CN103014132A - 核糖核酸酶的检测方法及其应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：1)从受试者个体中获得体液样本；2)使所述体液样本与双链核酸接触，使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)检测步骤2)中的接触后的产物，从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量。此外，本发明还提供了该检测方法的应用和肿瘤检测试剂盒。利用本发明所提供的核糖核酸酶检测底物和检测方法，能够灵敏、准确地检测来源于不同肿瘤患者血清核糖核酸酶的活性及含量，不仅操作简便，而且大大降低了检测费用，对于多种疾病的早期检测、疗效评价、人群普查等大规模应用均具较高的使用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学及分子诊断领域，具体而言，涉及一种受试者体液中核糖核酸酶的检测方法、该方法在肿瘤检测中的应用以及一种肿瘤检测试剂盒。
背景技术
早期诊断是疾病尤其是肿瘤治疗中的一个关键环节。通常，人们通过测量血液中的每种肿瘤对应的物质(通常被称为肿瘤标志物)来检测各种肿瘤。所述的肿瘤标志物可定义为“在癌细胞产生的物质中或是在因体内正常细胞与癌细胞相互作用而产生的物质中，可通过对血液、组织和排泄物(尿液和粪便)等进行检查从而用作为癌症诊断或治疗的标志物的物质”。
核糖核酸酶或称RNA酶，是一大类包括数十个种类的、能够将RNA底物水解成小分子核酸的酶。1958年，Miliarese首先提出血清RNase浓度与恶性肿瘤有密切关系。1970年，Reddi首次证实胰腺癌患者血清RNase异常升高(Reddi KK，Holland JF.Elevated serum ribonuclease in patients withpancreatic cancer.Proc Natl Acad Sci USA.1976，73(7)：2308-10)。在胰腺癌诊断中，应用最多的是测定血清RNase的浓度，这是由该酶的组织来源的和在血清中的高浓度所决定的。实验证明，RNase酶在胰腺和血清中的含量比其他组织器官高100倍以上，而且血清中提取的RNase在生物化学和免疫学特性与胰腺来源的RNase非常类似，并且均可被RNase抑制剂所抑制。这些相同的特性表明，血清中的RNase主要来源于胰腺。
为了检测样本中核糖核酸酶的活性或含量，研究人员在分析底物降解的基础上，建立了许多技术方案。早期的核糖核酸酶活性检测是建立在Kunitz技术上(Kunitz M.A spectrophotometric method for the measurement ofribonuclease activity.J.Biol.Chem.，1946，164：563-568)。在该技术中，他们向被检测样本中加入异质性的RNA样本，通过分光光度法检测RNA样本在300nm吸收值的变化，计算样本中核糖核酸酶的活性。除了以异质性的核糖核酸分子为底物，另一类核糖核酸酶检测方法是以人工合成的核糖核酸分子为底物，例如寡聚核糖核酸分子。通常情况下，以人工合成的寡聚核糖核酸分子为底物的检测技术具有更高的灵敏度和更好的特异性。其中的代表性技术是1991年由Witmer等人建立的(Witmer MR，Falcomer CM，Weiner MP，Kay MS，Begley TP，Ganem B and Scheraga HA.U-3′-BCIP：a chromogenicsubstrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems.Nucleic Acids Res.，1991，19：1-4)。该技术的主要特点是合成了核糖核酸酶底物U-3′-BCIP，该底物在核糖核酸酶的作用下会释放一种报告基团，利用分光光度计在650nm条件下检测报告基团的释放情况，从而计算样本中核糖核酸酶的活性和含量。这些不同的技术方案以及他们的改进方案虽然在一定程度上提高核糖核酸酶活性检测的灵敏度和准确性，但均存在一定的缺陷，不适合作为一个通用的研究手段用于样本核糖核酸酶活性的高通量检测，在技术上还有较大的可改进的空间。
综上所述，本领域迫切需要一种灵敏而特异的基于核糖核酸酶的疾病诊断尤其是肿瘤诊断标志物、以及相应的检测技术。
发明内容
为了开发可用于人类疾病尤其是肿瘤早期诊断的生物标志物、以及相应的检测技术，提高人类疾病尤其是肿瘤检测的灵敏度和特异性，发明人对核糖核酸酶降解双链核糖核酸底物的过程及机制进行了广泛而深入的研究，意外地发现绝大多数降解发生在双链核糖核酸底物的两个敏感位点CA/UG和UA/UA位点上。在这一研究结果的基础上，完成了本发明。
一方面，本发明提供了一种核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：1)从受试者个体中获得体液样本；2)使所述体液样本与双链核酸接触，使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)检测步骤2)中的接触后的产物，从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量；
其中，所述体液样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种；
