CN105136754B - 检测多巴胺的荧光适体传感器及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光适体传感器检测多巴胺的方法，它的步骤如下：（1）构建荧光适体传感器：首先利用tris‑HCl缓冲液离心溶解粉末状荧光适体，然后用tris‑HCl缓冲液配制出含10nM荧光适体，10μg/ml氧化石墨烯的淬灭溶液；（2）荧光强度的检测：把不同浓度的多巴胺加入到淬灭溶液中，然后在室温条件下孵育25分钟，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出多巴胺的发射谱线。本发明利用氧化石墨烯作为荧光淬灭剂，利用π‑π堆积作用使在5’端修饰有FAM荧光基团的适体结合在氧化石墨烯表面，通过能量转移FAM荧光能量传导到氧化石墨烯中，从而FAM荧光信号消失。
Description
技术领域
本发明是利用氧化石墨烯作为淬灭剂，基于荧光适体传感器原理检测多巴胺的方法。涉及标记FAM适体的淬灭，荧光分光光度计检测加入不同浓度多巴胺溶液中的荧光强度。
背景技术
多巴胺（Dopamine，DA）是一种分子量为189Da的小分子有机物，同时也是一种重要的儿茶酚胺类神经递质。多巴胺参与奖赏、运动、情绪等多种大脑生理功能的主要调节。大脑内的多巴胺神经元突触末梢在接受到刺激信号后，神经细胞产生并释放多巴胺，从而使神经元细胞周围的多巴胺浓度增加。兴奋突触后或前的多巴胺受体后，引发下游相关的靶细胞及全身的反应，同时刺激所产生的多巴胺绝大部分在几毫秒内被代谢掉。生物体内多巴胺正常浓度通常在1nM到100nM之间，而这却对人体的新陈代谢、心血管、中枢神经、肾功能、内分泌系统等方面的调控具有不可替代的作用。于此同时多巴胺具有兴奋心脏、增加肾血流量、治疗缺血性及感染性休克等功能。DA含量在生物体内失衡时可以引起注意力缺陷多动症、亨廷顿病、精神分裂症、帕金森氏症、老年痴呆症等方面的疾病。常用的检测多巴胺的方法包括分光光度法、化学发光法、液相色谱法、毛细管法、电化学方法等。
以上检测多巴胺方法需要一定的操作过程如复杂的多巴胺检测样品前处理，同时需较长时间检测分析多巴胺样品，而且存在所用检测的实验仪器设备比较复杂昂贵等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是多巴胺检测样品前处理复杂，提供一种快速灵敏检测多巴胺的方法，该方法构建了一种荧光适体光学生物传感器。
本发明的技术方案是：一种检测多巴胺的荧光适体传感器：
（1）FAM标记适体荧光淬灭：首先利用tris-Hcl缓冲液离心溶解粉末状荧光适体，然后用tris-Hcl缓冲液配制出含10nM荧光适体，氧化石墨烯的淬灭溶液；
（2）荧光强度的检测：把不同浓度的多巴胺加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的多巴胺的荧光强度。
根据不同浓度的多巴胺的荧光强度，拟合出公式y=36.66+0.1474x，其中y为多巴胺的荧光强度，x为多巴胺的的浓度。
所述步骤（1）中氧化石墨烯的浓度为2-14μg/ml，优选10μg/ml。
所述步骤（1）中缓冲液pH 7.4、缓冲液组成为50mM tris-Hcl和30mM Nacl，荧光适体结构为5’-FAM-GTCTCTGTGTGCGCCAGAGAACACTGGGGCAGATATGGGCCAG
CACAGAATGAGGCCC，由生物公司合成并分装，使用前加入缓冲液离心溶解，离心速度为3000rpm，时间5min。
所述步骤（2）中在室温条件下孵育10-60 min。
所述荧光分光光度计激发发射波长为480nm，入射发射狭缝为10.0nm，发射谱检测范围为510-600nm。
所述多巴胺的浓度为1-500μM,。
所述的检测多巴胺的方法，它的步骤如下：把含多巴胺样品加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育25 min，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取3 ml孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出多巴胺的荧光强度，根据公式y=36.66+0.1474x，得出多巴胺的浓度。
本发明的有益效果是：利用氧化石墨烯作为荧光淬灭剂，利用π-π堆积作用使在5’端修饰有FAM荧光基团的适体结合在氧化石墨烯表面，通过能量转移FAM荧光能量传导到氧化石墨烯中，从而FAM荧光信号消失。当加入检测物多巴胺后，由于多巴胺和适体的高亲和力结合，适体远离氧化石墨烯的表面，进而FAM的荧光再次显现，而此时恢复显现的荧光强度和多巴胺浓度在一定范围内相关。
附图说明
图1为利用荧光适体传感器检测多巴胺的方法原理图；
图2为加入不同浓度多巴胺的FAM-DNA荧光强度发射曲线；
图3为根据不同多巴胺浓度和荧光强度对应关系绘制拟合曲线；
图4 为同一浓度不同底物下的特异性柱状图。
具体实施方式
一种检测多巴胺的荧光适体传感器：
（1）FAM标记适体荧光淬灭：首先利用tris-Hcl缓冲液离心溶解粉末状荧光适体，然后用tris-Hcl缓冲液配制出含10nM荧光适体，氧化石墨烯的淬灭溶液；
（2）荧光强度的检测：把不同浓度的多巴胺加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的多巴胺的荧光强度，根据不同浓度的多巴胺的荧光强度，拟合出公式y=36.66+0.1474x，其中y为多巴胺的荧光强度，x为多巴胺的的浓度。
