CN115948508B - 一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测尿嘧啶‑DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用，属于酶检测技术领域。本发明将熵驱动DNA催化与DNAzyme生物催化剂相结合，构建了一个熵驱动的哑铃型DNAzyme组装回路系统。该系统能够产生更高的扩增信号，而且具有优异的体内外分析性能，且在实际检测过程中，可在室温下进行一步反应，不需要严格的温度控制和复杂的反应程序。由于级联回路的高信号增强，该策略能够灵敏检测UDG活性，检测限达到为8.71×10^‑6单位每毫升，并能在单细胞水平上准确定量细胞内UDG活性。它可以进一步筛选UDG抑制剂，测量动力学参数，区分癌细胞和正常细胞，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装 回路系统及应用

技术领域

本发明属于酶检测技术领域，具体涉及一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

灵敏和准确监测活细胞内源性尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)对了解DNA修复途径和发现抗癌药物至关重要。传统的UDG活性测定方法包括凝胶电泳法、放射自显影和质谱(MS)，这些方法存在着放射性污染、仪器昂贵和灵敏度差的问题。此外，一些蛋白酶介导的等温信号扩增策略，如指数扩增反应(EXPAR)、滚环扩增(RCA)、外切酶介导的信号扩增、CRISPR/Cas12a催化的信号扩增等方法也用于UDG活性的检测，但是这些酶促反应往往受到狭窄的pH范围和离子浓度的限制，而且蛋白质酶容易受到周围微环境的影响而发生变化，这限制了它们在细胞裂解物或死细胞中的应用。此外，考虑到UDG在单个细胞间表达水平的变异性，这些系综平均UDG分析方法很容易忽略UDG的细胞异质性和空间信息。应该注意的是裂解物或固定细胞中的生物分子的物理化学性质（例如，含量和活性）与活细胞中的生物分子不完全相同。最近，等温无酶信号放大由于反应条件简单、温和，更适合于细胞内原位成像。因此，开发一种内源性无酶扩增策略用于直接观察活细胞中UDG活性是非常可取的。

由于其纳米级的可预见性、良好的可控性和生物相容性以及多用途的修饰能力，各种DNA人工回路在构建具有识别和可编程功能的生物传感系统方面显示出极大的潜力。目前已经开发了多种DNA人工回路用于RNA和酶的原位可视化，包括：DNAzyme、熵驱动DNA催化(EDC)、杂交链式反应(HCR)和催化发夹组装(CHA)。但是，它们的检测灵敏度受到线性信号(1:n)的限制。为了获得更高的信号，已经成功地设计了一些不同DNA回路集成的级联DNA回路，如级联CHA-HCR回路、级联HCR回路、级联CHA-DNAzyme回路和DNA树枝状大分子自组装等。尽管提高了灵敏度，但这些级联DNA放大器受到发夹底物和中间体在流体环境中缓慢动力学的限制，或由于树枝状DNA结构的空间位阻效应而逐渐缓慢的反应速率的限制。此外，这些级联DNA放大器需要小心设计发夹探针，而由于亚稳态发夹结构之间可能发生不希望有的相互作用而导致高背景信号。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统及应用。本发明将熵驱动DNA催化(EDC)与DNAzyme生物催化剂相结合，构建了一个熵驱动的哑铃型DNAzyme组装回路系统。该系统能够产生更高的扩增信号，而且具有优异的体内外分析性能，且在实际检测过程中，可在室温下进行一步反应，不需要严格的温度控制和复杂的反应程序。由于级联回路的高信号增强，该策略能够灵敏检测UDG活性，检测限达到为8.71×10^-6单位每毫升，并能在单细胞水平上准确定量细胞内UDG活性。它可以进一步筛选UDG抑制剂，测量动力学参数，区分癌细胞和正常细胞，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述系统至少包括双链检测底物，三链底物复合物，以及燃料探针和报告探针；

其中，所述双链检测底物由检测探针和触发探针互补构成，所述检测探针其核苷酸序列中修饰有尿嘧啶；当检测体系中存在UDG时，其识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N-糖苷键将其从双链检测底物中分离出来，从而产生一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点；随后，检测体系中的APE1切割检测底物中的AP位点，释放触发探针。

所述三链底物复合物由连接探针、辅助探针1以及辅助探针2构成；

所述连接探针和燃料探针均包含结构域b和结构域g，结构域b和g为具有催化活性的DNAzyme单元；

所述报告探针至少包含一个腺苷核糖核苷酸(rA)，且报告探针两侧标记有荧光基团和猝灭基团；

释放的自由的触发探针与上述连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体（连接探针/触发探针/辅助探针2），同时暴露连接探针的立足点区域d；然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装；释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链；所述连接探针/燃料探针双链的两端包含结构域b和结构域g；

