CN112708661B - 一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统 - Google Patents

一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞内5‑醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统，属于有机合成、分析化学及细胞成像领域。包括：合成生物正交ATP试剂ATP‑γ‑炔基；酶化学反应完全封闭细胞内本身存在的5‑羟甲基尿嘧啶；化学还原细胞内5‑醛基尿嘧啶为5‑羟甲基尿嘧啶；通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5‑醛基尿嘧啶上；通过滚换扩增放大荧光信号，实现细胞内5‑醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。解决了现有技术中无法特异性检测细胞内5‑醛基尿嘧啶的技术缺点。

Description

一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统
技术领域
本发明属于细胞成像技术领域，涉及一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统。
背景技术
核酸的表观修饰在生命活动中起重要作用，全面了解天然碱基的修饰对于剖析表观遗传调控至关重要。近年来，现有技术文献报道了一种新型的表观遗传标记5-醛基尿嘧啶(简称5fU)，5-醛基尿嘧啶存在于许多细胞和组织中，可由紫外暴露、电离辐射产生；DNA上5-醛基尿嘧啶修饰会导致基因错配、改变DNA结构、引起DNA功能扰动。由于这些修饰丰度低(小鼠胚胎干细胞内5-醛基尿嘧啶丰度为2.5x10-6dN)以及碱基结构的相似性，导致建立特异性的5fU检测方法极其困难。Zhou等人通过叠氮修饰的苯并咪唑-2-乙腈实现了小鼠海马组织中5fU的分离测序。基于测序的检测方法需要大量细胞样品，且只能得到细胞群体的平均值信息，无法反映单细胞水平差异，亦不能提供亚细胞空间分布特征。
细胞原位荧光成像可以在单细胞水平检测生物分子的亚细胞分布。抗体标记的细胞免疫荧光成像已被用于检测5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)等高丰度DNA修饰。然而，该类方法灵敏度不足，不适用于低丰度的5-醛基尿嘧啶检测。滚环扩增反应是一种靶点等温扩增方法，通过触发环状模板滚动产生具有周期性序列的长链DNA，实现荧光信号放大。前期，申请人团队基于滚环扩增反应，实现了微流控液滴中5-羟甲基尿嘧啶的单分子成像分析；但是，在该工作中，公开了5-羟甲基尿嘧啶DNA激酶(5-羟甲基尿苷DNA激酶)利用ATP底物对5-羟甲基尿嘧啶的特异性磷酸化标记。由于是以巯基修饰的ATP-γ-S作为底物，且由于细胞内存在大量巯基蛋白，ATP-γ-S不能用于细胞原位基因组识别。
因此，当前亟需能够实现细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统，解决了现有技术中无法特异性检测细胞内5-醛基尿嘧啶的技术困难。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，包括：
封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；
将细胞内的5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；
通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-羟甲基尿嘧啶上；
通过滚换扩增放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
优选地，通过酶化学反应封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶是利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上。
进一步优选地，将细胞与20U 5-HMUDK和500μM ATP在1x Cutsmart缓冲液中于37℃孵育2小时。
优选地，采用硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶。
进一步优选地，用1mg/mL硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶，避光室温下反应5分钟。
优选地，通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上，具体操作如下：
利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP-γ-炔基结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上，再通过点击化学反应将DNA引物连接到新生成的5-羟甲基尿嘧啶上。
进一步优选地，将细胞与20U 5-HMUDK和500μM ATP-γ-炔基在1x Cutsmart缓冲液中于37℃孵育2小时。多次洗涤后，通过点击化学反应将叠氮官能团修饰的DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上。
进一步优选地，ATP-γ-炔基是利用ATP和丙胺合成。
更进一步优选地，利用ATP和丙胺合成ATP-γ-炔基，具体操作：将ATP二钠盐(4.9mM)和丙胺(245mM)溶于水中，用稀盐酸将溶液pH调至6.0，随后将EDC-HCl(490mM)加入上述溶液中，在室温下搅拌24h后，用氢氧化钠迅速将溶液pH调至8.5。旋转蒸发后得到淡黄色黏性产物，再通过硅胶柱层析纯化得到白色固体产物ATP-γ-炔基。
本发明公开了一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析系统，包括：
5-羟甲基尿嘧啶封闭模块，用于封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；
5-羟甲基尿嘧啶还原模块，用于将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；
DNA引物连接模块，用于将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上；
荧光信号放大模块，用于放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
优选地，所述5-羟甲基尿嘧啶封闭模块是利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上。
优选地，所述DNA引物连接模块是通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上。
优选地，所述DNA引物为ATP-γ-炔基，是通过ATP和丙胺合成。
优选地，所述荧光信号放大模块是通过滚换扩增放大荧光信号。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，通过提前封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；通过硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；随后利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP-γ-炔基结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上；再通过点击化学反应将DNA引物连接到5-羟甲基尿嘧啶上；通过滚换扩增实现荧光信号放大，最终实现了细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。即可实现单细胞单分子成像。
进一步地，本发明利用ATP和丙胺合成ATP-γ-炔基，反应条件温和，反应简单。
本发明公开的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析系统，反应体系简单，可实现细胞内5-醛基尿嘧啶的快速、准确成像。能够有效解决现有技术中无法特异性检测细胞内5-醛基尿嘧啶的技术缺点。
附图说明
图1为生物正交ATP试剂ATP-γ-炔基的合成过程和反应条件原理图；
图2为本方法对细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析的原理图。
图3为探索细胞内5-醛基尿嘧啶修饰的特异性识别图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