所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸，其长度为7-30个碱基对，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列或UA碱基序列，第二单链的碱基序列中含有与第一单链中CA碱基序列或UA碱基序列互补的UG碱基序列或UA碱基序列，所述双链核酸的一端连接有能量供体基团，另一端连接有能量受体基团，且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述双链核酸的长度为7-30个碱基对，优选为22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；还可以优选为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个碱基对，进一步优选为9、10、11、12、13、14或15个碱基对，还可以进一步优选为7、8、9、10、11或12个碱基对。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中CA碱基序列互补的UG碱基序列。
根据本发明的一个实施方式，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个UA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中UA碱基序列互补的UA碱基序列。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述双链核酸的第二单链与第一单链完全互补，所述双链核酸的第一单链的碱基序列优选为5’-AUGAGCCUGAUUU、5’-AUGAGCCUAAUUU、5’-GGCUGCU、5’-GAAUGAGCU、5’-GAGUCAGCUAATCUU、5’-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU或5’-AGCUGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC，进一步优选为5’-AUGAGCCUGAUUU。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团，其中，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’-羟基被修饰的核苷酸基团，所述核糖基团被修饰的核苷酸基团优选为核糖基团的2’-羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于双链核酸的同一条核酸单链上，或者位于不同核酸单链上。优选所述能量供体基团和所述能量受体基团位于同一或不同单链的两端。
根据本发明的一种实施方式，其中，所述能量供体基团为荧光供体基团，所述能量受体基团为荧光受体基团，其中，所述的荧光受体基团优选为荧光淬灭基团。
优选所述荧光供体基团为选自荧光素(fluorescein)基团、四氯荧光素(tetrachlorofiuorescein)基团、六氯荧光素(hexachlorofluorescein)基团、罗丹明(rhodamine)基团、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)基团、花青染料(Cydye)、德克萨斯红(Texas Red)基团、氟硼荧光染料(Bodipy dye)基团和亚历克萨荧光染料(Alexa dye)基团中的至少一种，更优选为选自6-羧基荧光素基团、5-四氯荧光素基团、5-六氯荧光素基团、6-羧基-x-罗丹明基团、N，N′-对羧苄基吲哚三菁基团和6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。
优选所述荧光受体基团为选自氮代氧杂蒽(nitrogen-substituted xanthene)基团、取代或未取代的四偶氮苯基苯胺(substituted 4-(phenyldiazenyl)phenylamine)基团、取代或未取代的四偶氮苯基萘胺(substituted4-(phenyldiazenyl)naphthylamine)基团，更优选所述荧光受体基团为选自4-(4′-二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸(4-(4′-dimethylaminophenylazo)benzoicacid))基团、N，N′-双甲基-N，N′-联苯-4-(5-叔丁氧羰基戊胺)哌啶砜基罗丹明(N，N’-dimethyl-N，N’-diphenyl-4-((5-t-butoxycarbonylaminopentyl)minocarbonyl)piperidinylsulfonerhodamine)基团、4′，5′-二硝基荧光素(4′，5′-dinitrofluorescein)基团、氨基哌啶酸(pipe-colic acid amide)基团、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺(4-[4-nitrophenyldiazinyl]phenylamine)基团、4-(4-硝化苯嗪基)萘胺(4-[4-nitrophenyldiazinyl]naphthylamine)基团中的至少一种。
本发明提供上述的检测方法在肿瘤检测中的应用。
根据本发明的一种实施方式，所述应用包括，1)根据上述检测方法分别获得来自于受试者的体液样本和来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量；2)比较来自于受试者的体液样本和来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量，来自于受试者的体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低，表明该受试者异常；优选地，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低30％以上，表明该受试者异常；进一步优选地，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低50％以上，表明该受试者异常；最优选地，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低70％以上，表明该受试者异常。