所述系统还包括辅助因子Mg²⁺，所述辅助因子Mg²⁺来源于MgCl₂。加入辅助因子Mg²⁺后，激活DNAzyme的核糖核酸酶活性，从而催化报告探针在rA位置裂解为两个片段，导致荧光基团（如FAM）的荧光恢复和DNAzyme的释放；随后，释放的DNAzyme与新的报告探针杂交启动新一轮的裂解反应，导致大量报告探针水解并产生增强的荧光信号。

本发明的第二个方面，提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的试剂盒，所述试剂盒包含上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统。

本发明的第三个方面，提供一种检测尿嘧啶DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统或试剂盒进行检测。

本发明的第四个方面，提供上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统、试剂盒和/或方法在尿嘧啶-DNA糖基化酶相关药物筛选和/或样品中尿嘧啶DNA糖基化酶检测分析中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1）上述技术方案所涉及的探针均为单链DNA结构，无需精心设计的发夹探针，大大简化了探针的设计。

2）上述技术方案中EDC扩增产物可以完全转化为具有催化活性的双DNAzyme单元，消除了中间产物与DNA反应物随机扩散导致的二次信号扩增系统组装不完整的问题。

3）与单一EDC回路相比，双重EDC-DNAzyme回路具有高信号和良好的体外检测和体内成像性能；双重EDC-DNAzyme回路具有较高的扩增效率，因此该策略具有较高的灵敏度，检测限低至8.71× 10⁻⁶单位每毫升，这是已报道的无酶UDG测定方法中最灵敏的。

4）耦合DNAzyme生物催化剂的EDC效应器级联信号放大可在恒温下进行一锅反应，无需苛刻的温度控制和复杂的反应程序。

5）在温和的操作条件下，通过无酶级联催化放大靶标UDG信号，整个反应可以在均相中进行，不需要繁琐的洗涤/分离步骤。

6）该方法可用于筛选UDG抑制剂，测量动力学参数，定量UDG在癌细胞中的活性。此外，该方法还可以用于区分癌细胞和正常细胞，甚至实时成像细胞内UDG的活性。重要的是，通过合理设计检测探针的损伤部位，可编程双重EDC-DNAzyme回路可以扩展到检测其他DNA修复酶，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明用于细胞内UDG成像的EDC驱动哑铃型DNAzyme组装回路原理图。

图2为本发明实施例中不同实验条件下的双重EDC-DNAzyme回路的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。泳道M表示DNA marker（分子质量参照）；泳道1表示检测探针+连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针+ APE1 + UDG；泳道2表示检测探针+连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针+APE1；泳道3表示连接探针/触发探针/辅助探针2复合物；泳道4表示辅助探针1;泳道5表示辅助探针2；泳道6表示触发探针。泳道1-6对应的荧光图像（下图）由ChemiDoc^TMMP Imaging System拍摄。

图3为本发明实施例中灵敏度检测相关图。A为双重EDC-DNAzyme回路原理图。B为EDC回路原理图。C为时间依赖性荧光变化。曲线a表示双重EDC-DNAzyme回路响应1单位每毫升UDG；曲线b表示双重EDC-DNAzyme回路响应反应缓冲液；曲线c表示EDC回路响应1单位每毫升UDG；曲线d表示EDC回路响应反应缓冲液。D为3h的优化反应时间下的荧光发射光谱。曲线a表示双重EDC-DNAzyme回路响应1单位每毫升UDG；曲线b表示双重EDC-DNAzyme回路响应反应缓冲液；曲线c表示EDC回路响应1单位每毫升UDG；曲线d表示EDC回路响应反应缓冲液。E为双重EDC-DNAzyme和EDC回路产生的荧光强度，其中F表示存在UDG，F ₀表示不存在UDG。F为EDC-DNAzyme和EDC回路产生的荧光强度比，其中F表示存在UDG，F ₀表示不存在UDG。误差棒表示三次重复实验的标准偏差。

图4为本发明实施例特异性检测相关图，A为响应不同浓度UDG的双重EDC-DNAzyme回路的荧光发射光谱。B为由不同浓度UDG产生的双重EDC-DNAzyme（红色曲线）和EDC（绿色曲线）回路的荧光强度。C为双重EDC-DNAzyme （红色曲线）和EDC（绿色曲线）回路的荧光强度与UDG的浓度呈对数线性相关。D为响应反应缓冲液（对照，黑色柱）、1毫克每毫升BSA（蓝色柱）、1毫克每毫升IgG（绿色柱）、1单位每毫升hAAG（青色柱）、1单位每毫升Fpg（橙色柱）、1单位每毫升UDG（粉色柱）、1单位每毫升UDG和上述干扰蛋白的混合物（红色柱）的双重EDC-DNAzyme回路的荧光强度。误差棒表示三次重复实验的标准偏差。

