CN109468384A - 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，采用聚合酶链式反应，复合扩增45个Y基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。45个Y基因座包含33个低突变率基因座、9个快速突变型位点和3个极低突变频率的Y Indel基因座。本发明可同时复合扩增45个基因座，对累积的3495个无关男性进行检测，共检测出3491个单倍型，GD值达0.99886；采用新型荧光标记技术，荧光效率高，确保了更快的扩增速度、更好的均衡性和更高的灵敏度；具有很强的检材适应性、较强的扩增特异性、较高的温度耐受性和良好的种属特异性，对高浓度女性样本有很好的耐受性。

Description

一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，属于生物学领域。
背景技术
短串联重复序列(简称STR)也称微卫星DNA，是一类广泛存在于原核及真核生物基因组中的核苷酸重复序列。其一般由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
人类Y染色体的遗传多态性具有多个研究优势，如在遗传过程中不与另外的染色体发生重组，而突变是多样性改变的唯一因素，使得按年代先后发生的各种稳定的单倍型得以保存和进化，从而能够构建出很清楚的Y染色体基因进化谱系树；Y染色体的序列结构特征能稳定地由父亲传给儿子并为男性所特有，具有父系遗传特点；非重组区域具有较低的群体内多态性和较高的群体间变异，易产生人群特异性的单倍型，从而使得其分布方式具有极高的地理特异性；Y染色体非重组区域发生回复、平行突变的概率非常低，增加了Y染色体基因谱系树的可靠性；非重组区域突变率相对稳定，能够很好的区分群体间亲缘关系，STR的突变率高，能够很好区分近代人群个体之间的亲缘关系。
早期的Y-STR复合扩增体系中仅包含有12个左右的Y-STR基因座，而随着DNA作为鉴定手段的应用愈加广泛、数据比对的增加和Y-STR父系遗传的特性不断研究，这就需要更多的基因座来提供更多的信息量以满足各方面的需求，比如在亲子鉴定、失踪人口比对时，为了避免误判的发生，往往需要辅助多种试剂盒进行联合使用，以达到检测的准确度要求。另外，随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用也愈发的重要，这就需要STR试剂盒在基因座位上具有较高的兼容性。近年来，全国公安机关DNA数据库的库容量突飞猛进，利用DNA数据库直接破获的案件越来越多。常规DNA数据库是“一对一、点对点”的比对模式，需要相应的参照比对样本才能进行认定或者排除，而Y-STR数据库则是“以点带面”的比对模式，比中嫌疑人所属的家系即可极大缩小侦查范围。用于比对的Y-STR基因座数量影响比对的效率。公安机关对于用于建库的Y-STR基因座有推荐数量，包括20个必选(DYS19，DYS385a，DYS385b，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS391，DYS392，DYS393，DYS437，DYS438，DYS439，DYS456，DYS458，DYS448，DYS635，Y_GATA_，H4，DYS481，DYS533和DYS576)，15个优选基因座(DYS460，DYS549，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS449，DYS518，DYS627，DYS570，DYS527a，DYS527b，DYS447，DYS444，DYS557，DYS643和DYS596)及25个备选基因座(DYS446，DYS510，DYS622，DYS443，DYS587，DYS522，Y_GATA_A10，DYS520，DYS552，DYS593，DYS531，DYS459a，DYS459b，DYS508，DYS388，DYS617，DYS645，DYS713，DYS630，DYS404S1a，DYS404S1b，DYS626，DYS526a，DYS526b和Y indel)。
发明内容
本发明提供一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，应用于人类Y染色体45个Y基因座的复合扩增，具有扩增快速、均衡性好和灵敏度高的特点，能满足中国人群个体识别、性犯罪等男女混合斑中男性罪犯个体识别、亲子鉴定和Y染色体DNA建库需求等。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，采用聚合酶链式反应，复合扩增45个Y基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。
上述试剂盒采用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座，用于检测人类基因组Y染色体上具有多态性的遗传标记基因。
上述基因测序仪为单道或多道毛细管的基因测序仪。
上述45个Y基因座包含33个低突变率基因座、9个快速突变型位点和3个极低突变频率的Y Indel基因座，其中，33个低突变率基因座为：DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS527a，DYS527b，DYS460，DYS458，DYS19，DYS444，DYS385a，DYS385b，DYS593，DYS393，DYS549，DYS439，DYS392，DYS448，DYS522，DYS456，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS645，DYS459a，DYS459b，DYS437，DYS447，DYS391，DYS643，DYS557和DYS596；9个快速突变型位点为：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS404S1a，DYS404S1b，DYS449和DYS518，以提高近亲男性个体的分辨力；3个极低突变频率的Y Indel基因座为：rs771783753，rs759551978和rs199815934。
首先针对上述45个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃，扩增产物的长度范围为111-463bp，并对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形锋利、峰高较高的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。引物设计参考模板见下表：
表1引物设计模板
基因座 引物模板 基因座 引物模板 基因座 引物模板
rs771783753 AC010889.3 DYS385 a/b AC007379.2 DYS390 AC011289.4
