CN105891174A - 一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种检测奶制品中β‑内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用。该适配体传感器按照以下方法制备：制备GO溶液；取梯度浓度的β‑内酰胺酶，与荧光素FAM标记的β‑内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，加入GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；确定适配体传感器标准线性曲线。基于氧化石墨烯和适配体的相互作用，建立了一种直接、快速、灵敏、特异性强的适配体传感器，利用该传感器能快速检测市面上的奶制品中非法添加的β‑内酰胺酶。这对于打击食品领域的违法犯罪行为，保障食品安全和人们健康具有重要实际意义。

Description

一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用。

背景技术

随着人们生活质量的逐渐提高，乳及乳制品的安全备受关注，而其中最突出的就是抗生素的残留问题。奶牛乳房炎是危害奶牛产奶的严重疾病，一直困扰乳业的健康发展，以青霉素类和头孢菌素类为代表的β-内酰胺类抗生素(β-lactamantibiotic)由于价格低廉、抗菌性强而被广泛应用于预防和治疗牛乳腺的首选药物。

β-内酰胺酶(β-lactamase)是细菌产生的可水解β-内酰胺类抗生素的酶，由于β-内酰胺酶可以特异性水解青霉素及头孢类等抗生素，所以被不法分子作为解抗剂非法添加入食品或食品原料(例如牛奶和生乳)中，从而达到掩蔽抗生素的目的，影响抗生素残留检测。出于经济利益的驱动，一些不法奶站人为的使用β-内酰胺酶等生物制剂来降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2011年广东检验检疫局技术中心的胡科锋等在广州市抽取4个品牌不同包装的牛奶20份进行检测，8个样品检出β-内酰胺酶，检出率40％；2010年5-7月，沈阳疾病预防控制中心的马景宏等从沈阳市各超市2次随机采集7个品牌不同的乳制品共50份，利用杯碟法对市售牛奶中残留的β-内酰胺酶进行检测，结果显示：7个品牌的乳制品样品50份中共有4大品牌19份样品(38％)检测结果为阳性，此种类似报道还有很多，由此可见β-内酰胺酶的滥用情况非常普遍。长期食入非法添加β-内酰胺酶的奶制品，一方面会增加人体内细菌的耐药性，降低甚至完全抵消抗生素类药物的疗效，此外还会使过敏体质的人出现荨麻疹、发热、甚至过敏性休克等危害；另一方面在分解抗生素后，可能引进其它有害物质(如：青霉素噻唑酸等)。正因为上述危害性，中国食品整治办于2009年2月4日在《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》中明确将β-内酰胺酶列入非食用物质，要求进行全国性监控，特别是要开展奶站和乳品企业整顿，严厉打击奶畜养殖违规添加“解抗剂”(β-内酰胺酶)的违法行为。此方法主要用于检测这种“无抗奶”的。

核酸适配体(aptamer)主要指的是ssDNA或RNA的寡聚核苷酸序列，该序列能与目标靶分子高选择性、高特异性的结合。Tuerk和Gold在1990年提出一种新的体外筛选和扩增方法，命名为指数富集配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichrnent,SELEX)技术，他们应用该筛选技术筛选得到与T4DNA聚合酶gp43高选择性、高特异性结合的RNA序列。同年，Ellington等用类似的筛选方法从RNA随机文库中筛选得到与汽巴克隆蓝、活性蓝4等小分子有机染料高特异性、高选择性的RNA分子，他们筛选得到的这些个别RNA序列命名为aptamers，它源于拉丁文词aptus，意思为“适合”。两年后，Bock等又从一个化学合成的随机DNA库中成功筛选到ssDNA适配体。Aptamer与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等，结合常数Kd达到微摩尔至皮摩尔范围。适配体作为一种识别分子，与传统的抗体相比具有以下优点：①亲和性和特异性高；②作用的靶分子范围更广，可以为无机金属小分子也可为生物大分子；③筛选周期短，筛选过程能自动化；④稳定性好，不易被高温、酸碱降解，可长期保存，常温下运输；⑤分子质量小，无免疫原性；⑥适配体分子较小，易于通透细胞膜进入细胞内检测细胞内的靶分子；⑦合成容易，经过修饰后具有多功能化学性质，可以参加多种反应。近年来，核酸适配体日益受到国内外化学、生物医学、纳米材料、蛋白质科学、物理、数学多学科研究者的广泛关注。目前有关这方面的基础研究和实际应用还只处于起步阶段，面临着更大的发展空间。国内学者在适配体的相关研究中成果显著，深受国家重视。由此表明核酸适配体的基础和应用研究有着重要理论意义、实用价值和应用前景。

