CN105823766B - 一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法和应用，目的在于提供一种可以对分子印迹反应过程进行实时定量荧光监控的方法、并用于制备高选择性的分子印迹聚合物(MIP)。该方法不仅可以通过荧光信号的变化直接观测到分子印迹反应的进行过程，而且能够根据荧光曲线确定印迹反应的最佳终点，从而实现分子印迹过程的定量化。

Description

一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法和应用
技术领域
本发明属于材料制备技术领域，涉及一种可以通过在线实时荧光监测从而定量制备高选择性分子印迹聚合物的方法，以及将其应用于印迹各种目标分子。
背景技术
分子印迹是一种通过人工合成获得具有类似天然抗体和受体分子选择性和亲和力的聚合物材料的方法。与蛋白等生物识别分子相比，分子印迹聚合物有制备简单、成本低廉、稳定性好、可重复使用、可用于多种目标物、易于修饰等优点。目前分子印迹聚合物在分离、传感、催化等诸多领域都得到了广泛应用，但在制备方法上尚缺乏定量的指导依据，大部分工作都是基于经验进行简单的条件优化，对于印迹的化学计量点难以掌控。
叶磊教授研究组曾采用核磁共振(NMR)和动态光散射(DLS)等手段研究了沉淀聚合体系在不同反应时间得到的分子印迹聚合物对模板分子识别性能的变化(Long,Y.；Philip,J.Y.；Schillen,K.；Liu,F.；Ye,L.Insight into molecular imprinting inprecipitation polymerization systems using solution NMR and dynamic lightscattering.Journal of Molecular Recognition,2011,24,619-630)。除此之外，其它研究小组先后采用荧光各向异性和荧光光谱(Chen,Y.C.；Wang,Z.；Yan,M.；Prahl,S.A.Fluorescence anisotropy studies of molecularly imprintedpolymers.Luminescence:The Journal of Biological and Chemical Luminescence2006,21,7-14；Wandelt,B.；Mielniczak,A.；Cywinski,P.Monitoring of cAMP-imprintedpolymer by fluorescence spectroscopy.Biosens Bioelectron 2004,20,1031-1039)、拉曼光谱(Uibel,R.H.；Harris,J.M.Templating of multiple ligand metal ioncomplexation sites in 8-hydroxyquinoline-modified silica sol-gel materialsinvestigated by in situ Raman spectroscopy.Anal Chem 2005,77,991-1000.)、红外光谱(Osmani,Q.；Hughes,H.；Flavin,K.；Hedin-Dahlstrom,J.；Allender,C.J.；Frisby,J.；McLoughlin,P.The use of FTIR and NMR spectroscopies to studyprepolymerisation interactions in nitrogen heterocycles.Analytical andbioanalytical chemistry 2008,391,1229-1236；Molinelli,A.；O'Mahony,J.；Nolan,K.；Smyth,M.R.；Jakusch,M.；Mizaikoff,B.Analyzing the mechanisms of selectivity inbiomimetic self-assemblies via IR and NMR spectroscopy of prepolymerizationsolutions and molecular dynamics simulations.Anal Chem 2005,77,5196-5204.)和圆二色(CD)光谱(Fireman-Shoresh,S.；Marx,S.；Avnir,D.Induction and detection ofchirality in doped sol？gel materials:NMR and circular dichroismstudies.Journal of Materials Chemistry 2007,17,536)等方法对分子印迹的机理进行了研究。但上述方法都只能对分子印迹的起始反应溶液和产物进行离线分析，未能实现原位、实时跟踪分子印迹的整个反应过程。
