅か１個の塩基が除去され、そして短くなったプロー
ブの画分が生じる。
【０２５０】 第２工程において、過剰量の第２のプローブを反応に添加する。質量作用の法
則により、第１工程で生成した短くなったプローブは新しく添加した相補プロー
ブに結合しようとする傾向を有するのに対し、短くなっていないプローブは標的
核酸に結合する。相補プローブに結合する短くなったプローブは一端で３’オー
バーハングを有さない複合体を生成し、そして脱重合される。このことが脱重合
反応に利用される基質の量を効率的に倍化する。工程１および２は所望の水準の
検出が達成されるまで更に反復することができる。別の好ましい実施態様におい
て、反応は上記した通りＮＤＰＫとカップリングされ、ルシフェラーゼによる、
またはＮＡＤＨによる試験系により検出可能なＡＴＰ等価物を生成する。
【０２５１】 核酸中の特定の塩基の同一性を調査できる能力はまた、異なる種、または異な
る対立遺伝子の場合でも、それに由来する核酸間の識別を可能にする。関連また
は無関連の種の核酸間の検出識別能力はまた、所定の核酸含有試料内に含まれる
種の識別を可能にする。例えば、幾つかの関連する細菌のうちどの種が試料（例
えば臨床試料、環境試料または非ヒト動物由来試料）中に含有されているかを調
べるために方法を用いることができる。
【０２５２】 この方法の好ましい実施態様において、少なくとも２種の種または対立遺伝子
に由来する実質的に同一の配列を有する核酸を検出する。同一性の領域（標的核
酸配列）は少なくとも１箇所の所定の位置内に種間または対立遺伝子間の１ヌク
レオチドミスマッチ少なくとも１つを含み、そして、識別すべき各種に独特の核
酸配列の３’エンドおよび５’エンドまたは識別部を含む。
【０２５３】 次に、一部の実施態様においては、同一性の領域に実質的に相補的なＲＮＡま
たはＤＮＡプローブを合成する。プローブは様々な長さを有することができ、好
ましくは約１０〜約１０００塩基、最も好ましくは約１０〜約１００塩基の長さ
を有する。上記した通り、この相補的プローブは調査位置を含んでいる。
【０２５４】 調査位置はプローブ内で変化できる。例えば調査位置は好ましくは核酸プロー
ブの３’エンドの１０塩基内にある。より好ましくは、調査位置は核酸プローブ
の３’エンドの６塩基内にある。最も好ましくは、調査位置は核酸プローブの３
’エンドの最後から２番目または最後の塩基にある。
【０２５５】 核酸プローブは、調査位置の塩基が一方の種または対立遺伝子の所定の位置に
おけるヌクレオチドには相補的であるが、他方に対してはミスマッチのためにそ
うではないように設計する。同様に、第２のプローブは、第２の種または対立遺
伝子の所定の位置のヌクレオチドに対して調査位置で相補的であるように合成す
ることができる。
【０２５６】 この同じ操作法は所定の試料内の複数の種の存在または非存在を確認するため
に用いることができる。これらの実施態様において、必要とされるものは塩基ミ
スマッチを含む種間の実質的に同一の配列の識別、または、識別すべき各種に独
特の核酸配列の識別であるのみである。同様に、本操作法はある試料中の遺伝子
座における対立遺伝子の数の定量的分析のために使用できる。適切な内部または
外部対照群に対する相対値として分析出力の量を比較することにより、遺伝子座
における対立遺伝子の数を測定できる。これらの比較対照量は、ある試料中の一
方の対立遺伝子の他方に対する比ｖｓ対照試料中の同じ比の値として表示するこ
とができる。この方法により、異型接合性またはトリソミーの損失のような事象
を検出することができる。
【０２５７】 例えば、正常な異型接合対照群は異型接合体を形成する２つの対立遺伝子に関
して約１：１の比を有する。すなわち、異型接合体の各対立遺伝子は、核酸プロ
ーブを用いてその対立遺伝子の存在を検出する際に、検出することができる。第
１位および第２の対立遺伝子を検出する際の識別子ヌクレオチドの放出により得
られる分析出力の量を比として表示する場合、第１および第２の対立遺伝子の相
対量はその遺伝子座において異型接合である試料の場合とほぼ同様となる。試料
が異型接合性を失った場合、２つの対立遺伝子のうちの一方が検出されなくなる
。第１の対立遺伝子が失われた場合、第１の対立遺伝子に対する核酸プローブを
用いて試料を試験する場合には、第１の対立遺伝子は試料中に検出されなくなる
。しかしながら、第２の対立遺伝子は既知の異型接合対照試料中に存在するもの
と同様の量で存在し、このため、第２の対立遺伝子に対する核酸プローブを用い
て試料の試験を行なうことで分析出力が得られる。第１の対立遺伝子の異型接合
性の損失を有する試料に関する第１および第２のの対立遺伝子の分析出力の量を
比として表す場合、その比は約０：１となり、第１の対立遺伝子が存在しないこ
とを示している。逆に、第２の対立遺伝子が失われた場合、第１および第２の対
立遺伝子に関する分析出力の量の比は約１：０となり、第２の対立遺伝子が存在
しないことを示している。
【０２５８】 対立遺伝子のトリソミーの存在は同様の様式で検出される。トリソミーの場合
、第１および第２の対立遺伝子に関して４通りの結果が考えられる。トリソミー
は第１の対立遺伝子に関しては同型接合性であることができ、この場合、第１の
対立遺伝子の３コピーが存在し、第２の対立遺伝子のコピーは存在しない。即ち
、第１および第２の対立遺伝子に関する分析出力の量の比は３：０となる。トリ
ソミーが第２の対立遺伝子に対して同型接合性である場合は、第２の対立遺伝子
の３コピーが存在する。第１および第２の対立遺伝子に関する分析出力の量の比
は０：３となる。２通りの場合の異型接合性トリソミー、即ち、対立遺伝子１の
２コピーおよび対立遺伝子２の１コピー、または、対立遺伝子１の１コピーおよ
び対立遺伝子２の２コピーが可能である。これらの２通りの異型接合性トリソミ
ーの結果は、好ましくは既知の異型接合性の対照試料との比較において、第１お
よび第２の対立遺伝子に関する分析出力の量のの比を測定することにより検知で
きる。比が２：１である場合は、異型接合性トリソミーが第１の対立遺伝子２コ
ピーおよび第２の対立遺伝子１コピーを有する。比が１：２である場合は、異型
接合性トリソミーは第１の対立遺伝子１コピーおよび第２の対立遺伝子２コピー
を有する。
【０２５９】 適切な対照群、例えば異型接合性対照群を用いることにより、異型接合性また
はトリソミーの損失を有することが疑われる試料の分析から得られる比を適切に
解釈できるようになる。
【０２６０】 いくつかの実施態様における次の工程において、各プローブを用いて個別の反
応を行なう。プローブを標的核酸にハイブリダイズしてプローブ核酸−標的核酸
複合体を形成する。プローブ核酸−標的核酸複合体において、プローブの調査位
置におけるヌクレオチドは核酸の所定の位置のヌクレオチドと並置され、これに
より塩基対形成が起こる。次にプローブ−標的核酸複合体を、その３’エンドか
らプローブの脱重合が起こるのを可能にする条件下に反応させる。
【０２６１】 脱重合のための好ましい条件（脱重合条件）は明細書に記載する通りである。
次いでヌクレオチドを検出する。一部の好ましい実施態様においては、反応４お
よび実施例に記載の通りヌクレオチドをＡＴＰ等価物に変換する。好ましい実施
態様においては、ＡＴＰはルシフェラーゼまたはＮＡＤＨ検出系により検出する
。
【０２６２】 本発明の上記実施態様は、プローブの調査位置におけるヌクレオチドが種の核
酸の所定の位置におけるヌクレオチドに相補的である場合にのみ脱重合によりＮ
ＴＰが生成されることから、異なる種または対立遺伝子に由来する核酸間の識別
を可能にする。上記した通り、調査位置における塩基が標的核酸の所定の位置に
おける塩基に相補的である場合にのみ多大な脱重合が進行する。ＡＴＰ濃度を含
むＮＴＰ濃度は、ミスマッチが存在しない場合と比較して、ミスマッチが存在す
る場合に差が生じる。このような差を検出することができる（例えばＡＴＰまた
はＮＡＤＨ検出系の何れかによる）。
【０２６３】 本発明の意図する方法は核酸の試験において広範な用途を有する。一部の特徴
において、内因性核酸は特定の天然または突然変異の配列が存在するかしないか
を調べるために試験する。この種の分析は、核酸試料を採取する元となる対象の
遺伝的特徴を調べることから、場合により遺伝子タイピングと称される。種形成
、生物体の同一性、例えばヒト、イヌ、ニワトリ、ウシ等の識別は種特異的核酸
プローブ、例えばチトクロームＢをコードする遺伝子の領域を選択するプローブ
を用いて調べることができる。
【０２６４】 意図する方法を用いて、例えばヒト患者が、Ｌｅｉｄｅｎ Ｖ突然変異、突然
変異βグロビン遺伝子、デルタ５０８対立遺伝子の領域における嚢胞性繊維症関
連遺伝子、プロトロンビン遺伝子における突然変異、先天的副腎過形成、ａｂｌ
遺伝子セグメントとともにｂｃｒ遺伝子の領域において生じる転位、ＴＨＯ１対
立遺伝子またはＴＰＯＸ対立遺伝子に存在するもののような遺伝子における反復
配列の数、並びに、特定の癌において認められる特定の対立遺伝子の遺伝子座に
おける異型接合性の損失および対立遺伝子トリソミー等を有するかどうかを実例
として測定することができる。遺伝子タイピングはまた、コメ、ダイズまたはト
ウモロコシのような植物ゲノム、および、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊ
ｕｎｉ，サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ
）のような微生物ゲノムを試験することにより薬剤耐性株が試料中に存在するか
しないかを調べるためにも用いることができる。
【０２６５】 本発明の方法の１つの例示される用途において、商業的に意味のある植物のＳ
ＮＰの検出を行なう。コメにおいて、アミロース含量は一般的にコメの加工およ
び調理時の品質を決定する最も重要な要因と考えられている。コメの澱粉合成酵
素のｍＲＮＡ前の５’−リーダー配列におけるＧＴ遷移はメッセージの通常のス
プライシングを変化させる。本発明の方法をもちいたコメ澱粉合成酵素ＳＮＰの
ような商業的に重要なＳＮＰの信頼性ある経費効率の高い検出法は農業分野でも
重要な手段を与える。
【０２６６】 本発明の方法で用いるための核酸プローブの設計のために有用な適切な核酸標
的配列の決定は当業者の知るとおりである。遺伝子配列のデータベース、例えば
Ｇｅｎｂａｎｋを用いて選択された核酸標的の独特性を確認することができる。
ＰＣＲプライマーを設計するための市販のソフトウエアを用いて本発明で使用す
るプローブの設計の一助とすることができる。 反復配列の測定 本発明の方法は核酸試料中の反復配列の存在を調べるために有用である。核酸
標的配列中に存在する反復既知配列は典型的には反復当たり２〜約２４塩基の長
さを有する。ジ−およびトリヌクレオチドの反復が当該分野でよく知られている
。本方法の用途は１縦列反復（Ｓｉｎｇｌｅ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ（Ｓ
ＴＲ））検出である。典型的には、標的核酸の異なる対立遺伝子は異なる数の反
復配列を有し、このため反復数の測定は遺伝子タイピングに有用である。このよ
うな方法は同一性の試験において法医学における重要な用途を有している。反復
既知配列数を測定するための方法は以下の通りである。
【０２６７】 既知反復配列複数を含む特殊な核酸プローブを設計して作成する。各プローブ
は核酸標的配列の配列に相補的な反復配列を異なる数だけ含んでいる。各プロー
ブは標的の反復領域の下流にある標的の非反復領域に相補的な５’−末端ロッカ
ー配列を有する。プローブは典型的には３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを
有するが、本明細書に記載したと下り、本発明の脱重合工程の間の３’−末端か
らのヌクレオチドの放出は、残存プローブの大きさにより別途確認することもで
きる。
【０２６８】 ５’−末端ロッカー配列の使用は、反復領域に対して相対的にプローブの５’
−末端を固定する。即ち、例えばプローブが標的より少ない反復を有する場合、
これは反復領域全体に渡りどこにでもハイブリダイズできるわけではなく、反復
の最初のマッチする基にのみ合致する。本実施態様においては、プローブは標的
よりも短いが、標的配列に完全に相補的である。しかしながら、プローブが標的
より多い反復を有する場合は、プローブは隣接する非反復領域にまで伸長し、そ
の３’−末端領域でミスマッチとなる。
【０２６９】 場合により、既知の反復数（および種々のプローブへの応答のしかた）を有す
る標準核酸試料との比較により反復数を測定することが望ましい。他の例におい
ては、反復の数は、ＡＴＰに変換された放出ヌクレオチドの全ての発光スペクト
ル分析における光出力のような、放出されたヌクレオチドの数を示す、その縦（
ｘ−）軸をプローブ中の反復数、そしてその横（ｙ−）軸を分析出力として有す
るグラフの曲線の形により反復数を推定することができる。
【０２７０】 このようなグラフにおいて、例えば脱重合酵素が鋳型依存性のポリメラーゼま
たはｅｘｏＩＩＩである場合、出力は、プローブが標的と同じかこれより少ない
反復を有する場合のほうが、プローブが標的より多い反復を有する場合の出力と
比較して、大きくなる。Ｓ−型の曲線はプローブの反復数が標的の反復数を超え
た後に最も急速に変化する。即ち、曲線の微分値はその時点で最大値となる。脱
重合酵素がミスマッチ基質から優先的にヌクレオチドを放出する場合も、プロー
ブが標的と同じか少ない反復を有する場合に出力が低値となること以外は、同様
の結果が得られる。
【０２７１】 即ち、既知配列の反復数を測定するための方法の好ましい実施態様において、
複数の個別に処理された試料を準備する。各々の試料は複数の既知の反復配列お
よび反復配列に対して標的の下流の非反復領域を含む核酸標的配列を含有する。
試料を上記核酸プローブにハイブリダイズする。
【０２７２】 処理された反応混合物は、各々の処理された試料を、ハイブリダイズされた核
酸プローブ−の３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵
素の脱重合量と混合することにより形成する。処理された反応混合物は酵素がハ
イブリダイズされた核酸プローブを脱重合し、識別子ヌクレオチドを放出するの
に十分な時間、維持する。
【０２７３】 試料は放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在に関して分析し、分
析出力を得る。そのプローブが標的核酸に存在するものと同じ数の配列反復を含
むような試料から得られる分析出力は核酸標的中に存在する配列反復数を示し、
これを測定した結果である。分析出力は、本発明の一般的方法に関して本明細書
に記載したとおり、残存プローブの可視化を含む、発光スペクトル測定、質量ス
ペクトル測定、蛍光スペクトル測定または吸光度スペクトル測定により得られる
。
【０２７４】 本発明の１つの特徴において、標的核酸は２つの対立遺伝子の反復配列の数に
関して同型接合である。本発明の別の方法においては、標的核酸は反復配列に関
して異型接合である。
【０２７５】 本発明の１つの実施態様において、識別子ヌクレオチドは反復配列を含む領域
の部分であるヌクレオチドである。本発明の別の方法においては、核酸プローブ
はさらに、プローブの反復配列の下流（３’側）に位置する第２の非反復配列を
有する。この第２の非反復配列はその反復配列の５’側の標的核酸に位置する非
反復配列に相補的である。本実施態様においては、プローブ配列の識別子ヌクレ
オチドが第２の非反復配列を含む領域の部分であることを意図している。即ち、
識別子ヌクレオチドは反復配列の３’側のプローブ中に位置する標的核酸の非反
復配列に相補的な１〜約２０核酸を含む配列中に存在する。 ヘアピン構造を用いた試験 プローブはヘアピン構造を有さないように構築することが好ましいが、ヘアピ
ン構造を構築する試験も有用である。本発明の１つの実施態様は、実施例２３に
記載するとおり、標的にハイブリダイズされ、その後ヘアピン構造を形成するこ
とができるように修飾されるプローブを用いて核酸試料中の核酸標的配列の存在
または非存在を測定するためのヘアピン構造の使用を意図する。本実施態様は以
下の工程を包含する。
【０２７６】 調査位置を有する核酸標的配列を含むと思われる核酸試料を含有する処理され
た試料を準備する。標的配列は、核酸試料中に存在する場合は、核酸プローブと
ハイブリダイズする。プローブは少なくとも２つの区分よりなる。第１の区分は
プローブの３’−末端の約１０〜約３０ヌクレオチドを含んでいる。これらのヌ
クレオチドは調査位置の約１〜約３０ヌクレオチド下流から始まる位置の標的鎖
配列と相補的である。プローブの第２の区分はプローブの５’−末端領域に位置
し、そして、標的配列の約１０〜約２０ヌクレオチドを含んでいる。従ってこの
同じ配列は同じく５’から３’の方向に標的とプローブの両方に存在する。この
配列は、調査位置上またはその直ぐ上流（５’側）のヌクレオチドから、プロー
ブの３’−末端ヌクレオチドが標的にアニーリングする個所の直ぐ上流のヌクレ
オチドまでの、標的中領域に渡っている。０〜約５０、好ましくは、０〜約２０
個のヌクレオチド長で第１の区分とも第２の区分ともハイブリダイズしない配列
を有するプローブの任意の第３の区分がプローブの第１および第２の区分の間に
位置する。
【０２７７】 処理された試料中のプローブは、ｄＮＴＰおよび鋳型依存性のポリメラーゼと
混合することにより、調査位置を少なくとも経由して、鋳型依存的な方法で伸長
され、これにより伸長されたプローブ／標的ハイブリッドを形成する。好ましい
実施態様においては、プローブ伸長の長さは、調査位置の上流に存在し、調査位
置の３’−末端に相補的なヌクレオチドの間には存在しない、標的配列のヌクレ
オチドに相補的なｄＮＴＰの伸長反応からの離脱により限定される。
【０２７８】 伸長されたプローブ／標的ハイブリッドは未反応のｄＮＴＰから分離され、即
ち、試料中の調査位置の存在または非存在または調査位置の塩基の同一性を測定
するための伸長されたプローブ鎖の使用のために少なくとも必要な水準まで、精
製される。伸長されたプローブ／標的のハイブリッドを変性して鎖を分離する。
伸長されたプローブ鎖はヘアピン構造を取ることができるようになる。
【０２７９】 伸長反応に有用なポリメラーゼ酵素は、鋳型非特異的な方法で３’−末端デオ
キシアデノシンを付加する活性の無い鋳型依存性のポリメラーゼであることが好
ましい。即ち、意図する伸長のためにはＴａｑのようなポリメラーゼ以外を用い
るのが好ましい。
【０２８０】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を、伸長されたプローブヘ
アピン構造の３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素
の脱重合量と混合することにより形成される。反応混合物は、脱重合酵素が３’
−末端ヌクレオチドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、その
後、放出された識別子ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸
標的配列の存在または非存在を示す。その分析出力は本明細書に記載する通り測
定することができる。
【０２８１】 ＲＥＡＰＥＲ（商標名）と称され実施例２４および図１に示されるもののよう
な、更に別の本発明の実施態様は、核酸試料中の核酸標的配列または標的配列内
の特定の塩基の存在または非存在を測定する際のヘアピン構造の使用を意図し、
以下の工程を包含する。第１の核酸プローブ鎖にハイブリダイズされた核酸標的
配列を含むと思われる核酸試料を含有する処理された試料を準備する（図１Ａ）
。
【０２８２】 ハイブリッドは第１のハイブリッドと称する。第１のプローブは少なくとも２
つの区分よりなる。第１の区分は標的調査位置の下流約５〜約３０ヌクレオチド
から始まる位置の標的核酸配列に相補的なプローブ３’−末端約１０〜約３０ヌ
クレオチドを含んでいる。第１のプローブの第２の区分は、調査位置から調査位
置の約１０〜約３０ヌクレオチド下流まで標的配列の反復である約５〜約３０ヌ
クレオチドを含み、そして、プローブの第１の区分にはハイブリダイズしない。
即ち、第２の配列は、調査位置から下流に向かって第１のプローブの３’−末端
ヌクレオチドが標的と並置される位置まで標的配列の領域の反復である。プロー
ブの第１および第２の区分の間に位置するプローブの任意の第３の区分は、０〜
約５０、好ましくは約２０までのヌクレオチド長であり、第１および第２の何れ
かの区分とハイブリダイズしない配列を有する。
【０２８３】 処理された試料中の第１のハイブリッドを第１のプローブの３’−末端におい
て伸長することにより第１のプローブを調査位置を超えて伸長し、その配列が調
査位置を含む伸長された第１のハイブリッド（図１Ｂ）を形成する。伸長された
第１のハイブリッドは元の標的核酸および伸長された第１のプローブよりなる。
次に伸長された第１のハイブリッドを水性組成物中で変性することにより、ハイ
ブリダイズされた二本鎖の２本の核酸鎖を分離し、分離された標的核酸および分
離された伸長された第１のプローブを含有する水溶液を形成する。
【０２８４】 約１０〜約２０００、より好ましくは約１０〜約２００、最も好ましくは約１
０〜約３０ヌクレオチド長であり、伸長された第１のプローブの調査位置の約５
〜約２０００、好ましくは約５〜約２００ヌクレオチド下流から始まる位置の伸
長された第１のプローブに相補的な第２のプローブを伸長された第１のプローブ
にアニールさせ、これにより第２のハイブリッドを形成する（図１Ｃ）。第２の
ハイブリッドは、伸長された第１のプローブの５’−エンドにその伸長が達する
まで、第２のプローブの３’−エンドにおいて伸長され、これにより、その３’
領域が識別子ヌクレオチドを含む第２の伸長されたハイブリッド（図１Ｄ）を形
成する。
【０２８５】 伸長反応に用いられるポリメラーゼ酵素は、鋳型非特異的様式で３’−末端デ
オキシアデノシンを付加する活性の無い鋳型依存性のポリメラーゼであることが
好ましい。即ち、意図する伸長のためにはＴａｑのようなポリメラーゼ以外を用
いることが好ましい。
【０２８６】 伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して２本の核酸鎖、すなわ
ち、伸長された第２のプローブおよび伸長された第１のプローブを分離する。こ
のようにして形成された水生組成物を冷却することにより、元の核酸試料中に標
的配列が存在する場合は、分離された伸長された第２のプローブ（図１Ｅ）から
「ヘアピン構造」が形成される。即ち、標的配列が元の核酸試料中に存在する場
合は、第２の伸長されたハイブリッドの第２の伸長されたプローブの３’−末端
配列は、調査位置および第２の伸長されたプローブの調査位置から下流の配列を
有する領域から、元の（最初に命名された）プローブの３’−末端ヌクレオチド
が元の標的にアニールされたヌクレオチドの位置まで、第２の伸長されたプロー
ブの配列とハイブリダイズする。
【０２８７】 処理された反応混合物は、ヘアピン構造含有組成物を、核酸ハイブリッドの３
’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混
合することにより形成される。反応混合物は、３’−末端領域の識別子ヌクレオ
チドを放出するのに十分な時間、脱重合条件下に維持され、その後、放出された
識別子ヌクレオチドの存在について分析される。分析出力は核酸標的配列の存在
または非存在を示す。ここでもまた、分析出力は本明細書に記載するいくつかの
方法の１つにより測定することができる。
【０２８８】 前述した実施態様の場合と同様、ｄＮＴＰを伸長反応に用いる。識別子ヌクレ
オチドの分析を容易にするためには脱重合よりも前にｄＮＴＰからヘアピン構造
を分離することが好ましい。 キット 本発明の他の実施態様は核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または
非存在を測定するためのキットを意図する。このようなキットはハイブリダイズ
された核酸プローブの３’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有