图5为本发明实施例中细胞的UDG检测相关图。A为初始速度随检测底物浓度的变化。UDG浓度为1单位每毫升。B为不同浓度的UGI诱导UDG的相对活性。UDG浓度为0.5单位每毫升。C为分别测定裂解缓冲液（蓝色柱）、裂解缓冲液+ UGI（橙色柱）、HeLa细胞提取物+UGI（绿色柱）、HL-7702细胞提取物（粉色柱）、HeLa细胞提取物（红色柱）产生的荧光强度。细胞提取物相当于10000个细胞。D为双重EDC-DNAzyme（红色曲线）和EDC（绿色曲线）回路的荧光强度与HeLa细胞个数呈对数性相关。

图6为本发明实施例HeLa细胞（下图）和HL-7702细胞（上图）中UDG活性的成像。A为连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针。B为检测底物(T) +连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物。C为检测底物+连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针。比例尺为50 μm。D为定量统计不同条件处理的HeLa细胞和HL-7702细胞的平均荧光强度。A组（紫色柱）：连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针；B组（绿色柱）：检测底物(T) +连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针；C组（黄色柱）：检测底物+连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物+燃料探针+报告探针。

图7为本发明实施例中细胞内UDG检测相关图。A为用于细胞内UDG成像的双重EDC-DNAzyme回路示意图。B为用于细胞内UDG成像的EDC回路示意图。C为使用双重EDC-DNAzyme回路（上图）和EDC回路（下图）对HeLa细胞中UDG活性进行细胞内成像。D为使用双重EDC-DNAzyme回路（红色柱）和EDC回路（绿色柱）定量HeLa细胞的平均荧光强度。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个典型具体实施方案中，提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，所述系统至少包括双链检测底物，三链底物复合物，以及燃料探针和报告探针；

其中，所述双链检测底物由检测探针和触发探针互补构成，所述检测探针其核苷酸序列中修饰有尿嘧啶；当检测体系中存在UDG时，其识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N-糖苷键将其从双链检测底物中分离出来，从而产生一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点；随后，检测体系中的APE1切割检测底物中的AP位点，释放触发探针。

所述三链底物复合物由连接探针、辅助探针1以及辅助探针2构成；

所述连接探针和燃料探针均包含结构域b和结构域g，结构域b和g为具有催化活性的DNAzyme单元；

所述报告探针至少包含一个腺苷核糖核苷酸(rA)，且报告探针两侧标记有荧光基团和猝灭基团；

所述荧光基团和猝灭基团在此不做具体限定，在本发明的一个具体实施方案中，所述荧光基团可以为6-羧基荧光素（FAM），所述猝灭基团可以为黑洞猝灭剂1（BHQ1）。

释放的自由的触发探针与上述连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体（连接探针/触发探针/辅助探针2），同时暴露连接探针的立足点区域d；然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装；释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链；所述连接探针/燃料探针双链的两端包含结构域b和结构域g；

所述系统还包括辅助因子Mg²⁺，所述辅助因子Mg²⁺来源于MgCl₂。加入辅助因子Mg²⁺后，激活DNAzyme的核糖核酸酶活性，从而催化报告探针在rA位置裂解为两个片段，导致荧光基团（如FAM）的荧光恢复和DNAzyme的释放；随后，释放的DNAzyme与新的报告探针杂交启动新一轮的裂解反应，导致大量报告探针水解并产生增强的荧光信号。

本发明一个或多个具体实施方案中，所述系统中的探针均为单链DNA探针，因此无需精心设计发夹探针，极大简化探针的设计。

本发明一个或多个具体实施方案中，所述系统中所使用的探针核苷酸序列如下所示：

当然，所述供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统还可以包含缓冲液等，本领域技术人员可根据实际情况进行选择使用，在此不再做具体限定。当然，上述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统可作为检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的试剂盒的组成成分。

因此，本发明一个或多个具体实施方案中，提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的试剂盒，所述试剂盒包含上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统。

本发明一个或多个具体实施方案中，提供一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统或试剂盒进行检测。

具体的，所述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法包括：

将上述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统、APE1与待测样品进行孵育即得。上述检测方法可以在室温下进行一步反应，不需要严格的温度控制和复杂的反应程序，因此更具体的，所述孵育条件为：在30-40℃（优选为37℃）孵育60-100分钟（优选为90分钟）。