根据本发明的一种实施方式，所述健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量可以在需要预测受试者是否为异常时测得，更优选地，也可以预先检测健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶含量，设定其统计学上的取值范围为正常核糖核酸酶含量范围，这样，针对不同的受试者，只要测定该受试者体液样本中的核糖核酸酶含量，然后以该正常核酸酶含量范围为基准，比较受试者体液样本中核酸酶含量的变化，即可进行特定肿瘤的早期预测或诊断。
其中，所述肿瘤优选为胃癌、结肠癌或肺癌。
另一方面，本发明还提供了一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有本发明提供的双链核酸；进一步还优选含有核糖核酸酶标准品。所述标准品即阳性对照品，是已知的具有核糖核酸酶活性的物质。
利用本发明所提供的核糖核酸酶检测底物(即，双链核酸)和检测方法，能够灵敏、准确地检测来源于不同受试者体液中的核糖核酸酶的活性及含量。本发明提供的核糖核酸酶检测方法不仅操作简便，而且大大降低了检测费用，对于多种疾病的早期检测、疗效评价、人群普查等大规模应用均具较高的使用价值。相对于现有技术而言，本发明提供的检测方法具有明显的技术优势，主要包括以下几个方面。
1)检测稳定性：相对于现有技术的核糖核酸酶的单链核酸底物，本发明提供的双链核酸底物的稳定性更高，在实际应用中具有更为明显的技术优势。
2)高度特异性：本发明是建立在对双链核糖核酸底物中的核糖核酸酶切割敏感位点的基础上完成的，利用所鉴定的核糖核酸酶切割敏感位点，本发明能够实现核糖核酸酶的特异性检测，从而提高了检测的特异性和准确性。
3)定量检测技术：在本发明的两个突出的技术特点，即，底物稳定性和高度特异性的基础上，本发明提供的检测方法能够更加稳定地检测样本中核糖核酸酶的活性，并进一步计算出核糖核酸酶的含量，从而建立了可行的核糖核酸酶定量检测技术，是对现有检测技术的一个重大发展和进步。
4)高通量检测技术：本发明提供的利用荧光能量共振转移法检测样本中核糖核酸酶的活性和含量的方法操作简单，适合于作为标准化的检测方法而对大量样本进行高通量、低成本的检测。
5)广泛的适用性：本发明提供的双链核酸底物及检测方法可用于建立标准的核糖核酸酶检测体系，及用于分析、比较样本中或样本间不同核糖核酸酶的活性及含量。
本发明提供了一种受试者体液中核糖核酸酶的检测方法及其在肿瘤检测中的应用，以及一种肿瘤检测试剂盒。与现有技术相比，由于本发明提供的检测底物更稳定和更特异，因此尤为适合于临床检测应用；另一方面，本发明建立了一种适合于高通量和大规模应用的定量检测样本中核糖核酸酶的方法，从而为疾病尤其是肿瘤的检测提供了一种简便、高效的检测技术。
附图说明
图1为本发明一种实施方式中RNase A处理前的反应体系在500-650nm范围内的荧光光谱。
图2为本发明一种实施方式中RNase A处理后的反应体系在500-650nm范围内的荧光光谱。
图3为本发明一种实施方式中酶促反应时的检测时间对荧光强度的曲线。
图4为本发明一种实施方式中RNaseA浓度对K值的曲线。
图5为本发明一种实施方式中健康对照个体与肿瘤个体样本中核糖核酸酶含量的比较图。
具体实施方式
本发明中，荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是指，当一个荧光基团(又称为荧光供体基团)的荧光光谱与另一个荧光基团(又称为荧光受体基团)的激发光谱相重叠时，荧光供体基团的激发能诱发荧光受体基团发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的一种现象。FRET的产生及效率与荧光供体基团与荧光受体基团的空间距离紧密相关，该空间距离在7-10nm时FRET的效率最佳。随着距离延长，FRET呈显著减弱。荧光供体基团和荧光受体基团之间的FRET的效率，可以由E＝1/1+(R/R0)6反映。其中，R表示荧光供体基团和荧光受体基团之间的距离，R0表示福氏距离。在福氏距离R0处，荧光供体基团与荧光受体基团间的FRET效率为50％。福氏距离R0依赖于供体发射谱和受体激发谱的重叠程度、以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。
应当理解，凡是具有荧光发射光谱和荧光激发光谱重叠的荧光基团，即，能够发生FRET现象的荧光基团组合均能应用于本发明。这些荧光基团组合包括但不限于本说明书中提到的各种荧光基团组合。
本发明中，对双链核酸进行修饰的方式为本领域技术人员所公知。例如，本发明对双链核酸进行的化学修饰为以下的一种或一种以上化学修饰的组合：
(1)对双链核酸的骨架结构中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对双链核酸的骨架结构中核糖的修饰；
(3)对双链核酸的核苷酸残基中碱基的修饰。
所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼烷置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定核糖核酸分子的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
硫代磷酸修饰 硼烷化磷酸盐修饰