する酵素および核酸プローブ少なくとも１つを含んでおり、その核酸プローブは
核酸標的配列に相補的である。キットは場合により更にヌクレオシドジホスフェ
ートキナーゼを包含する。好ましくは、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼは
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるものとする。キッ
トは場合により更に脱重合により上記核酸を検出するための取り扱い説明書を包
含する。好ましくは、キットに含まれるヌクレオチド放出活性を有する酵素は、
ピロホスフェートイオンの存在下、その３’−末端領域の塩基が全体的な相補性
でマッチするハイブリダイズされた核酸を脱重合する鋳型依存性のポリメラーゼ
である。或いは、キットに含まれるヌクレオチド放出活性を有する酵素は、３’
から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの
３’−末端においてミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイズされた核酸
を脱重合する。
【０２８９】 このようなキットは本発明の方法の何れに対しても有用であるものと認識され
るべきである。特定の成分の選択は、実施するためにキットを設計する特定の方
法により異なる。識別子ヌクレオチドの放出により測定されるか、または、脱重
合後に残存するプローブの検出による、分析出力の検出のための別の要素も準備
することができる。例えば、３’−末端領域から識別子ヌクレオチドを放出させ
たプローブを検出するために臭化エチジウムを本発明のキットに供給することが
できる。
【０２９０】 このようなキットに含まれる取り扱い説明書はユーザーに対し、本発明の種々
の方法を実施するためにどのようにしてキットの要素を使用するかを指示する。
このような取り扱い説明書は、発行スペクトル測定、質量スペクトル測定、蛍光
スペクトル測定および吸光度スペクトル測定による検出を包含する本発明の検出
方法の説明を含むことができる。
【０２９１】 別の実施態様においては、本発明は、以下の要素：ハイブリダイズされた核酸
プローブからヌクレオシドトリホスフェートとして識別子ヌクレオチドを放出す
るピロホスフェート存在下の活性を有する酵素；アデノシン５’ジホスフェート
；ピロホスフェート；ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ；および少なくとも
１つの核酸プローブを包含する核酸試料中の所定の核酸標的配列少なくとも１つ
の存在または非存在を測定するためのキットを意図し、ここで核酸プローブは所
定の核酸標的配列に相補的である。
【０２９２】 好ましくは、ピロホスフェートの存在下に識別子ヌクレオチドを放出する活性
を有する酵素は、Ｔｎｅ３重突然変異ＤＮＡポリメラーゼ、クレノーｅｘｏ−，
クレノー、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｖｕ ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択され
る。好ましくは、ヌクレオシドジホスフェートキナーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるものである。
【０２９３】 キットは場合により取り扱い説明書を包含する。 別の実施態様においては、本発明は、ハイブリダイズされた核酸プローブの３
’−末端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素および取り扱い
説明書を包含する、核酸試料中の所定の核酸標的配列の存在または非存在を測定
するためのキットを意図する。このようなキットは場合によりヌクレオシドジホ
スフェートキナーゼを包含する。好ましくは、ヌクレオシドジホスフェートキナ
ーゼはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓによりコードされるものである
。キットは更に所定の核酸標的配列に相補的な核酸プローブを包含する。
【０２９４】 本発明の別の実施態様において、核酸検出試験キットは、本発明により意図さ
れる脱重合法、特に脱重合検出法を実施するために提供される。 １つの実施態様においては、キットは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラ
ーゼ、Ｔｎｅ３重突然変異ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｖｕポリメラ
ーゼ、Ａｔｈポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片、クレノ
ーエキソマイナス、Ｅ．ｃｏｉｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＡＭＶ逆転写酵素、
ＭＭＬＶ逆転写酵素またはポリ（Ａ）ポリメラーゼを包含する、ピロホスホロリ
シスを触媒することのできる酵素の入った容器を包含する。別の実施態様におい
ては、キットはＳ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＢＡＬ ３１、タチナタマメヌ
クレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＨのようなエキ
ソヌクレアーゼを含有する容器を包含する。
【０２９５】 上記した酵素の種類の何れも、脱重合有効量で意図する方法中用いられる。即
ち、酵素は、ハイブリダイズされたプローブを脱重合して識別子ヌクレオチドを
放出するような量で用いる。この量は使用する酵素により、そして脱重合を行な
う温度により変動する。キットの酵素は典型的には約０．１〜１００Ｕ／反応の
量で存在し、特に好ましい実施態様においては、濃度は約０．５Ｕ／反応である
。対照試料と共に少なくとも一回の試験を行うために十分な量の酵素を準備する
。
【０２９６】 本明細書に記載する通り、識別子ヌクレオチドの存在または非存在を測定する
ための好ましい分析出力はルシフェラーゼの存在下ルシフェリンとのＡＴＰの反
応により生じる発光である。発光を用いたＤＮＡの検出に使用するためのピロホ
スホロリル化酵素を含むキットは、好ましくは、ＮＤＰＫの入った容器およびＡ
ＤＰの入った容器を包含する。同様に、発光を用いたＤＮＡの検出に使用するた
めのエキソヌクレアーゼ酵素を含むキットは、ＰＲＰＰ合成酵素の入った容器お
よびＡＤＰの入った容器を包含する。ＮＤＰＫまたはＰＲＰＰの合成酵素は、約
０．０１〜１００Ｕ／反応、好ましくは約０．１〜約１．０Ｕ／反応の濃度で提
供される。
【０２９７】 好ましくは、上記試薬およびここで記載するキットに用いられる全ての試薬は
夾雑ＡＴＰやアデニレートキナーゼを含まない。夾雑物の一部は透析により酵素
から除去することができる。
【０２９８】 場合により、キットはｄＮＴＰまたはＮＴＰからＡＴＰへの増幅のための試薬
の入った容器を含む。増幅試薬には、例えば、ピルベートキナーゼ、アデニレー
トキナーゼ、ＮＭＰＫ、ＮＤＰＫ、ＡＭＰ（例えば増幅酵素および基質として）
およびｄＣＴＰまたはＡＭＰ−ＣＰＰ（例えば高エネルギーホスフェート供与体
として）が包含される。特に好ましい実施態様においては、キットは試験方法を
実施するための取り扱い説明書を含む１つの同封物として包装することができる
。一部の実施態様においては、試薬は容器内に準備され、直接の使用または希釈
後の使用に適する強度のものとする。別の好ましい実施態様においては、結果の
定量を可能とするために、標品のセットも提供する。更に別の好ましい実施態様
においては、最適酵素活性のための試験緩衝液も含める。
【０２９９】 更に別の実施態様において、意図するキットはヌクレアーゼ、ＰＲＰＰ合成酵
素、ＰＲＰＰ、ＮＤＰＫ、およびＡＤＰをルシフェラーゼおよびルシフェリンと
共に包含する。好ましい実施態様においては、ヌクレアーゼは約１〜５００Ｕ／
反応の濃度で提供し、特に好ましい実施態様においては、約２０Ｕ／反応の濃度
とする。特に好ましい実施態様においては、ＰＲＰＰ合成酵素は約０．０１Ｕ／
反応〜１０Ｕ／反応、好ましくは約０．１Ｕ／反応の濃度で提供する。一部の好
ましい実施態様においては、キットは、単一の試薬溶液として提供される全ての
上記試薬およびルシフェラーゼおよびルシフェリンを包含する。
【０３００】 別の好ましい実施態様において、上記試薬は、例えば、ルシフェラーゼにより
利用されない高エネルギーホスフェート供与体、好ましくはｄＣＴＰ、およびＡ
ＭＰをルシフェラーゼおよびルシフェリンと共に包含する。別の好ましい実施態
様においては、キットは同じ溶液中に提供された上記全ての試薬およびルシフェ
ラーゼおよびルシフェリンを包含する。
【０３０１】 本発明の更に別の実施態様において、上記したキットはプローブ媒介特異的核
酸検出のためのプローブを包含することができる。一部の実施態様においては、
キットは目的の核酸標的に対する核酸プローブ少なくとも１つを包含する。別の
実施態様においては、キットは複数のプローブを有し、その各々は、調査位置に
おいて異なる塩基を含むか、または、異なる標的ＤＮＡ配列を調査するように設
計されている。
【０３０２】 実施態様の各々において、キットは、塩基対１つ以上が異なる２つの相同核酸
標的の識別のため、または、核酸標的が欠失または挿入の突然変異を有するかど
うかを調べるために、核酸標的内の特定の塩基の同一性を調査する際に用いるた
めの取り扱い説明書を含む。キットに含まれることのできる核酸プローブの種類
およびその使用は以下により詳細に記載する。 実施例１：ＲＮＡの特異的検出：外来性の標的ＲＮＡ添加および無添加での反応
におけるプローブ配列にマッチするＲＮＡ種由来のシグナルの比較 特定の標的配列の検出のためにピロホスホリル化反応を用いるために、系に更
に求められる条件は、プローブが外来性ＲＮＡの存在下および非存在下に極めて
同じシグナルを生じるべきことである。本実施例においては、大量のコウボＲＮ
Ａの存在下に標的グロビンｍＲＮＡを検出するように設計されたプローブのシグ
ナルの強度をコウボＲＮＡ無添加に観察されるシグナルと比較する。
【０３０３】 種々の濃度のコウボＲＮＡ、プローブ６（配列番号１）またはプローブ８（配
列番号２）および標的グロビンｍＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，１８１０３−０
２８）を含有するハイブリダイゼーション溶液は、５μｌの５００ｎｇ／μＬの
プローブ６またはプローブ８何れかを、１ＸＴＥ緩衝液（１０ｍＭ，Ｔｒｉｓ，
１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の５μＬの４０ｎｇ／μＬ標的グロビンｍＲＮＡおよび１
０μＬのコウボＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．，Ｒ３６２９）
に添加してコウボＲＮＡ総量０，２，２０，２００，４００および８００ｎｇを
含有する溶液とすることにより調製した。溶液を１５分間５０℃に加熱し、次に
１５分間室温まで冷やした。
【０３０４】 以下の主反応混合物を調製した。
【０３０５】
【表６】 上記した主混合物の一部（１８μＬ）を１８本のチューブの各々に添加した。
１５分間冷却した後、プローブ６を含有する種々のハイブリダイゼーション溶液
２μＬをチューブに添加し、チューブを３７℃の加熱ブロックにいれた。
【０３０６】 反応主混合物と共にハイブリダイゼーション混合物を１５分間インキュベート
した後に、溶液２０μＬをＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）１００μ
Ｌに添加し、得られた反応の光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ−２０／２
０ルミノメーターを用いて測定した。
【０３０７】 プローブ６データを収集した後、同一のセットの反応をプローブ８を含有する
ハイブリダイゼーション溶液を用いて実施した。 以下のデータが得られた。
【０３０８】
【表７】
【０３０９】
【表８】 これらのデータによれば、極めて大量のコウボＲＮＡをハイブリダイゼーショ
ン反応に添加した場合、特異的標的ＲＮＡ種に対するハイブリダイズされたプロ
ーブからのシグナルは大きく低下されない。
【０３１０】
【表９】 実施例２：Ｖ因子のＬｅｉｄｅｎ突然変異の存在の測定 Ｖ因子遺伝子の合成の第１の核酸標的をＦＶ１（配列番号３）の３２位にＧを
含む野生型配列を有するように設計した。相補鎖、ＦＶ２（配列番号４）はその
３’−末端に更に４個の塩基を有していた。Ｖ因子の第２の合成核酸標的は、Ｌ
ｅｉｄｅｎ突然変異、即ちＦＶ３（配列番号５）の３２位にＡ残基を有するよう
に設計した。突然変異相補鎖ＦＶ４（配列番号６）もまたその３’−末端に更に
４個の塩基を有していた。核酸標的オリゴヌクレオチド、ＦＶ１〜ＦＶ４は水中
１ｍｇ／ｍｌの濃度で個別に溶解した。
【０３１１】 核酸プローブＦＶ５（配列番号７）は第１の標的ＦＶ１の１本の鎖に全体的に
相補的となるように合成した。プローブは、相補Ｃ残基がＦＶ１の３２位のＧに
相当するプローブＦＶ５の３’−末端ヌクレオチドから２番目の調査位置にある
ように合成した。同様に、合成の核酸プローブは、第２の標的、Ｌｅｉｄｅｎ突
然変異を有するＶ因子、ＦＶ３の一方の鎖に全体的に相補的な配列ＦＶ６（配列
番号８）を有するように調製した。プローブは、ＦＶ３の３２位のＡに相当する
、プローブＦＶ６の３’−末端ヌクレオチドから２番目の調査位置における相補
Ｔ残基を位置するように合成した。核酸プローブの保存溶液は水中１ｍｇ／ｍｌ
の濃度であった。
【０３１２】 ＦＶ１オリゴヌクレオチドをその相補鎖ＦＶ２当量と混合し、約１５分間９５
℃に加熱し、次に室温に冷却し、Ｖ因子遺伝子の野生型配列に相当する、第１の
核酸標的を含む二本鎖ＤＮＡセグメントを含む第１の試料を調整した。
【０３１３】 ＦＶ３オリゴヌクレオチドをＦＶ４を有するその相補鎖当量と混合し、約１５
分間９５℃に加熱し、次に室温に冷却し、第２の標的、Ｌｅｉｄｅｎ突然変異の
領域にＶ因子遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）セグメントを含む
第２の試料を調製した。
【０３１４】 第１または第２の標的の存在について試験すべきｄｓＤＮＡ試料１μＬを、核
酸プローブ１μＬおよび水１８μＬと混合し、個別のハイブリダイゼーション組
成物を形成した。対照試料として１μＬのｄｓＤＮＡ試料および１９μＬの水を
用いた。
【０３１５】 これらを３分間９５℃に加熱して変性し、次に１０分間ハイブリダイズ条件下
（３７℃インキュベーター中）に維持し、個別の処理された試料を形成した。 主混合物は、１０ＸＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（２０μＬ；Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｍ１９５）、ピロリン酸ナトリウム（４０ｍＭ Ｎａ4Ｐ2Ｏ7溶液５μＬ；Ｐｒ
ｏｍｅｇａ，Ｃ１１３）、クレノーＥｘｏ Ｍｉｎｕｓ（５μＬ；５Ｕ、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍ２１８）、ＮＤＰＫ（ＮＤＰＫ［Ｓｉｇｍａ，Ｎ０３７９］の１０
Ｕ／μＬ溶液１μＬ，水中に溶解）、ＡＤＰ（水中に溶解したＡＤＰ［Ｓｉｇｍ
ａ，Ａ５２８５］の１０μＭ溶液２μＬ）および水（６７μＬ）を含有するよう
に調製した。
【０３１６】 ハイブリダイズされた、処理された試料（２０μＬ）は各々、主混合物と混合
し、３７℃で１５分間維持し、脱重合試料を形成した。 脱重合試料を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添加
し、生成した光の量をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーター
で測定した。合計８試料および２対照試料を分析した。平均した結果を以下に示
す。
【０３１７】
【表１０】 データによれば、光シグナルは、核酸プローブが核酸標的に完全に相補的であ
る場合（試験番号１，２，８および９）のほうが、核酸プローブが３’−末端ヌ
クレオチドから２番目の位置にミスマッチを有する核酸標的に部分的に相補的で
ある場合（試験番号３，４，６および７）よりも約１０倍高値であった。また後
者のシグナルは核酸標的にハイブリダイズすべきプローブがない場合（試験番号
５および１０）に発せられた光よりも約１０倍高値であった。
【０３１８】
【表１１】 実施例３：別の調査プローブによるヒトのＶ因子Ｌｅｉｄｅｎ表現型を有するこ
とがわかっている試料中のヌクレオチド配列の存在または非存在の測定 本実施例においては、実施例２で用いられたような逆の鋳型鎖に相補的な別の
対のプローブを用いて野生型Ｖ因子遺伝子の遺伝子配列およびこの遺伝子のＬｅ
ｉｄｅｎ対立遺伝子を検出する。オリゴヌクレオチドＦＶ７（配列番号９）およ
びＦＶ８（配列番号１０）を水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。オリゴヌクレ
オチドＦＶ１（配列番号３）、ＦＶ２（配列番号４）、ＦＶ３（配列番号５）お
よびＦＶ４（配列番号６）を標的として用い、以下の溶液を調製した。
【０３１９】
【表１２】 上記した溶液を３分間９５℃に加熱し、次に１０分間３７℃のインキュベータ
ーにいれた。以下の主混合物を調製した。 １０ｘＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９５）２０μＬ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ１１３） ５μＬ １０Ｕ／μｌ クレノーＥｘｏ Ｍｉｎｕｓ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ２１８） ５μＬ ＮＤＰＫ（Ｓｉｇｍａ，ＮＯ３７９，水中１０Ｕ／μＬ） １μＬ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ５２８５，水中１０ μＭ） ２μＬ 水 ６７μＬ １００μＬ 主混合物２０μＬを、１０分間３７℃でインキュベートした後加熱したヌクレ
オチド混合物の各々に添加した。得られた反応混合物を３７℃で１５分間インキ
ュベートし、次に１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添
加し、生成した光を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメー
ターで測定した。
【０３２０】 以下の結果が得られた。
【０３２１】
【表１３】 これらのデータによれば、プローブＦＶ７は天然のＶ因子遺伝子に相当する配列
を含むＤＮＡに対しＦＶ８よりも遥かに強いシグナルを与え、従って、試料中の
本ＤＮＡ配列の検出に用いることができる。プローブＦＶ８はＬｅｉｄｅｎ突然
変異領域内のＶ因子をコードする配列を含むＤＮＡに対し、ＦＶ７よりも遥かに
強いシグナルを与えた。
【０３２２】
【表１４】 実施例４：デルタ５０８突然変異の領域における嚢胞性繊維症遺伝子中の配列の
検出 本実施例においては、デルタＦ５０８対立遺伝子として知られる突然変異を含
む嚢胞性繊維症遺伝子のセグメントをコードする配列を検出するために試験を行
った。
【０３２３】 オリゴヌクレオチドＣＦ１（配列番号１１）およびＣＦ２（配列番号１２）を
合成し、５０ｐｍｏｌ／μＬの濃度で水中で再溶解した。これらのプライマーを
用いてＰＣＲ増幅によりヒト染色体ＤＮＡの増幅されたセグメントを作成した。
ＰＣＲ反応はヒトゲノムＤＮＡ２０ｎｇ、各プライマー５０ｐｍｏｌ、１ｘＰｒ
ｏｍｅｇａ Ｔａｑ反応緩衝液＋１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ
１８８Ａ）、２００μＭ ｄＮＴＰおよび１．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１８６Ａ）の組成とした。サイクル条件は１ｘ９４℃
２分、３５ｘ［９４℃０．５分、６０℃１分、７２℃１分］、１ｘ７２℃７分、
４℃浸積とした。増幅したＤＮＡはＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ａ７１７０）を用いて、ＰＣＲ産物２５μＬを樹脂１ｍｌと混合し、３
ｘ１ｍｌの８０％イソプロパノールで洗浄することにより精製した。このＤＮＡ
を用いてデルタＦ５０８突然変異を含む嚢胞性繊維症遺伝子をコードする野生型
ヒトＤＮＡを提示した。
【０３２４】 オリゴヌクレオチドＣＦ６（配列番号１６）およびＣＦ７（配列番号１７）を
１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解し、混合し、アニーリングして、上記オリゴヌク
レオチドＦＶ１およびＦＶ２の場合と同様に二本鎖ＤＮＡセグメントを形成した
。このＤＮＡを用いてこの遺伝子座においてデルタＦ５０８突然変異をコードす
るヒトＤＮＡを提示した。
【０３２５】 オリゴヌクレオチドプローブＣＦ３（配列番号１３）、ＣＦ４（配列番号１４
）およびＣＦ５（配列番号１５）を調製した。プローブＣＦ３の配列は野生型の
嚢胞性繊維症遺伝子と完全に相補的であった。プローブＣＦ４の配列はデルタＦ
５０８突然変異に存在するヌクレオチドに相補的な３’−末端ヌクレオチドを除
き、プローブＣＦ３の配列と同一であり、従って、その突然変異配列の一方の鎖
と完全に相補的であった。プローブＣＦ５の配列はそのＦ５０８突然変異配列の
第２の鎖に完全に相補的であり、従ってやはり、３’−末端ヌクレオチドにおい
てプローブＣＦ３の全体的相補性とは異なっていた。プローブを個別に水に溶解
し、１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。以下の溶液を調製した。
【０３２６】
【表１５】 上記した溶液を３分間９５℃に加熱し、次に１０分間３７℃のインキュベータ
ー中に入れた。
【０３２７】 主混合物を実施例３に記載の通り調製し、この溶液２０μＬを上記溶液１〜１
４の各々に添加した。これらをさらに１５分間３７℃でインキュベートした。 溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し、反
応により生じた光を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメー
ターで測定した。
【０３２８】 以下の結果が得られた。
【０３２９】
【表１６】 ＊正価は二重の試料を平均し、別個のセットで測定された標的のみの値を差し
引くことにより計算した。 これらのデータは、プローブＣＦ３は突然変異の部位にミスマッチヌクレオチド
を有するプローブＣＦ４およびＣＦ５の何れにより生じるシグナルよりも野生型
ＤＮＡで遥かに高いシグナルを与えたことを示している。更に、突然変異配列に
完全に相補的なＣＦ４およびＣＦ５の両方のプローブとも、野生型ＤＮＡの場合
よりもデルタＦ５０８突然変異をコードするＤＮＡの場合に遥かに高いシグナル
を与えた。
【０３３０】
【表１７】 実施例５：正常およびデルタＦ５０８の対立遺伝子の両方を含有する試料を含む
デルタ５０８突然変異の領域における嚢胞性繊維症遺伝子の配列の検出 本実施例はデルタＦ５０８対立遺伝子として知られる突然変異を含む嚢胞性繊
維症遺伝子のセグメントをコードする配列を検出する試験を説明するものである
。試験はこの領域のこの遺伝子の野生型ヒト配列を用いて、そして、両方の対立
遺伝子を有する試料を用いて説明する。ここでの結果は、試験が上記対立遺伝子
に対する同型接合体間の識別が可能であり、種々の遺伝病のキャリアの場合等の
ような、両対立遺伝子が共に存在する異型接合試料を検出するために用いること
ができることを示している。
【０３３１】 オリゴヌクレオチドＣＦ８（配列番号１８）およびＣＦ９（配列番号１９）、
合成の野生型標的を水に溶解し、実施例２に記載の通りアニーリングした。ＣＦ