多巴胺(Dopamine，DA)自聚是一种非常温和的聚合反应，在室温、溶解氧以及碱性条件下，即可在多种表面快速发生(Lee,H.；Dellatore,S.M.；Miller,W.M.；Messersmith,P.B.Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.Science2007,318,426-430.)。聚多巴胺不仅能在所有的材料表面附着成膜，而且形成的薄膜表面含有大量的活性官能团，能够发生一系列反应，为进一步修饰改性提供了条件。目前多巴胺自聚反应已经被应用于多种蛋白质分子的印迹，如肌红蛋白(myoglobin)、辣根过氧化物酶(HRP)、溶菌酶(lysozyme)和人血清白蛋白(HSA)等(Zhou,W.H.；Lu,C.H.；Guo,X.C.；Chen,F.R.；Yang,H.H.；Wang,X.R.Mussel-inspired molecularly imprinted polymer coatingsuperparamagnetic nanoparticles for protein recognition.Journal of MaterialsChemistry 2010,20,880-883；Zhang,M.；Zhang,X.；He,X.；Chen,L.；Zhang,Y.A self-assembled polydopamine film on the surface of magnetic nanoparticles forspecific capture of protein.Nanoscale 2012,4,3141-3147；Nematollahzadeh,A.；Shojaei,A.；Abdekhodaie,M.J.；Sellergren,B.Molecularly imprinted polydopaminenano-layer on the pore surface of porous particles for protein capture inHPLC column.Journal of colloid and interface science 2013,404,117-126.)。
但是，上述工作都是在大体积(15-50mL)的反应溶液中进行印迹反应。由于只能在反应结束后才能对材料的吸附选择性和吸附容量进行表征，使得材料制备条件的优化工作量巨大，聚合反应的时间长达3-48小时，并且发现聚合反应时间过长确实会发生印迹因子不升反降的情况。
发明内容
针对以上问题，本发明提出一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法和应用，目的在于提供一种可以对分子印迹反应过程进行实时定量荧光监控的方法、并用于制备高选择性的分子印迹聚合物(MIP)。该方法不仅可以通过荧光信号的变化直接观测到分子印迹反应的进行过程，而且能够根据荧光曲线确定印迹反应的最佳终点，从而实现分子印迹过程的定量化。
根据申请人在研究过程中的发现，聚多巴胺可以高效猝灭异硫氰基荧光素标记蛋白(FITC-protein)和罗丹明B(RhB)的荧光，而单体多巴胺并无这一性质。据此，本发明设计在实时荧光PCR仪上进行分子印迹反应，利用多巴胺聚合条件简单、聚多巴胺可以猝灭荧光的特性，通过利用模板分子自身荧光或外加荧光指示剂的方法，实时跟踪监测聚合反应进行过程中溶液荧光强度的变化。该方法可以直观地看到模板分子进入聚多巴胺层并被猝灭的时间曲线，协助定量判断分子印迹聚合反应的最佳终点，从而提供一种便捷、实用的实时定量进行分子印迹、获得高特异性MIP的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，包括：
1)在反应管中依次加入含有表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒的缓冲液和带荧光指示的模板分子，混合均匀后加入多巴胺水溶液；
在实时荧光PCR仪上实时监测反应溶液荧光值的变化，当荧光值下降到接近平台时，终止反应。
进一步地，步骤1)中所述表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒包括SiO2纳米颗粒、金纳米颗粒、磁纳米颗粒等各种无机或有机固体颗粒材料；为了方便反应后与溶液分离，优选磁纳米颗粒；更优选Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒。