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2′-羟基(2′-OH)的修饰。在核糖的2′-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易识别小干涉核酸，由此增加了小干涉核酸的稳定性，使小干涉核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2′-羟基的修饰包括2′-氟修饰(2′-fiuromodification)、2′-氧甲基修饰(2′-OME)、2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)、2′-2，4-二硝基苯酚修饰(2′-DNP modification)、锁核酸修饰(LNA modification)、2′-氨基修饰(2′-Amino modification)、2′-脱氧修饰(2′-Deoxy modification)等。
2′-氟修饰 2′-氧甲基修饰
2′-甲氧乙基修饰 2′-2，4-二硝基苯酚修饰
锁核酸修饰 2′-氨基修饰 2′-脱氧修饰
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5位点引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶(5′-bromo-uracil)和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)修饰等。
5′-溴尿嘧啶 5′-碘尿嘧啶
N3-甲基脲嘧啶 2，6-二氨基嘌呤
优选所述修饰为对所述双链核酸的骨架结构中核糖的2′-羟基的修饰。进一步优选所述修饰为所述双链核酸的骨架结构中核糖的2′-羟基被甲氧基或氟取代。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。如在以下实施例中，以RNase A为例进行了说明，但应当理解，本发明的核糖核酸酶检测方法同样也适用于RNase I、RNase H等核糖核酸酶的检测。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。实施例中未注明具体条件的实验方法可按照常规实验条件进行，例如Sambrook等人在《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例用于说明本发明中使用的寡聚核糖核苷酸的序列结构及荧光基团的光学参数。
委托广州锐博生物科技有限公司合成具有表1中所示序列的寡聚核糖核苷酸，荧光基团标记在寡聚核糖核苷酸的5′端。互补的寡聚核糖核苷酸可按《分子克隆：实验室手册》中的方法退火形成双链核糖核酸。表1示出了合成的寡聚核糖核苷酸的序列。其中，SEQ ID NO：11表示的寡聚核糖核苷酸中，对3位的鸟苷酸残基的戊糖进行了2′-氧甲基(2′-OME)修饰。SEQ ID NO：12表示的寡聚核糖核苷酸中，对14位的脲苷酸残基的戊糖进行了2′-氟取代(2′-Fluro substitution)修饰。SEQ ID NO：13表示的寡聚核糖核苷酸中，对20位的胞苷酸残基的戊糖进行了2′-氧甲基(2′-OME)修饰。表2示出了用于标记的荧光基团的光学参数和中英文全称。
表1.寡聚核糖核苷酸的序列结构
| 核酸编号 | 核酸序列 |
| SEQ ID NO：1 | 5’-FAM-AUGAGCCUGAUUU |
| SEQ ID NO：2 | 5’-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU |
| SEQ ID NO：3 | 5’-TET-AUGAGCCUAAUUU |
| SEQ ID NO：4 | 5’-TAMRA-AAAUUAGGCUCAU |
| SEQ ID NO：5 | 5’-HEX-GGCUGCU |
| SEQ ID NO：6 | 5’-TAMRA-AGCAGCC |
| SEQ ID NO：7 | 5’-FAM-GAAUGAGCU |
| SEQ ID NO：8 | 5’-TAMRA-AGCUCAUUC |
| SEQ ID NO：9 | 5’-HEX-GAGUCAGCUAATCUU |
| SEQ ID NO：10 | 5’-TAMRA-AAGAUUAGCUGACUC |
| SEQ ID NO：11 | 5’-TET-UGG(OME)UAUGAGCCUGAUUUUGAU |
| SEQ ID NO：12 | 5’-TAMRA-AUCAAAAUCAGGCU(F)CAUACCA |
| SEQ ID NO：13 | 5’-FAM-AGCUGGUGGUACAGAUGAUC(OME)UUGCAUCGUC |
| SEQ ID NO：14 | 5’-TAMRA-GACGATGCAAGAUCAUCUGUACCACCAGCU |
表2.荧光基团的光学参数
实施例2
本实施例用于说明荧光共振能量转移现象的鉴定。在本发明提供的应用荧光共振能量转移法检测核糖核酸酶水平的技术方案中，一个关键的条件是标记在双链核糖核酸底物两端的荧光供体基团和荧光受体基团之间能够发生荧光共振能量转移。
为了验证这一点，首先将合成的SEQ ID NO：1所示的寡聚核糖核苷酸(5’-FAM-AUGAGCCUGAUUU)和SEQ ID NO：2所示的寡聚核糖核苷酸(UACUCGGACUAAA-TAMRA-5’)退火形成互补的双链核糖核酸底物DS1。取4μl的DS1加入到2ml荧光共振能量转移缓冲液(0.01M Tris-HCl，pH 7.4，0.002M MgCl2)中混匀，DS1的终浓度为10nM，随后将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。将含有反应体系的石英杯放入荧光光谱仪，设定480nm激发，扫描500-650nm范围内的光谱，结果如图1所示。其中，横轴表示波长，纵轴表示荧光强度。可以看出，在515nm处荧光强度较低，575nm处荧光强度较高。向反应体系中加入20μlRNase A(终浓度为1×10-6μg/μl)后，部分反应底物被RNase A降解，导致与这些反应底物连接的荧光供体基团与荧光受体基团分离，这时候再进行相同的光谱扫描，得到的光谱图如图2所示。其中，横轴表示波长，纵轴表示荧光强度。可以看出，在515nm处荧光光强显著提高，575nm处荧光光强基本消失，降低到本底水平。这个结果表明与双链核糖核酸底物结合的荧光供体基团与荧光受体基团之间确实能够进行荧光共振能量转移。另一方面，这个结果也表明底物被加入的RNase A降解后，荧光供体基团与荧光受体基团之间的距离远大于荧光共振能量转移所需的最大距离，因而不能进行能量转移。