DYS481 AC016991.5 DYS593 AC010135.3 DYS438 AC244434.2
DYS389I/II AC244504.2 rs759551978 AC010889.3 Y_GATA_H4 AC011751.2
DYS635 AC245171.2 rs199815934 AC006376.2 DYS449 AC051663.9
DYS533 AC053516.10 DYS393 AC006152.4 DYS404S1a/b AC073649.3
DYS627 AC009491.3 DYS549 AC010133.4 DYS645 AC009239.3
DYS527a/b AC007965.3 DYS439 AC245170.2 DYS459a/b AC010682.3
DYS576 AC010104 DYS392 AC011745.4 DYS437 AC002992
DYS460 AC009235.4 DYS448 AC025227.6 DYS447 AC005820
DYS458 AC010902.4 DYS518 AC010972.3 DYS391 AC011302
DYS19 AC017019.3 DYS522 AC007247 DYS643 AC007007
DYF387S1a/b AC017005.7 DYS456 AC010106.2 DYS557 AC007876
DYS444 AC007043.3 DYS570 AC012068.5 DYS596 AC016991.5
上述DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同，DYS459a和DYS459b扩增引物相同，DYF404S1a和DYF404S1b扩增引物相同，DYS527a和DYS527b扩增引物相同。
扩增时，45个Y基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物用荧光染料标记，将引物混合，构成复合扩增引物。
为了提高检测的准确性，引物5′端第1个碱基用FAM、HEX、TAMRA、ROX或atto590标记，其中，用TAMRA、ROX或atto590标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记。
将45个Y基因座分为下列五组，第一组：rs771783753，DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS627，DYS527a，DYS527b和DYS576；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a，DYS385b，DYS593和rs759551978；第三组：rs199815934，DYS393，DYS549，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518和DYS522；第四组：DYS456，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，YS449，DYS404S1a和DYS404S1b；第五组DYS645，DYS459a，DYS459b，DYS437，DYS447，DYS391，DYS643，DYS557和DYS596；第一组的引物5′端第一个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用HEX标记；第三组的引物5′端第一个碱基用TAMRA标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记；第四组的引物5′端第一个碱基用ROX标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记；第五组的引物5′端第一个碱基用atto590标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记。本申请引物在上海生工合成。
45个基因座对应的引物编号、引物序列、荧光标记、及扩增系统中各条引物浓度如下表2所示。
表2为基因座对应的引物编号、序列、荧光标记、及浓度
注：5撇端标记FAM，HEX，TAMRA，ROX，ATTO590；中间斜体加下划线碱基以FAM修饰。
本发明中的模板DNA为人类男性基因组DNA。通过各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法和Chelex100纯化等方法提取的DNA，或免提取的滤纸、FTA卡、棉签或纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞，均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)和汗液等。DNA模板量优选在0.1ng至2ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致检测时荧光信号超出检测范围，但可通过减少PCR循环数解决。
为了提高检测的准确性，上述聚合酶链式反应在2×PCR Master MIX缓冲液中进行，2×PCR Master MIX缓冲液组分为：MgCl2：4mM，Tris-HCl(pH8.3，25℃)：100mM，KCl：50mM，(NH4)2SO4：16mM，dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)：0.4mM，BSA：1.2g/L，NP40：1.6wt％，Tween 20：1wt％(以上原料购自美国Sigma-Aldrich公司)和热启动taq酶：0.4U/ul。
本申请反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰。每个扩增体系(25μL)需要2.5U至5U的耐热DNA聚合酶。本发明的扩增体系除了引物混合物，PCR反应Master Mix之外，还包括毛细管电泳检测分型的带荧光标记的分子量内标和等位基因阶梯。
本试剂盒适应不同检材的扩增，具有较大的退火温度范围，扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI2720、Bio-Rad T100和博日Life Pro等)采用以下的程序可以得到较好的结果：预变性95℃，3分钟；94℃，5秒钟；60℃，1分钟；26-28个循环；60℃终延伸10分钟，然后4-16℃保持。扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件进行数据的分析。