进一步地，步骤1)中，表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒的浓度不超过0.2mg/mL，优选0.1-0.2mg/mL；荧光模板分子浓度不超过0.1mM，优选10nM-10μM之间；多巴胺水溶液浓度应不超过0.1mg/mL，优选0.05-0.1mg/mL。
进一步地，步骤1)中所述带荧光指示的模板分子包括本身具有荧光性质的模板分子，通过共价标记荧光团的模板分子以及本身不具有荧光性质，外加了荧光指示剂的模板分子。
进一步地，步骤2)中，对于本身具有荧光性质的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用模板分子的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化；对于带有共价标记荧光团的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用所标记荧光团的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化；对于本身不具有荧光性质，外加了荧光指示剂的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用荧光指示剂的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化。
进一步地，本方法还包括：终止反应后分离出表面吸附有分子印迹聚合物的纳米颗粒，洗涤后干燥保存或进一步使用；其中磁纳米颗粒用磁场分离。
进一步地，为使荧光指示剂信号的变化更好地反映出模板分子进入聚合物的过程，应选用波长条件与实时荧光PCR仪匹配，且带电或亲疏水性质与模板分子相近或本身与模板分子之间具有一定相互作用的荧光分子作为荧光指示剂。
另外，虽然不加磁纳米颗粒的多巴胺溶液也可以发生自聚而引起荧光下降，但为了方便印迹聚合物的后续分离保存和应用，本发明在聚合反应中均加入磁纳米颗粒。同时，为了避免Fe3O4磁核表面对荧光模板分子或荧光指示剂有严重的非特异性吸附而导致与聚合反应无关的荧光猝灭，本发明对Fe3O4磁核进行了较厚的SiO2包覆处理。如附图1所示，获得的Fe3O4@SiO2粒径为105±5nm，其中SiO2层的厚度约为50nm。
本发明利用上述实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，根据反应溶液荧光曲线的变化最大化印迹因子和选择因子，制备高选择性的分子印迹聚合物。
本发明的有益效果为：
提供了一种可实时荧光监测分子印迹聚合反应过程的方法。根据荧光曲线的变化可实现高选择性分子印迹聚合物的制备，简化了分子印迹聚合物的制备过程。本发明的方法操作简单、可控性好，可为获得高选择性的MIP提供快速、高通量的条件优化平台，并为进一步深入研究分子印迹机理提供实用、可靠的研究手段。
附图说明
图1是制备多巴胺印迹MIP所用Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒的透射电镜图。
图2是初始浓度分别为10、5.0、2.0和1.0nM的DNase-FITC模板分子在37℃下、含0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中用0.1mg/mL多巴胺进行印迹的实时荧光变化曲线。图中虚线为各初始模板分子浓度条件下用式(1)进行非线性拟合的结果。
图3是DNase-FITC印迹曲线中t1/2(min)与对应起始模板分子浓度(nM)的线性相关曲线。
图4是不同印迹聚合反应时间DNase-FITC模板分子从溶液进入MIP的转化率及该条件下获得的MIP对DNase-FITC模板分子的选择性和印迹因子。
图5是初始浓度分别为10、20、40和50nM的RhB在37℃下、含0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中用0.1mg/mL多巴胺进行印迹的实时荧光变化曲线。
图6是不同起始浓度的RhB印迹曲线中t1/2(min)与浓度(nM)间的线性相关曲线。
图7是不同印迹聚合反应时间RhB从溶液进入MIP的转化率及该条件下获得的MIP对RhB的选择性和印迹因子。
图8是10nM的DNase I(或Exo III)与50nM的RhB混合后，在37℃下、含0.2mg/mLFe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中用0.1mg/mL多巴胺进行印迹的实时荧光变化曲线。
图9是DNase I+RhB双重印迹体系中不同反应时间RhB从溶液进入MIP的转化率及该条件下获得的MIP对DNase I的选择性和印迹因子。