本发明一个或多个具体实施方案中，所述方法还包括对上述孵育反应产物进行凝胶电泳和/或荧光检测分析。

所述荧光检测分析可以是基于荧光分光光度计在488nm的激发波长下测量荧光光谱，扫描范围为500至650 nm。

其中，所述待测样品可以是环境样品或生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞，特别的，经试验证明，本发明的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统能够用于活细胞内尿嘧啶-DNA糖基化酶的检测，从而在单细胞水平上准确定量细胞内UDG活性。

本发明一个或多个具体实施方案中，提供上述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统、试剂盒和/或方法在尿嘧啶-DNA糖基化酶相关药物筛选和/或样品中尿嘧啶-DNA糖基化酶检测分析中的应用。

经试验证明，本发明技术方案能够单细胞水平上准确定量细胞内尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，从而可进一步筛选尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂，测量动力学参数，区分癌细胞和正常细胞等。因此，本发明技术方案特别适合于对活细胞中尿嘧啶-DNA糖基化酶的检测，具有简单，直观且灵敏度高等优点。

所述药物可以是尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂或尿嘧啶-DNA糖基化酶促进剂。

所述样品可以是环境样品或生物样品，所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞，经试验证明，本发明的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统能够用于活细胞内尿嘧啶-DNA糖基化酶的检测，从而在单细胞水平上准确定量细胞内UDG活性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，使用相关探针等核苷酸序列如下所示：

其中，U代表尿嘧啶，rA代表腺苷核糖核苷酸。

实施例

实验方法

DNA复合物的制备：将所有合成的寡核苷酸溶解于1× Tris-EDTA缓冲液（10毫摩尔每升Tris、1毫摩尔每升EDTA, pH 8.0）中制备得到原液。将等量的检测探针和触发探针在1×反应缓冲液（10毫摩尔每升Tris-HCl、10毫摩尔每升MgCl₂，pH 8.0）中稀释，在95℃退火5分钟，然后缓慢冷却至室温，得到双链结构的检测底物。同样，将等量的连接探针、辅助探针1和辅助探针2在1×反应缓冲液中稀释，按照上述步骤，得到连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物。

UDG引发的碱基切除反应和双重EDC-DNAzyme回路：1×标准taq反应缓冲液（10毫摩尔每升Tris-HCl、50毫摩尔每升KCl、1.5毫摩尔每升MgCl₂, pH 8.3）、不同浓度的UDG，100纳摩尔每升检测底物和2U的APE1，在20微升溶液中进行UDG启动的碱基切除反应，37℃反应20 min。然后，将上述5微升碱基切除反应产物加入20微升的级联信号放大系统(含200纳摩尔每升连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物，200纳摩尔每升燃料探针，1.75微摩尔每升报告探针和2微升10×反应缓冲液（100毫摩尔每升Tris-HCl、100毫摩尔每升MgCl₂,pH 8.0）中，室温反应3 h进行EDC驱动的哑铃型DNAzyme组装和报告探针的裂解反应。

凝胶电泳和荧光检测：在1× TBE缓冲液（9毫摩尔每升Tris-HCl、9毫摩尔每升硼酸、0.2毫摩尔每升EDTA， pH 7.9）中，以1× SYBR Gold作为指示剂，采用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证所提策略的可行性。将15微升反应产物，3微升6×上样缓冲液，2微升10× SYBR Gold加入凝胶，室温110 V下运行60分钟。使用Bio-Rad ChemiDoc^TMMP成像系统（美国，加利福尼亚州，赫拉克勒斯）可视化凝胶图像。荧光测量使用日立F-7000荧光分光光度计(东京，日本)进行，激发波长为488 nm，扫描范围为500至650 nm。

抑制试验：检测底物与不同浓度的UGI在37°C孵育15分钟，然后加入2单位的APE1和0.5单位每毫升的UDG。UDG测定遵循上述的程序。根据公式1计算UDG的相对活性(RA)。

RA (%) = C_i/C_t× 100% = 10^{(Fi-Ft) / 1513.22}× 100%(1)

其中F_t和F_i分别为有UGI和无UGI时的荧光强度。C_i和C_t值根据图3C中的线性回归方程得到。

细胞培养和活细胞内的UDG成像：将人宫颈癌细胞系(HeLa)和人肝细胞系(HL-7702)放入含有1％青霉素-链霉素和10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(美国，英杰公司)，在37℃下于5% CO₂的湿润培养箱中培养。用Countstar细胞计数器计数细胞数。使用核提取试剂盒(美国，加利福尼亚州，卡尔斯巴德，试剂盒)提取细胞。HeLa细胞和HL-7702细胞接种于玻璃细胞培养皿底部，在37℃下培养12 h，使用1× PBS冲洗贴壁细胞2次。转染实验中，向细胞中加入500微升Opti-MEM溶液（含7.5微升的Lipofectamine3000，2.5微升10微摩尔每升的检测底物，10微升10微摩尔每升的连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物，10微升10微摩尔每升的燃料探针，5微升100微摩尔每升的报告探针和10微升P3000），在37℃下培养90 min。然后将含有10毫摩尔每升的500微升Opti-MEM溶液加入培养基中并孵育90分钟。转染后，使用1× PBS洗涤细胞6次，然后向培养皿中加入含10% FBS的新鲜DMEM培养基。采用10×物镜的倒置Olympus IX71显微镜（日本，奥林巴斯）采集细胞的荧光图像。