利用同样的检测方法，分别检测了由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4退火形成的双链底物DS2的荧光共振能量转移、由SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6退火形成的双链底物DS3的荧光共振能量转移、由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8退火形成的双链底物DS4的荧光共振能量转移、由SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10退火形成的双链底物DS5的荧光共振能量转移、由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12退火形成的双链底物DS6的荧光共振能量转移、由SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14退火形成的双链底物DS7的荧光共振能量转移。结果表明，与这些底物两端结合的荧光供体基团和荧光受体基团之间均能发生荧光共振能量转移现象，因此这些荧光基团标记的双链核糖核酸底物也可用在本发明的核糖核酸酶活性检测中。
实施例3
本实施例用于说明本发明的应用荧光共振能量转移检测样本中核糖核酸酶水平的方法。
为了利用FRET法检测样本中核糖核酸酶的活性和含量，取4μl双链核糖核酸底物DS1加入到2ml荧光共振能量转移缓冲液(0.01M Tris-HCl，pH7.4，0.002M MgCl2)中混匀，DS1的终浓度为10nM，随后将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。在向反应体系中加入20μl一定浓度的RNase A后，对反应体系进行持续480nm的激发，并同时在515nm进行检测，得到以秒为间隔的荧光强度值，利用这些数值绘制检测时间-荧光强度曲线。
具体如图3所示，其中，横轴表示检测时间，纵轴表示荧光强度。该曲线符合以下所示的酶促动力学公式(I)。
其中，Fmax为双链核糖核酸底物分解后，标记在其两端的荧光基团完全分开时产生的最大的荧光强度变化值，可由实验测得，同一批次实验只需测得一个Fmax。t为时间，t0为实验开始计时后加入核酸酶的时间，可为0。Kobs为描述反应速度K值。
随后，使用prism软件对这条曲线进行分析。首先，根据完全反应后的荧光强度的变化值对曲线进行标准化。其次，对这条标准化曲线进行非线性回归拟合，非线性回归拟合的范围为0至100％，拟合后得到与反应速度相关的K值，且拟合的曲线与标准化的反应曲线的拟合率高达0.99以上。相关数据分析过程及公式可参见以下两篇文献：1)Liu JQ，Chen CY，Xue Y，HaoYH and Tan Z.G-quadruplex hinders translocation of BLM helicase on DNA：areal-time fluorescence spectroscopic unwinding study and comparison withduplex substrates.J Am Chem Soc.2010，132(30)：10521-7；2)Lucius AL，WongCJ and Lohman TM.Fluorescence stopped-flow studies of single turnoverkinetics of E.coli RecBCD helicase-catalyzed DNA unwinding.J Mol Biol.2004339(4)：731-50。
将已知浓度商品化的RNaseA用DEPC水进行浓度梯度稀释，并用稀释后的RNase A对终浓度为10nM的、在其两端用荧光基团标记的双链核糖核酸底物进行荧光能量共振转移实验，反应温度25℃，时间长度为900秒。通过一系列不同浓度RNaseA与底物的反应，分别测得一系列K值。
将以上反应得到的K值与其相应的浓度做成一条表示RNase A浓度与K值之间关系的标准曲线。结果如图4所示，其中，横轴表示RNase A的浓度，纵轴表示在该浓度条件下测得的K值。这条曲线符合如下所示的非线性回归拟合公式(II)。
其中，Ymax为曲线最大值，表示相应于足够量RNaseA的最大响应的K值，Ymin为曲线的最小值，表示RNaseA活性于趋近0时的最小响应的K值，X为RNaseA的浓度，EC50为半效应浓度；KH为曲线中线性区段的斜率。
这条曲线的关系符合剂量累计效应，且由这条标准曲线也可以将得到的K值反向回归成相对应的RNaseA浓度。相关数据分析过程及公式可参见以下两篇文献：1)Liu JQ，Chen CY，Xue Y，Hao YH and Tan Z.G-quadruplexhinders translocation of BLM helicase on DNA：a real-time fluorescencespectroscopic unwinding study and comparison with duplex substrates.J AmChem Soc.2010，132(30)：10521-7；2)Lucius AL，Wong CJ and Lohman TM.Fluorescence stopped-flow studies of single turnover kinetics of E.coli RecBCDhelicase-catalyzed DNA unwinding.J Mol Biol.2004339(4)：731-50。