在上述反应缓冲体系中按照特定的PCR程序扩增模板DNA，可以得到混合的各基因座扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物进行扩增，使得扩增产物也带有荧光标记物，并且可以在激光激发下发出能够被遗传分析仪(如ABI3100、3130、3730和3500)识别的光信号，通过引物设计和不同荧光素的标记，各基因座扩增片段具有不同长度和不同的荧光标记，所以扩增产物可以在遗传分析仪上电泳分离后进行检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时，首先将扩增产物、分子量内标(InternalLane Standard)和甲酰胺按照一定的比例混合，随后混合物进入仪器毛细管或凝胶中进行电泳分离。分子量内标是由多条带有荧光标记的已知长度的DNA片段组成，可用来衡量PCR扩增产物片段长度，从而计算等位基因的大小，与等位基因阶梯进行比对可推测等位基因分型。
电泳后的数据可以在GeneMapper、PeakScanner和GeneScan等数据分析软件上进行分析，从而得到Y-STR基因分型的图谱和数据。
本发明具很好的种属特异性，具有很好的女性样本耐受力和男性样本检出率。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明的优点及有益效果如下：
1、同时复合扩增45个基因座，对累积的3495个无关男性进行检测，共检测出3491个单倍型，GD值达0.99886。
2、采用新型荧光标记技术，荧光效率高，确保了更快的扩增速度、更好的均衡性和更高的灵敏度。
3、本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex100法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类男性血液或口腔细胞。
4、本试剂盒中的特异性引物，具有较强的扩增特异性(除各基因座的扩增峰外，不存在干扰分析结果的杂峰)和较高的温度耐受性(温度耐受范围较广，保证在使用不同品牌或质量的PCR扩增仪时均能得到较好的扩增结果)；对狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鼠、兔、鱼和大肠杆菌这十种不同种属物种的DNA进行检测，无扩增峰出现，具有良好的种属特异性；对高浓度女性样本有很好的耐受性，2ug女性样本无扩增，对2ug女性样本中0.1ng男性样本可完全检出。
5、本试剂盒有12个基因座扩增产物在220bp范围以内，有利于降解样本的检测。
附图说明
图1为Y-STR检测试剂的STR位点排布图；
图2为实施例2中试剂盒45个基因座等位基因分型标准物图；
图3为实施例2中扩增男性DNA标准品扩增图；
图4为实施例3中扩增男女混合样本扩增图；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1.Y-STR复合扩增试剂的制备
1.Y-STR复合扩增检测系统位点的排布
本发明的Y-STR试剂盒包含常用的33个低突变率基因座：DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I/II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437和DYS385a/b；9个快速突变型基因座：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a/b，DYS449和DYS518；还包括3个突变率极低(千万分之五以下，接近于0)的indel基因座。
上述STR位点的排布方式如图1所示。
2.Y-STR复合扩增体系专用引物
根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如前述表2所示。
3.Y-STR荧光复合扩增验证系统的制备
表3为试剂盒成份表
5×Primers为表2所示的78条引物按照发明内容中表2所示的浓度进行混匀。
表4为每25μL的PCR扩增体系
表5为2×PCR Master Mix的组分
PCR扩增体系即为配制好进行PCR反应的各组分混合物。
MgCl2、Tris-HCl(pH8.3，25℃)、KCl、(NH4)2SO4、dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)、BSA、NP40和Tween 20购自美国Sigma-Aldrich公司，热启动taq酶购自大连宝生物。
Marker Orange-600参照申请号为201610988458.1的专利申请制备。本发明还提供了用于分析的等位基因分型标准物，等位基因分型标准物由各个基因座引物分别扩增对应等位基因的扩增产物混合组成。图2为Allellic ladder电泳图谱。男性DNA标准品9948购自美国Promega公司。
实例2.Y-STR复合扩增验证试剂的应用
1.样本扩增
将24μL由实例1制备的PCR扩增体系加入1μL的0.5ng/μL男性DNA标准品9948，进行PCR扩增。
PCR扩增程序为：95℃，3分钟；94℃，5秒钟；60℃，1分钟；26个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。
2.PCR产物的检测
扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测。
1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。
2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，短暂离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。
3)设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳。检测大约40分钟后，电泳结束。随后，用Gene Mapper软件进行数据分析，其检测结果如下图3所示，上述男性DNA标准品得到完整的STR分型。
实例3.Y-STR复合扩增验证试剂对男女混合斑中男性个体的识别
将24μL由实例1制备的PCR扩增体系加入1μL的男女性DNA混合物，其中，男性DNA样本99480.1ng，女性DNA样本9947A 2ug。按照实施例2的配置扩增体系，PCR扩增程序为：95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，28个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。按照实施例2PCR产物的检测流程进行检测。其检测结果如图4所示，上述混合样本能够检测到完整的男性DNA样本的STR分型，且对女性样本无扩增。
实例4大量样本测试
1、收集亲子鉴定案件中的血样：本实验中样品由亲子鉴定机构提供，样本类型有血滤纸，唾液卡，共3500个无关个体。将1.2mm孔径血滤纸片或唾液卡样本加入配置好的25微升反应体系中，体系如表6所示。
表6
2、扩增检测