该方法的检测机理如图1所示。该方法包含一个双链检测底物（检测探针/触发探针），一个三链底物复合物（连接探针/辅助探针1/辅助探针2），一个燃料探针和一个报告探针。检测探针是一个14 nt的单链DNA，在结构域b和c1之间修饰一个尿嘧啶。连接探针和燃料探针都包含两个不同的结构域（域b和域g），对应于Mg²⁺依赖的DNAzyme的两个互补亚基。报告探针是一个15 nt的序列，包含一个腺苷核糖核苷酸(rA)，两侧的核苷酸分别标记有荧光团（6-羧基荧光素，FAM）和猝灭剂（黑洞猝灭剂1，BHQ1）。实验包括三个连续的步骤：(1)UDG特异性切割检测底物以释放触发探针，(2)触发探针介导的熵驱动链置换反应用于哑铃型DNAzyme结构组装，(3) DNAzyme催化报告探针循环切割以恢复FAM荧光。在步骤1中，UDG识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N -糖苷键将其从检测底物中分离出来，产生一个脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点。随后，APE1切割检测底物中的AP位点，释放触发探针。在步骤2中，自由的触发探针与连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体（连接探针/触发探针/辅助探针2），同时暴露连接探针的立足点区域d。然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装。释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链。该哑铃型连接探针/燃料探针复合物在DNA双链（即双链EDC-DNAzyme）的两端包含两个具有催化活性的DNAzyme单元（结构域b和g）。在步骤3中，加入辅助因子Mg²⁺后，激活DNAzyme的核糖核酸酶活性，从而催化报告探针在rA位置裂解为两个片段，导致FAM荧光恢复和DNAzyme的释放。随后，释放的DNAzyme与新的报告探针杂交启动新一轮的裂解反应，导致大量报告探针水解并产生增强的荧光信号。当UDG缺失时，不能诱导尿嘧啶碱基的切除，检测探针不能被切割，导致触发探针的立足点区域b*被完整的检测探针阻断。因此，没有发生趾端驱动链置换反应，没有产生活性DNAzyme裂解报告探针，也没有检测到明显的FAM荧光信号。

实验结果

1.可行性验证

为了验证靶标诱导熵驱动放大器的可行性，我们以SYBR Gold为荧光指示剂，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析反应产物。结果如图2所示，当UDG不存在时，可以观察到连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物、检测探针和燃料探针的特征带（图2，泳道2）。当UDG存在时，可以产生比检测探针条带迁移率更高的明显条带（图2，泳道1，黑色虚线框），表明UDG识别了U:A碱基对，并在APE1辅助下特异性切除了尿嘧啶。同时出现辅助探针1（图2,泳道4）和连接探针/触发探针/辅助探针2中间产物（图2,泳道3）的特征条带，燃料探针的条带消失（图2,泳道1）。此外，还检测到比连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物条带迁移率更低的明显条带，即分子量最大的连接探针/燃料探针条带（图2，泳道1，红色虚线框）。由于辅助探针2（图2,泳道5）和触发探针（图2,泳道6）是长度相似的单链DNA，所以它们的电泳迁移率相同，因此在凝胶中很难将它们分离。因此，观察到的模糊带（图2，泳道1，黑色虚线框）对应于触发探针和辅助探针2的混合条带。此外，使用ChemiDocTM MP成像系统（该系统具有蓝色外源照明）对这些管子进行可视化（图2，底部）。UDG存在时产生的亮绿色荧光（图2，泳道1，底部）与UDG不存在时的可忽略的荧光（图2，泳道2，底部）和只存在DNA探针时的荧光（图2，泳道3-6，底部）显著不同，这表明只有UDG存在时才能诱导碱基切除反应从而释放触发探针，启动双重EDC-DNAzyme回路，进而产生放大信号（图2，泳道1，底部）。

