CN103884838A - 聚多巴胺纳米球生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其以直径为40～400nm的聚多巴胺纳米球为载体，聚多巴胺纳米球的表面吸附标记有荧光分子的寡核苷酸。本发明还公开了上述的传感器在荧光检测DNA和凝血酶中的应用。本发明提供的聚多巴胺纳米球生物传感器以聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有荧光分子的寡核苷酸，利用聚多巴胺纳米球优异的荧光猝灭特性从而有效的降低背景信号可提高检测的灵敏度，只需通过普通的荧光分光光度计就可以实现信号的采集，再通过变化表面吸附的寡核苷酸，从而大大的扩宽了其检测样品范围。

Description

聚多巴胺纳米球生物传感器
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种聚多巴胺纳米球生物传感器，还涉及该传感器在检测DNA和凝血酶中的应用。
背景技术
聚多巴胺是一种在人体中普遍存在的真黑素类高分子物质，具有良好的生物相容性和可生物降解的特点。聚多巴胺可以比较容易的通过碱性条件下多巴胺的自聚合得到。聚多巴胺具有优异的荧光猝灭特性，可以有效的猝灭很宽的波谱范围内的荧光分子的荧光。同时聚多巴胺对寡核苷酸的不同构象具有不同的作用力，能区分寡核苷酸的不同的构象。基于此原理，我们构建了吸附寡核苷酸的聚多巴胺纳米球生物传感器，通过表面吸附的寡核苷酸的对DNA和凝血酶的特异性识别作用，引起的寡核苷酸构象的变化带来的荧光强度的变化，特异性的荧光检测DNA和凝血酶。
发明内容
技术问题：本发明最后要解决的技术问题，是提供上述生物传感器在检测DNA和凝血酶中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其以直径为40～400nm的聚多巴胺纳米球为载体，聚多巴胺纳米球的表面吸附标记有荧光分子的寡核苷酸。
作为优选，所述聚多巴胺纳米球的直径为300～400nm。
作为另一种优选，所述荧光分子为羧基荧光素（FAM）。
作为另一种优选，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明还提供了上述聚多巴胺纳米球生物传感器的构建方法，包括如下步骤：
（1）盐酸多巴胺在碱性溶液中15～80℃反应2～72h，得聚多巴胺悬浮液；
（2）步骤（1）制得的悬浮液在5000～20000rpm条件下离心10～30min，去除上清，沉淀加入高纯水重悬；重复2～4次，沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为0.05～1mg/mL聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为10～100nmol/L的标记有荧光分子的寡核苷酸的Tris-HCl缓冲溶液按（1～9）：（1～9）的体积混合，振荡反应10～60min，即得。
其中，步骤（1）中，所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的水与醇的混合溶液，其pH为7.5～11，盐酸多巴胺与碱性溶液的重量体积比为0.1～5.0mg：1mL；或者所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的Tris的水溶液与醇的混合溶液，其pH为7.5～10.5，Tris的水溶液浓度为5～25mmol/L；或者所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的Tris的水溶液与异丙醇的混合溶液，其pH为7.5～10.5，Tris的水溶液浓度为5～25mmol/L。
其中，步骤（2）中，标记有荧光分子的寡核苷酸为羧基荧光素（FAM）标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明还提供了上述聚多巴胺纳米球生物传感器在检测DNA中的应用。
所述应用，具体为：利用聚多巴胺纳米球生物传感器检测DNA含量，包括以下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：用缓冲溶液配制不同浓度的DNA标准样品溶液，将DNA标准样品溶液和聚多巴胺纳米球生物传感器溶液等体积混合，37℃下振荡反应30～120min；其中，DNA标准样品的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470～495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度。
本发明还提供了上述聚多巴胺纳米球生物传感器在检测凝血酶中的应用。
所述应用，具体为：利用聚多巴胺纳米球生物传感器检测凝血酶含量，包括以下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：用缓冲溶液配制不同浓度的凝血酶溶液，将凝血酶溶液和聚多巴胺纳米球生物传感器溶液等体积混合，37℃下振荡反应30～120min；荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470～495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度。
有益结果：本发明提供的聚多巴胺纳米球生物传感器以聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有荧光分子的寡核苷酸，利用聚多巴胺纳米球优异的荧光猝灭特性从而有效的降低背景信号可提高检测的灵敏度，只需通过普通的荧光分光光度计就可以实现信号的采集，再通过变化表面吸附的寡核苷酸，从而大大的扩宽了其检测样品范围。该传感器的普适性和实用性为生物分子的特异性检测提供了一种极好的方法。
本发明利用DNA的特异性的识别作用，实现对DNA的高灵敏检测，检测DNA的线性范围为0.78-25nmol/L，特异性好，可以区分单碱基错配。
同时利用适配体的特异性的识别作用，实现对凝血酶的高灵敏检测，检测凝血酶的线性范围为0.78-37.5nmol/L，特异性好，可以避免牛血清白蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG和溶解酵素Lysozyme的干扰。
本发明提供的生物传感器的构建及应用方便快捷，在提高检测灵敏度的同时，能够简化检测过程，缩短检测时间。
附图说明
图1聚多巴胺纳米球的扫描电子显微镜图。
图2聚多巴胺纳米球的红外谱图。
图3聚多巴胺纳米球的拉曼谱图。
图4检测DNA浓度的荧光发射谱图（A）及信号相关性曲线（B）。
图5检测DNA的特异性图。
图6检测凝血酶浓度的荧光发射谱图（A）及信号相关性曲线（B）。
图7检测凝血酶的特异性图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：生物传感器的构建。
以直径为300～400nm的聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有羧基荧光素的寡核苷酸，其中标记有荧光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，构建聚多巴胺纳米球生物传感器，包括以下步骤：
（1）将体积比为5:2的10mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调混合溶液pH至10.3，混合溶液中加入盐酸多巴胺，盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为1mg：1mL，室温搅拌反应72h；
（2）步骤（1）得到的悬浮液，在10000rpm条件下，离心10min，去除上清，取沉淀加入高纯水重悬，重复离心与重悬的步骤3次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为0.2mg/mL的聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为40nmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制的标记有荧光分子的寡核苷酸溶液按5：5的体积混合，振荡10min即得。