图10是Exo III+RhB双重印迹体系中不同反应时间RhB从溶液进入MIP的转化率及该条件下获得的MIP对Exo III的选择性和印迹因子。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本领域的技术人员应当理解，实施例不应解释为对本发明的限制，在本发明的精神和实质范围内，可以做各种修改和变动，本发明的保护范围应视所附权利要求书而定。
实施例一、实时荧光监测荧光标记蛋白的分子印迹过程。
为了展示本方法对荧光模板分子的可行性，首先自行制备了脱氧核糖核酸酶I的异硫氰基荧光素标记物(DNase-FITC)。将30mg DNase I溶解在10mL PBS缓冲液中(0.1M，pH9.16)，向其中逐滴加入含有2mL 2.3mg/mL FITC的DMSO溶液。在室温下避光振摇4h。然后加入5mL Tris缓冲液(0.1M，pH＝8.0)终止反应。继续振摇0.5h，然后用0.45μm滤膜过滤，滤液用10kDa Millipore超滤管在4℃以及4500rpm下离心15min进行超滤。重复超滤6次保证未反应的FITC被完全洗去。通过以下公式计算DNase I的标记率：F/P＝3.1×A495/[A280-0.31×A495]。
其中A280和A495分别为超滤后溶液在280nm和495nm处的吸光度值。经过计算得到F/P为3.66，即相当于平均每个DNase I分子上标记了3.66个FITC，数目较为合适。将所得DNase I-FITC标记物定量至0.1μM用于下一步的印迹实验。
印迹反应在200μL八联管内进行，在含有0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，加入终浓度分别为10，5.0，2.0和1.0nM的DNase-FITC，室温下混合30min。然后加入终浓度为0.1mg/mL的DA水溶液(用新鲜去离子水配制，下同)，用10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)将体系的最终体积定容为200μL。将以上装有反应溶液的八联管置于实时荧光PCR仪(Stratagene Mx3000P,USA)内，设定温度为37℃，连续监测记录FITC对应通道(激发波长为492nm，发射波长为516nm)的荧光强度直至到达平台不再继续变化，得到用多巴胺印迹不同浓度DNase-FITC的荧光下降曲线，如图2所示。在相同条件下制备不加DNase-FITC的聚多巴胺NIP磁纳米颗粒作为参比。
由图2可见，随着印迹反应的不断进行，溶液的荧光强度随之逐渐下降。起始溶液中加入的模板分子量越少，曲线下降到达平台所需的时间越短。若用F0表示反应溶液的起始荧光强度，Fb表示曲线下降到平台后的荧光强度，Ft表示反应进行到t(min)时溶液的荧光强度，CRt表示t(min)时印迹反应的转化率(即溶液中的模板分子进入到聚多巴胺层的百分比)，则CRt＝(F0-Ft)/(F0-Fb)。当CRt＝0.5时，表明已有约50％的模板分子进入聚多巴胺层，此时对应的反应时间用t1/2(min)表示。将图2中各条曲线的t1/2(min)与对应起始模板分子的浓度c0(nM)作图，结果示于图3中。可见，二者之间存在非常好的线性关系，线性回归方程为：
t1/2(min)＝2.03c0(nM)+24.9(R2＝0.995)
进一步对图2中的数据进行拟合，可得CRt随时间的变化符合以下关系式(R2>0.999)
其中p为拟合得到的常数，p＝2.6±0.2。
为进一步了解不同反应时间获得的多巴胺印迹DNase-FITC的磁纳米颗粒的吸附特性，在含有0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，加入最终浓度为10nM的DNase-FITC进行印迹。分别在反应30min，60min，90min，120min，150min及180min时终止反应，分离出磁纳米印迹颗粒并用乙醇洗涤三次。
在含有40μg上述不同反应时间得到的磁纳米印迹颗粒的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，分别加入100ng的DNase I或外切酶III(Exo III，作为参考蛋白考察MIP的选择性)，吸附30min后，测量上清液中剩余酶的活性，计算被吸附的酶的量。
DNase I和Exo III的活性分别采用以下DNA荧光探针进行测定。
DNase I探针：5’-C*A*A*C*(dT-TAMRA)*ACATCACTCGGATG(dT-BHQ2)*A*G*T*T*G-3’
Exo III探针：5’-A*T*C*A*T*C*T*T*T*A*C*G*C*A*A*G*A*(dT-BHQ1)*G*A*T-FAM-3’
其中下划线斜体表示互补序列，加星号表示硫代修饰的碱基，TAMRA和FAM分别为羧基四甲基罗丹明和羧基荧光素标记，BHQ2和BHQ1分别为其对应的猝灭基团。