氧化石墨烯的浓度为2-14μg/ml，缓冲液pH 7.4、缓冲液组成为50mM tris-Hcl和30mM Nacl，荧光适体结构为5’-FAM-GTCTCTGTGTGCGCCAGAGAACACTGGGGC
AGATATGGGCCAGCACAGAATGAGGCCC，由生物公司合成并分装，使用前加入缓冲液离心溶解，离心速度为3000rpm，时间5min，在室温条件下孵育10-60 min，荧光分光光度计激发发射波长为480nm，入射发射狭缝为10.0nm，发射谱检测范围为510-600nm，多巴胺的浓度为1-500μM,。
所述的检测多巴胺的方法，它的步骤如下：把含多巴胺样品加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育25 min，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取3 ml孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出多巴胺的荧光强度，根据公式y=36.66+0.1474x，得出多巴胺的浓度。
1. 原理验证及相关性实验
原理如图1所示，当‘No target’时FAM-DNA和GO通过π-π堆积力结合在GO表面，通过能量转移后荧光淬灭，当有‘dopamine’时修饰的适体与检测底物特异结合，同时FAM-DNA脱离GO表面，荧光重新恢复。
设定光荧光分光光度计激发波长480nm，入射发射狭缝均为10nm，发射波长检测范围为510-600nm，在石英比色皿中分别检测未加入多巴胺及加入不同浓度多巴胺的荧光强度，结果见附图2，在发射波长521nm处，根据不同多巴胺浓度和荧光强度对应关系绘制曲线。结果见附图3。
2. 实验条件优化
本发明分别对实验的孵育时间、氧化石墨烯浓度进行了优化，在10nM荧光适体、10μg/ml氧化石墨烯、200μM多巴胺条件下，设计了孵育时间分别为10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min后检测反应液荧光强度；在10nM荧光适体、30mM盐浓度、200μM多巴胺条件下，设定氧化石墨烯浓度为2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/ml检测反应溶液的荧光强度。通过实验结果分析本发明选择最优实验条件：孵育时间25min，氧化石墨烯浓度10μg/ml。
3. 特异性实验
分别取200μM的多巴胺、维生素C、去肾上腺素、肾上腺素加入淬灭溶液中，在设定条件下检测反应溶液中荧光强度。其结果如图4，（F-F0)/(FDA-F0)中F0和F分别表示加入不同选择性物质前后的荧光强度，FDA表示多巴胺的荧光强度，通过图可以看出本发明特异性较好。
4. 验证实验
表1 验证实验
分别取不同浓度的多巴胺，测定多巴胺的荧光强度，根据公式y=36.660+0.1474x，计算得出多巴胺的浓度，如表1所示，根据偏差得出本发明的检测方法准确。
Claims (7)
1.一种检测多巴胺的荧光适体传感器，其特征在于：
（1）FAM 标记适体荧光淬灭：首先利用tris-Hcl 缓冲液离心溶解粉末状荧光适体，然后用tris-Hcl 缓冲液配制出含10nM 荧光适体，氧化石墨烯的淬灭溶液；
（2）荧光强度的检测：把不同浓度的多巴胺加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出不同浓度的多巴胺的荧光强度；
根据不同浓度的多巴胺的荧光强度，拟合出公式y=36.66+0.1474x，其中y 为多巴胺的荧光强度，x 为多巴胺的的浓度；
所述步骤（1）中缓冲液pH 7.4、缓冲液组成为50mM tris-Hcl 和30mM Nacl，荧光适体结构为5’-FAM-GTCTCTGTGTGCGCCAGAGAACACTGGGGCAGATATGGGCCAGCACAGAATGAGGCCC，由生物公司合成并分装，使用前加入缓冲液离心溶解，离心速度为3000rpm，时间5min。
2.根据权利要求1 所述的检测多巴胺的荧光适体传感器，其特征在于：所述步骤（1）中氧化石墨烯的浓度为2-14μg/ml。
3.根据权利要求2 所述的检测多巴胺的荧光适体传感器，其特征在于：所述步骤（1）中氧化石墨烯的浓度为10μg/ml。
4.根据权利要求1 所述的传感器，其特征在于：所述步骤（2）中在室温条件下孵育10-60 min。
5.根据权利要求1 所述的检测多巴胺的荧光适体传感器，其特征在于：所述荧光分光光度计激发发射波长为480nm，入射发射狭缝为10.0nm，发射谱检测范围为510-600nm。
6.根据权利要求1 所述的检测多巴胺的荧光适体传感器，其特征在于：所述多巴胺的浓度为1-500μM。
7.如权利要求1-6任一项所述的检测多巴胺的荧光适体传感器用于检测多巴胺的方法，其特征在于，它的步骤如下：把含多巴胺样品加入到淬灭溶液中，在室温条件下孵育25min，设定荧光分光光度计激发发射波长及入射发射狭缝，取3 ml孵育好的反应溶液加入石英比色皿中检测，得出多巴胺的荧光强度，根据公式y=36.66+0.1474x，得出多巴胺的浓度。
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