为了证明双重EDC- DNAzyme回路的高放大效率（图3A），我们构建了单一EDC回路（图3B）进行对比。通过在辅助探针2的5'端修饰一个FAM和在连接探针3'端修饰一个BHQ1来构建单一EDC回路，但不涉及报告探针和随后的DNAzyme循环裂解反应。在没有UDG的情况下，无论是EDC（图3C，曲线d）还是双重EDC-DNAzyme（图3C，曲线b）回路都没有观察到明显的荧光信号增强，表明EDC和双重EDC-DNAzyme回路的所有组件都稳定共存，没有明显的背景泄漏。加入UDG后，双重EDC-DNAzyme回路产生的荧光信号远高于EDC回路产生的荧光信号（图3C，曲线c），并在3 h达到平台（图3C，曲线a）。因此，我们记录了在最佳反应时间3 h时，双重EDC-DNAzyme回路和EDC回路的荧光发射光谱（图3D）。双重EDC-DNAzyme回路的信号和信噪比分别比单一EDC回路高9.1倍和2.2倍（图3E和F），说明双重EDC-DNAzyme回路能够以高信号和信噪比灵敏检测UDG活性。

2.灵敏度检测

在最佳条件下，我们检测了由不同浓度UDG产生的双重EDC- DNAzyme和EDC回路的荧光强度。如图4A所示，随着UDG浓度增加，EDC-DNAzyme回路的荧光强度也相应增加（图4B，红色曲线）。此外在UDG浓度从1×10⁻⁵单位每毫升到0.5单位每毫升范围内，荧光强度与UDG浓度呈对数线性相关。回归方程为F = 1513.22 lg C + 8170.41（R²= 0.9972，图4C，红色曲线），其中C表示UDG的浓度(单位每毫升)，F代表荧光强度，检出限为8.71 × 10⁻⁶单位每毫升。作为对比，我们测定了EDC回路的灵敏度。如图4B（绿色曲线）所示，随着UDG浓度增加，EDC回路的荧光强度缓慢增加（图4B，红色曲线）。此外在UDG浓度从5 × 10⁻⁴单位每毫升到0.5单位每毫升范围内，荧光强度与UDG浓度呈对数线性相关。回归方程为F = 199.06 lg C+ 926.95（R²= 0.9981，图4C，绿色曲线），检出限为5.75 × 10⁻⁴单位每毫升。值得注意的是，双重EDC-DNAzyme扩增策略的动态范围比单一EDC扩增策略高1个数量级，比基于指数放大反应(EXPAR)的荧光方法高1个数量级，与基于酶介导的三环级联信号扩增的生物发光方法相当。与基于缺口酶辅助信号扩增的比色法（0.02单位每毫升）相比，双重EDC-DNAzyme扩增策略的灵敏度提高了2296倍，比基于外切酶辅助信号扩增的荧光法（0.0025单位每毫升）提高了287倍，比单一EDC扩增策略提高了66倍。灵敏度的提高可归因于双重EDC-DNAzyme回路的高信号增强和高信噪比。

3．特异性检测

我们使用了几种无关蛋白，包括甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)、人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)、免疫球蛋白G (IgG)和牛血清白蛋白(BSA)，评估了所提出策略的特异性。如图4D所示，1单位每毫升UDG产生的荧光信号明显增强（图4D，粉色柱），而1毫克每毫升BSA（图4D，蓝色柱）、1毫克每毫升IgG（图4D，绿色柱）、1单位每毫升hAAG（图4D，青色柱）、1单位每毫升Fpg（图4D，橙色柱）以及不含任何蛋白质的对照组（图4D，黑色柱）产生的荧光信号则可以忽略不计。值得注意的是, 将UDG加入到干扰蛋白中（图4D，红色柱）产生的高荧光信号与1单位每毫升UDG产生的高荧光信号相同（图4D，粉色柱）。这些结果表明所提出的策略对靶标UDG具有良好的选择性。

4.动力学分析

为了进一步使用所提出的策略来测量UDG的酶动力学参数，在37℃下，当存在1单位每毫升UDG和不同浓度检测底物时，计算了在前3分钟UDG催化的dU切除修复反应中的初始速度(V)。如图5A所示，V值随着检测底物浓度的增加而增大。根据米氏方程（式1），得到了UDG的动力学参数，包括米氏常数(K_m)和最大初始速度(V_max)。

V = V_max[S] / (K_m+ [S])(1)

式中[S]为检测底物浓度。K_m值计算为75.42纳摩尔每升，与基于双环级联信号放大（63.2纳摩尔每升）、滚环扩增(RCA)（68.10纳摩尔每升）和三环级联信号放大（100.27纳摩尔每升）的荧光法得到的K_m值一致。