图4对比了不同反应时间得到的初始模板分子浓度为10nM的DNase-FITC印迹的MIP的转化率(CR)、印迹因子(IF)和选择性(Selectivity)测定结果。其中印迹因子(IF)为MIP与对应NIP对模板分子吸附容量的比值；选择因子(Selectivity)为MIP对模板分子与作为参照的非模板分子的吸附容量的比值。可见，从反应时间30min到120min，MIP的选择性和印迹因子均随着反应时间的增加而增大。到反应120min时，模板分子的转化率达到92.9％。而从120min到150min的反应过程中，模板分子的转化率仅仅增加了3％，印迹因子和选择性到达平台，甚至开始下降，说明这段反应时间内合成的主要为NIP，且其覆盖和阻碍了内部MIP的印迹位点对模板分子的结合。因此，为了得到印迹效果最好、选择性最高的MIP，最佳的印迹反应时间为120min。
实施例二、实时荧光监测小分子荧光染料罗丹明B(RhB)的分子印迹过程。
在含有0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，加入终浓度为10，20，40，50nM的RhB，室温下混合30min。加入终浓度为0.1mg/mL的DA水溶液(用新鲜去离子水配制)，体系的最终体积为200μL。反应在200μL八联管中进行，在实时荧光PCR仪上设定温度为37℃，监测RhB对应通道(激发波长为556nm，发射波长为580nm)的荧光值变化3h。荧光曲线如图5所示。对得到的RhB荧光下降曲线进行拟合，得到与式(1)相同的非线性相关方程(R2>0.999)，其中p＝2.7±0.2，t1/2与加入RhB的起始浓度成线性关系(图6)，t1/2(min)＝0.597c0(nM)+36.4(R2＝0.998)。
与印迹DNase-FITC的结果相对比，RhB模板分子增加所需增加的印迹反应时间小于DNase-FITC，表明PDA与RhB之间的相互作用相对较强。二者的p值非常接近，推测p值为聚多巴胺印迹体系印迹单一模板分子时的特征常数。计算可得当t＝0.74t1/2时，转化率随反应时间的增加达到极大值，即模板分子进入聚多巴胺层的速率最快。
在含有0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，加入终浓度为50nMRhB，室温下混合30min。加入终浓度为0.1mg/mL的DA水溶液(用新鲜去离子水配制)，体系的最终体积为200μL。反应在200μL八联管中进行，在实时荧光PCR仪上设定温度为37℃，监测RhB对应通道的荧光值变化，并且分别在反应30min，60min，90min，120min，150min及180min后终止反应，分离出得到的不同印迹时间的磁纳米颗粒并用乙醇洗涤三次。
在含有40μg上述不同反应时间得到的RhB印迹的磁纳米颗粒的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中分别加入8pmol的RhB或FAM(FAM作为RhB的类似物用于表征MIP产物的选择性)，体系的最终体积为200μL。吸附30min后，测量上清液的荧光，计算被吸附的荧光染料的量。
上述不同反应时间得到的RhB印迹的磁纳米颗粒的吸附实验结果如图7所示。在反应150min之内，MIP的选择性和印迹因子随着反应时间的增加而增大，反应的转化率达89.9％。之后，从150min到180min，转化率仅仅由89.9％增大到93.4％，且MIP的选择性和印迹因子不再继续提高，表明该印迹体系合适的反应时间为150min。
由以上实验结果可知，通过监测多巴胺印迹荧光模板分子过程中荧光值的变化，可以确定合适的终止聚合反应的时间。当CRt约为90％时，获得的印迹材料印迹因子和选择性最佳，计算可得对应的反应时间t＝2.3t1/2。由于t1/2与起始模板分子的浓度成线性关系，因此对于确定的起始模板分子的浓度，可以方便地估算出合适的印迹聚合反应时间。
实施例三、以罗丹明B为外加荧光指示剂，实时荧光监测多种蛋白的分子印迹过程。
在前面的方法中，对于不具有荧光性质的蛋白分子DNase I预先进行了共价荧光标记。虽然荧光标记的方法并不复杂，但还是增加了额外的步骤，并存在降低模板蛋白分子活性的风险。以下进一步提出一种免荧光标记的双重印迹方法，尝试在印迹无荧光标记的普通目标蛋白分子的反应溶液中，直接加入小分子荧光染料作为荧光指示剂进行印迹。其中目标蛋白的作用是作为印迹体系的模板分子，而小分子荧光染料的作用是在印迹的过程中产生荧光信号变化，指示印迹反应的进程。
在含有0.2mg/mL Fe3O4@SiO2的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中，同时加入终浓度为50nM的RhB与10nM的模板蛋白(DNase I或Exo III)，室温下混合30min。加入最终浓度为0.1mg/mL的DA水溶液，体系的最终体积为200μL。反应在200μL八联管中进行，在实时荧光PCR仪上设定温度为37℃，监测对应通道的荧光值变化，并且分别在反应30min，60min，90min，120min，150min及180min后终止反应，分离出得到的磁纳米颗粒并用乙醇洗涤三次。
