CN114018890B - 一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法 - Google Patents

一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质等复杂生物基质样品中T4多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的新方法。复杂生物基质样品中存在大量盐分和蛋白质，需要经过高倍数稀释，否则难以实现荧光检测T4 PNK。研究发现，当T4 PNK等酶促反应完成时，首先加入定量AgNO3溶液，其次加NaIO4和Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，最后向溶液中加入暗态ssDNA/AgNCs，孵育后可得到亮态ssDNA/AgNCs，进行荧光检测T4 PNK的活性。该方法检测灵敏度高，抗干扰能力强，无需稀释即可适用高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品。

Description

一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域的基因工程工具酶和荧光纳米材料ssDNA/AgNCs，公开了一种ssDNA/AgNCs用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中T4多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的新方法，拓展了ssDNA/AgNCs在复杂样品中检测的应用。
背景技术
基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体 DNA 制备等程序中所需要的酶类。基因工程常用的工具酶，主要是核酸酶、聚合酶、连接酶、DNAzyme和其他修饰酶等。本实验着重介绍四种基因工程工具酶，分别是T4 PNK酶、T4 DNA 连接酶、Vent® (exo-) DNA酶和 Nt.BstNBI酶。T4 PNK来自携带克隆的 T4 PNK 基因的大肠杆菌菌株，催化 Pi 从 ATP 的 γ 位置转移和交换到多核苷酸和核苷 3'-单磷酸的 5'-羟基末端(5’-OH)，进而 T4 DNA 连接酶将催化5'-磷酸末端(5’-PO4)和3’-羟基末端(3’-OH)形成磷酸二酯键从而连接两个DNA片段。Nt.BstNBI是一个缺口内切酶，它识别 DNA 双链体的不对称序列 5’-GAGTC-3’，并且在距离 3’末端四个碱基处仅切割一条链，可以与 Vent® (exo-) DNA聚合酶于55℃协同反应，因此 Nt.BstNBI 有助于循环放大检测信号，实现对目标物的低浓度检测。
银纳米簇（AgNCs）是由几个到几十个银原子组成，它们的超小尺寸接近电子的费米波长，从而其连续的能带被分离成多个独立的能级，展示出分子特性如强荧光性，解决了传统荧光染料光漂白的问题，可作为一种稳定的可控荧光信号源用于生物分子检测。其中，以ssDNA为模板合成的银纳米簇制备简单，往往具有较高的荧光量子产率、光稳定性、发射波长依赖于DNA序列和良好的生物相容性等优点。ssDNA/AgNCs的荧光变化有两种类型。一种是靠近富鸟嘌呤(G)的DNA序列，导致AgNCs的荧光显著增强，而另一种是ssDNA/AgNCs与其互补寡核苷酸杂交，导致AgNCs荧光发生变化。基于不同的荧光“开启”和“关闭”模型，ssDNA/Ag NCs 已成功应用于检测各种生物学上重要的分析物。尽管有这些有利因素，目前基于 ssDNA/Ag NCs 的荧光传感器仍然存在高背景、抗干扰能力弱和相对较低的灵敏度。为提高抗干扰能力，测定样品前进行高倍数稀释尤为重要，但这使得操作变得复杂，灵敏度同样受到挑战。此外，为解决ssDNA/Ag NCs灵敏度低的问题，采用相应扩增方式富集DNA尤为重要。迄今为止，扩增时常用的基因工程工具酶仅限于Exonuclease III (E. coli)，限制了ssDNA/Ag NCs在分子生物学领域的应用。
DNA 5'-羟基末端的磷酸化对于细胞事件很重要，例如 DNA 复制、重组和修复由一些内源性或外源性因素（包括化学物质、电离辐射以及核酸酶等）引起的 DNA 损伤。5'-羟基末端的磷酸化通常由各种修复酶催化，包括常用的T4 PNK。T4 PNK 最初是在感染了 T-even 噬菌体的大肠杆菌的蛋白质提取物中发现的。自 50 多年前发现以来，T4 PNK 已成为双功能修复酶家族的典范，并已成为分子生物学的主力军以及生物学和生物工程领域的宝贵研究工具。其 5'-激酶活性允许 T4 PNK 磷酸化 DNA/RNA 分子的 5'-羟基末端。这将DNA/RNA 转化为 DNA/RNA 连接酶所需的 5'-磷酸底物，在 DNA 和 RNA 修复中发挥重要作用。由于 T4 PNK 具有这些重要的生物学作用，因此准确监测其活性是非常必要的。有许多针对 T4 PNK 的检测方法，包括生物发光、电化学和荧光等方法。尽管它们的性能良好，但其中一些方法操作复杂，不能实现检测复杂样品。