5. UDG抑制剂的评价

有报道称UDG活性异常会导致肿瘤的发生和肿瘤细胞的异质性，而UDG表达升高与多种肿瘤密切相关，如胶质母细胞瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌。因此，UDG抑制剂的筛选对临床肿瘤研究和癌症治疗具有至关重要的意义。我们采用尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)作为模型UDG抑制剂。UGI以1:1的化学计量比与UDG特异性结合，形成生理上不可逆的复合物，使UDG失活。如图5B所示，随着UGI浓度的增加，UDG的相对活性呈剂量依赖性逐渐降低。UGI的半最大抑制浓度(IC₅₀)为0.157单位每毫升，与基于集成DNA结构开关荧光法的半最大抑制浓度（0.2单位每毫升）一致。

6.细胞的UDG检测

我们采用所提出的策略来量化内源性UDG活性。如图5C所示，HeLa细胞提取物（图5C，红色柱）比只有裂解缓冲液的对照组（图5C，蓝色柱）产生更高的荧光强度。为了证实双重EDC-DNAzyme回路增强的荧光信号是由细胞内UDG驱动的，而不是由细胞提取物中的其他干扰成分驱动的，我们使用UGI抑制细胞提取物中UDG的活性。加入UGI后，荧光强度比不加UGI的HeLa细胞提取物降低了88.35 %（图5C，绿色柱），揭示了UGI对UDG活性有明显的抑制作用。值得注意的是，HeLa细胞提取物产生的荧光信号（图5C，红色柱）远高于HL-7702细胞提取物产生的荧光信号（图4C，粉色柱），表明正常细胞中UDG活性较低。此外，HeLa细胞在3～10000个细胞范围内，随着细胞数量增加，双重EDC-DNAzyme回路的荧光强度也相应增加（图5D，红线）。荧光强度与HeLa细胞个数呈对数性相关，相应的方程为F = 1327.76 lg N +537.68 (R²= 0.9824)，其中N是细胞个数，F是荧光强度。检测限达单个细胞。作为比较，我们采用单一EDC回路来测量不同数量的HeLa细胞产生的荧光强度。如图5D（绿线）所示，在100～10000个细胞范围内，随着HeLa细胞数量增加，EDC回路的荧光强度也相应增加，荧光强度与HeLa细胞个数呈对数性相关，方程为F = 208.50 lg N - 147.89 (R²= 0.9968)，其中N是细胞个数，F是荧光强度。检测限计算为52个细胞。双重EDC- DNAzyme扩增策略的灵敏度比EDC扩增策略高52倍，甚至高于酶辅助的双环级联扩增策略（3个细胞）。

7.细胞内UDG的成像

我们进一步研究了双重EDC-DNAzyme回路用于细胞内UDG实时成像的能力。我们设计了一种非特异性检测底物（即检测底物(T)），将检测探针中的尿嘧啶替换为胸腺嘧啶。理论上，UDG不能识别检测底物(T)来启动后续的扩增反应。如图6A所示，当仅将连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物、燃料探针和报告探针转染到活细胞中时，在HeLa细胞或HL-7702细胞中检测到的荧光信号可忽略，表明DNAzyme催化的循环裂解反应没有发生。而将检测底物(T)、连接探针/辅助探针1 /辅助探针2复合物、燃料探针和报告探针转染到活细胞中时，也观察到类似的结果（图6B）。相比之下，经双重EDC-DNAzyme回路处理的HeLa细胞中检测到明亮的荧光信号（图6C，下图），表明由于UDG诱导连接探针/燃料探针复合物组装导致了大量碎片报告探针的产生。值得注意的是，经双重EDC-DNAzyme回路处理的HL-7702细胞中检测到微弱的荧光信号（图6C，上图），表明正常细胞中UDG活性较低。定量分析表明，HeLa细胞产生的荧光强度比HL-7702细胞产生的荧光强度高3.7倍（图6D），这与先前的研究和体外测量结果一致（图5C）。我们进一步研究了双重EDC-DNAzyme回路（图7A）与EDC回路（图7B）在细胞内UDG成像的信号放大效率。与单一EDC回路转染的HeLa细胞中相对较弱的荧光信号相比（图7C，下图），双重EDC回路转染的HeLa细胞中产生了强烈的荧光信号。而且，双重EDC-DNAzyme回路处理的HeLa细胞产生的荧光强度比EDC回路处理的HeLa细胞高6.1倍（图7D）。这些结果表明，双重EDC-DNAzyme回路可以有效地放大信号，为灵敏检测UDG活性铺平道路。

综上，本发明基于熵驱动DNA催化(EDC)与DNAzyme生物催化的结合，构建了一个用于在活细胞检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的哑铃型DNAzyme组装回路（双重EDC-DNAzyme）。其具有如下优势：