实施例2：生物传感器的构建。
以直径为300～400nm的聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有羧基荧光素的寡核苷酸，其中标记有荧光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，构建聚多巴胺纳米球生物传感器，包括以下步骤：
（1）将体积比为5:2的10mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调混合溶液pH至10.3，混合溶液中加入盐酸多巴胺，盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为1mg：1mL，室温搅拌反应72h；
（2）步骤（1）得到的悬浮液，在10000rpm条件下，离心10min，去除上清，取沉淀加入高纯水重悬，重复离心与重悬的步骤3次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为0.5mg/mL的聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为60nmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制的标记有荧光分子的寡核苷酸溶液按5：5的体积混合，振荡10min即得，其寡核苷酸序列为：5’-FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
实施例3：生物传感器的构建。
以直径为300～400nm的聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有羧基荧光素的寡核苷酸，其中标记有荧光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，构建聚多巴胺纳米球生物传感器，包括以下步骤：
（1）将体积比为1:9的5mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调混合溶液pH至7.5，混合溶液中加入盐酸多巴胺，盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为0.1mg：1mL，15℃反应36h；
（2）步骤（1）得到的悬浮液，在5000rpm条件下，离心30min，去除上清，取沉淀加入高纯水重悬，重复离心与重悬的步骤4次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为0.05mg/mL的聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为10nmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制的标记有荧光分子的寡核苷酸溶液按9：1的体积混合，振荡30min即得，其寡核苷酸序列为：5’-FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
实施例4：生物传感器的构建。
以直径为300～400nm的聚多巴胺纳米球为载体吸附标记有羧基荧光素的寡核苷酸，其中标记有荧光分子的寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，构建聚多巴胺纳米球生物传感器，包括以下步骤：
（1）将体积比为9:1的25mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调混合溶液pH至10.5，混合溶液中加入盐酸多巴胺，盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为5.0mg：1mL，80℃反应2h；
（2）步骤（1）得到的悬浮液，在20000rpm条件下，离心20min，去除上清，取沉淀加入高纯水重悬，重复离心与重悬的步骤2次，最后得到的沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为1mg/mL的聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为100nmol/L的Tris-HCl缓冲溶液配制的标记有荧光分子的寡核苷酸溶液按1：9的体积混合，振荡60min即得，其寡核苷酸序列为：5’-FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3’。
实施例5
与实施例3基本相同，不同之处仅在于：步骤（1）中，采用体积比为1:9的水与异丙醇混合代替体积比为1:9的5mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调pH至7.5，盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为0.1mg：1mL。
实施例6
与实施例4基本相同，不同之处仅在于：步骤（1）中，采用体积比为9:1的水与异丙醇混合代替体积比为9:1的25mmol/L的Tris溶液与异丙醇混合，调pH至11盐酸多巴胺与混合溶液的重量体积比为5.0mg：1mL。
实施例7
利用实施例1制得的生物传感器检测DNA含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的DNA标准样品溶液与所述的聚多巴胺纳米球生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应60min，DNA标准样品的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度，结果见图4。
实施例8
利用实施例2制得的生物传感器检测DNA特异性，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的对照DNA样品溶液与所述的聚多巴胺纳米球生物传感器器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应120min，对照DNA样品的核苷酸序列如SEQ ID No：3、SEQ IDNo：4、SEQ ID No：5所示。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，
荧光的激发波长为470纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度，结果见图5。
实施例9
利用实施例3制得的生物传感器检测DNA含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含50mmol/L氯化钠，0.5mmol/L氯化钾，0.2mmol/L氯化镁和0.2mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的DNA标准样品溶液与所述的聚多巴胺纳米球生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应30min，DNA标准样品的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度。
实施例10
利用实施例5制得的生物传感器检测DNA含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含200mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的DNA标准样品溶液与所述的聚多巴胺纳米球生物传感器器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应120min，DNA标准样品的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为450纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度。