实验得到了与前面类似的荧光下降曲线(图8)。对于10nM DNase I，p＝2.6±0.1，t1/2＝42.6min。对于10nM Exo III，p＝2.7±0.1，t1/2＝49.0min。对照实施例二中，单独50nM RhB的印迹体系，t1/2＝66.3min。可见同时含有RhB与模板蛋白的印迹反应溶液中，RhB与模板蛋白之间可能存在弱的相互作用，从而加速了RhB进入PDA层的过程，导致荧光下降速率加快。DNase I和Exo III的分子量相近，但是DNase I的等电点(pI＝4.9)低于Exo III(pI＝5.9)。在pH＝8.0的Tris缓冲液中，前者带有更多的负电荷，因此与带有正电荷的RhB具有更强的作用力，使得荧光下降速率更快，即t1/2值更低。为了验证这一规律，进一步印迹了其他几种常见的蛋白：脱氧核糖核酸酶I、牛血清蛋白、核酸外切酶III、胰蛋白酶、溶菌酶，在相同的起始模板分子浓度条件下，测得t1/2值如表1所列。
表1.50nM RhB分别与10nM以下各蛋白进行双重印迹对应的t1/2值
其中用DNase I印迹的MIP吸附Exo III或者Exo III印迹的MIP吸附DNase I来表征对应的MIP的选择性，用对应的NIP吸附的目标酶的结果作为参照来表征MIP的印迹因子，在含有40μg上述不同反应时间得到的双模板印迹磁纳米颗粒的10mM Tris缓冲液(pH＝8.0)中分别加入100ng的DNase I或Exo III，吸附30min后，测量剩余上清液中的对应酶的活性，从而计算被吸附的酶的量。
作为MIP的参比，制备了与其反应时间相同的NIP磁纳米颗粒，即聚合时没有加入模板蛋白分子和荧光染料制备的磁纳米颗粒。
结果如图9和图10所示。总体变化规律与实施例一和实施例二的结果非常相似，从反应时间30min到120min之间，MIP的选择性和印迹因子均随着反应时间的增加而增大。DNase I的MIP在反应时间接近120min时，MIP的选择性和印迹因子达到最大值，而Exo III的MIP在反应时间120min后也很快达到最大值。二者最佳印迹反应时间之间的差别与表1中二者t1/2之间的差别非常接近。
特别值得一提的是，对DNase I的MIP，免荧光标记的双重印迹方法得到的最佳反应时间与实施例一中共价荧光标记DNase I得到的结果基本一致，可见外加荧光指示剂的双重印迹方法可以替代共价荧光标记蛋白的印迹方法，从而成为一种简便、实用的实时荧光指示制备印迹因子和选择因子最大化的分子印迹聚合物的方法。

Claims (10)

1.一种实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，包括：
1)在反应管中依次加入含有表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒的缓冲液和带荧光指示的模板分子，混合均匀后加入多巴胺水溶液；
2)在实时荧光PCR仪上实时监测反应溶液荧光值的变化，当荧光值下降到接近平台时，终止反应。
2.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，步骤1)中所述表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒包括SiO2纳米颗粒、金纳米颗粒、磁纳米颗粒。
3.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，步骤1)中所述表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒为Fe3O4@SiO2磁纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，步骤1)中，表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒的浓度不超过0.2mg/mL，荧光模板分子浓度不超过0.1mM，多巴胺水溶液浓度应不超过0.1mg/mL。
5.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，步骤1)中所述带荧光指示的模板分子包括本身具有荧光性质的模板分子，通过共价标记荧光团的模板分子以及本身不具有荧光性质，外加了荧光指示剂的模板分子。