按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。3500个样本除5个样本无扩增外，获得3495个检测结果，共3491种不同的单倍型，GD值为0.99886，检出率为99.86％。
本发明包括了公安部建库要求必选和优选的全部35个基因座，并从备选基因座中选取了多态性高的7个STR基因座DYS459a，DYS459b，DYS404S1a，DYS404S1b，DYS522，DYS593，DYS645和3个突变率极低，在中国人群中多态性高的Y indel基因座rs771783753，rs759551978和rs199815934。与同类产品比，本发明一次检测的基因座多，对男性样本的识别力高。对累积的3495个无关男性进行检测，共检测出3491个单倍型，GD值达0.99886。
表7为Y-STR荧光检测试剂盒基因座对比
注：√表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座。

Claims (10)

1.一种同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：采用聚合酶链式反应，复合扩增45个Y基因座，其扩增产物用基因测序仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：包含33个低突变率基因座、9个快速突变型位点和3个极低突变频率的Y Indel基因座，其中，33个低突变率基因座为：DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS527a，DYS527b，DYS460，DYS458，DYS19，DYS444，DYS385a，DYS385b，DYS593，DYS393，DYS549，DYS439，DYS392，DYS448，DYS522，DYS456，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，DYS645，DYS459a，DYS459b，DYS437，DYS447，DYS391，DYS643，DYS557和DYS596；9个快速突变型位点为：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS404S1a，DYS404S1b，DYS449和DYS518；3个极低突变频率的Y Indel基因座为：rs771783753，rs759551978和rs199815934。
3.根据权利要求2所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：DYS389I和DYS389II扩增引物相同，DYF387S1a和DYF387S1b扩增引物相同，DYS385a和DYS385b扩增引物相同，DYS459a和DYS459b扩增引物相同，DYF404S1a和DYF404S1b扩增引物相同，DYS527a和DYS527b扩增引物相同。
4.根据权利要求3所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：扩增时，45个Y基因座采用分别位于该基因座核心重复区两侧的一对引物进行扩增，其中每对引物中至少有一条引物用荧光染料标记，将引物混合，构成复合扩增引物。
5.根据权利要求4所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：引物5′端第1个碱基用FAM、HEX、TAMRA、ROX或atto590标记，其中，用TAMRA、ROX或atto590标记的引物，引物5′端第6个碱基用FAM进行标记。
6.根据权利要求5所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：45个Y基因座分为下列五组，第一组：rs771783753，DYS481，DYS389I，DYS389II，DYS635，DYS533，DYS627，DYS527a，DYS527b和DYS576；第二组：DYS460，DYS458，DYS19，DYF387S1a，DYF387S1b，DYS456，DYS385a，DYS385b，DYS593和rs759551978；第三组：rs199815934，DYS393，DYS549，DYS439，DYS392，DYS448，DYS518和DYS522；第四组：DYS456，DYS570，DYS390，DYS438，Y_GATA_H4，YS449，DYS404S1a和DYS404S1b；第五组DYS645，DYS459a，DYS459b，DYS437，DYS447，DYS391，DYS643，DYS557和DYS596；第一组的引物5′端第一个碱基用FAM标记；第二组的引物5′端第一个碱基用HEX标记；第三组的引物5′端第一个碱基用TAMRA标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记；第四组的引物5′端第一个碱基用ROX标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记；第五组的引物5′端第一个碱基用atto590标记、引物5′端第六个碱基用FAM标记。
7.根据权利要求6所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：45个基因座对应的引物编号、引物序列、荧光标记、及扩增体系中各条引物浓度如下表所示：
表中，中间斜体加下划线碱基以FAM修饰。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：适用的样本DNA，为利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的男性基因组DNA，或者为免提取的滤纸、FTA卡、棉签或纱布中任意一种载体收集的男性血液或口腔细胞。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：聚合酶链式反应在2×PCR Master MIX缓冲液中进行，2×PCR Master MIX缓冲液组分为：MgCl2：4mM，Tris-HCl(pH8.3，25℃)：100mM，KCl：50mM，(NH4)2SO4：16mM，dNTPs(四种脱氧核糖核苷酸的等摩尔混合物)：0.4mM，BSA：1.2g/L，NP40：1.6wt％，Tween 20：1wt％和热启动taq酶：0.4U/ul。
10.根据权利要求1-7任意一项所述的同时检测45个Y基因座的复合扩增检测试剂盒，其特征在于：扩增程序为：95℃，3分钟；94℃，5秒钟；60℃，1分钟；26-28个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。
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