６（配列番号１６）およびＣＦ７（配列番号１７）もまた標的として使用した。
ＣＦ３（配列番号１３）およびＣＦ４（配列番号１４）はプローブとして使用し
た．以下の溶液を調製した。
【０３３２】
【表１８】 上記した溶液を３分間９５℃に加熱し、次に１０分間３７℃のインキュベータ
ー中に入れた。
【０３３３】 主混合物を実施例３に記載の通り調製し、この溶液２０μＬをチューブ１〜１
５の各々に添加した。チューブをさらに１５分間３７℃でインキュベートし、次
に溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し、反
応により生じた光を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメー
ターで測定した。以下の結果が得られた。
【０３３４】
【表１９】 ＊この値は２連の反応を平均し、適切な標的のみの対照反応で測定された値を
差し引くことにより計算した。
【０３３５】 これらのデータもまた、プローブＣＦ３が正常な（野生型、同型接合）ＤＮＡ
でプローブＣＦ４よりも遥かに強いシグナルを与え、プローブＣＦ４は同型接合
のデルタＦ５０８突然変異標的でプローブＣＦ３よりも遥かに強いシグナルを与
えた。更にまた、異型接合体の場合のように試料中に両方の標的が存在した場合
、シグナルは両方のプローブから得られ、異型接合体の存在が示された。即ち、
本方法で得られる分析出力は、核酸試料中の核酸標的配列が同型接合または異型
接合の何れであるか、そして同型接合である場合、どちらの対立遺伝子が存在す
るかを示していた。
【０３３６】
【表２０】 実施例６：１ヌクレオチド多形の領域におけるプロトロンビン遺伝子に相当する
ＤＮＡ配列の検出 ヒトプロトロンビン遺伝子における突然変異の存在または非存在に関する試験
を本実施例では説明する。このＳＮＰはプロトロンビン遺伝子におけるＧからＡ
への置換を特徴とする。
【０３３７】 オリゴヌクレオチドＰＴ１（配列番号２０）、ＰＴ２（配列番号２１）、ＰＴ
３（配列番号２２）およびＰＴ４（配列番号２３）を合成し、水に溶解して１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度とした。次にＰＴ１およびＰＴ２の試料を以下の溶液において使
用するために水で０．３ｎｇにまで希釈し、以下の溶液を調製した。
【０３３８】
【表２１】 これらの溶液を３分間９５℃に加熱し、次に１０分間３７℃のインキュベータ
ー中に入れた。
【０３３９】 主混合物を実施例３に記載の通り調製し、この溶液２０μＬを溶液１〜１０の
各々に添加した。全ての溶液をさらに１５分間３７℃でインキュベートし、次に
溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し、溶液
により生じた光を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメータ
ーで測定した。以下の結果が得られた。
【０３４０】
【表２２】 これらのデータによれば、プローブＰＴ３はプローブＰＴ４よりも野生型標的
（ＰＴ１）で遥かに高いシグナルを与えたが、プローブＰＴ４はＰＴ３よりも突
然変異鋳型（ＰＴ２）で遥かに高いシグナルを与えた。
【０３４１】
【表２３】 実施例７：植物材料から単離されたＤＮＡにおけるＳＮＰの測定 本発明の方法をここでは知られたＳＮＰ部位においてコメＤＮＡの遺伝子型を
測定するために使用する。
【０３４２】 コメゲノムのセグメントの増幅により作成された特定の標的を本実施例では調
査する。この標的は、増幅されたＤＮＡ標的の一方の鎖を除去するために何も行
わない場合は高いバックグラウンドシグナル値を生じ、あるコメ株に存在するＳ
ＮＰを検出するように設計されている２つのプライマー間の相違を示さないこと
が解かった。この実施例はどのようにして増幅されたＤＮＡ鎖の一方を意図的に
破壊し、他方の鎖を調査することができるかを示している。特にこの例の場合、
このような操作により標的からのバックグラウンド光シグナルが大きく減少し、
調査シグナルの明瞭な測定が可能となる。
【０３４３】 プローブＲＳ１（配列番号２４）およびＲＳ２（配列番号２５）を水中５０ｐ
ｍｏｌ／μｍの濃度に溶解した。プローブＲＳ１は反応に使用する酵素により切
断されない最初の４つの５’−末端結合にホスホチオエート結合を含んでいた。
ＤＮＡをコメより単離し、１０μｇ／ｍＬの濃度とした。
【０３４４】 ５検体の暗号化されたＤＮＡ試料および２検体の既知遺伝子型のＤＮＡ試料（
「Ｇ」対立遺伝子および「Ｔ」対立遺伝子）が得られ、これらをプローブＲＳ１
（配列番号２４）およびＲＳ２（配列番号２５）を用いて増幅した。次にＤＮＡ
をＴ７エキソヌクレアーゼ６で１５分間３７℃で処理し、精製した。得られた精
製されたＤＮＡを、プローブＲＳ３（配列番号２６）、ＲＳ４（配列番号２７）
を用いて、またはプローブを用いることなくピロホスホリル化反応に付し、反応
生成物をＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添加し、光生成を測定し
た。
【０３４５】 以下の結果が得られた。
【０３４６】
【表２４】 正味光単位、比およびコールされた遺伝子型
【０３４７】
【表２５】 ＊ 正味光単位＝総光単位−無プライマー値 ＊＊ 比＝正味光単位ＷＴプライマー／正味光単位変異体プライマー これらの結果を得た後、ＤＮＡ試料の同一性を無コード化したが、採用した全
ての遺伝子型はこれらの試料の予め測定された遺伝子型と合致した。これらの結
果から、本実施例に記載した試験を用いて植物ＤＮＡ中のＳＮＰを測定でき、試
料の一方のＤＮＡ鎖を除去することにより鋳型からの高いバックグラウンドシグ
ナルの排除が容易になり、ＳＮＰの測定が可能になることがわかる。
【０３４８】
【表２６】 （＊指定した塩基間のホスホロチオエート結合の存在を指す）
【０３４９】
【表２７】 実施例８：ピロホスホリル化による試験法を用いた反復ＤＮＡ配列の識別 本実施例はＤＮＡ中の４塩基対配列の反復の数を測定するための試験法を説明
するものである。このような反復配列の識別は法医学的試料の識別のために極め
て有用であることが解かっている。このセットのプローブ、ＴＲ１（配列番号３
１）、ＴＲ２（配列番号３２）およびＴＲ３（配列番号３３）は、ＣＡＴＴ配列
の６，７および８反復をそれぞれを有するＴＨＯ １遺伝子座の既知対立遺伝子
を厳密にマッチさせるように設計した。
【０３５０】 プローブＴＲ１〜ＴＲ３を水に懸濁して１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。６，７お
よび８反復を有するＴＨＯ １対立遺伝子と同型接合の標的をＧｅｎｅ Ｐｒｉ
ｎｔ（商標名）Ｓｙｓｔｅｍ取り扱い説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコール
を用いて増幅した。これらの標的は対立遺伝子６（配列番号２８）、対立遺伝子
７（配列番号２９）および対立遺伝子８（配列番号３０）とそれぞれ命名した。
ゲル精製された標的をＰＣＲ増幅し、その後更に、Ｗｉｚａｒｄ（商標名）ＰＣ
Ｒ Ｃｌｅａｎ−ｕｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製し、ＤＮＡ濃度
をＤＮＡ Ｑｕａｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。これらの標的は１μ
ｇ／ｍｌの濃度に調節し、脱イオン水を添加することにより３．３μｇ／ｍｌと
した。水を添加することにより以下のプローブ含有溶液を最終容量２０μＬとな
るように調製した。
【０３５１】
【表２８】 これらの溶液を３分間９５℃で加熱し、次に１０分間室温でインキュベートす
ることにより冷却した。
【０３５２】 以下の主混合物を調製した。 成分 量（μＬ）／反応 １０ｘＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 ４ ４０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ０．５ １０μＭ ＡＤＰ ０．４ クレノーｅｘｏ−， １０Ｕ／μＬ ０．５ ＮＤＰＫ， １Ｕ／μＬ ０．２ ナノ精製水 １４．４ この溶液を混合し、この溶液２０μＬを上記溶液１〜２４に添加し、得られた
溶液を３７℃で１５分間インキュベートした。このインキュベートの後、得られ
た溶液の４μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添
加し、生成された光を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメ
ーターで測定した。以下の結果が得られた。
【０３５３】
【表２９】 上記した非プローブ反応の値を種々のプローブ／標的マッチの値から差し引き
、得られた数値を以下の表に示した。
【０３５４】
【表３０】
【０３５５】
【表３１】 反復領域において、プローブが標的と同数以下の反復を含んでいる場合、プロ
ーブの３’−エンドにはミスマッチ塩基が存在しないはずであり、相対的に強力
なシグナルが得られる。ＴＲ１プローブは６，７または８反復を含む標的でこの
ようなシグナルを示す。しかしながら、プローブが標的に存在するものよりも多
い反復をこの領域に含む場合は、ミスマッチ塩基は、発生シグナルを大きく減少
させるようなプローブの３’−エンドにあると推定される。推定されるとおり、
ＴＲ３プローブは対立遺伝子８標的では強力なシグナルを与えたが、対立遺伝子
７および６標的では遥かに弱いシグナルを与えた。種々のプローブを用いて発生
させるシグナルを用いて反復領域における反復単位の数を測定することができる
ため、この方法は試料中に存在する対立遺伝子を測定するために用いることがで
きる。
【０３５６】 上記方法を用いると、標的と同じ数かそれより少ない反復配列を含むプローブ
は同様の光出力を与えた。標的よりもプローブにより多い反復が存在する場合は
、低い分析出力が観察された。即ち、標的中の反復の数は、個別に試験した試料
の間の分析出力、ここでは発光における示差的変化により正確に測定することが
できた。
【０３５７】
【表３２】 実施例９：他のクラスのプローブを用いたピロホスホリル化に基づく試験法を用
いた反復ＤＮＡ配列の識別 本実施例においては、特定のクラスの標的でシグナルを発生するのみであるは
ずのあるクラスのプローブが、別の標的でも本質的に等しいシグナルを与えると
いうことを示す意外な結果が示されている。このような結果は予測された結果と
は合致しないものの、これらはなお試料の対立遺伝子組成を測定するために用い
ることができる。
【０３５８】 上記実施例におけるプローブはヒトの遺伝子タイピングのために用いられるＴ
ＨＯ １の対立遺伝子にハイブリダイズするように設計された。それらは３つの
対立遺伝子の標的とプローブＴＲ２について以下に説明するようにハイブリダイ
ズするように設計した。 プローブＴＲ２（上鎖）と対立遺伝子６標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３５９】
【表３３】 プローブＴＲ２（上鎖）と対立遺伝子７標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３６０】
【表３４】 プローブＴＲ２（上鎖）と対立遺伝子８標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３６１】
【表３５】 実施例８に記載したとおり、標的がプローブより少ない反復を有している場合
は、ミスマッチ塩基はプローブの３’−エンドに存在することができ、ピロホス
ホリル化反応のためには極めて不良の基質である二本鎖ＤＮＡ領域を創生する。
これらの予測を得られた結果に基づいて検証した。
【０３６２】 本実施例において、新しい形態のプローブを反応に用いる。これらのプローブ
は、反復領域を越えて伸長し、正しい数の反復セグメントを有する対立遺伝子に
ハイブリダイズする際にこのＤＮＡセグメントの後に標的にハイブリダイズする
ように設計する。対立遺伝子６，７および８標的との対立遺伝子７プローブ（Ｔ
Ｒ６）の予測されるハイブリダイゼーションセグメントを以下に示す。 プローブＴＲ６（上鎖）と対立遺伝子６標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３６３】
【表３６】 プローブＴＲ６（上鎖）と対立遺伝子７標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３６４】
【表３７】 プローブＴＲ６（上鎖）と対立遺伝子８標的（下鎖）のハイブリダイゼーション
：
【０３６５】
【表３８】 上記した通り、プローブＴＲ６は対立遺伝子７とのみと３’−末端ミスマッチ
を有さない産物を形成するよう設計した。即ち、このプローブは対立遺伝子７標
的で強力なシグナルを与えるのみであることが予測された。
【０３６６】 このようなプローブが種々の標的で与える実際のシグナルを試験するために、
プローブＴＲ４（配列番号３４）、ＴＲ５（配列番号３５）、ＴＲ６（配列番号
３６）、ＴＲ７（配列番号３７）およびＴＲ８（配列番号３８）を水に溶解し、
１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。これらのプローブを標的の対立遺伝子６（配列番号
２８）、対立遺伝子７（配列番号２９）および対立遺伝子８（配列番号３０）と
共に用いて、以下の溶液を調製した。これらの溶液の最終容量は水を添加して２
０μＬに調節した。プローブは１μｇ／反応の濃度で使用した。
【０３６７】
【表３９】 これらの溶液を３分間９５℃に加熱し、次に１０分間室温に冷却した。主混合
物を調製し、前実施例に記載の通り上記溶液に添加した。次に得られた溶液を１
５分間３７℃に加熱し、前実施例に記載の通りサンプリングした。試料をＬ／Ｌ
試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添加し、前実施例に記載の通り光出力を
即座に測定した。以下の結果が得られた。
【０３６８】
【表４０】
【０３６９】
【表４１】 意外にも、これらのプローブは予測された検出パターンを与えなかった。例え
ば、プローブＴＲ６は対立遺伝子７（Ａ７）を有する標的で強力なシグナルを与
えるのみであることが予測された。プローブは対立遺伝子７よりも対立遺伝子６
（Ａ６）で低いシグナルを示したが（それぞれ９０．６ｖｓ２８６．４単位）、
対立遺伝子７および８（Ａ８）でのシグナルの間には僅かのみの差が見とめられ
た（それぞれ２８６．４ｖｓ２６４．４単位）。一般的に、プローブは全て、プ
ローブの反復単位数以上の数の反復単位を有するいかなる標的とも実質的に等し
い反応性を示した。これらの同じプローブはプローブ中に存在するよりも少ない
反復単位を有する標的ではより低いシグナルを示し、観察されたシグナル強度は
反復単位数の差が大きくなるに従い減少した。即ち、これらのプローブは明らか
に予測されたシグナルパターンを与えなかったが、これらを用いてＴＨＯ １対
立遺伝子の測定を行なうことができる。
【０３７０】
【表４２】 実施例１０：ＴＨＯ １対立遺伝子の検出のための別のプローブ 本実施例では別のプローブを用いて、ＴＨＯ １対立遺伝子標的およびプロー
ブの間の別のミスマッチの創生により本質的に１つのＴＨＯ １対立遺伝子で強
力なシグナルを与えるプローブ／標的複合物の形成が可能となることを示す。
【０３７１】 プローブＴＲ９（配列番号３９）、ＴＲ１０（配列番号４０）およびＴＲ１１
（配列番号４１）を１ｍｇ／ｍｌで溶解し、ＴＨＯ １の対立遺伝子６（配列番
号２８）、対立遺伝子７（配列番号２９）および対立遺伝子８（配列番号３０）
を有する３ｎｇ／反応の標的を用いるか、何れの標的も用いることなく、上記実
施例に記載の通り反応に付した。これらの溶液を前述の実施例の場合と同様に加
熱し、冷却した。得られた溶液を前述の実施例の場合と同様、主混合物で処理し
、インキュベートし、Ｌ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０２Ａ）に添加し、生
成した光を測定した。以下の結果が得られた。
【０３７２】
【表４３】 プローブのみおよび標的のみ反応の値を複合反応の値から差し引き、以下の表
に示した。
【０３７３】
【表４４】 プローブと標的との間のミスマッチ塩基の数を増大させると測定シグナル値は
低下し、そして、多くの場合においてバックグラウンド反応に起因する数値より
も低値まで測定値を減少させる。特に、２塩基対のミスマッチを有するプローブ
ＴＲ９、および、プローブの末端から３塩基にＡからＣへの突然変異を有するＴ
Ｒ１０はＴＨＯ １対立遺伝子を検出する能力を示さない。しかしながら、プロ
ーブの末端から３塩基にＡからＧへの変化を有するプローブＴＲ１１は他の標的
で観察されたシグナルよりも大きい測定可能なシグナルを対立遺伝子６標的で生
成した。
【０３７４】 次にプローブＴＲ１２（配列番号４２）およびＴＲ１３（配列番号４３）を上
記の通り用いた。以下の結果を得た。
【０３７５】
【表４５】 プローブの３’−末端から４塩基対で別のミスマッチを有するこれらのプロー
ブは、極めて低値のシグナルを与えたのみであり、ＴＨＯ １の対立遺伝子間を
識別しなかったことは明らかであった。即ち、これらのデータは、対立遺伝子特
異的なシグナルを与えることのできるプローブは、プローブの３’−エンド近傍
のプローブ配列中に置かれた塩基対ミスマッチを有するプローブを設計すること
により識別できることを示唆している。
【０３７６】
【表４６】 実施例１１：ピロホスホリル化に基づく試験法を用いた反復ＤＮＡ配列の識別−
ＩＩＩ 本実施例においては、ＴＰＯＸ４ヌクレオチド短縦列反復の６〜１３コピーを
含むＰＣＲ標的をピロホスホリル化による試験をもちいて反復数特異的プローブ
により識別した。標的は予めゲル精製したＴＰＯＸバンド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｄ
Ｃ５１１１）の各々の標準的ＰＣＲ増幅により調製した。ＰＣＲサイクルのパラ
メーターは９４℃１分間、（９４℃１５秒；６０℃３０秒；７２℃６０秒）ｘ３
５、６８℃１０分とした。正しい大きさのＰＣＲ産物を４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により確認した。ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＣＲ精
製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ７１７０）を用いて精製し、水に再懸濁して１
０ｎｇ／μＬの濃度とした。調査配列プローブはＰ６（配列番号４４）、Ｐ７（
配列番号４５）、ｐ８（配列番号４６）、Ｐ９（配列番号４７）、ｐ１０（配列
番号４８）、ｐ１１（配列番号４９）、ｐ１２（配列番号５０）およびＰ１３（
配列番号５１）とした。
【０３７７】 ６〜１３ＴＧＡＡ反復を有する標的を、上記調査プローブの各々を用いて調査
した。使用した標的対立遺伝子はＡ６（配列番号５２）、Ａ７（配列番号５３）
、Ａ８（配列番号５４）、Ａ９（配列番号５５）、Ａ１０（配列番号５６）、Ａ
１１（配列番号５７）、Ａ１２（配列番号５８）およびＡ１３（配列番号５９）
とした。プローブは溶液中最終濃度２．５μＭとし、反応当たり標的１０ｎｇを
使用し、容量は水で２０μＬに増加させた。溶液を２分間９５℃に加熱し、次に
１０分かけて室温に冷却した。
【０３７８】 主混合物２０μＬを各溶液（水１４．７μＬ、１０ｘＤＮＡ重合緩衝液４μＬ
，４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ５μＬ、１０μＭＡＤＰ ０．４μＬ、ＮＤＰＫ（１
Ｕ／μＬ）０．２μＬ、クレノーｅｘｏ−（１０Ｕ／μＬ）０．２μＬ）に添加
し、更に１５分間３７℃でインキュベートした。次に溶液４μＬをＬ／Ｌ試薬１
００μＬに添加し、光出力をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメ
ーターで読みとった。得られた相対光単位（ｒｌｕ）を以下に示す。
【０３７９】
【表４７】 上記した値をバックグラウンド補正し、負数は０とし、以下の表にまとめた。
【０３８０】
【表４８】 データは調査プローブはＴＰＯＸ遺伝子座の関連する同型接合対立遺伝子の存
在を認識できることを示している。同様に異型接合の標的を同じセットの調査プ
ローブを用いて試験した。各精製ＰＣＲ標的１０ｎｇを各調査反応に含有させた
。反応条件は上記した同型接合標的の場合と同様とした。得られたｒｌｕ値を以
下に示す。
【０３８１】
【表４９】 上記した値をバックグラウンド補正し、負数は０とし、以下の表にまとめた。
【０３８２】
【表５０】 上記表中の結果からわかるとおり、プローブＰ６が原因不明の擬陽性１検体を
識別したものの、本方法は各異型接合標的を正確に識別している。 調査プローブ配列：
【０３８３】
【表５１】 標的対立遺伝子
【０３８４】
【表５２】
【０３８５】
【表５３】 実施例１２：異型接合性の損失の調査 一部の癌のような特定の種類の疾患状態において、特定の対立遺伝子の遺伝子
座の異型接合性が変化する。例えば、非癌性細胞は特定の遺伝子座で異型接合で
ある。しかしながら癌細胞では、２つの対立遺伝子の一方が、特定の遺伝子座で
損失または欠失している場合がある。このことを異型接合性の損失と称する。
【０３８６】 この種の異型接合性損失（ＬＯＨ）反応を、以下に記載する通りプローブ１０
７３０（配列番号６０）およびプローブ１０７３１（配列番号６１）を用いて２
種のＥ．ｃｏｉｌ標的（Ｗ３１１０，ＤＨ５α）２５ｎｇ（１μＬ）および５０
ｎｇ（２μＬ）をＰＣＲ増幅することにより行なった。これらのプローブはＤＨ
５αＤＮＡ中には存在するがＷ３１１０ＤＮＡ中には存在しないΔＭ１５９３ｂ
ｐの欠失を含んでいる。ＰＣＲサイクル数は、同じ増幅条件下の「同型接合」標
的（２μＬ Ｗ３１１０または２μＬＤＨ５α）の増幅の場合と同様、各バンド
のＤＮＡの量の半分を「異型接合」標的（１μＬ Ｗ３１１０または１μＬＤＨ
５α）の増幅で生成されるように最適化した。
【０３８７】 目的の遺伝子座を含む以下のＰＣＲ標的、即ち、同型接合試料の場合はＥ．ｃ
ｏｉｌゲノムＤＮＡ、Ｗ３１１０またはＤＨ５αを２μＬ （５０ｎｇ）；異型
接合試料の場合はＷ３１１０およびＤＨ５α各々を１μＬ；ＬＯＨ試料の場合は
のＷ３１１０またはＤＨ５αを１μＬを２連で調製した。 ５μｌ １０ｘＴａｑ緩衝液＋１５ｍＭ ＭｇＣｌZ（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｍ１８８Ａ） ０．５μＬ プローブ１０７３０（５０ｐｍｏｌ） ０．５μＬ プローブ１０７３１（５０ｐｍｏｌ） １μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰ １μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１８６Ａ） ４０μＬ 水 ＰＣＲサイクルのパラメータは９６℃１分間、（９４℃１５秒；６０℃３０秒
；７２℃４５秒）ｘ２０、７２℃４５秒分とした。ＰＣＲ反応の精製はＷｉｚａ
ｒｄ（商標名）ＰＣＲ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ７１８１）５００μＬを用
いて、製造元による取り扱い説明書に従って行ない、水２５μＬで溶離した。
【０３８８】 次に２連のＤＮＡ標的（１μＬ）を、１μｇ（２００ｐｍｏｌ）のプローブ１
０７３２（配列番号６２）、ｗ３１１０とＤＨ５αに共通の配列；１μｇ（２０
０ｐｍｏｌ）のプローブ１０７３３（配列番号６３）、Ｗ３１１０のＤＮＡにの
み完全にマッチする配列；および１μｇ（２００ｐｍｏｌ）のプローブ１０７３
４（配列番号６４）、ＤＨ５αのＤＮＡにのみ完全にマッチする配列を用いて２
連で調査した。調査反応液４μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｆ２０２Ａ）と合わせ、光出力を測定した。
【０３８９】
【表５４】 欠失特異的な調査オリゴヌクレオチド（１０７３９）は高いバックグラウンド