6.如权利要求5所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，步骤2)中，对于本身具有荧光性质的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用模板分子的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化；对于带有共价标记荧光团的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用所标记荧光团的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化；对于本身不具有荧光性质，外加了荧光指示剂的模板分子，在实时荧光PCR仪上采用荧光指示剂的激发、发射波长条件实时监测反应溶液荧光值的变化。
7.如权利要求5所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，选用波长条件与实时荧光PCR仪匹配，且带电或亲疏水性质与模板分子相近或本身与模板分子之间具有相互作用的荧光分子作为荧光指示剂。
8.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，还包括：终止反应后分离出表面吸附有分子印迹聚合物的纳米颗粒，洗涤后干燥保存或进一步使用。
9.如权利要求8所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，表面可生长聚多巴胺的纳米颗粒为磁纳米颗粒时，采用磁场分离出表面吸附有分子印迹聚合物的磁纳米颗粒。
10.如权利要求1所述的实时定量荧光监测分子印迹过程的方法，其特征在于，还包括：根据反应溶液荧光曲线的变化最大化印迹因子和选择因子，制备高选择性分子印迹聚合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107271410B (zh) * 2017-05-17 2020-04-14 武汉汉瑞隆德检测技术有限公司 细菌或真菌的活性快速检测方法
CN108226341B (zh) * 2018-01-02 2020-11-03 上海谱实生态环境科技有限公司 农产品中农药残留的精确检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102034584A (zh) * 2010-10-28 2011-04-27 天津大学 磁性聚多巴胺-氧化铁纳米粒子及制备方法
CN103884838A (zh) * 2014-03-31 2014-06-25 南京大学 聚多巴胺纳米球生物传感器
CN103887030A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 华东理工大学 一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用
CN103961705A (zh) * 2014-05-16 2014-08-06 福州大学 叶酸修饰的中空硫化铜/聚多巴胺复合物的制备及其应用
CN104293917A (zh) * 2013-06-17 2015-01-21 北京大学 用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针
CN105384872A (zh) * 2015-12-15 2016-03-09 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 一种青霉素g钠表面分子印迹聚合物的制备方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102034584A (zh) * 2010-10-28 2011-04-27 天津大学 磁性聚多巴胺-氧化铁纳米粒子及制备方法
CN104293917A (zh) * 2013-06-17 2015-01-21 北京大学 用于具有3’-5’外切活性的核酸酶检测的硫代探针
CN103884838A (zh) * 2014-03-31 2014-06-25 南京大学 聚多巴胺纳米球生物传感器
CN103887030A (zh) * 2014-04-04 2014-06-25 华东理工大学 一种用于纯化并固定化组氨酸标签蛋白的磁性亲和纳米颗粒及其制备方法和应用
CN103961705A (zh) * 2014-05-16 2014-08-06 福州大学 叶酸修饰的中空硫化铜/聚多巴胺复合物的制备及其应用
CN105384872A (zh) * 2015-12-15 2016-03-09 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 一种青霉素g钠表面分子印迹聚合物的制备方法及其应用

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