发明内容
本发明的目的在于提供寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的新方法。
本发明另一目的在于以定量检测 Hela 细胞抽提物、人血清和尿液中 T4 PNK 为例，提供上述寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的具体构筑方式。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列，其特征在于它包括五条DNA链；DNA链分别是 T2-DNA链、L-DNA链、T1-DNA链、ssDNA 链和Target-DNA；其中，T2-DNA链、T1-DNA链均与 L-DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target-DNA由两部分组成，3’端含有富G序列，5’端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L-DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L-DNA互补碱基个数；
传感中使用的 T2-DNA、L-DNA、T1-DNA、ssDNA 和 Target-DNA序列如下所示：
T2-DNA(SEQ ID NO.1)：TAGGCAGGAG；
L-DNA(SEQ ID NO.2)：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCC
AAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；
T1-DNA(SEQ ID NO.3)：GAGGTGGTGG；
ssDNA (SEQ ID NO.4)：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；
Target-DNA(SEQ ID NO.5):
TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG。
本发明进一步公开了采用所述寡核苷酸序列用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列的方法，其特征在于按下述步骤进行:
（1）以单链T2-DNA为起点，T2-DNA碱基序列为：TAGGCAGGA；首先，T4 PNK存在时，催化磷酸基团(Pi) 从三磷酸腺苷(ATP)的 γ 位置转移和交换到单链 T2-DNA 的 5'-OH末端，实现5'-OH末端到5'-PO4末端的转换，便于后续T2-DNA与T1-DNA的连接；然后，T2-DNA与T1-DNA经 T4 DNA连接酶作用形成一条长链结构T-DNA。L-DNA与T-DNA形成互补的双链DNA，经 Vent® (exo-) DNA聚合酶作用，dNTPs排列在L-DNA互补序列上，形成有缺口的双链DNA，缺口内切酶Nt.BstNBI作用于dsDNA的缺口，切割下富G序列Target-DNA，循环DNA聚合和切刻过程，富集Target-DNA。该部分由T2-DNA经酶作用一步步合成Target-DNA；具有较低的背景信号，灵敏度较高。
（2）此时溶液中成分复杂，包括复杂生物基质样品含有的大量氯离子与蛋白质以及后加入的多种工具酶。因此，要有针对性地处理反应液中的氯离子和蛋白质，从而适应暗态ssDNA/AgNCs转换成亮态ssDNA/AgNCs荧光银纳米簇。加入适量且过量AgNO3溶液，涡旋使Ag+与Cl-充分结合，加入NaIO4溶液或者加入Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，过量的Ag+用(NH4)2S2O8氧化除去，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液。向上清液中，加入SDS溶液调节蛋白质表面电性；按照ssDNA、AgNO3、NaBH4摩尔比1:1:1~1:10:10，加入AgNO3溶液和NaBH4溶液，形成暗态ssDNA/AgNCs，暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光。测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm；
（3）当复杂生物基质样品内不存在T4 PNK时，T2-DNA 无法完成5’磷酸化过程，不能进一步反应，从而得不到Target-DNA；溶液中的ssDNA/AgNCs仍然处于暗态，无法转换成能产生强荧光发射的亮态ssDNA/AgNCs；所述的复杂生物基质样品指的是Hela细胞、人血清和尿液中T4 PNK。