目前对乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法主要有杯碟法、头孢硝基噻吩显色法、酸度法、碘量法、高效液相色谱法等，但这些方法有些是采用化学显色的间接法来检测乳制品中残留的β-内酰胺酶，不够灵敏，而色谱法需要大型仪器和复杂的样品前处理。近年也有一些免疫分析方法，如酶联免疫法和胶体金法。国内外现已也有一些针对β-内酰胺酶快速检测的免疫试剂盒，如：华安麦科β-内酰胺酶快速检测试剂盒、SNAPβ-内酰胺酶快速检测试剂盒等。但这些试剂盒有些是利用青霉素作为酶的底物进行反应间接检测食品中β-内酰胺酶含量，可能会受到其它物质的影响。尽管也有研究者关于β-内酰胺酶胶体金免疫层析方法的研究应用，但由于有些奶制品在加工过程中会伴有一些颜色，不适合用胶体金免疫层析方法对其进行检测。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述制备方法得到的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器。

本发明的又一目的在于提供上述检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器在检测奶制品中β-内酰胺酶中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，按照以下操作步骤：

(1)用石墨粉末合成氧化石墨烯；将氧化石墨烯配制成0.04mg/mL的GO溶液；

(2)分别取浓度为0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、14U/mL、18U/mL、22U/mL、26U/mL、30U/mL、38U/mL、46U/mL、54U/mL的β-内酰胺酶，与6nM荧光素FAM标记的β-内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，然后加入步骤(1)所得GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；所述测定荧光强度时激发波长485nm，发射波长535nm；

(3)确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R²＝0.999，n＝3；线性范围为1-58U/mL，R²＝0.999，最低检测线为0.5U/mL。

步骤(1)所述用石墨粉末合成氧化石墨烯是采用Hummers方法进行合成，具体按照以下步骤：将3g石墨粉、70mL浓硫酸加入烧杯并置于冰水浴中，然后将2g NaNO₃、9g KMnO₄加入体系中；升温至35℃，维持30min；加入138ml去离子水，搅拌15min，然后加入120ml温度在60℃的3％H₂O₂直至溶液无明显气泡为止，将所得黄色液体，离心、酸洗、水洗、烘干、剥离，得到氧化石墨烯。

步骤(2)所述β-内酰胺酶核酸适配体序列号为5’-FAM-CCAAACTCGGG-3’，在期刊Fast,W.,Sutton,L.D.,2013.公开发表过。

一种由上述的制备方法得到的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器。

利用上述的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器在检测奶制品中β-内酰胺酶中的应用。

本发明的原理是：当适配体吸附在氧化石墨烯表面时，氧化石墨烯能迅速猝灭适配体的荧光信号导致体系处于低荧光信号阶段；另一方面，当适配体与目标物β-内酰胺酶结合时，适配体就会从氧化石墨烯表面脱落下来，从而导致体系处于高的荧光信号阶段。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明将β-内酰胺酶的核酸适配体，与氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作用，最终建立一种针对奶制品中残留β-内酰胺酶的新颖、快速、直接、灵敏度高、能定量检测的适配体荧光生物传感器新方法；此外，该方法用核酸适配体来替代传统抗体，用于识别β-内酰胺酶，核酸适配体较于传统抗体更具有一些能与配体快速、特异性、亲和性高等优点。这对于打击食品领域的违法行为，保障食品安全和人们健康具有重要实际意义；而且对于研制其它违法添加物和分析对象的类似方法具有借鉴作用。

附图说明

图1为氧化石墨烯的表征结果，其中A：X射线衍射的测试结果；B：紫外光谱的测试结果。

图2为氧化石墨烯对FDNA的影响试验图。

图3为适配体传感器制备原理图。

图4为适配体传感器检测条件优化，其中A：GO浓度；B：孵育时间；C：温度；D：pH。

图5为适配体传感器标准曲线图。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：GO的制备

3g石墨粉、70mL浓硫酸加入到500mL烧杯并置于冰水浴中，称取2g NaNO₃缓慢加入体系中，然后缓慢加入9g KMnO₄，升温至35℃维持30min，得到深绿色液体。加入138mL去离子水，搅拌15min，接着加入120mL 60℃的3％H₂O₂直至溶液无明显气泡为止。经过上述步骤后，得到黄色液体，离心、酸洗、水洗、烘干、剥离，得到氧化石墨烯(GO)。最后，紫外光谱和XRD鉴定合成的GO，紫外图谱在230nm处出现了氧化石墨烯的特征紫外吸收峰，XRD图谱的2θ衍射峰由石墨的26.5°转变为氧化石墨烯的特征峰9.2°。结果见图1。

实施例2：GO对FDNA荧光信号的作用

为了测试GO对FDNA荧光信号的影响作用，取一系列浓度的适配体溶液(4nM,8nM,12nM,16nM,20nM)加入到一定浓度的GO溶液中，室温孵育10min后测试其荧光强度，检测结果表明，GO能与荧光素FAM共轭，从而猝灭了其荧光信号。结果见图2。