値を与えた。一般的に、これらのデータはＬＯＨの測定のために方法が有用であ
ることを示している。しかしながら、２つの試料、即ち第１のＷ／Ｗ同型接合体
および第１のＤ ＬＯＨは、原因不明の異常データを示している。
【０３９０】
【表５５】 実施例１３：異型接合性の損失の調査−ＣＭＶ 合成サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）標的を用いて異型接合性の損失を測定す
るための調査試験の使用について、本実施例で説明する。
【０３９１】 ＣＭＶ標的の選択理由は、調査プローブオリゴヌクレオチド（９２１１（配列
番号７１）および９２１２（配列番号７２）が以前使用されており、十分検索さ
れているためである。オリゴヌクレオチド１０８００（配列番号６５）および１
０８０１（配列番号６６）をアニーリングしてＣＭＶゲノムの断片となる合成標
的「Ａ」を作成した。同様に、オリゴヌクレオチド１０８０３（配列番号６７）
および１０８０５（配列番号６８）をアニーリングしてＣＭＶゲノムの断片とな
る合成標的「Ｇ」を作成した。標的ＡおよびＧはその名称の元となるヌクレオチ
ドを有する１つのヌクレオチド位置を除いて同じである。両者の標的ともＳａｃ
Ｉのオーバーハングを有している。
【０３９２】 標的をｐＺＥＲＯ−２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＳａｃＩ制限部
位にクローニングし、ＴＯＰ１０ Ｅ．ｃｏｉｌ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
に形質転換した。ＡおよびＧクローン中の正しいヌクレオチド配列の存在は配列
決定により確認した。しかしながら、Ｇクローンは調査プローブにアニーリング
する領域の５’−エンドから３塩基内側のヌクレオチド位置に意図しない突然変
異を含んでいることが解かった。このミスマッチは調査プローブアニーリング配
列の５’−エンドの近傍であったため、調査結果には影響しない。
【０３９３】 以下の５種の標的溶液をＡおよびＧクローンを用いて作成した。 １．ヘテロ：Ａ １２５ｐｇ＋Ｇ １２５ｐｇ／μＬ ２．ＬＯＨＡ：Ａ １２５ｐｇ＋Ｇ ０ｐｇ／μＬ ３．ＬＯＨＧ：Ａ ０ｐｇ＋Ｇ １２５ｐｇ／μＬ ４．Ｍｉｘ Ａｇ：Ａ １２５ｐｇ＋Ｇ ６２ｐｇ／μＬ ５．Ｍｉｘ Ｇａ：Ａ ６２ｐｇ＋Ｇ １２５ｐｇ／μＬ 上記した標的溶液を以下の反応に従ってＪＨ６７（配列番号６９）および１１
０７７（配列番号７０）プローブを用いてＰＣＲ増幅した。 ２μＬ 標的溶液 １μＬ プローブＪＨ６７および１１０７７（各々５０ｐｍｏｌ） １μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ １０ｘＴａｑ緩衝液 １μＬ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ４０μＬ 水 ＰＣＲサイクリングパラメータは９６℃１分、（９４℃１５秒、６０℃３０秒
、７２℃４５秒）ｘ１５，７２℃４５秒とした。その後全ＰＣＲ反応物をＷｉｚ
ａｒｄ（商標名）ＰＣＲ精製樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ７１７０）５００μＬを
用いて、製造元による取り扱い説明書に従って精製した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液３
０μＬを用いて溶離した。反応ごとにクレノーｅｘｏ−２単位を用いた以外は標
的６μＬおよび調査プローブ１μｇを用いた標準的な調査反応を行なった。最終
反応混合物４μＬをＬ／Ｌ試薬１００μＬと合わせ、相対光単位を測定した。
【０３９４】
【表５６】 これらのデータは適切な調査プローブとともに本方法を用いることによりＬＯ
Ｈが測定できることを示している。
【０３９５】
【表５７】 実施例１４：先天性副腎過形成（ＣＡＨ）遺伝子の多重分析 先天的副腎過形成（ＣＡＨ）は１０エクソンを含むステロイド２１−ヒドロキ
シラーゼ（ＣＹＰ２１）における広範な突然変異の結果生じる常染色体劣性遺伝
疾患の一群である。機能的遺伝子であるＣＹＰ２１と非機能的擬似遺伝子である
ＣＹＰ２１Ｐとの間には高い水準の核酸相同性（エクソンで９８％、イントロン
で９６％）がある。疾患をもたらすこの遺伝子における多くの種類の突然変異に
は、完全遺伝子欠失、大型遺伝子変換、１点突然変異および小型８ｂｐ欠失が含
まれる［Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，３：３７３−３７
８ （１９９４）参照］。
【０３９６】 ＣＡＨ疾患誘発突然変異の大部分は非発現ＣＹＰ２１Ｐ擬似遺伝子中に存在す
る配列であり、ＣＹＰ２１ＰおよびＣＹＰ２１との間の組み換えを介してＣＹＰ
２１遺伝子に生じる。即ち、１つの突然変異検出法は典型的にはＣＹＰ２１遺伝
子を検出し、ＣＹＰ２１Ｐ擬似遺伝子は検出しない。集団における疾患保有対立
遺伝子の頻度は約１／５０である。
【０３９７】 ＣＡＨ標的はクレノーｅｘｏ−およびコウボＮＤＰＫを用いて種々の突然変異
に関して調査し、その結果を、Ｔｎｅ３重突然変異熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
および熱安定性Ｐｆｕ ＮＤＰＫを用いた同様の分析と比較した。両方の野生型
のＣＡＨ ＰＣＲ産物、突然変異合成標的、および、クローニングされたＣＹＰ
２１Ｐ擬似遺伝子から増幅した擬似遺伝子ＰＣＲ産物を上記試験における標的と
して用いた。これらを以下に示す。
【０３９８】 ＰＣＲ増幅に用いたプライマー対および得られた産物を以下に示す。 プライマー サイズＰＣＲセグメント 増幅されたセグメント 10912+10909 １４００ｂｐ ５’末端ＣＹＰ２１ 11461+11480 ９１８ｂｐ ５’末端ＣＹＰ２１ 10910+11286 １４９２ｂｐ ３’末端ＣＹＰ２１ 11535+11286 １４９６ｂｐ ３’末端ＣＹＰ２１ 10912+10911 ２６８０ｂｐ 偽遺伝子（ＣＹＰ２１Ｐ） 用いた合成の標的および調査オリゴヌクレオチドを以下に示す。
【０３９９】 ＰＣＲ反応は標的（反応当たり２５ｎｇ）として未消化のヒトゲノムＤＮＡ（
Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ３０４１）を用いながら４種の異なるプローブのセットでＣ
ＡＨ遺伝子の領域を増幅するように設定した。擬似遺伝子の増幅のためには、フ
ォワードＰＣＲプローブの上流のＣＹＰ２１遺伝子を特異的に切断する制限酵素
ＢｃｌＩでヒトゲノムＤＮＡを予め消化し、これによりＣＹＰ２１Ｐのみを増幅
できるようにした［Ｋｒｏｎｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４４（１０）：
２０７５−２０８２（１９９８）］。
【０４００】 ２６８０ｂｐのＰＣＲ産物を消化ＤＮＡ５０ｎｇから増幅し、その後、プラス
ミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ１３８０）に製造元
の取り扱い説明書に従ってクローニングした。クローンを選択し、配列決定（Ｕ
ＳＢシーケナーゼキット、ＵＳ７０７７０）することにより、実際に擬似遺伝子
であることを確認した。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにおけるクローニング
されたＣＹＰ２１ｐ遺伝子は、突然変異調査分析のための純粋な擬似遺伝子ＰＣ
Ｒ産物を得るためのその後の増幅において使用した（ＰＣＲ反応当たりプラスミ
ド１００ｐｇ）。
【０４０１】 ＣＡＨ遺伝子の調査のための熱安定性酵素の使用はまた１つの反応内で６個ま
での複数の部位の調査を可能にする。本実施例で使用する方法は、通常の結果は
殆ど全ての試料中に予測された遺伝子の存在（または突然変異遺伝子の非存在）
を示し、突然変異遺伝子の存在を示すことはめったにないようなスクリーニング
実験室内で日常的に実施される試験を説明するものである。ここで示す例におい
ては、得られた定性的結果から、その後の試験において、存在する厳密な突然変
異を測定する。
【０４０２】 即ち、当量のＣＡＨ野生型（ＷＴ）９１８ｂｐおよび１４９６ｂｐのＰＣＲ産
物を混合し（これにより全ＣＡＨ遺伝子を含むようにし）、そして、各突然変異
部位につき個別に、または複合群として調査した。識別比は合わせたＰＣＲ産物
の個別反応、並びに、複合反応の双方について良好であった。更に、ＣＡＨ野生
型ＰＣＲ産物および６野生型調査オリゴヌクレオチドプローブまたは６突然変異
調査オリゴヌクレオチドプローブのいずれかを用いた多重反応を等モル量の合成
標的（各突然変異部位に対する突然変異合成標的；ＰＣＲ産物または合成標的の
何れか０．２ ｐｍｏｌｅ）と組み合わせて模擬的な異型接合試料とした。
【０４０３】
【表５８】 ＣＡＨ遺伝子が大型であり、存在する種々の突然変異が多数であるため、熱安
定性酵素、即ち高ストリンジェンシーな検出法を使用することがこの複合標的の
ためには極めて好都合であることが解かった。クレノーｅｘｏ−およびコウボＮ
ＤＰＫを用いて３７℃で調査が困難であった突然変異部位は、Ｔｎｅ３重突然変
異ポリメラーゼおよびｐｆｕ ＮＤＰＫを高温で用いた場合より良好に調査でき
た。更にまた、熱安定性酵素を使用することにより、同じ調査試験において多く
の野生型または突然変異の調査オリゴヌクレオチドの複合化が可能となり、存在
する突然変異の迅速なスクリーニングが可能となった。
【０４０４】
【表５９】 突然変異部位１に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド６（野生型）
【０４０５】
【表６０】 突然変異部位２に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド２（擬似／突然変異）
【０４０６】
【表６１】 突然変異部位１に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド１（擬似／突然変異）
【０４０７】
【表６２】 突然変異部位３に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド３（擬似／突然変異）
【０４０８】
【表６３】 突然変異部位２に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド７（野生型）
【０４０９】
【表６４】 突然変異部位３に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド８（野生型）
【０４１０】
【表６５】 突然変異部位４に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド４（擬似／突然変異）
【０４１１】
【表６６】 突然変異部位４に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド９（野生型）
【０４１２】
【表６７】 突然変異部位５に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド５（擬似／突然変異）
【０４１３】
【表６８】 突然変異部位５に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド１０（野生型）
【０４１４】
【表６９】 突然変異部位６に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド１１（野生型）
【０４１５】
【表７０】 突然変異部位６に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド１２（擬似／突然変異
）
【０４１６】
【表７１】 突然変異部位７に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド２３（野生型）
【０４１７】
【表７２】 突然変異部位７に対するＣＡＨ調査体オリゴヌクレオチド２４（擬似／突然変異
） 実施例１５：増幅を行なわない染色体ＤＮＡの検出：Ｉ 理論的には、染色体ＤＮＡ中の１コピー遺伝子の直接検出は十分なＤＮＡが試
験できるのであれば可能であるはずである。必要とされるヒトゲノムＤＮＡの量
は以下の通り計算できる。 ［（１ｘ１０-9ｇ ＤＮＡ）（５ｘ１０9塩基／ゲノム）］／（１ｘ１０3塩基特
異的標的） ＝ ＤＮＡ約５ｍｇ しかしながら、調査されるＤＮＡの量が増大するに従い、このＤＮＡからの非特
異的ＤＮＡシグナルも増大する。従ってＤＮＡ僅か１μｇ程度の量の染色体ＤＮ
Ａでもバックグランドがかなり高くなる。
【０４１８】 このような限界を克服するためには染色体当たりの標的ＤＮＡのコピーを増大
させることが１つの方法である。このような配列は多く知られている。種々の種
の反復ＤＮＡの絶対的配列はゲノム中の配列のコピー数と同様、変動する。例え
ば、Ｅ．ｃｏｉｌ染色体ｒｅｐ配列として知られる配列の５００〜１０００コピ
ーが存在すると推定されている。Ａｌｕ配列は約３００，０００コピーの量で半
数体のヒト染色体中に存在する。Ａｌｕ配列を検出するために必要とされるヒト
染色体ＤＮＡの推定量は以下の通りである。 ［５ｘ１０-3ｇ ＤＮＡ（１コピー遺伝子条件）］／ゲノムあたり３ｘ１０5コ
ピー ＝１．７ｘ１０-8グラム（またはＤＮＡ約１７ｎｇ） 本実施例においては、Ａｌｕ配列の２つの領域（Ａｌｕ １オリゴヌクレオチ
ド１１５９７（配列番号８７）およびＡｌｕ ２オリゴヌクレオチド１１５９８
（配列番号８８））のプローブを用いて染色体ＤＮＡの直接検出が可能であるこ
とを示した。
【０４１９】 ゲノムＤＮＡ（４．２μｇ）を、消化断片上に３’オーバーハングを生じさせ
るＳｐｈＩ制限酵素４０単位で完全（３７℃５時間）に消化した。消化されたゲ
ノムＤＮＡの４０ｎｇまたは８０ｎｇの何れかを、個別の反応における調査プロ
ーブ１１５９７および１１５９８、および、同じ反応における１１５９７および
１１５９８ １．０μｇとアニーリングし、水を添加して最終容量２０μＬとし
た。調査プローブを有さない負の対照群も同様に調製した。溶液を３分間９２℃
に加熱し、１５分間室温に冷却した。
【０４２０】 以下に記載する主混合物２０μＬを各アニーリング反応物に添加し、チューブ
を更に２０分間３７℃でインキュベートし、次に氷上に保存した。反応混合物の
うち４μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ１２０Ｂ）に４連で
添加し、相対光単位（ｒｌｕ）をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミ
ノメーターで測定した。得られたｒｌｕ値を以下に示す。 主混合物： ２００μＬ １０ｘＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 ２５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ２５μＬ クレノーｅｘｏ− １０μＬ ＮＤＰＫ １Ｕ／μＬ ２０μＬ ＡＤＰ １０μＭ ７２０μＬ 水
【０４２１】
【表７３】 実施例１６：増幅を行なわない染色体ＤＮＡの検出：ＩＩ Ａｌｕ配列の存在を検出するための別の方法は１プローブ伸長反応を以下
の通り実施する方法である。
【０４２２】 本実施例は本発明の調査法においてヘアピン構造を形成するために使用するオ
リゴヌクレオチドプローブの異なる種類の使用を説明する。本試験は調査反応へ
の調査部位に特異的なプローブの付加の必要性をなくすための方法を示すもので
ある。
【０４２３】 ここではオリゴヌクレオチドプローブは標的鎖の調査位置の下流（３’側）の
標的鎖にアニーリングする。オリゴヌクレオチドはその５’−エンドにヌクレオ
チドの未アニーリング領域を有し、それに続き標的鎖上の調査領域に同一の約５
〜約２０ヌクレオチドを有する。次にオリゴヌクレオチドのアニーリングした３
’−エンドを標的鎖の調査位置を通過して伸長させ、いわゆる伸長されたプロー
ブを構築する。ハイブリッドを変性し、ヘアピン構造を伸長されたプローブ鎖と
オリゴヌクレオチドプローブの５’−エンドとの間に形成する。次にこの領域を
標準的な調査反応において試験してミスマッチの有無を調べる。
【０４２４】 伸長されたプローブ鎖がとると思われる種々のヘアピン構造を示すように４つ
のプローブを設計した。これらのプローブを１０２０７（配列番号１７７）、１
０２０８（配列番号１７８）、１０２０９（配列番号１７９）および１０２１２
（配列番号１８０）と命名した。
【０４２５】 これらのプローブは、自己アニーリングさせた場合、以下の自己ハイブリダイ
ズ第２の構造を形成すると推定される。
【０４２６】
【表７４】 プローブは標的のＡｌｕ配列に結合し、伸長されるように設計する。伸長後、プ
ローブは「ヘアピン」構造を形成することができ、２重鎖ＤＮＡの伸長体を形成
する。次にこのＤＮＡを「プローブレス」のピロホスホリル化反応において検出
する。伸長されたプローブ配列が、ヘアピンの１セグメントを構成するように設
計されたプローブのセグメントを超えて伸びる場合は、産物は３’オーバーハン
グを有するため産物が検出されるとは予測されない。このような状況を回避する
ためには、設計されたプローブを４個のＤＮＡ塩基の１つがなくなっている反応
において用いることができる。このようにして反応を行うことにより、プローブ
はハイブリダイゼーションの領域を越えて伸長されない。スキーム１は２つのこ
のようなプローブがどのようにしてＡｌｕ配列にハイブリダイズするかを示すも
のである。
【０４２７】
【表７５】 これらのプローブの予測された伸長された産物および伸長された産物が形成で
きるヘアピンの二次構造を以下のスキーム２に示す。
【０４２８】
【表７６】 実施例１７：種形成−種々の動物に特異的なミトコンドリアＤＮＡの検出 本実施例においては、チトクロームＢ遺伝子のセグメントを有するミトコンド
リアＤＮＡのセグメントを、種々の動物種より、ＰＣＲプライマー１１５９０（
配列番号９５）および１１５８９（配列番号９６）を用いて増幅した（ＰＮＡＳ
８６：６１９６−６２００）。これらのＰＣＲプライマーを１０ｍＭＴｒｉｓ、
ｐＨ７．５で希釈し、最終濃度０．２２μｇ／μＬとした。使用したゲノムＤＮ
Ａはウシ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６８５０−１）、ニワトリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，
６８５２−１）、イヌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６９５０−１）およびヒト（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｇ１５２１）であった。
【０４２９】 ＰＣＲ反応は５μＬ １０ｘ緩衝液＋１５ｍＭ ＭｇＣｌ2（Ｐｒｏｍｅｇａ
，Ｍ１８８Ｊ）、１μＬ ｄＮＴＰ １０ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃ１４４Ｇ）
、２μＬプライマー１１５９０、２μＬプライマー１１５８９、０．５μＬ Ｔ
ａｑポリメラーゼ５Ｕ／μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１８６Ｅ）および３８．５μ
Ｌ水を含有するように調製した。次に各チューブにゲノムＤＮＡ １μＬ（１０
０ｎｇ）を添加した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは（１５秒９４℃；１５秒
５５℃；３０秒７２℃）ｘ３０とした。ＰＣＲ産物の大きさは、少量を取ってア
ガロースゲルで泳動し、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色により可視化して確認
した。次にＰＣＲ産物を遊離のヌクレオチドから分離し（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７
１７０）、少量をアガロースゲルで泳動した。全試料とも同じ大きさのＰＣＲ産
物を生成していた。
【０４３０】 次に各ＰＣＲ ＤＮＡを試験に用いてこれを種特異的プローブで特異的に識別
できるかどうかを調べた。調査プローブ（１μｇ／μＬ）１μＬおよび水１７μ
Ｌを適切なＰＣＲ産物２μＬと混合し、３分間９１℃で加熱し、次に１５分間室
温に冷却した。主混合物（下記）２０μＬを各チューブに添加し、各々を更に１
５分間３７℃でインキュベートした。次に溶液４μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ１２０Ｂ）に添加し、相対光出力（ｒｌｕ）をＴｕｒｎｅ
ｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで測定した。２反応から得られた
ｒｌｕの平均値−ＤＮＡバックグラウンド値、並びに標準偏差値を以下に示す。 主混合物 ３１２μＬ １０ｘＤＮＡ ｐｏｌ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９５Ａ） ３９μＬ Ｎａｐｐｉ ４０ｍＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ３５０Ｂ） ３９μＬ クレノーｅｘｏ ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１２８Ｂ） １５．６μＬ ＮＤＰＫ １Ｕ／μＬ ３１．２μＬ ＡＤＰ １０μＭ（Ｓｉｇｍａ） １１２３μＬ 水（Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ３９９）
【０４３１】
【表７７】 データによれば、プライマーはミトコンドリアＰＣＲ産物を検出している。ヒ
ト特異的プローブ（１１５７６（配列番号９７）および１１５８３（配列番号９
８））の両方ともヒトミトコンドリアＤＮＡに特異的であることが解かった。共
通プローブである１１５８２（配列番号９９）は全ての種を検出したが、ニワト
リＤＮＡでは低い効率であった。ニワトリ特異的プローブ１１５７７（配列番号
１００）はニワトリミトコンドリアＤＮＡに特異的であったが、他のニワトリ特
異的プローブ１１５８４（配列番号１０１）はイヌを除く全ての種を検出した。
ウシ特異的プローブ１１５８８（配列番号１０２）はウシＤＮＡに対してはもっ
とも高い検出シグナルを示したが、他の種も検出した。イヌ特異的プローブ１１
５８６（配列番号１０３）はイヌおよびウシのＤＮＡでのみ試験したが、ウシＤ
ＮＡよりもイヌＤＮＡのほうが良好に検出していた。より純粋なＰＣＲ産物がバ
ックグラウンドのより少ないＤＮＡを与える。
【０４３２】
【表７８】 実施例１８：トリソミーの検出 本実施例では摸倣トリソミー試料の検出を説明する。核酸プローブおよび標的
は実施例１３に記載のものを用いた。これらにはＣＭＶプローブ９２１１（配列
番号７１）および９２１２（配列番号７２）、二本鎖合成ＣＭＶ野生型標的ＣＭ
Ｖ−Ａのｐ−ゼロ−２クローン（１０８００（配列番号６５）および１０８０１
（配列番号６６））および二本鎖合成ＣＭＶ突然変異標的ＣＭＶ−Ｇのｐ−ゼロ
−２クローン（１０８０３（配列番号６７）および１０８０５（配列番号６８）
）が含まれる。
【０４３３】 各ｐ−ゼロ−２プラスミド（１μｇ）を１時間３７℃でＰｓｔＩ制限酵素で完
全に消化した。次に消化物１０μＬをさらに水２０μＬで希釈した。 以下の主混合物を調製した。 ６０μＬ １０ｘＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１９５Ａ） ７．５μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ１１３） １．５μＬ １０Ｕ／μＬ クレノーｅｘｏ−（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１２８Ａ） ３μＬ ＮＤＰＫ ６μＬ １０μＭ ＡＤＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ａ５２８５） ２２５μＬ 水 （Ｐｒｏｍｅｇａ ＡＡ３９９） 以下の溶液を消化され希釈された鋳型を用いて調製した。