1.所涉及的探针均为单链DNA结构，无需精心设计的发夹探针，大大简化了探针的设计。

2.一次EDC扩增产物可以完全转化为具有催化活性的双DNAzyme单元，消除了中间产物与DNA反应物随机扩散导致的二次信号扩增系统组装不完整的问题。

3.与单一EDC回路相比，双重EDC-DNAzyme回路具有高信号和良好的体外检测和体内成像性能。双重EDC-DNAzyme回路具有较高的扩增效率，因此该策略具有较高的灵敏度，检测限低至8.71× 10⁻⁶单位每毫升。当UDG不存在时，由于EDC-DNAzyme的交叉相互作用受到分子内杂交的阻碍，所以功能化的EDC-DNAzyme底物保持完整。当UDG存在时，启动尿嘧啶切除修复反应，导致检测探针断裂，触发探针释放。释放的触发探针可以通过立足点辅助分支迁移启动上游的EDC循环扩增，导致形成两个具有催化活性的DNAzyme单元。由此产生的双DNAzyme单元作为信号转换器，循环切割荧光团/猝灭基团修饰的报告探针，从而产生放大的荧光信号。

4.耦合DNAzyme生物催化剂的EDC效应器级联信号放大可在恒温下进行一锅反应，无需苛刻的温度控制和复杂的反应程序。

5.在温和的操作条件下，通过无酶级联催化放大靶标UDG信号，整个反应可以在均相中进行，不需要繁琐的洗涤/分离步骤。

6.该方法可用于筛选UDG抑制剂，测量动力学参数，定量UDG在癌细胞中的活性。此外，该方法还可以用于区分癌细胞和正常细胞，甚至实时成像细胞内UDG的活性。重要的是，通过合理设计检测探针的损伤部位，可编程双重EDC-DNAzyme回路可以扩展到检测其他DNA修复酶。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，包括双链检测底物，三链底物复合物，以及燃料探针和报告探针；

其中，所述双链检测底物由检测探针和触发探针互补构成，所述检测探针的核苷酸序列中修饰有尿嘧啶；

所述检测探针的核苷酸序列为5’-AGC GAU CGT AGG GT-3’；

所述触发探针的核苷酸序列号为SEQ ID NO.2；

所述三链底物复合物由连接探针、辅助探针1以及辅助探针2构成；

所述连接探针的核苷酸序列号为SEQ ID NO.5；

所述辅助探针1的核苷酸序列号为SEQ ID NO.3；

所述辅助探针2的核苷酸序列号为SEQ ID NO.4；

所述连接探针和燃料探针均包含结构域b和结构域g，结构域b和g为具有催化活性的DNAzyme单元；

所述燃料探针的核苷酸序列号为SEQ ID NO.6；

所述报告探针包含一个腺苷核糖核苷酸，且报告探针两侧标记有荧光基团和猝灭基团；

所述报告探针的核苷酸序列为5’-AGA GTA TrAG GAT ATC-3’；

当检测体系中存在尿嘧啶-DNA糖基化酶时，检测探针识别尿嘧啶碱基，并通过水解尿嘧啶碱基和DNA磷酸骨架之间的N-糖苷键将尿嘧啶-DNA糖基化酶从双链检测底物中分离出来，从而产生一个脱嘌呤/脱嘧啶位点；随后，检测体系中的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1切割检测底物中的脱嘌呤/脱嘧啶位点，释放触发探针；

释放的自由的触发探针与连接探针的趾端区域b结合，并通过趾端驱动链置换将辅助探针1从连接探针上置换下来，形成一个新的三链中间体，同时暴露连接探针的立足点区域d；然后，燃料探针与连接探针上新暴露的立足点区域d结合启动新的立足点辅助的分支迁移反应，导致辅助探针2和触发探针的释放以及连接探针和燃料探针的组装；释放的自由触发探针可以与新的连接探针结合，启动循环链置换反应，从而使连接探针/辅助探针1/辅助探针2复合物分解，产生丰富的连接探针/燃料探针双链；所述连接探针/燃料探针双链的两端包含结构域b和结构域g。

2.如权利要求1所述的检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，所述荧光基团为6-羧基荧光素，所述猝灭基团为黑洞猝灭剂1。

3.如权利要求1所述的检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统，其特征在于，所述系统还包括辅助因子Mg²⁺，所述辅助因子Mg²⁺来源于MgCl₂。

4.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3任一项所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统。

5.一种检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-3任一项所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统或权利要求4所述试剂盒进行检测；

所述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法包括：

将上述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统与待测样品进行孵育即得；所述方法还包括对上述孵育反应产物进行凝胶电泳和/或荧光检测分析；

所述检测尿嘧啶-DNA糖基化酶的方法不以疾病诊断为目的。

6.权利要求1-3任一项所述熵驱动哑铃型DNAzyme组装回路系统或权利要求4所述试剂盒在尿嘧啶-DNA糖基化酶相关药物筛选中的应用。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物为尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂或尿嘧啶-DNA糖基化酶促进剂。