实施例3：适配体传感器的制备原理

当样品中没有β-内酰胺酶时，FDNA与GO产生π-π共轭吸附在GO表面，此时GO能迅速猝灭FDNA的荧光信号，使体系处于低荧光信号阶段。另一方面，当奶制品中含有β-内酰胺酶，FDNA与β-内酰胺酶特异性结合，从而阻碍了FDNA吸附在GO的表面，此时由于FDNA未能与GO作用，从而导致体系处于高荧光信号阶段。实验原理见图3。

实施例4：适配体传感器检测条件优化

·GO浓度

取一系列浓度的GO溶液(0.02,0.04,0.06,0.08and 0.10mg/mL)与一定浓度的FDNA于棕色离心管中，混匀，室温孵育10min后测试其荧光强度。结果显示当GO浓度在0.04mg/mL之后，荧光强度几乎不变。考虑节省原料，GO最优浓度为0.04mg/mL。结果见图4中的A。

·孵育时间

这一部分为两个方面，一个是FDNA与β-内酰胺酶的孵育时间，另一个是FDNA与GO的作用时间。由于GO能快速结合FDNA，并迅速猝灭荧光信号，因此，孵育时间这一部分只考虑FDNA与β-内酰胺酶的结合时间。实验结果表明，当FDNA与β-内酰胺酶孵育时间超过20min后，体系的荧光强度逐渐下降。故20min作为最优的孵育时间。结果见图4中的B。

·温度

取1U/mLβ-内酰胺酶与一定量的FDNA分别于4℃、25℃、40℃、50℃下孵育20min，然后加入0.04mg/mL GO溶液，孵育10min后测试荧光强度。实验结果显示，在温度为40℃时，β-内酰胺酶的活性最大。结果见图4中的C。

·pH

一个适宜的环境能使FDNA的荧光信号达到最强。取一定量的FDNA于不同pH的Tris-EDTA缓冲液中，加入1U/mLβ-内酰胺酶，40℃孵育20min后与0.04mg/mL GO混合，孵育10min，然后测试荧光强度。实验结果表明，FDNA在pH为7.2时，其荧光信号最强。结果见图4中的D。

实施例5：适配体传感器的制备

在上述确定了适配体传感器最佳检测条件后，取一系列浓度的β-内酰胺酶(0.5,1,5,10,14,18,22,26,30,38,46,54U/mL)与一定量的FDNA孵育20min，然后加入0.04mg/mL GO溶液，孵育10min，测定荧光强度。实验结果表明，随着β-内酰胺酶浓度的增加，荧光强度也随之升高。但是，当β-内酰胺酶浓度超过46U/mL之后，荧光信号几乎不变。另外，确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R²＝0.999，n＝3；线性范围为1-58U/mL，R²＝0.999，最低检测线为0.5U/mL，结果见图5。

实施例6：适配体传感器的应用

在确定适配体传感器标准曲线和线性范围之后，利用该适配体传感器检测样品。现找市面上17种奶制品，经过样品前处理后分别添加3个水平浓度的β-内酰胺酶(5,15,30U/mL)，运用上述建立的适配体传感器分别检测并计算回收率。由检测结果可知，添加标样测收回率为96.04％-119.67％，每个样本的变异系数小于6.70％。结果见表1。

表1适配体传感器加样回收测试结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤：

(1)用石墨粉末合成氧化石墨烯；将氧化石墨烯配制成0.04mg/mL的GO溶液；

(2)分别取浓度为0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、14U/mL、18U/mL、22U/mL、26U/mL、30U/mL、38U/mL、46U/mL、54U/mL的β-内酰胺酶，与6nM荧光素FAM标记的β-内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，然后加入步骤(1)所得GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；所述测定荧光强度时激发波长485nm，发射波长535nm；

(3)确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R²＝0.999，n＝3；线性范围为1-58U/mL，R²＝0.999，最低检测线为0.5U/mL。

2.根据权利要求1所述的一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述用石墨粉末合成氧化石墨烯是采用Hummers方法进行合成，具体按照以下步骤：将3g石墨粉、70mL浓硫酸加入烧杯并置于冰水浴中，然后将2g NaNO₃、9g KMnO₄加入体系中；升温至35℃，维持30min；加入138ml去离子水，搅拌15min，然后加入120ml温度在60℃的3％H₂O₂直至溶液无明显气泡为止，将所得黄色液体，离心、酸洗、水洗、烘干、剥离，得到氧化石墨烯。

3.一种由权利要求1所述的制备方法得到的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器。

4.利用权利要求3所述的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器在检测奶制品中β-内酰胺酶中的应用。