应用同样检测方法，分别将由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4退火形成的双链底物DS2、由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6退火形成的双链底物DS3、由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8退火形成的双链底物DS4、由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10退火形成的双链底物DS5、由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12退火形成的双链底物DS6、以及由SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14退火形成的双链底物DS7用于本实施例中的核糖核酸酶含量检测。结果表明，这些检测底物均能得到有效的剂量累计曲线，适合于核糖核酸酶的活性检测。
实施例4
本实施例对利用荧光共振能量转移法定量检测人血清中核糖核酸酶的方法进行说明。
利用实施例2和实施例3中建立的检测方法对人血清中核糖核酸酶的活性和含量进行了分析。具体步骤如下。
1)将合成的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2退火形成互补的双链底物DS1用于本实施例检测；
2)将-80℃保存的人血清样本从冰箱中取出，置于冰上低温融化，对融化后的血清在4℃条件下进行500×g、10分钟低温离心，去除血清中的不溶物，将获得的上清用于核糖核酸酶含量的检测；
3)取2ml荧光共振能量转移缓冲液(0.01M Tris-HCl，pH 7.4，0.002MMgCl2)，向其中加入终浓度为10nM的DS1，混匀后将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。将步骤2制备好的50μl所述上清加入到反应体系中，在25℃进行反应，反应时间为900秒。对反应体系进行持续的480nm激发，并同时在515nm进行检测，得到以秒为间隔的荧光强度值，利用这些数值绘制时间-荧光强度曲线，定义为反应曲线；
4)按照步骤3的方法，将同样处理的50μl所述上清加入到只含有2ml荧光共振能量转移缓冲液的反应体系中，该反应体系中不含DS1。在25℃进行反应，获得时间-荧光强度曲线，定义为背景曲线；
5)将反应曲线和背景曲线的加样点取齐后，用反应曲线减去背景曲线中对应的每一个时间点的荧光强度值，得到用于核糖核酸酶含量分析的实际反应曲线，根据完全反应后荧光强度的变化值对实际反应曲线进行标准化，在0至100％的范围进行非线性拟合，得到代表反应速度的K值，然后根据之前得到的RNase A浓度与K值之间关系的标准曲线，最后反向回归得到与K值相对应的RNase A浓度。相关数据分析过程及公式可参见以下两篇文献：1)Liu JQ，Chen CY，Xue Y，Hao YH and Tan Z.G-quadruplex hinders translocation of BLM helicase on DNA：a real-timefluorescence spectroscopic unwinding study and comparison with duplexsubstrates.J Am Chem Soc.2010，132(30)：10521-7；2)Lucius AL，Wong CJand Lohman TM.Fluorescence stopped-flow studies of single turnoverkinetics of E.coli RecBCD helicase-catalyzed DNA unwinding.J Mol Biol.2004339(4)：731-50。
实施例5
本实施例用于说明应用本发明的检测方法检测临床样本中的核糖核酸酶含量、及健康对照个体与肿瘤个体的核糖核酸酶含量的差异分析结果。
分别获得来源于18例胃癌、20例结肠癌、18例肺癌、19例乳腺癌患者的血清各2ml，同时获得24例健康对照个体的对照血清样本各2ml，利用实施例4中的方法分别对这些样本进行荧光共振能量转移实验，获得每个样本中核糖核酸酶的浓度。以健康对照个体的平均值为基准对癌症患者的核糖核酸酶浓度进行统计学分析，结果如表3和图5所示，其中，图5为健康对照个体与肿瘤个体样本中核糖核酸酶含量的比较图，横坐标标出了健康对照以及肿瘤类型组，纵坐标为用健康对照个体的平均值进行归一化的各肿瘤类型的血清样本中的核糖核酸酶的含量。结果表明，与健康对照个体相比，胃癌、结肠癌以及肺癌患者血清中核糖核酸酶的含量降低了30％以上，t检验的结果表明这些差异的P值小于0.05，具有显著性，而乳腺癌患者血清核糖核酸酶的含量与健康对照组相比则没有显著的变化。
表3
| 样本类型 | 样本编号 | 核糖核酸酶含量(％) | 相对于健康对照的比值(％) |
| 健康对照 | 1 | 111.46 | - |
| 健康对照 | 2 | 84.93 | - |
| 健康对照 | 3 | 110.1 | - |
| 健康对照 | 4 | 97.95 | - |
| 健康对照 | 5 | 73.77 | - |
| 健康对照 | 6 | 61 | - |
| 健康对照 | 7 | 71.17 | - |
| 健康对照 | 8 | 107.31 | - |
| 健康对照 | 9 | 93.61 | - |