【０４３４】
【表７９】 溶液を３分間９５℃に加熱し、次に室温で１０分間冷却した。次に主混合物２
０μＬを添加し、溶液を更に１５分間３７℃に加熱した。次に溶液４μＬを１０
０μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し、相対光出力をＴ
ｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで即座に測定した。ｒｌ
ｕ値を以下に示す。
【０４３５】 ｒｌｕ値によれば、１：２（Ａ：Ｇ）鋳型混合物は１：２のｒｌｕ比を示した
のに対し、異型接合の１：１のＡ：Ｇのｒｌｕ比は１：１に近いものであった。
即ち意図する方法はトリソミーの検出のために有用であることを示している。
【０４３６】
【表８０】 実施例１９：植物材料から単離したＤＮＡにおけるＳＮＰ異型接合性水準の分析 ＳＮＰ部位において異なる種々の量の２対立遺伝子を有する８つの異なるコメ
ＤＮＡ試料を分析して植物試料における異型接合性の程度を検出するピロホスホ
リル化の能力を調べた。ＤＮＡ遺伝子型（ＧおよびＴ）は実施例７に示すとおり
である。
【０４３７】 ８つの暗号化された異型接合コメＤＮＡ試料および２つの同型接合コメＤＮＡ
試料を入手（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ，Ｃｒｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃ
ｅｎｔｅｒ）し、実施例７に記載の通りプライマーＲＳ１（配列番号２４）およ
びＲＳ２（配列番号２５）を用いてＰＣＲ増幅した。次に得られたＰＣＲ産物を
Ｔ７エキソヌクレアーゼ６で処理し、実施例７に記載の通り精製した。得られた
ＤＮＡの調査は、ＰＣＲ産物４μＬを調査オリゴヌクレオチド１５０ｐｍｏｌお
よび水と混合して最終容量２０μＬとすることにより行なった。この溶液を２分
間９５℃で、次に１０分間３７℃でインキュベートした。使用した調査オリゴヌ
クレオチドはＲＳ３（配列番号２６）、ＲＳ４（配列番号２７）、或いは未使用
とした。次に主混合物２０μＬを添加し、溶液を更に１５分間３７℃でインキュ
ベートした。次にこれらの溶液を１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ
２０２Ａ）と合わせ、光出力をＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｅｇ＆Ｇ ｍｉｃｒｏｌｕｍ
ａｔ ｐｌｕｓルミノメータで測定した。相対光単位（ｒｌｕ）を無オリゴヌク
レオチドバックグラウンドについて補正し、以下に示す。
【０４３８】
【表８１】 これらのＧ：Ｔ比は更に以下の検討により確認した。８つの異型接合試料およ
び２つの同型接合試料を前述の通り再度増幅したが、今回はＰＣＲ反応には１μ
Ｌの32ＰｄＡＴＰおよび32ＰｄＣＴＰを加えた。次に得られたＰＣＲ産物１０μ
Ｌを３７℃で１時間ＰＣＲ緩衝液中２．５ｍＭのＭｇＣｌ2中で１μＬの制限エ
ンドヌクレアーゼＡｃｃＩで消化した。ＡｃｃＩはＧ対立遺伝子ＰＣＲ産物を１
２０ｂｐの２重物に切断するが、Ｔ対立遺伝子のＰＣＲ産物由来の２４０ｂｐ断
片は切断しない。消化物は１０％アクリルアミドＴＢＥゲル上で泳動し、６５℃
で１時間乾燥し、得られたバンドを１時間Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ
ｓ Ｆｌｕｏｒｏｉｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎ上で定量した。以下の数値を得た
。
【０４３９】
【表８２】 試料８はＰＣＲ反応が失敗したため数値が得られなかった。２つのデータセッ
トの間の相関係数は０．９９２０３６であった。
【０４４０】
【表８３】 実施例２０：蛍光標識を使用した調査 本実施例は本発明の方法により目的の標的核酸にハイブリダイズざれたプロー
ブの３’−末端から放出されたヌクレオチドを質量スペクトル測定または蛍光Ｈ
ＰＬＣにより検出することができ、これにより核酸試料中の標的核酸または標的
の調査位置の特定の塩基の存在または非存在の証拠を得ることができることを示
すものである。
【０４４１】 調査プローブはヌクレオチドの５’−末端に連結された蛍光標識を有するよう
に設計される。フルオレセインまたはローダミンのような蛍光タグは、プローブ
として使用することになるオリゴヌクレオチドの５’−エンドに存在するホスホ
ロアミダイトヌクレオチドに結合した蛍光分子を用いて合成中にプローブにとり
込まれることができる（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０４４２】 プローブＰＴ５（配列番号１０４）およびＰＴ６（配列番号１０５）を用いて
プロトロンビン遺伝子をコードする約５００塩基対に渡るヒトゲノムＤＮＡの領
域をＰＣＲ増幅する。プローブＰＴ５は５’−エンドの最初の５塩基の間にホス
ホロチオエート結合を有する。
【０４４３】 ＰＣＲサイクルのパラメーターは以下の通り、即ち、９４℃２分間；（９４℃
３０秒；６０℃１分；７０℃１分）ｘ４０；７０℃４５分とした。Ｔ７遺伝子６
エキソヌクレアーゼ（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）５０単位をＰＣＲ反応混合物
２５μＬに添加し、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。磁性シリカ（
Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ１３３０）を用いて遊離のヌクレオチドを溶液から除き、残
存ＤＮＡを水１００μＬで溶離した。ＰＣＲ産物をＴ７遺伝子６エキソヌクレア
ーゼ（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、上記した通り遊離ヌクレオチドか
ら精製した。
【０４４４】 プロトロンビン調査プローブは、突然変異プロトロンビン配列のセグメントに
全体的に相補的な１１２６５（配列番号１０６）、および、野生型プロトロンビ
ン配列のセグメントに全体的に相補的な１１２６６（配列番号１０７）とした。
これらのプローブの各々は３’−エンドから８塩基に脱安定化突然変異を有して
いる。これらのプローブの各々は上記した通りプローブの合成の間にとりこまれ
た５’−エンドの標識を有する。
【０４４５】 精製されたＰＣＲ産物は２つの調査プローブ（野生型および突然変異）の各々
を用いて個別の反応において調査する。調査プローブの各々についてプローブ分
子よりもモル過剰量の標的分子とも調査反応は以下の組成： ４０μＬ ＰＣＲ産物 １５ｐｍｏｌ 調査オリゴヌクレオチド で行ない、水を最終容量５０μＬとなるまで添加する。
【０４４６】 反応混合物を３分間９５℃で、ついで１５分間３７℃でインキュベートする。 次に主混合物５０μＬを添加する。クレノーｅｘｏ−を含有する主混合物の組
成はＡＤＰおよびＮＤＰＫを含有しないほかは実施例１に記載のものと同様であ
る。次に反応を１５分間３７℃で進行させる。次にハイブリッドの変性を行なう
ために、３分間９５℃で反応混合物をインキュベートし、水１００μＬを添加し
て分離した鎖を希釈し、そして、得られた変性溶液を氷上のチューブに入れる。
【０４４７】 次に溶液を半分に分け、２通りの異なる方法で分析する。一方の方法では溶液
中の標識されたプローブの大きさをケイ素脱着イオン化質量スペクトル測定によ
り分析する（Ｗｅｉ，Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：２４３−２４６
，１９９９）。本方法はフェムトモルおよびオットモルレベルの分析対象に対し
て感度を有する。試料は上記文献中に記載のスペクトル測定法用に調製する。本
質的には、分析対象を典型的には０．００１〜１０．０μＭの範囲の濃度で脱イ
オン水／メタノール混合物（１：１）に溶解する。溶液のうち少量（少なくとも
０．５〜１．０μＬ，少なくとも０．５フェムトモル〜１００ピコモルの分析対
象に相当）を多孔質の表面に吸着させ、乾燥した後に質量スペクトル分析を行な
う。
【０４４８】 これらの試験はＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲのタイムオブフライト質量スペ
クトル測定（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上、３３７ｎｍで
操作するパルス窒素レーザー（Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行なう。
形成されたイオンは２０ｋＶの電圧下、加速されてタイムオブフライトの質量分
析器に入る。他の液体クロマトグラフィー質量スペクトル測定（ＬＣ−ＭＳ）機
器を用いて分析してもよい（Ｎｉｅｓｓｅｎ Ｗ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ａ
７９４：４０７−４３５（１９９８））。
【０４４９】 第２の方法においては、溶液中の変性された標識プローブ鎖をＪａｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：
１２３９−１２４４（１９９４）またはＬｅｖｉｔｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：９３−１００（１９８４）に記載の通り、蛍光
検出器を用いてＨＰＬＣにより分析する。変性した標識プローブ鎖の大きさはＡ
ＢＩ３７７により確認する。
【０４５０】 変性された溶液中に存在する標識されたプローブ鎖の大きさは、ヌクレオチド
がプローブの３’−末端から放出されたか否かを示しており、従って、マッチま
たはミスマッチの塩基対がプローブ／鋳型ハイブリッドの３’−末端に存在した
かどうかを示している。野生型プローブを含有する変性溶液の場合は、元のプロ
ーブの長さより短い標識されたプローブが観察されることは、元の試料中の少な
くとも１つの対立遺伝子の３’−末端においてマッチ塩基が存在すること、従っ
て、元の試料の少なくとも１つの対立遺伝子は野生型であることを示している。
突然変異プローブを含有する変性溶液の場合、元のプローブの長さより短い標識
されたプローブが観察されることは、元の試料中の少なくとも１つの対立遺伝子
の３’−末端においてマッチ塩基が存在すること、従って、元の試料の少なくと
も１つの対立遺伝子は野生型であることを示している。両方の場合において、分
析出力を定量することによりその遺伝子座において遺伝子型が同型接合である異
型接合であるかを調べることができる。
【０４５１】
【表８４】 実施例２１：複合細胞混合物中で検出することができる最小細胞集団の測定 本実施例は、意図する方法を用いて他の細胞のバックグラウンドにおいて小さ
い細胞集団を検出することができることを示すように考案されている。即ち、１
ｘ１０6ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）の一定バックグラ
ウンド中漸増量のｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）を含有する細胞混
合物からＲＮＡを単離した。次にＲＮＡを用いて染色体転位によりｋ５６２細胞
に特異的であるｂｃｒ／ａｂｌ転位転写物のＲＴ−ＰＣＲを行なった。転位はａ
ｂｌ遺伝子のセグメントの関与とともにｂｃｒ遺伝子の領域において起こる。Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞は転位を有さず、このため、ｂｃｒおよびａｂｌの転写物に関
し野生型である。
【０４５２】 ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をリン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、５分間２０００Ｇで遠心
分離し、細胞を沈殿させた。上澄みを除去し、細胞沈殿物をＳＶ ＲＮＡ溶解緩
衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，＃Ｚ３１００）に再懸濁し、溶解緩衝液中
１ｘ１０6個／１７５μＬの最終密度とした。同様にしてＫ５６２細胞をリン酸
塩緩衝食塩水で洗浄し、５分間２０００Ｇで遠心分離し、細胞を沈殿させた。上
澄みを除去し、細胞沈殿物をＳＶ ＲＮＡ溶解緩衝液に再懸濁し、溶解緩衝液中
１ｘ１０6個／１７５μＬの最終密度とした。細胞溶解物を１８ゲージの針を通
すことによりゲノムＤＮＡをせん断させた。
【０４５３】 細胞溶解物を以下に記載する通り合わせ、ＳＶ溶解緩衝液を最終容量３５０μ
Ｌとなるように添加した。試料２はＫ５６２溶解物の１：１０００希釈物を用い
、試料３，４および５はＫ５６２溶解物の１：１００希釈物を用い、そして試料
６〜１０は未希釈の溶解物を用いた。
【０４５４】
【表８５】 次に総ＲＮＡを製造元の取り扱い説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｚ３１００）に従
ってＳＶ総ＲＮＡ単離システムを用いて上記の合わせた溶解物から単離した。Ｒ
ＮＡを各々１００μＬの水に溶離し、使用時まで−２０℃で保存した。
【０４５５】 得られた各試料のＲＮＡ濃度は、水３００μＬと混合した該当試料１０μＬを
ＵＶスペクトル測定することにより調べた。セットＡにおいては、試料は上記し
たＮＩＨ−３Ｔ３細胞とＫ５６２細胞の複合物とした。セットＢにおいては、試
料は上記した数および容量のＫ５６２細胞のみとした。スペクトル分析の結果は
以下に示すとおりである。ＯＤ２６０の吸光度はＤＮＡの量を示し、ＯＤ２８０
の吸光度は蛋白の量を示し、そして２６０／２８０の比がＲＮＡの純度を決定し
、高純度の試料は約２．０の２６０／２８０比を有する。
【０４５６】
【表８６】 ＊ｎａ＝低値のため正確な測定が不可能。） １Ｂ〜８Ｂの値は極めて低値であったため、当該分野でよく知られているとお
り、極めて低い核酸濃度においてはスペクトル分析の感度が無いことを示してい
る。
【０４５７】 染色体転位のためにＫ５６２特異的となっているｂｃｒ−ａｂｌ産物のＲＴ−
ＰＣＲ反応は、２００塩基対のＲＴ−ＰＣＲ産物を得るために合計５μＬのＲＮ
Ａおよび増幅プライマー９２６１および１０８６０（下記）を用いて製造元によ
る取り扱い説明書に従ってＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ１２５０
）を用いてセットアップした。１０８６０のオリゴヌクレオチドは５’−末端に
３個のホスホロチオエート結合を有している。ＲＴ−ＰＣＲサイクルパラメータ
ーは４８℃４５分間、９５℃２分間、４０ｘ（９４℃３０秒間、６５℃１分間、
６８℃１分間）、６８℃７分間、４℃浸積とした。
【０４５８】
【表８７】 得られた増幅産物５μＬを１．５％アガロースゲル上で泳動した。２００ｂｐ
のｂｃｒ／ａｂｌバンドは試料３Ｂ〜１０Ｂおよび３Ａ〜１０Ａで検出可能であ
った。従って、上記した方法を用いたｂｃｒ／ａｂｌ転位は１ｘ１０6個のＮＩ
Ｈ−３Ｔ３細胞のバックグラウンドにおいて１００個のＫ５６２細胞中容易に検
出された。
【０４５９】 別のセットの反応において、ＲＴ−ＰＣＲ産物（２５μＬ）を３７℃で３０分
間Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ０．５単位で処理した。次に試料をＭａｇｎ
ｅＳｉｌ（商標名）磁性シリカ粒子を用いて精製した。
【０４６０】 即ち、ＰＣＲ産物２５μＬを結合緩衝液（０．４Ｍチオシアン酸グアニジン＋
０．０８Ｍ酢酸カリウム）１５０μＬ中で粒子１．５ｍｇと合わせた。組成物を
室温で２分間インキュベートした。チューブを磁気スタンドに置くことにより粒
子を捕獲し、上澄みを除去した。粒子を７０％エタノール１５０μＬで４回洗浄
した。粒子を水５０μＬに再懸濁し、室温で２分間インキュベートした。次に結
合緩衝液（粒子非含有）１５０μＬを添加し、チューブを室温で２分間インキュ
ベートした。粒子を捕獲し、７０％エタノール１５０μＬで３回洗浄した。最終
洗浄液を除去し、粒子を室温で１０分間風乾した。次に粒子を水１００μＬに再
懸濁し、室温で２分間インキュベートした。粒子を捕獲し、精製されたＰＣＲ産
物を含有する上澄みを新しいチューブに移した。各精製ＲＴ−ＰＣＲ産物５μＬ
を調査試験に用いたところ、統計学的データのグラフは、１０細胞調査試験の−
４σ値は０細胞対照調査反応の＋４σ値と交差しないことから、１０のｋ５６２
細胞が検出できたことを示していた。即ち、この技法を用いることにより、混合
細胞集団の０．００１％が検出される。
【０４６１】 以下の主混合物を調製した。 １０ｘ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１９０） ２０μＬ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２０μＬ 水 ５１μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ５μＬ １０ｕＭ ＡＤＰ ２μＬ ５Ｕ／μＬ Ｔｎｅ３重突然変異ポリメラーゼ（１Ｕ／反応）１μＬ ０．５Ｕ／μＬ Ｐｆｕ ＮＤＰＫ（０．１Ｕ／反応） １μＬ 試料（５μＬ）および１１０６５調査オリゴヌクレオチド（１μｇ）を水中で
合わせ、最終容量２０μＬとした。これらを３分間９５℃に加熱し、次に６０℃
で１０分間インキュベートした。次に主混合物２０μＬを添加し、反応混合物を
６０℃で１５分間インキュベートした。次に１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｆ２０２Ａ）に添加し、光出力（平均ｒｌｕ）をＴｕｒｎｅｒ（登録商
標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで測定した。バックグラウンドのＲＬＵを差
し引き、３読み取り値の平均を以下に示す。
【０４６２】
【表８８】 実施例２２：調査反応のＰＣＲクリーンアップおよびＡＴＰ測定工程の自動化 調査反応のＰＣＲクリーンアップとＡＴＰ測定の工程を自動化できる能力を本
実施例で説明する。ロボットは調査主混合物の添加を自動化し、ルシフェラーゼ
反応の前にインキュベート時間を与えることも可能であるが、それはこの特定の
実施例では説明しない。
【０４６３】 同じＰＣＲ増幅プライマー、同じＳＮＰ調査プライマーおよび同じ増幅条件を
用いた実施例７に詳細に記載したＰＣＲ操作をここでも用いることにより既知Ｓ
ＮＰ部位における１８９のコメゲノムＤＮＡの遺伝子型を調べる。ＰＣＲ反応終
了後、５０μＬのＰＣＲ反応の各々の２５μＬをＤｙｎｅｘ（商標名）Ｖ−底９
６穴プレートに移し、Ｂｉｏｍｅｋ（商標名）２０００ロボット（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）上に置いた。Ｔ７エキソヌクレアーゼ６（１μＬ）を各ウェルに添加し、プ
レートを３０分間３７℃でインキュベートした。ロボットをプログラミングし、
以下の工程を完了した。 （１）ロボットが溝中の上下ピペッティング操作によりチオシアン酸グアニジン
溶液中の磁気シリカ粒子を（Ｐｒｏｍｅｇａ）を混合した。 （２）粒子１８０μＬを８マイクロピペットチップのセットに採取し、プレート
のカラム１に移した。これと同じセットの８チップで粒子１８０μＬを各プレー
トの各カラムに移した。 （３）個別のチップを用いて上下ピペッティング操作を４回行なうことによりウ
ェルの内容物を混合した。この工程では各ウェル専用のチップを用いた。 （４）ロボットはプレートを磁気ピン列を有するステーションにまで移動させ、
ここで粒子をウェル側部に捕獲し、上澄みを廃棄物として除去し、溝部にいれた
。 （５）ロボットは各ウェルに付き専用の新しいセットのチップを用いて３回７０
％エタノール洗浄を行なった。 （６）最後の洗浄溶液を除去した後、ロボットのグリッパーアームでプレートを
磁石から取り外して別のステーションに置き、ここで各ウェルに水５０μＬを添
加した。 （７）上下ピペッティング操作により水を粒子と混合し、次に１５０μＬの０．
４Ｍチオシアン酸グアニジン、０．０８Ｍ酢酸カリウムを各ウェルに添加した。
一列の８チップを用いて溶液を分注し、ここでは各ウェルにつき専用のチップを
用いてウェルの内容物を混合した。 （８）ロボットでプレートを磁気ピン列に戻した。 （９）ウェルの内容物を上下ピペッティング操作により混合し、粒子をウェル壁
上に捕獲し、そして、上澄みを廃棄物溝に除去した。 （１０）１００μＬの７０％エタノール洗浄を３回行なった。 （１１）最終洗浄液を除去した後、粒子を１０分間風乾した。 （１２）次にロボットのグリッパーアームでプレートを磁石から取り外し、別の
スタンドに置いた。 （１３）１００μＬの水を各ウェルに添加し、ウェルの内容物を上下ピペッティ
ング操作により各ウェル専用のチップで混合した。 （１４）プレートを磁石上に置き、粒子と分離したＤＮＡ含有水を新しいプレー
トに移した。
【０４６４】 この時点で、マルチチャンネルピペッターを用いて手動により各ウェルの内容
物１０μＬをルミノメーター９６穴プレートに移し、調査オリゴヌクレオチド（
１０μＬ中１５０ピコモル）を各ウェルに添加した。次に、０．６Ｎ ＮａＯＨ
１０μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で５分間インキュベートし、二本
鎖ＤＮＡを変性した。次に０．１Ｍ トリスｐＨ７．３を１０μＬ添加して溶液
を中和し、アニーリングが可能な場合は調査オリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡに
アニーリングさせた。
【０４６５】 プレートをＢｅｒｔｈｏｌｄ（商標名）ルミノメーターに移し、５分間３７℃
に加温した。次にルミノメーターで自動的にＬ／Ｌ試薬１００μＬを添加した。
データをＥｘｃｅｌ（登録商標）スプレッドシートに移して分析した。データを
以下に示す。本方法を使用することにより合計１９２試料のうち、１８９試料が
同型接合の野生型か突然変異か、または、異型接合であるかを判別できた。 対象となった総試料 １８９ ＷＴ同型接合体 １０８ 突然変異同型接合体 ７４ 異型接合体 ７ 対象外 ３ ％対象試料 ９７．４ 平均ＷＴ ＲＬＵ ２８９７９１．９６ 平均突然変異ＲＬＵ ２９４９５８．３０ 対照値： 対照ＷＴ調査 １１００ ｒｌｕ 対照突然変異調査 １３００ ｒｌｕ
【０４６６】
【表８９】 （＊は示された塩基間のホスホロチオエート結合の存在を示す）
【０４６７】
【表９０】
【０４６８】
【表９１】
【０４６９】
【表９２】
【０４７０】
【表９３】
【０４７１】
【表９４】
【０４７２】
【表９５】
【０４７３】
【表９６】
【０４７４】
【表９７】
【０４７５】
【表９８】 実施例２３：自己アニーリング調査プローブ 本実施例は本方法の調査技術においてヘアピン構造を形成するために用いる種
々のオリゴヌクレオチドプローブの使用を例示する。本研究は調査反応に調査部
位特異的なプローブを加える必要性をなくすための方法を示す。
【０４７６】 ここでは、オリゴヌクレオチドプローブは標的配列の調査位置の下流（３’側
）の標的鎖にアニールする。オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの未アニーリン
グ領域をその５’エンドに、そしてそれに引き続き、標的鎖の調査領域と同一の
約５〜約２０ヌクレオチドを有する。次にオリゴヌクレオチドのアニーリングさ
れた３’−エンドを標的鎖の調査位置を通過して伸長し、いわゆる伸長プローブ
と称される物を構築する。ハイブリッドを変性し伸長されたプローブ鎖とオリゴ
ヌクレオチドプローブの５’−エンドとの間にヘアピン構造を形成する。次にこ
の領域のミスマッチの有無について標準的な調査反応により試験する。
【０４７７】 伸長されたプローブ鎖がとると思われる異なる種類のヘアピン構造を示すよう
に４つのプローブを設計した。これらのプローブは、１０２０７（配列番号８９
）、１０２０８（配列番号９０）、１０２０９（配列番号９１）および１０２１
２（配列番号９２）である。