参见图1为本发明的原理图；本发明以细胞内5-醛基胞嘧啶为研究对象，通过本发明方法实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
本发明所述的方法，包括以下四部分：
第一部分，合成生物正交ATP试剂ATP-γ-炔基；如图1所示。
第二部分，酶化学反应完全封闭细胞内本身存在的5-羟甲基尿嘧啶；
第三部分，化学还原细胞内5-醛基尿嘧啶为5-羟甲基尿嘧啶；
第四部分，通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上，通过滚换扩增放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。如图2所示。
实施例1利用本发明方法实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
首先合成生物正交ATP试剂ATP-γ-炔基，包括以下操作：
利用ATP和丙胺合成ATP-γ-炔基。具体地讲，将ATP二钠盐(4.9mM)和丙胺(245mM)溶于水中，用稀盐酸将溶液pH调至6.0，随后将EDC-HCl(490mM)加入上述溶液中，在室温下搅拌24h后，用氢氧化钠迅速将溶液pH调至8.5。旋转蒸发后得到淡黄色黏性产物，再通过硅胶柱层析纯化得到白色固体产物ATP-γ-炔基，保存待用。
制备环化的5fU锁式探针：10μM锁式探针-5fU和30μM连接探针-5fU在10μl 1×T4DNA连接酶反应缓冲液中于55℃条件下杂交2小时，然后加入3μl T4DNA连接酶于37℃孵育2小时，65℃孵育30分钟。然后加入25个单位的核酸外切酶Ⅰ和400个单位的核酸外切酶Ⅲ于37℃下过夜反应，80℃加热30分钟使反应体系中的酶失活，反应所得的环化的5fU锁式探针储存于-20应条件下备用。
以MCF-10A人乳腺细胞系为基本模型，用4％(质量/体积)多聚甲醛室温固定细胞10分钟，PBS清洗细胞3次后，用0.5％(体积/体积)Triton X-100在室温下对细胞进行透性处理5分钟；
PBS清洗细胞3次后，酶化学反应完全封闭细胞内本身存在的5-羟甲基尿嘧啶，包括以下操作：将细胞与20U 5-羟甲基尿苷DNA激酶和500μM ATP在1x Cutsmart缓冲液中于37℃孵育2小时；
PBS清洗细胞3次后，化学还原细胞内5-醛基尿嘧啶为5-羟甲基尿嘧啶，包括以下操作：用1mg/mL硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶，避光室温下反应5分钟；
PBS清洗细胞3次后，通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上，包括以下操作：将细胞与20U 5-羟甲基尿苷DNA激酶和500μM ATP-γ-炔基在1xCutsmart缓冲液中于37℃孵育2小时。
多次洗涤后，通过点击化学反应将叠氮官能团修饰的DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上。然后加入环化的200nM挂锁探针，被上述DNA引物捕获，在37℃下与细胞孵育3小时；2xSSC清洗细胞3次后，加入10μL1x phi29缓冲液，该缓冲液中包含5U phi29聚合酶、2.5mMdNTPs和0.5μLBSA(10mg/mL)，于37℃孵育2小时。洗涤后，加入20μL杂交混合液，杂交混合液中包括200nM FAM-探针和20％甲酰胺，在37℃下培养30分钟；2x SSC清洗细胞3次后，加入20μL DAPI工作液染细胞核，在室温下培养10分钟，最终利用激光共聚焦荧光显微镜对细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
上述实施例设计的序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0002920007860000061
Figure BDA0002920007860000071
荧光结果参见图3，图3中左侧为细胞核染料DAPI的荧光成像通道，可以看出，细胞核染色均匀；中间为5fU的荧光成像通道，每个单点代表5fU的信号，说明本发明的方法可以实现5fU的单分子成像；右边为DAPI通道和5fU通道互相叠加的结果，可以看出，目标物5fU大部分存在于细胞核内。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 西安交通大学
<120> 一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctatgtttc ttgaggaggg cagcaa 26
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcaagaaa tcgacgcgta taataatgct gggctctagt aggtcttgct gccct 55
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcttgagg agggcagcaa 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtataata atgctgggct ctagt 25

Claims (7)

1.一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，其特征在于，包括：
封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；
将细胞内的5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；
通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-羟甲基尿嘧啶上，具体操作如下：利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP-γ-炔基结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上，再通过点击化学反应将DNA引物连接到新生成的5-羟甲基尿嘧啶上；
通过滚环扩增放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
2.根据权利要求1所述的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，其特征在于，封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶是利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上。
3.根据权利要求1所述的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，其特征在于，采用硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶。
4.根据权利要求1所述的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，其特征在于，ATP-γ-炔基是利用ATP和丙胺合成。
5.一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析系统，其特征在于，包括：
5-羟甲基尿嘧啶封闭模块，用于封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；
5-羟甲基尿嘧啶还原模块，用于将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；
DNA引物连接模块，用于利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP-γ-炔基结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上，再通过点击化学反应将DNA引物连接到新生成的5-羟甲基尿嘧啶上；
荧光信号放大模块，用于通过滚环扩增放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。
6.根据权利要求5所述的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析系统，其特征在于，所述5-羟甲基尿嘧啶封闭模块是利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上。
7.根据权利要求5所述的细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析系统，其特征在于，ATP-γ-炔基是通过ATP和丙胺合成。
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