| 健康对照 | 10 | 85.3 | - |
| 健康对照 | 11 | 81.46 | - |
| 健康对照 | 12 | 94.48 | - |
| 健康对照 | 13 | 91.13 | - |
| 健康对照 | 14 | 97.7 | - |
| 健康对照 | 15 | 95.34 | - |
| 健康对照 | 16 | 103.03 | - |
| 健康对照 | 17 | 86.66 | - |
| 健康对照 | 18 | 161.18 | - |
| 健康对照 | 19 | 105.63 | - |
| 健康对照 | 20 | 101.05 | - |
| 健康对照 | 21 | 174.32 | - |
| 健康对照 | 22 | 99.43 | - |
| 健康对照 | 23 | 108.73 | - |
| 健康对照 | 24 | 103.28 | - |
| 胃癌 | 1 | 66.13 | 66 |
| 胃癌 | 2 | 45.84 | 46 |
| 胃癌 | 3 | 31.62 | 32 |
| 胃癌 | 4 | 24.68 | 25 |
| 胃癌 | 5 | 61.91 | 62 |
| 胃癌 | 6 | 58.77 | 59 |
| 胃癌 | 7 | 66.42 | 67 |
| 胃癌 | 8 | 59.26 | 59 |
| 胃癌 | 9 | 28.27 | 28 |
| 胃癌 | 10 | 43.86 | 44 |
| 胃癌 | 11 | 26.66 | 27 |
| 胃癌 | 12 | 45.25 | 45 |
| 胃癌 | 13 | 11.65 | 12 |
| 胃癌 | 14 | 69.93 | 70 |
| 胃癌 | 15 | 52.2 | 52 |
| 胃癌 | 16 | 24.18 | 24 |
| 胃癌 | 17 | 47.11 | 47 |
| 胃癌 | 18 | 32.12 | 32 |
| 结肠癌 | 1 | 55.71 | 56 |
| 结肠癌 | 2 | 49.45 | 49 |
| 结肠癌 | 3 | 53.68 | 54 |
| 结肠癌 | 4 | 37.44 | 37 |
| 结肠癌 | 5 | 66.04 | 66 |
| 结肠癌 | 6 | 59.88 | 60 |
| 结肠癌 | 7 | 49.28 | 49 |
| 结肠癌 | 8 | 68.98 | 69 |
| 结肠癌 | 9 | 34.22 | 34 |
| 结肠癌 | 10 | 42.46 | 42 |
| 结肠癌 | 11 | 68.69 | 69 |
| 结肠癌 | 12 | 72.94 | 73 |
| 结肠癌 | 13 | 49.85 | 50 |
| 结肠癌 | 14 | 53.44 | 53 |
| 结肠癌 | 15 | 35.71 | 36 |
| 结肠癌 | 16 | 26.83 | 27 |
| 结肠癌 | 17 | 52.51 | 53 |
| 结肠癌 | 18 | 16.49 | 16 |
| 结肠癌 | 19 | 34.48 | 34 |
| 结肠癌 | 20 | 45.63 | 46 |
| 肺癌 | 1 | 42.67 | 43 |
| 肺癌 | 2 | 32.41 | 32 |
| 肺癌 | 3 | 54.08 | 54 |
| 肺癌 | 4 | 58.84 | 59 |
| 肺癌 | 5 | 71.35 | 71 |
| 肺癌 | 6 | 51.87 | 52 |
| 肺癌 | 7 | 55.21 | 55 |
| 肺癌 | 8 | 44.85 | 45 |
| 肺癌 | 9 | 58.6 | 59 |
| 肺癌 | 10 | 31.15 | 31 |
| 肺癌 | 11 | 33.44 | 33 |
| 肺癌 | 12 | 63.79 | 64 |
| 肺癌 | 13 | 61.5 | 62 |
| 肺癌 | 14 | 52.82 | 53 |
| 肺癌 | 15 | 60.76 | 61 |
| 肺癌 | 16 | 13.57 | 14 |
| 肺癌 | 17 | 9.15 | 9 |
| 肺癌 | 18 | 64.61 | 65 |
| 乳腺癌 | 1 | 60.5 | 60 |
| 乳腺癌 | 2 | 73.15 | 73 |
| 乳腺癌 | 3 | 76.87 | 77 |
| 乳腺癌 | 4 | 84.56 | 85 |
| 乳腺癌 | 5 | 85.05 | 85 |
| 乳腺癌 | 6 | 113.07 | 113 |
| 乳腺癌 | 7 | 109.6 | 110 |
| 乳腺癌 | 8 | 88.15 | 88 |
| 乳腺癌 | 9 | 62.98 | 63 |
| 乳腺癌 | 10 | 111.52 | 112 |
| 乳腺癌 | 11 | 90.07 | 90 |
| 乳腺癌 | 12 | 95.65 | 96 |
| 乳腺癌 | 13 | 93.61 | 94 |
| 乳腺癌 | 14 | 102.47 | 102 |
| 乳腺癌 | 15 | 84 | 84 |
| 乳腺癌 | 16 | 77.06 | 77 |
| 乳腺癌 | 17 | 92.55 | 93 |
| 乳腺癌 | 18 | 90.32 | 90 |
| 乳腺癌 | 19 | 94.29 | 94 |
Claims (24)
1.一种核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：1)从受试者个体中获得体液样本；2)使所述体液样本与双链核酸接触，使得所述双链核酸能够被所述体液样本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)检测步骤2)中的接触后的产物，从而检测所述体液样本中核糖核酸酶的含量；
其中，所述体液样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种；