【０４７８】 これらのプローブは自己アニーリングさせた場合には以下の自己ハイブリダイ
ズ二次構造を形成すると推定される。
【０４７９】
【表９９】 ４種のプローブの各々５μＬ（５μｇ）をナノ精製水で希釈して１００μＬと
した。次にこれらを１：１０で連続希釈して最終希釈ファクター１：１００，０
００とした。希釈されたプローブ２０μＬを３分間９５℃で個別のチューブ中で
加熱し、１０分間室温に冷却して自己アニーリングさせた。次に実施例１に記載
した主混合物２０μＬを各チューブに添加し、チューブを１５分間３７℃でイン
キュベートした。溶液１０μＬを１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ
２０２Ａ）に添加し、相対光単位をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ル
ミノメーターで即座に測定した。プローブ非存在の対照群は相対光単位５７．２
４であり、残存プローブの結果は以下の表に相対光単位（ｒｌｕ）として報告す
る。
【０４８０】
【表１００】 プローブ１０２０７は期待された通り調査のための効率的な標的として機能し
、プローブ１０２０８は予測されたマイナスの結果を示した。プローブ１０２１
２は塩基のマッチが僅か３箇所であり、このため伸長できず、低い値をもたらし
た。プローブ１０２０９は３’−エンドから内側の３番目のヌクレオチドにある
ミスマッチのため、ヘアピンが形成してもアニーリングされない３’−末端ヌク
レオチドを有していると考えられる。このような未アニーリングの３’−末端ヌ
クレオチドが低いｒｌｕの原因であると考えられる。
【０４８１】
【表１０１】 実施例２４：自己アニーリングプライマーを用いた調査：ＩＩ 本実施例および図１は異なる種類のオリゴヌクレオチドプローブである「ＲＥ
ＡＰＥＲ（商標名）」プローブの本発明の方法における使用を説明する。この実
施例は調査反応に調査部位特異的なプローブを加える必要性をなくすための方法
を示している。
【０４８２】 ここではオリゴヌクレオチドの第１プローブ（配列番号１１２）はその３’−
エンドにおいて、標的鎖の調査位置の下流（３’側）の標的鎖（配列番号１１１
）にアニールさせる（図１Ａ）。プローブはその５’−エンドに、調査位置を含
む標的鎖上の領域に同一の約５〜約２０ヌクレオチドを含むヌクレオチドの未ア
ニーリング領域を有している。この同一領域は標的とプローブの鎖の双方で同じ
方向に存在する。
【０４８３】 次にアニールしたプローブの３’−エンドを標的鎖の調査位置を通過して伸長
し、図１Ｂに示されるとおり、第１の伸長されたプローブおよび伸長された第１
のハイブリッドと称される物を形成する（配列番号１１３）。伸長された第１の
ハイブリッドを変性し、第２のプローブ（配列番号１１４）を第１の伸張された
プローブにアニーリングして第２のハイブリッドを形成する。この第２のプロー
ブは第１の伸長されたプローブ鎖上の調査位置の下流の領域の第１の伸張された
プローブ鎖と相補的である（図１Ｃ）。
【０４８４】 次に図１Ｄに示すとおり、第２のプローブを伸長し、第２の伸長されたハイブ
リッドを形成する。第２の伸長されたハイブリッドは第１の伸長されたプローブ
および第２の伸長されたプローブよりなる（配列番号１１５）。
【０４８５】 第２の伸長されたハイブリッドの鎖を変性し、再生させてヘアピン構造を形成
させる。ヘアピンの形成により、第１の伸長されたプローブは３’−オーバーハ
ングを有するヘアピン構造を形成するのに対し、第２の伸長されたプローブは脱
重合の基質となる５’−オーバーハングを含むヘアピン構造を形成する。次に第
２の伸長されたプローブ鎖を脱重合し、分析出力を明細書に記載の通り得る。分
析出力は、本明細書で説明した通り、元の標的鎖、または元の標的鎖中の特定の
塩基の存在または非存在を測定する。
【０４８６】 配列番号１１１のオリゴヌクレオチドを水で１ｍｇ／ｍｌに希釈する。この溶
液を１１１と標示する。配列番号１１２のオリゴヌクレオチドを水で１ｍｇ／ｍ
ｌに希釈して、この溶液を１１２と標示する。各溶液１１１および１１２を１μ
Ｌづつ水１８μＬと合わせる。溶液を５分間９５℃に加熱し、その後、１０分間
室温に冷却して、配列番号１１１と１１２のオリゴヌクレオチドをアニーリング
させる。
【０４８７】 この溶液に、ｄＮＴＰ混合物を各ｄＮＴＰに付き０．２５ｍＭの最終濃度とな
るまで、１０ｘクレノー緩衝液を最終濃度１ｘとなるまで、そして、５Ｕのクレ
ノー酵素を添加する。これらの成分の入ったチューブを３０分間３７℃でインキ
ュベートする。このようにして形成された伸長された第１のハイブリッドＤＮＡ
（配列番号１１３を含む）を精製（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｍｅｒｍａｉｄ ｓｙｓｔ
ｅｍ）し、水５０μＬ中に溶離する。
【０４８８】 この精製伸長第１ハイブリッド溶液に、第２のプローブとして配列番号１１４
のオリゴヌクレオチド１μＬ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加する。次に溶液を５分間９
５℃に加熱し、室温に冷却して１１４および１１３を図１Ｃに示すとおりアニー
リングさせ、第２のハイブリッドを形成する。この溶液にｄＮＴＰ混合物を各ｄ
ＮＴＰに付き０．２５ｍＭの最終濃度となるまで、１０ｘクレノー緩衝液を最終
濃度１ｘとなるまで、そして、５Ｕのクレノー酵素を添加する。これらの成分の
入ったチューブを３０分間３７℃でインキュベートして第２の伸長されたプロー
ブを含有する第２の伸長されたハイブリッドを形成する（オリゴヌクレオチド配
列番号１１５）。
【０４８９】 形成された配列番号１１５／１１３の第２の伸長されたハイブリッドＤＮＡ（
図１Ｄ）を精製（Ｑｉｑｇｅｎ，Ｍｅｒｍａｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）して未反応の
ｄＮＴＰから伸長されたハイブリッドを分離し、水５０μＬ中に溶離させる。（
或いは、元の１１２オリゴヌクレオチドをその５’−末端でビオチニル化し、こ
のビオチンはその後配列番号１１３の鎖中にも存在する。このビオチニル化鎖１
１３を次に鎖１１５から変性し、製造元の取り扱い説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｚ
５４８１）に従ってストレプトアビジンコーティング常磁性体粒子を用いて溶液
から除去し、１１５のヘアピン構造を以下の通り形成させる。） このハイブリッド溶液を次に５分間９５℃に加熱し、水で希釈して１００μＬ
とし、１０分間氷上で冷却してヘアピン構造を形成させる。
【０４９０】 以下の主混合物を調製して混合する。
【０４９１】
【表１０２】 この主混合物２０μＬを冷却後上記ヘアピン含有溶液２０μＬに添加し、得ら
れた混合物を１５分間３７℃に加熱する。このインキュベーションの後、溶液の
４μＬ試料を２連で採取し、１００μＬのＬ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆ２０
２Ａ）に添加し、反応により生成した光をＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／
２０ルミノメーターを用いて即座に測定する。バックグラウンド値（酵素無添加
）を超える水準の正の分析出力はマッチした塩基がヘアピン構造の３’−末端に
存在することを指しており、このことは、標的鎖の存在を指し、そしてこの特定
の例においては、標的の調査位置にＧ塩基が存在することも指す。
【０４９２】
【表１０３】 実施例２５：自己アニーリングプライマーの調査：ＩＩＩ 本実施例では、実施例２３に記載した方法を用いて試料中のＥ．ｃｏｉｌ Ｄ
ＮＡの存在を検出する。Ｒｅａｐｅｒ（商標名）プローブ（１２０２８）はＥ．
ｃｏｉｌ ＤＮＡのｌａｃ Ｚ遺伝子の２０ヌクレオチドにハイブリダイズする
ように設計した。ｌａｃ Ｚ遺伝子のこの領域は配列番号１１７と命名する。未
伸長のプライマーは自己アニーリングせず、それ自身伸長してプライマーの２量
体を形成するか、高い水準のバックグラウンドノイズが生じることに留意しなけ
ればならない。プライマーはこの可能性を最低限にする用に設計した。
【０４９３】
【表１０４】 以下の反応をセットアップしてオリゴヌクレオチド１２０２８をＥ．ｃｏｉｌ
ｌａｃ Ｚ遺伝子の相補領域にハイブリダイズした。１２０２８オリゴヌクレ
オチドは反応中大モル過剰に存在させ、これにより複数の伸長作業を行なって１
２０２８オリゴヌクレオチドの全てが確実に伸長して配列番号１１６が構築され
るようにした。伸長はｄＣＴＰの非存在下に行ない、１５塩基付加後にポリメラ
ーゼによる伸長を停止した。オリゴヌクレオチド１２０２８をナノ精製水で希釈
し、最終濃度１００μｇ／ｍｌとした。
【０４９４】
【表１０５】 溶液を９５℃で３分間インキュベートし、ＤＮＡを変性した。次に５Ｕ／μＬ
のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ１８６１）１μＬを添加し
、９５℃のインキュベーションを更に２分間進め、その後（９５℃３０秒、５５
℃３０秒、７２℃１分）ｘ３５サイクルおよび４℃浸積を行なった。次にチュー
ブを取り外し、溶液２０μＬを新しいチューブに移した。１Ｕ／μＬ Ｓｈｒｉ
ｍｐアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）１μＬを各チューブに添加し、次にこれ
らを３０分間３７℃でインキュベートし、その後１５分間６５℃でインキュベー
トし、溶液中の残存するヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの５’−エンド
から末端ホスフェートを除去した。チューブを遠心分離機中短時間回転させ、チ
ューブ底部に溶液を収集し、そして３分間９５℃で加熱してＤＮＡを変性させた
。次にチューブを１０分間室温に冷却し、主幹となるループ構造を形成させた。
【０４９５】 溶液から遊離のヌクレオチドを除去するため、各チューブの内容物を個々にＳ
ｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラムに適用し、製造元（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）の取り扱い説明書に従って予備回転し、次に２分間３０００ｒｐｍで遠心
分離した。溶離した溶液２０μＬを主混合物（５０μＬ １０ｘＤＮＡポリメラ
ーゼ緩衝液、６．２５μＬ ４０ｍＭ Ｎａｐｐｉ、１０μＬ １０Ｕ／μＬ
クレノーｅｘｏ ｍｉｎｕｓ，２μＬ １Ｕ／μＬＮＤＰＫ、５μＬ １０μＭ
ＡＤＰおよび２７μＬ水）５μＬに添加し、混合し、３７℃で２０分間インキ
ュベートした。次に２０μＬを取り出して１００μＬのＬ／Ｌ 試薬（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐ）に添加した。光出力を即座にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ
２０／２０ルミノメーターで測定した。相対光単位（ｒｌｕ）の結果を以下に示
す。
【０４９６】
【表１０６】 溶液３および４（プライマーのみ）のバックグラウンドｒｌｕ値は極めて低値
であり、遊離のヌクレオチドが良好に除去されていることが示された。従って溶
液１および２の高値のバックグラウンドはＥ．ｃｏｉｌ ＤＮＡによるものであ
る。１２０２８オリゴヌクレオチドの伸長の効率は２０〜２５％の範囲内にある
と思われる。これはより高いヌクレオチドおよび／またはプライマーの濃度を用
いることにより向上できると考えられる。 １２０２８／ｌａｃＺ（配列番号１１６／１１７）ハイブリッド：
【０４９７】
【表１０７】 下線を付した伸長により付加されたヌクレオチドを有する伸長した１２０２８／
ｌａｃＺ（配列番号１１８／１１７）ハイブリッド：
【０４９８】
【表１０８】 下線を付した伸長により付加されたヌクレオチドを有する伸長した１２０２８（
配列番号１１８）二次構造：
【０４９９】
【表１０９】 実施例２６：Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのゲノム中のＤＮＡ配
列の検出 オリゴヌクレオチド１１４５３（配列番号１１９）および１１４５４（配列番
号１２０）は完全に相補的であり、アニーリングしてＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ
ｒ ｊｅｊｕｎｉの７０ｂｐのセグメントとなる合成標的を形成することができ
る。これらの２つのオリゴヌクレオチドをナノ精製水で希釈して最終濃度１０μ
ｇ／ｍｌとした。次に各々４μＬを２３２μＬの１０ｍＭトリスｐＨ７．３と混
合し、ＤＮＡ０．３μｇ／ｍｌの標的溶液を調製した。オリゴヌクレオチド１１
４５１（配列番号１２１）および１１４５０（配列番号１２２）は合成標的に顕
れる細菌ゲノムの対向する鎖に結合するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕ
ｎｉ調査プローブである。オリゴヌクレオチド１１４５１はオリゴヌクレオチド
１１４５４にアニーリングする。オリゴヌクレオチド１１４５０はオリゴヌクレ
オチド１１４５３にアニーリングする。
【０５００】 以下の溶液を３連で調製しナノ精製水を最終容量２０μＬとなるまで添加した
。
【０５０１】
【表１１０】 調製した溶液を５分間９２℃でインキュベートし、次に１０分間室温に冷却し
た。主混合物を１０単位のクレノーｅｘｏ−ポリメラーゼおよび４単位のＮＤＰ
Ｋを用いて実施例１に記載の通り調製した。主混合物２０μＬを各チューブに添
加し、１５分間３７℃でインキュベートした。次に各溶液５μＬを１００μＬの
Ｌ／Ｌ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆ２０２Ａ）と合わせ、光出力を即座にＴｕｒｎ
ｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで測定した。平均の相対光単位
（ｒｌｕ）を上記表中に記録する。
【０５０２】 標的と共に各調査プローブを用いることは強力な正味のシグナルを与えると考
えらえる。しかしながら一番上のプローブ（１１４５１）は恐らくはヘアピンの
形成により極めて強力なシグナルのみを与え、調査にはあまり適さない。一番下
の調査プローブ（１１４５０）が調査にはより適する。
【０５０３】
【表１１１】 実施例２７：核酸増幅を行なわないＥ．ｃｏｉｌ反復配列の検出 本実施例においては、Ｅ．ｃｏｉｌ中の反復配列をピロホスホリル化前の標的
配列の増幅を必要とすることなく検出する。この標的配列は「ｃｏｌｉｒｅｐ」
と命名する。
【０５０４】 オリゴヌクレオチド１１７０７（配列番号１２３）はｃｏｌｉｒｅｐ ＤＮＡ
の配列のセグメントと全体的に相補的である。オリゴヌクレオチド１１７０７溶
液（１ｍｇ／ｍｌ）１２μＬを水２０４μＬと混合して、溶液Ａを作成した。１
１７０７（１ｍｇ／ｍｌ）４μＬを水２０４μＬおよび１０ｍＭトリスｐＨ８．
０ ８μＬと混合することにより別の溶液を調製し、溶液Ｂを作成した。Ｅ．ｃ
ｏｉｌはＳｉｇｍａ ｃａｔ＃Ｄ４８８９，Ｅ．ｃｏｉｌ菌株Ｂ超純粋である。
【０５０５】 ４ｎｇ（２μＬ）のＥ．ｃｏｉｌ ＤＮＡを１８μＬの溶液Ａおよび１８μＬ
の溶液Ｂと個別のチューブ中で混合した。同様にして４０ｎｇのＥ．ｃｏｉｌ
ＤＮＡを１８μＬの溶液Ａおよび１８μＬの溶液Ｂと個別のチューブ中で合わせ
た。次にこれらの溶液を３分間９２℃でインキュベートし、１５分間室温で冷却
した。以下の主混合物を調製した。 １０ｘＤＮＡポリメラーゼ緩衝液 ２４０μＬ ４０ｍＭ ＮａＰＰｉ ３０μＬ クレノーｅｘｏ−（１０Ｕ／μＬ） ３０μＬ ＮＤＰＫ（１Ｕ／μＬ） １２μＬ １０μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ） ２４μＬ 水 ８６４μＬ 主混合物２０μＬを各反応に添加し、次にそれらを１５分間３７℃でインキュ
ベートした。次にＬ／Ｌ試薬１００μＬを添加し、相対光出力（ｒｌｕ）を即座
にＴｕｒｎｅｒ（登録商標）ＴＤ２０／２０ルミノメーターで測定した。以下の
ｒｌｕが得られた。
【０５０６】
【表１１２】 データによればオリゴヌクレオチドプローブ１１７０７は本発明の方法により
増幅することなくＥ．ｃｏｉｌのＤＮＡを検出できることがわかる。 調査オリゴヌクレオチド：
【０５０７】
【表１１３】 上記から多くの修正や変更が本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく
行なえることは明らかである。記載した特定の例に関する如何なる制限も意図せ
ず、これを行なうものではない。開示内容は添付した請求項により請求項の範囲
内に属する変更を包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は実施例８９に記載のＲｅａｐｅｒ（商標名）試験を説明するものである
。図１Ａは第１のプローブである配列番号１１２（１１２）に核酸標的である配
列番号１１１（１１１）をアニーリングすることにより形成した第１のハイブリ
ッドを示す。矢印は１１１における調査位置を指している。 図１Ｂは１１１を伸長された１１２にアニーリングすることにより形成される
第１の伸長されたハイブリッドを示す。伸長された１１２は第１の伸長されたプ
ローブである配列番号１１３（１１３）である。 図１Ｃは図１Ｂに示した変性核酸分子由来の１１３を配列番号１１４（１１４
）に示す第２のプローブにアニーリングすることにより形成した第２のハイブリ
ッドである。矢印は１１３における調査位置を指している。 図１Ｄは１１３および配列番号１１５（１１５）に示す伸長された１１４鎖を
アニーリングすることにより形成される伸長された第２のハイブリッドである。 図１Ｅは図１Ｄから変性され、ヘアピン構造を形成している１１５鎖を示す。
矢印はハイブリッドの３’−末端における調査位置を指している。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ０９／３８３，３１６ (32)優先日 平成11年８月25日(1999．8．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ (72)発明者 ライペ，ドナ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53705， マディソン，シェボイガン・アベニュー 4833，ナンバー 328 (72)発明者 マンドレカー，ミッシェル アメリカ合衆国ウィスコンシン州53575， オレゴン，アシュ・ストリート 525 (72)発明者 ケパート，ダニエル アメリカ合衆国ウィスコンシン州53527， カティッジ・グローヴ，ヴィスタ・ドライ ブ 112 (72)発明者 ローズ，リチャード・ビー アメリカ合衆国ウィスコンシン州53703， マディソン，ウエスト・ウィルソン・スト リート 444，ナンバー207 (72)発明者 アンドリュース，クリスティーン・アン アメリカ合衆国ウィスコンシン州53527， カティッジ・グローヴ，ウィスパリング・ ウェイ 800 (72)発明者 ハートネット，ジェームズ・ロバート アメリカ合衆国ウィスコンシン州53719， マディソン，チェサピーク・ドライブ 2590 (72)発明者 グ，トレント アメリカ合衆国ウィスコンシン州53715， マディソン，ノース・ウィングラ・ドライ ブ 1329 (72)発明者 オルソン，ライアン・ジェイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53705， マディソン，ノース・アレン・ストリート 340，ナンバー ８ (72)発明者 ウッド，キース・ヴイ アメリカ合衆国ウィスコンシン州53711― 5399，マディソン，コットケ・ドライブ 902，ナンバー ５ (72)発明者 ウェルチ，ロイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306， パロ・アルト，マグノリア・ドライブ 3868 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA35 CA25 CB01 CB03 CB07 CB08 CB14 CB20 CB21 CB30 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 FB13 GC10 GC15 JA20 2G054 AA06 AA10 AB05 CA22 EA01 EA02 EA03 EA04 GB02 JA10 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA08 HA13 HA14 4B063 QA01 QA12 QA13 QA19 QQ41 QR07 QR08 QR32 QR50 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (125)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または非存在
    を測定する方法であって、下記工程： （Ａ）３’−末端領域内に識別子（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ヌクレオチドを含む
    核酸プローブとハイブリダイズされた上記所定の核酸標的配列を含有する標的試
    料を提供すること； （Ｂ）処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末端から
    ヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して処理さ
    れた反応混合物を形成すること； （Ｃ）酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合してそれより識別子ヌクレオチ
    ドを放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること；および
    、 （Ｄ）放出された識別子ヌクレオチドの存在を分析して、上記内因性核酸標的配
    列の存在または非存在を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  2. 【請求項２】 上記識別子ヌクレオチドがヌクレオシドトリホスフェートで
    ある請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項１
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求項１
    記載の方法。
  5. 【請求項５】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求項
    ４記載の方法。
  6. 【請求項６】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出された
    後に蛍光標識される請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求項１
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出された
    後に蛍光標識される請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請求
    項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 上記処理された試料を下記操作： （ａ）試験すべき試料を核酸プローブの１つ以上と混合してハイブリダイゼーシ
    ョン組成物を形成すること、ただし上記核酸プローブの３’−末端領域は（ｉ）
    上記内因性核酸標的配列が試料中に存在する場合に該配列に対して部分的または
    全体的な相補性でハイブリダイズし、そして（ｉｉ）識別子ヌクレオチドを含む