实施例11
利用实施例4制得的生物传感器检测凝血酶含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的凝血酶溶液与所述的生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应60min。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度，结果见图6。
实施例12
利用实施6制得的生物传感器检测凝血酶特异性，包括如下步骤：
（1）配制溶液：缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含140mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；。
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的对照样品溶液与所述的生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应60min，对照样品分别为：牛血清白蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG、溶解酵素Lysozyme。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度，结果见图7。
实施例13
利用实施例1制得的生物传感器检测凝血酶含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含50mmol/L氯化钠，0.5mmol/L氯化钾，0.2mmol/L氯化镁和1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的凝血酶溶液与所述的生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应30min。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为480纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度。
实施例14
利用实施例6制得的生物传感器检测凝血酶含量，包括如下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含200mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化钾，1mmol/L氯化镁和0.2mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：将用缓冲溶液配制的不同浓度的凝血酶溶液与所述的生物传感器的溶液等体积混合，体积分别为200μL，37℃下振荡反应120min。荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度。
Figure IDA0000485076970000011
Figure IDA0000485076970000021

Claims (10)

1.一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其特征在于：以直径为40～400nm的聚多巴胺纳米球为载体，聚多巴胺纳米球的表面吸附标记有荧光分子的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其特征在于：所述聚多巴胺纳米球的直径为300～400nm。
3.根据权利要求1所述的一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其特征在于：所述荧光分子为羧基荧光素。
4.根据权利要求1所述的一种聚多巴胺纳米球生物传感器，其特征在于：所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
5.权利要求1-4任一项所述的聚多巴胺纳米球生物传感器的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）盐酸多巴胺在碱性溶液中15～80℃反应2～72h，得聚多巴胺悬浮液；
（2）步骤（1）制得的悬浮液在5000～20000rpm条件下离心10～30min，去除上清，沉淀加入高纯水重悬；重复2～4次，沉淀烘干，得聚多巴胺纳米球；
（3）将浓度为0.05～1mg/mL聚多巴胺纳米球的水溶液和浓度为10～100nmol/L的标记有荧光分子的寡核苷酸的Tris-HCl缓冲溶液按（1～9）：（1～9）的体积混合，振荡反应10～60min，即得。
6.根据权利要求5所述的生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的水与醇的混合溶液，其pH为7.5～11，盐酸多巴胺与碱性溶液的重量体积比为0.1～5.0mg：1mL；或者所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的Tris的水溶液与醇的混合溶液，其pH为7.5～10.5，Tris的水溶液浓度为5～25mmol/L；优选地，所述碱性溶液为体积比为（1～9）：（1～9）的Tris的水溶液与异丙醇的混合溶液，其pH为7.5～10.5，Tris的水溶液浓度为5～25mmol/L；步骤（2）中，标记有荧光分子的寡核苷酸为羧基荧光素（FAM）标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
7.权利要求1-4任一项所述的聚多巴胺纳米球生物传感器在检测DNA中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：利用聚多巴胺纳米球生物传感器检测DNA含量，包括以下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含50～200mmol/L氯化钠，0.5～5mmol/L氯化钾，0.2～1mmol/L氯化镁和0.2～1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：用缓冲溶液配制不同浓度的DNA标准样品溶液，将DNA标准样品溶液和聚多巴胺纳米球生物传感器溶液等体积混合，37℃下振荡反应30～120min；其中，DNA标准样品的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470～495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的DNA标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测DNA样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测DNA样品中DNA的浓度。
9.权利要求1-4任一项所述的聚多巴胺纳米球生物传感器在检测凝血酶中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：利用聚多巴胺纳米球生物传感器检测凝血酶含量，包括以下步骤：
（1）缓冲溶液配制：配制20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，其pH为7.4，含50～200mmol/L氯化钠，0.5～5mmol/L氯化钾，0.2～1mmol/L氯化镁和0.2～1mmol/L氯化钙；
（2）标准曲线绘制：用缓冲溶液配制不同浓度的凝血酶溶液，将凝血酶溶液和聚多巴胺纳米球生物传感器溶液等体积混合，37℃下振荡反应30～120min；荧光分光光度法分别测定各溶液的荧光发射图谱，荧光的激发波长为470～495纳米，发射图谱的波长范围为500-650纳米，根据不同浓度的凝血酶标准样品溶液对应的发射峰的强度值，得标准曲线；
（3）含量测定：采用与步骤（2）相同的方法，测定待测凝血酶样品发射峰的强度值，由标准曲线计算得待测凝血酶样品中凝血酶的浓度。
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