所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸，其长度为7-30个碱基对，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个CA碱基序列或UA碱基序列，第二单链的碱基序列中含有与第一单链中CA碱基序列或UA碱基序列互补的UG碱基序列或UA碱基序列，所述双链核酸的一端连接有能量供体基团，另一端连接有能量受体基团，且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述双链核酸的长度为22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述双链核酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个碱基对。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述双链核酸的长度为9、10、11、12、13、14或15个碱基对。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述双链核酸的长度为7、8、9、10、11或12个碱基对。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法，其中，所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补，所述第一单链的碱基序列为5’-AUGAGCCUGAUUU、5’-AUGAGCCUAAUUU、5’-GGCUGCU、5’-GAAUGAGCU、5’-GAGUCAGCUAATCUU、5’-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU或5’-AGCUGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的检测方法，其中，所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补，所述第一单链的碱基序列为5’-AUGAGCCUGAUUU。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的检测方法，其中，所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的检测方法，其中，所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其中，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’-羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的检测方法，其中，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于同一条核酸单链上。
13.根据权利要求1-11中任意一项所述的检测方法，其中，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于不同核酸单链上。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的检测方法，其中，所述能量供体基团为荧光供体基团，所述能量受体基团为荧光受体基团。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其中，所述荧光供体基团为选自6-羧基荧光素基团、5-四氯荧光素基团、5-六氯荧光素基团、6-羧基-x-罗丹明基团、N，N′-对羧苄基吲哚三菁基团和6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。
16.根据权利要求14所述的检测方法，其中，所述荧光受体基团为选自4-(4’-二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸基团、N，N′-双甲基-N，N′-联苯-4-(5-叔丁氧羰基戊胺)-哌啶砜基罗丹明基团、4′，5′-二硝基荧光素基团、氨基哌啶酸基团、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺基团和4-(4-硝化苯嗪基)萘胺基团中的至少一种。
17.权利要求1-16中任意一项所述的检测方法在肿瘤检测中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其中，所述肿瘤为胃癌、结肠癌或肺癌。
19.根据权利要求17或18所述的应用，其中，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低。
20.根据权利要求19所述的应用，其中，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低30％以上。
21.根据权利要求19所述的应用，其中，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低50％以上。
22.根据权利要求19所述的应用，其中，受试者体液样本中的核糖核酸酶的含量比来自于健康对照个体的体液样本中的核糖核酸酶的含量低70％以上。
23.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1-16中任意一项所述的双链核酸。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有核糖核酸酶标准品。
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