    ものとすること； （ｂ）核酸プローブとハイブリダイズした上記１つの所定の核酸標的配列を含有
    する処理された試料を形成するのに十分な時間上記ハイブリダイゼーション組成
    物を維持すること、 により形成する工程を更に含む請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 上記核酸試料が生物学的試料から得られる請求項１記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または非存
    在を測定する方法であって、下記工程： （Ａ）試験すべき試料を核酸プローブの１つ以上と混合してハイブリダイゼーシ
    ョン組成物を形成すること、ただし上記核酸プローブの３’−末端領域は（ｉ）
    上記所定の内因性核酸標的配列が試料中に存在する場合に該配列少なくとも１つ
    に対して部分的または全体的な相補性でハイブリダイズし、そして（ｉｉ）識別
    子ヌクレオチドを含むものとすること； （Ｂ）核酸プローブとハイブリダイズした上記所定の内因性核酸標的配列を含有
    する処理された試料を形成するのに十分な時間上記ハイブリダイゼーション組成
    物を維持すること、 （Ｃ）処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末端から
    ヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して処理さ
    れた反応混合物を形成すること； （Ｄ）酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合してそれより識別子ヌクレオチ
    ドを放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること；および
    、 （Ｅ）放出された識別子ヌクレオチドの存在を分析して、上記内因性核酸標的配
    列少なくとも１つの存在または非存在を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  14. 【請求項１４】 上記識別子ヌクレオチドがヌクレオシドトリホスフェート
    である請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項
    １３記載の方法。
  16. 【請求項１６】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求項
    １３記載の方法。
  17. 【請求項１７】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求項
    １３記載の方法。
  20. 【請求項２０】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請求
    項１３記載の方法。
  23. 【請求項２３】 上記試料が複数の所定の内因性核酸標的配列を含む、複数
    の上記核酸プローブと混合される請求項１３記載の方法。
  24. 【請求項２４】 上記核酸プローブの１つが１つの内因性標的核酸配列に部
    分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全て
    がそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より大きい請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 上記核酸プローブの１つが１つの内因性標的核酸配列に部
    分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全て
    がそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より小さい請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 上記核酸プローブの１つが１つの内因性核酸標的配列に全
    体的相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全
    てがそれらの対応する核酸標的配列に部分相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より大きい請求項２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 上記核酸プローブの１つが１つの内因性標的核酸配列に全
    体的相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全
    てがそれらの対応する核酸標的配列に部分相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より小さいい請求項２３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’−
    末端領域におけるその塩基が全体的相補性でマッチするハイブリダイズされた核
    酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性のポリメラーゼであ
    る請求項１３記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’→
    ５’−エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３’−
    末端領域にミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイズされた核酸を脱重合
    する請求項１３記載の方法。
  30. 【請求項３０】 試験すべき試料中の内因性核酸標的配列中の特定の塩基の
    存在または非存在を測定する方法であって、下記工程： （Ａ）試験すべき試料を核酸プローブの１つ以上と混合して内因性ハイブリダイ
    ゼーション組成物を形成すること、ただし上記核酸プローブ少なくとも１つの３
    ’−末端領域は（ｉ）上記内因性核酸標的配列と実質的に相補的であり、そして
    調査位置において所定のヌクレオチド少なくとも１つを有し、そして、（ｉｉ）
    識別子ヌクレオチドを含むものとすることとし、そして、上記核酸標的配列は存
    在および非存在を測定する特定の塩基少なくとも１つを有することとし； （Ｂ）処理された試料を形成するのに十分な時間、上記ハイブリダイズされた組
    成物を維持すること、ただしプローブの上記調査位置は、上記内因性標的配列中
    の識別すべき上記特定の塩基が存在する場合はこれと並べられていることにより
    塩基対形成が起こり得るようにしたヌクレオチドであることとし； （Ｃ）処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−末端から
    ヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素と混合してハイブリッドを脱
    重合して処理された反応混合物を形成すること； （Ｄ）処理された反応混合物を、これより識別子ヌクレオチドが放出されるのに
    十分な時間維持すること；および、 （Ｅ）放出された識別子ヌクレオチドの存在または非存在を分析することにより
    上記識別すべき特定の塩基の存在または非存在を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  31. 【請求項３１】 識別子ヌクレオチドが調査位置にある請求項３０記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求項
    ３０記載の方法。
  33. 【請求項３３】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求項
    ３０記載の方法。
  35. 【請求項３５】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項３２記載の方法。
  36. 【請求項３６】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項３４記載の方法。
  37. 【請求項３７】 上記核酸標的配列がデオキシリボ核酸およびリボ核酸より
    なる群から選択される請求項３０記載の方法。
  38. 【請求項３８】 第１位のプローブ、第２のプローブ、第３のプローブおよ
    び第４のプローブを更に包含する請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 上記第１のプローブの上記調査位置がデオキシアデノシン
    またはアデノシン残基である核酸残基を含有し、上記第２のプローブの上記調査
    位置がデオキシチミジンまたはウリジン残基である核酸残基を含有し、上記第３
    のプローブの上記調査位置がデオキシグアノシンまたはグアノシン残基である核
    酸残基を含有し、そして上記第４の核酸プローブがデオキシシトシンまたはシト
    シン残基である核酸残基を含有する請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 試験すべき上記試料が、複数の特定の塩基の存在または非
    存在を調査する複数の内因性核酸標的配列を含有する請求項３０記載の方法。
  41. 【請求項４１】 上記外因性核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列に部
    分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全て
    がそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より大きい請求項４０記載の方法。
  42. 【請求項４２】 上記核酸プローブの１つが１つの標的内因性核酸配列に部
    分相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全て
    がそれらの対応する核酸標的配列に全体的相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より小さい請求項４０記載の方法。
  43. 【請求項４３】 上記核酸プローブの１つが１つの内因性核酸標的配列に全
    体的相補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全
    てがそれらの対応する核酸標的配列に部分相補性でハイブリダイズする場合の分
    析出力より大きい請求項４０記載の方法。
  44. 【請求項４４】 上記核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列に全体的相
    補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全てがそ
    れらの対応する核酸標的配列に部分相補性でハイブリダイズする場合の分析出力
    より小さい請求項４０記載の方法。
  45. 【請求項４５】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、プロー
    ブの３’−末端領域におけるその塩基が全体的相補性でマッチするハイブリダイ
    ズされた核酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性のポリメ
    ラーゼである請求項３０記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’→
    ５’−エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３’−
    末端にミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイズされた核酸を脱重合する
    請求項３０記載の方法。
  47. 【請求項４７】 第１の内因性核酸標的または実質的に同一の第２の標的を
    含有する核酸試料中の該標的の存在または非存在を測定する方法であって、下記
    工程： （Ａ）試験すべき試料を核酸プローブの１つ以上と混合してハイブリダイゼーシ
    ョン組成物を形成すること、ただし上記第１位および第２の内因性核酸標的は内
    因性標的間で異なる所定の位置において単一のヌクレオチド少なくとも１つを除
    き配列同一性の領域を含むこととし、そして上記核酸プローブは（ｉ）配列同一
    性の上記核酸標的領域と実質的に相補的であり、そして調査位置においてヌクレ
    オチド少なくとも１つを包含し、ここでプローブの上記調査位置は標的およびプ
    ローブがハイブリダイズされる場合に標的の上記所定位置に並置され、そして（
    ｉｉ）３’−末端領域に識別子ヌクレオチドを含むこととし； （Ｂ）処理された試料を形成するのに十分な時間、上記ハイブリダイズされた組
    成物を維持すること、ただし上記プローブの上記調査位置のヌクレオチドは上記
    同一領域における上記標的の上記所定の位置のヌクレオチドと並置されているこ
    ととし； （Ｃ）処理された試料を、ハイブリダイズされた核酸プローブの３’−末端から
    ヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して反応混
    合物を形成すること； （Ｄ）識別子ヌクレオチドを放出し、上記ハイブリダイズされた核酸プローブを
    脱重合するのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること；および、 （Ｅ）放出された識別子ヌクレオチドの存在を分析して分析出力を得ること、た
    だし該分析出力は上記所定領域における上記ヌクレオチドの存在または非存在を
    示し、そしてこれにより第１または第２の核酸標的の存在または非存在を示す分
    析出力であるものとすること； を包含する上記方法。
  48. 【請求項４８】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求項
    ４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項４８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求項
    ４７記載の方法。
  51. 【請求項５１】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項４７記載の方法。
  52. 【請求項５２】 上記識別子ヌクレオチドがヌクレオシドトリホスフェート
    である請求項４７記載の方法。
  53. 【請求項５３】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項
    ５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請求
    項５３記載の方法。
  55. 【請求項５５】 上記核酸標的配列がデオキシリボ核酸およびリボ核酸より
    なる群から選択される請求項４７記載の方法。
  56. 【請求項５６】 第１位のプローブおよび第２のプローブを包含する請求項
    ４７記載の方法。
  57. 【請求項５７】 上記試験すべき試料が複数の第１の核酸標的および第２の
    実質的に同一の核酸標的を有する請求項５６記載の方法。
  58. 【請求項５８】 上記第１のプローブが上記所定位置における第１の標的核
    酸に相補的な上記調査位置におけるヌクレオチドを有し、そして上記第２のプロ
    ーブが上記所定位置における第２の標的核酸に相補的な調査位置におけるヌクレ
    オチドを有する請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 上記核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列と部分相補
    性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全てがそれ
    らの対応する核酸標的配列と全体的相補性でハイブリダイズする場合の分析出力
    より大きい請求項５７記載の方法。
  60. 【請求項６０】 上記核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列と部分相補
    性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全てがそれ
    らの対応する核酸標的配列と全体的相補性でハイブリダイズする場合の分析出力
    より小さい請求項５７記載の方法。
  61. 【請求項６１】 上記核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列と全体的相
    補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全てがそ
    れらの対応する核酸標的配列と部分相補性でハイブリダイズする場合の分析出力
    より大きい請求項５７記載の方法。
  62. 【請求項６２】 上記核酸プローブの１つが１つの標的核酸配列と全体的相
    補性でハイブリダイズする場合に得られる分析出力が、核酸プローブの全てがそ
    れらの対応する核酸標的配列と部分相補性でハイブリダイズする場合の分析出力
    より小さい請求項５７記載の方法。
  63. 【請求項６３】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’−
    末端領域におけるその塩基が全体的相補性でマッチするハイブリダイズされた核
    酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性のポリメラーゼであ
    る請求項４７記載の方法。
  64. 【請求項６４】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’→
    ５’−エキソヌクレアーゼ活性を示し、ハイブリダイズされたプローブの３’−
    末端領域にミスマッチ塩基１つ以上を有するハイブリダイズされた核酸を脱重合
    する請求項４７記載の方法。
  65. 【請求項６５】 核酸試料中の核酸標的配列中に存在する既知の配列の反復
    の数を測定する方法であって、下記工程： （Ａ）複数の個別の処理された試料を提供すること、ただし、各々の処理された
    試料は核酸プローブとハイブリダイズされた核酸標的配列を含有し、ここで、 （ａ）核酸標的配列は（ｉ）複数の既知の配列の反復、および、（ｉｉ）反復
    の下流の非反復領域を含み、そして、 （ｂ）核酸プローブは複数の異なるプローブの１つであり、ここで上記プロー
    ブはそこに含まれる相補配列反復の数が異なっており、各々の核酸プローブは（
    ｉ）標的核酸の対立遺伝子の既知の配列の反復に相補的な複数の配列反復、（ｉ
    ｉ）プローブの３’−末端領域における識別子ヌクレオチド、および、（ｉｉｉ
    ）標的の非反復領域に相補的でありヌクレオチド１〜約２０個を有する５’−末
    端ロッカー配列を有する、 ものとすること； （Ｂ）各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末
    端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して
    処理された脱重合反応混合物を形成すること； （Ｃ）酵素がハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合してそれより識別子ヌ
    クレオチドを放出できるのに十分な時間、処理された脱重合反応混合物を維持す
    ること；および、 （Ｄ）放出された識別子ヌクレオチドの存在に関して試料を分析して、上記核酸
    標的配列中に存在する配列反復の数を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  66. 【請求項６６】 上記核酸試料が対立遺伝子を示す２つの核酸標的配列を有
    し、そして、２つの対立遺伝子における配列反復の数に関して同型接合である請
    求項６５記載の方法。
  67. 【請求項６７】 上記核酸試料が対立遺伝子を示す２つの核酸標的配列を有
    し、そして、２つの対立遺伝子における配列反復の数に関して異型接合である請
    求項６５記載の方法。
  68. 【請求項６８】 上記識別子ヌクレオチドが反復される配列の部分であるヌ
    クレオチドである請求項６５記載の方法。
  69. 【請求項６９】 プローブ配列の上記識別子ヌクレオチドが標的核酸の反復
    される配列に対して３’−側に位置する非反復配列に対して相補的である請求項
    ６５記載の方法。
  70. 【請求項７０】 標的核酸の反復された配列の３’−側に位置する非反復配
    列に相補的である核酸１〜約２０個を含む配列中に上記識別子ヌクレオチドが存
    在する請求項６９記載の方法。
  71. 【請求項７１】 核酸標的配列中に存在する反復された既知配列が反復当た
    り２〜約２４塩基の長さを有する請求項６５記載の方法。
  72. 【請求項７２】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列少なくとも１つの
    存在または非存在を測定するための１段階法であって、下記工程： （Ａ）その３’−末端領域が上記所定の核酸標的配列に全体的に相補的であり、
    そして識別子ヌクレオチドを含んでいる核酸プローブにハイブリダイズされた上
    記所定の内因性核酸標的配列を含有している処理された試料を（ｉ）ハイブリダ
    イズされた核酸プローブからヌクレオシドトリホスフェートとして識別子ヌクレ
    オチドを放出するピロホスフェート存在下の活性を有する酵素の脱重合量、（ｉ
    ｉ）アデノシン５’ジホスフェート、（ｉｉｉ）ピロホスフェート、および、（
    ｉｖ）ＮＤＰＫと混合して処理された反応混合物を形成すること； （ｂ）酵素がハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合し、ヌクレオシドトリ
    ホスフェートとして３’−末端領域中の識別子ヌクレオチドを放出し、そして上
    記ヌクレオシドトリホスフェートおよび上記アデノシン５’ジホスフェートをア
    デノシン５’トリホスフェートに変換することができるのに十分な時間約２５〜
    約８０℃の温度に処理された反応混合物を維持すること；および、 （ｄ）アデノシン５’トリホスフェートの存在を分析して上記核酸標的配列少な
    くとも１つの存在または非存在を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  73. 【請求項７３】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項
    ７２記載の方法。
  74. 【請求項７４】 上記処理された試料を下記操作： （ａ）試験すべき試料を核酸プローブの１つ以上と混合してハイブリダイゼーシ
    ョン組成物を形成すること、ただし上記核酸プローブの３’−末端領域は（ｉ）
    核酸標的配列が試料中に存在する場合に該配列に部分的または全体的な相補性で
    ハイブリダイズし、そして（ｉｉ）識別子ヌクレオチドを含むものとすること； （ｂ）核酸プローブとハイブリダイズした上記１つの所定の核酸標的配列を含有
    する処理された試料を形成するのに十分な時間上記ハイブリダイゼーション組成
    物を維持すること、 により形成する工程を更に含む請求項７２記載の方法。
  75. 【請求項７５】 上記脱重合酵素が６０〜９０℃で活性を維持する請求項７
    ２記載の方法。
  76. 【請求項７６】 上記脱重合酵素がＴｎｅ３重突然変異株ＤＮＡポリメラー
    ゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮ
    ＡポリメラーゼおよびＴｖｕ ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請
    求項７２記載の方法。
  77. 【請求項７７】 上記ＮＤＰＫがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ
    によりコードされている請求項７２記載の方法。
  78. 【請求項７８】 核酸試料中の核酸標的配列が同型接合または異型接合のど
    ちらの遺伝子座に由来する対立遺伝子であるかを測定するための方法であって、
    下記工程： （Ａ）複数の個別の処理された試料を提供すること、ただし、各々の処理された
    試料は（ｂ）核酸プローブとハイブリダイズされた（ａ）核酸標的配列を含有し
    、上記核酸標的配列は上記核酸標的の目的の遺伝子座に由来する第１の対立遺伝
    子、第２の対立遺伝子または第１および第２の対立遺伝子の混合物のものであり
    、該対立遺伝子は調査位置における配列が異なり、上記核酸プローブは上記プロ
    ーブと標的がハイブリダイズされる場合に標的配列の調査ヌクレオチド位置にお
    いて並置されている３’−末端領域の識別子ヌクレオチドを含んでいるものとす
    ること； （Ｂ）各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末
    端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して
    処理された反応混合物を形成すること； （Ｃ）酵素がハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合してそれより識別子ヌ
    クレオチドを放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること
    ；および、 （Ｄ）放出された識別子ヌクレオチドの存在に関して試料を分析して、核酸試料
    中の核酸標的配列が同型接合または異型接合のどちらの遺伝子座に由来する対立
    遺伝子であるかを示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  79. 【請求項７９】 上記分析が、放出された識別子ヌクレオチドの量に関して
    試料を分析することにより適切な対照群の分析出力と比較した場合に核酸試料中
    の核酸標的配列が同型接合または異型接合の何れであるかを示す分析出力を得る
    ことを包含する請求項７８記載の方法。
  80. 【請求項８０】 上記分析出力が核酸試料中の核酸標的配列が目的の遺伝子
    座において同型接合である場合にどの対立遺伝子が存在するかを示す請求項７８
    記載の方法。
  81. 【請求項８１】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’−
    末端領域におけるその塩基が上記核酸標的の塩基に全体的に相補的であるハイブ
    リダイズされた核酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性の
    ポリメラーゼである請求項７８記載の方法。
  82. 【請求項８２】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項
    ７９記載の方法。
  83. 【請求項８３】 対立遺伝子の遺伝子座の異型接合性の損失を測定するため
    の方法であって、下記工程： （Ａ）複数の個別の処理された試料を提供すること、ただし、各々の処理された
    試料は（ｂ）核酸プローブとハイブリダイズされた（ａ）核酸標的配列を含有し
    、上記核酸標的配列は上記核酸標的の第１の対立遺伝子または第１の対立遺伝子
    および第２の対立遺伝子の混合物のものであり、該対立遺伝子は調査位置におけ
    る配列が異なり、上記核酸プローブは上記プローブと標的がハイブリダイズされ
    る場合に上記調査ヌクレオチド位置を含む上記核酸標的配列の領域にハイブリダ
    イズする３’−末端領域および識別子ヌクレオチドを含んでいるものとすること
    ； （Ｂ）各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末
    端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して
    処理された反応混合物を形成すること； （Ｃ）ハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合してそれより識別子ヌクレオ
    チドを放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること；およ
    び、 （Ｄ）放出された識別子ヌクレオチドの量に関して試料を分析して、核酸試料中
    の核酸標的配列が対立遺伝子の遺伝子座において異型接合性を失ったかどうかを
    示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  84. 【請求項８４】 上記第１の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌク
    レオチドの量が既知の異型接合性の対照群の上記第１の対立遺伝子に対する上記
    放出された識別子ヌクレオチドの量より実質的に少なく、そして、上記第２の対
    立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の
    対照群の上記第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量
    と実質的に同じであり、上記第１の対立遺伝子の遺伝子座における異型接合性の
    損失を示している請求項８３記載の方法。
  85. 【請求項８５】 上記第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌク
    レオチドの量が既知の異型接合性の対照群の上記第２の対立遺伝子に対する上記
    放出された識別子ヌクレオチドの量より実質的に少なく、そして、上記第１の対
    立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量が既知の異型接合性の
    対照群の上記第１の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量
    と実質的に同じであり、上記第２の対立遺伝子の遺伝子座における異型接合性の
    損失を示している請求項８３記載の方法。
  86. 【請求項８６】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求項
    ８３記載の方法。
  87. 【請求項８７】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請求
    項８３記載の方法。
  88. 【請求項８８】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求項
    ８３記載の方法。
  89. 【請求項８９】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項８８記載の方法。
  90. 【請求項９０】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項８９記載の方法。
  91. 【請求項９１】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求項
    ８３載の方法。
  92. 【請求項９２】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請求
    項９１記載の方法。
  93. 【請求項９３】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出され
    た後に蛍光標識される請求項９２記載の方法。
  94. 【請求項９４】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’−
    末端領域におけるその塩基が上記核酸標的の塩基に全体的に相補的であるハイブ
    リダイズされた核酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性の
    ポリメラーゼである請求項８３記載の方法。
  95. 【請求項９５】 上記第１の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌク
    レオチドの量が上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子
    ヌクレオチドの量より実質的に少なく、上記第１の対立遺伝子の遺伝子座におけ
    る異型接合性の損失を示している請求項９４記載の方法。
  96. 【請求項９６】 上記第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌク
    レオチドの量が上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子
    ヌクレオチドの量より実質的に少なく、上記第２の対立遺伝子の遺伝子座におけ
    る異型接合性の損失を示している請求項９４記載の方法。
  97. 【請求項９７】 対立遺伝子のトリソミーの存在を測定するための方法であ
    って、下記工程： （Ａ）複数の個別の処理された試料を提供すること、ただし、各々の処理された
    試料は（ｂ）核酸プローブとハイブリダイズされた（ａ）核酸標的配列を含有し
    、上記核酸標的配列は上記核酸標的の第１の対立遺伝子、第２の対立遺伝子、ま
    たは第１の対立遺伝子および第２の対立遺伝子の混合物のものであり、該対立遺
    伝子は調査位置における配列が異なり、上記核酸プローブは上記プローブと標的
    がハイブリダイズされる場合に上記調査ヌクレオチド位置を含む上記核酸標的配
    列の領域にハイブリダイズする３’−末端領域および識別子ヌクレオチドを含ん
    でいるものとすること； （Ｂ）各々の処理された試料をハイブリダイズされた核酸プローブ−の３’−末
    端からヌクレオチド１つ以上を放出する活性を有する酵素の脱重合量と混合して
    処理された反応混合物を形成すること； （Ｃ）ハイブリダイズされた核酸プローブを脱重合してそれより識別子ヌクレオ
    チドを放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持すること；およ
    び、 （Ｄ）放出された識別子ヌクレオチドに関して試料を分析して、核酸標的配列中
    にトリソミーが存在するかどうかを示す対照試料の分析出力に対する相対的な量
    の上記分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  98. 【請求項９８】 約１：１である既知の異型接合対照群の上記第１および第
    ２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量の比と比較して
    、上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチド
    の量の比が約３対０であり、上記第１の対立遺伝子の遺伝子座におけるトリソミ
    ーを示している請求項９７記載の方法。
  99. 【請求項９９】 約１：１である既知の異型接合対照群の上記第１および第
    ２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量の比と比較して
    、上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチド
    の量の比が約０対３であり、上記第２の対立遺伝子の遺伝子座におけるトリソミ
    ーを示している請求項９７記載の方法。
  100. 【請求項１００】 約１：１である既知の異型接合対照群の上記第１および
    第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量の比と比較し
    て、上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチ
    ドの量の比が約２対１であり、上記第１の対立遺伝子の遺伝子座の２コピーおよ
    び上記第２の対立遺伝子の遺伝子座の１コピーを有するトリソミーを示す請求項
    ９７記載の方法。
  101. 【請求項１０１】 約１：１である既知の異型接合対照群の上記第１および
    第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチドの量の比と比較し
    て、上記第１および第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌクレオチ
    ドの量の比が約１対２であり、上記第１の対立遺伝子の遺伝子座の１コピーおよ
    び上記第２の対立遺伝子の遺伝子座の２コピーを有するトリソミーを示す請求項
    ９７記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求
    項９７記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請
    求項９７記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求
    項９７記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請
    求項１０４記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出さ
    れた後に蛍光標識される請求項１０５記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求
    項９７記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請
    求項１０７記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出さ
    れた後に蛍光標識される請求項１０８記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 ヌクレオチドを放出する活性を有する上記酵素が、３’
    −末端領域におけるその塩基が上記核酸標的の塩基に全体的に相補的であるハイ
    ブリダイズされた核酸をピロホスフェートイオン存在下に脱重合する鋳型依存性
    のポリメラーゼである請求項９７記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 上記第１の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌ
    クレオチドの量が同型接合性の対照群の上記上記放出された識別子ヌクレオチド
    の量より実質的に多く、上記核酸標的配列がトリソミーを有することを示してい
    る請求項９７記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 上記第２の対立遺伝子に対する上記放出された識別子ヌ
    クレオチドの量が同型接合性の対照群の上記上記放出された識別子ヌクレオチド
    の量より実質的に多く、上記核酸標的配列がトリソミーを有することを示してい
    る請求項９７記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または非
    存在を測定するためのキットであって、下記要素： （Ａ）ハイブリダイズされた核酸プローブの３’末端からヌクレオチド１つ以上
    を放出する活性を有する酵素；および、 （Ｂ）上記内因性核酸標的配列に相補的な核酸プローブ少なくとも１つ； を包含する上記キット。
  114. 【請求項１１４】 核酸試料中の内因性の所定の核酸標的配列少なくとも１
    つの存在または非存在を測定するためのキットであって、下記要素： （Ａ）ハイブリダイズされた核酸プローブからヌクレオシドトリホスフェートと
    して識別対ヌクレオチドを放出するピロホスフェート存在下の活性を有する酵素
    ； （Ｂ）アデノシン５’ジホスフェート； （Ｃ）ピロホスフェート； （Ｄ）ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ；および、 （Ｅ）上記所定の内因性核酸標的配列に相補的な核酸プローブ少なくとも１つ； を包含する上記キット。
  115. 【請求項１１５】 核酸試料中の所定の内因性核酸標的配列の存在または非
    存在を測定するためのキットであって、下記要素： （Ａ）ハイブリダイズされた核酸プローブの３’末端からヌクレオチド１つ以上
    を放出する活性を有する酵素；および、 （Ｂ）取り扱い説明書； を包含する上記キット。
  116. 【請求項１１６】 核酸試料中の調査位置を含む核酸標的配列の存在または
    非存在を測定するための方法であって、下記工程： （Ａ）以下の３区分、即ち（ｉ）標的配列の上記調査位置の下流約１〜約３０核
    酸から始まる位置の核酸標的配列と相補的なプローブ３’−末端の約１０〜約３
    ０ヌクレオチドを含む第１の区分、（ｉｉ）約１０〜２００核酸の長さであり上
    記核酸標的配列と同一の配列を有する５’−末端領域、および（ｉｉｉ）上記核
    酸試料に相補的ではない０〜約５０核酸を含む任意の第３の区分、よりなる核酸
    プローブとハイブリダイズされた上記核酸標的配列を含む核酸試料を含有する処
    理された試料を提供すること； （Ｂ）３’方向に上記核酸プローブを伸長して第２のハイブリッドとして核酸試
    料にハイブリダイズされた第２のプローブを形成すること； （Ｄ）上記第２のハイブリッドを変性して上記核酸標的配列から上記第２のプロ
    ーブを分離すること； （Ｅ）上記水性組成物を復元して上記第２のプローブからヘアピン構造を形成す
    ること； （Ｆ）ヘアピン構造含有組成物を、核酸ハイブリッドの３’−末端からヌクレオ
    チド１つ以上を放出させる活性を有する酵素の脱重合量と混合し、処理された反
    応混合物を形成すること； （Ｇ）酵素がハイブリダイズされた核酸を脱重合してその３’−末端よりヌクレ
    オチド１つ以上を放出できるのに十分な時間、処理された反応混合物を維持する
    こと；および、 （Ｈ）放出された識別子ヌクレオチドの存在を分析して、上記核酸標的配列の存
    在または非存在を示す分析出力を得ること； を包含する上記方法。
  117. 【請求項１１７】 核酸試料中の核酸標的配列または標的配列内の特定の塩
    基の存在または非存在を測定するための方法であって、下記工程： （Ａ）第１のハイブリッドとしての第１の核酸プローブとハイブリダイズした核
    酸標的配列を含むと思われる核酸試料を含有する処理された試料を提供すること
    、ただし、上記第１のプローブは少なくとも２つの区分よりなるものであり、第
    １の区分は標的調査位置の下流約５〜約３０ヌクレオチドから始まる位置に標的
    核酸配列に相補的なプローブ３’−末端約１０〜約３０ヌクレオチドを含み、第
    １のプローブの第２の区分はプローブの上記第１の区分にハイブリダイズしない
    調査位置から調査位置の約１０〜約３０ヌクレオチド下流までの標的配列の反復
    である約５〜約３０ヌクレオチドを含んでおり、そして、プローブの任意の第３
    の区分は長さが０〜約５０ヌクレオチドでありプローブの第１および第２の区分
    の何れともハイブリダイズしない配列から成るプローブの第１および第２の区分
    の間に位置することとすること； （Ｂ）処理された試料中の第１のハイブリッドを第１のプローブの３’−末端に
    おいて伸長することにより、調査位置を超えて第１のプローブを伸長し、そして
    調査位置を含む伸長された第１のハイブリッドを形成すること； （Ｃ）伸長された第１のハイブリッドの水性組成物を変性して２個の核酸鎖を分
    離し、分離された標的核酸および分離された伸長された第１のプローブを含む水
    性組成物を形成すること； （Ｄ）伸長された第１のプローブをアニーリングすることにより長さ約１０〜約
    ３０ヌクレオチドであり伸長された第１のプローブ中の調査位置の下流約５〜約
    ２０００ヌクレオチドから始まる位置の伸長された第１のプローブに相補的な第
    ２のプローブとし、これにより第２のハイブリッドを形成すること； （Ｅ）第２のプローブの３’−末端における第２のハイブリッドを伸長された第
    １のプローブの５’−末端に到達するまで伸長し、これにより３’−領域が識別
    子ヌクレオチドを含む第２の伸長されたプローブを含む第２の伸長されたハイブ
    リッドを形成すること； （Ｆ）伸長された第２のハイブリッドの水性組成物を変性して２つの核酸鎖を分
    離し、分離され伸長された第１および第２のプローブを含む水性組成物を形成す
    ること；（Ｇ）水性組成物を冷却して分離され伸長された第２のプローブからヘ
    アピン構造を形成してヘアピン構造含有組成物を形成すること； （Ｈ）ヘアピン構造含有組成物を、核酸ハイブリッドの３’−末端からヌクレオ
    チド１つ以上を放出させる活性を有する酵素の脱重合量と混合し、処理された反
    応混合物を形成すること； （Ｉ）３’−末端領域識別子ヌクレオチドを放出するのに十分な時間反応混合物
    を維持すること；および、 （Ｊ）放出された識別子ヌクレオチドの存在を分析して、上記所定の核酸標的配
    列または標的配列内の特定の塩基の存在または非存在を示す分析出力を得ること
    ； を包含する上記方法。
  118. 【請求項１１８】 上記分析出力が発光スペクトル測定により得られる請求
    項１１７記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 上記分析出力が蛍光スペクトル測定により得られる請求
    項１１７記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請
    求項１１９記載の方法。
  121. 【請求項１２１】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出さ
    れた後に蛍光標識される請求項１２０記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 上記分析出力が質量スペクトル測定により得られる請求
    項１１７記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 上記放出された識別子ヌクレオチドが蛍光標識を含む請
    求項１２２記載の方法。
  124. 【請求項１２４】 上記識別子ヌクレオチドが上記ハイブリッドから放出さ
    れた後に蛍光標識される請求項１２２記載の方法。
  125. 【請求項１２５】 上記分析出力が吸光度スペクトル測定により得られる請
    求項１１７記載の方法。
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