本发明更进一步公开了采用寡核苷酸序列用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的寡核苷酸序列方法在用于提高复杂生物基质样品抗干扰能力提高稳定方面的应用。实验结果显示：Hela细胞裂解液抽提物、人血清和尿液中T4 PNK。在最佳条件下，T4 PNK 的检测限为 5× 10−5 U/mL，线性范围为0.0002-20.0 U/mL。开发的新方法将进一步用于研究 T4 PNK 抑制剂和实现实时监测 T4 PNK 活性，在生物医学研究和药物筛选方面也显示出巨大的潜力。
本发明更加详细的描述如下：
当酶反应结束经高温停止时，Target-DNA展开成为一条直链，与ssDNA/AgNCs结合，使银簇荧光发生变化。该过程的介质要求严格，其中氯离子和蛋白质的存在严重干扰荧光输出。本方法用AgNO3溶液降低氯离子浓度，然后加入NaIO4溶液又或者加入Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，此外，加入一定比例SDS 和丙三醇提高荧光信号，最终实现寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测。本发明具有操作简单、分析较灵敏和抗干扰能力强的特点。
在上述基础上，所适用的复杂样品包括：Hela 细胞抽提物、人血清和尿液，以定量检测Hela抽提物中 T4 PNK 活性为例，包括以下步骤：
1、本方法共包括五条DNA链和四种酶。DNA链分别是 T2-DNA链、L-DNA链、T1-DNA链、ssDNA 链和Target-DNA链。其中，T2-DNA链、T1-DNA链均与 L-DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target-DNA由两部分组成，3’端含有富G序列，5’端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L-DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L-DNA互补碱基个数；
传感中使用的 T2-DNA、L-DNA、T1-DNA、ssDNA 和 Target-DNA序列如下所示：
T2-DNA(SEQ ID NO.1)：TAGGCAGGAG；
L-DNA(SEQ ID NO.2)：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCC
AAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；
T1-DNA(SEQ ID NO.3)：GAGGTGGTGG；
ssDNA (SEQ ID NO.4)：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；
Target-DNA(SEQ IDNO.5):
TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG。
2、首先，T2-DNA的5’磷酸化过程是T4 PNK 在T4 DNA 连接酶反应缓冲液中催化 Pi从 ATP 的 γ 位置转移和交换到单链的 T2-DNA 的 5'-OH末端，便于后续与T1-DNA的连接。T2-DNA与T1-DNA链摩尔比为1:1，经T4 DNA连接酶作用形成一条长链结构T-DNA，加入的L-DNA与T-DNA的摩尔比为1:4，形成互补的双链DNA。经Vent® (exo-) DNA聚合酶作用一定时间，dNTPs排列在L-DNA互补序列上，形成有缺口的双链DNA。缺口内切酶Nt.BstNBI作用于双链DNA的缺口，切割下富G序列Target-DNA，循环DNA聚合和切刻过程1.5 h，富集Target-DNA。按照ssDNA、AgNO3、NaBH4摩尔比1:5:5，加入AgNO3水溶液和冰水新制NaBH4溶液，4℃下培养6 h以上，加入到DNA溶液中37 ℃保温40 min后于565 nm激发波长下测荧光。
本发明公开的适合高盐、高蛋白质的复杂生物样品中T4 PNK酶活性的检测方法与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明的方法构筑的是多种工具酶联用存在下的“一锅法”免标记的荧光分子生物传感器，省去了DNA荧光标记的复杂过程，实验操作简单，等温加热且耗时短，试剂用量较少成本低，与同类别实验相比背景低，灵敏度较高。 抗干扰能力强，样品消耗量少，稳定性好，无需稀释即可适用高盐高蛋白等复杂生物基质样品，如Hela细胞裂解液、人血清和尿液等样品。
2、本发明采用了以dsDNA为模板的银纳米团簇作为一种输出荧光信号探针，生物相容性较好且设计比较灵活，同时对于DNA序列又具有很强的特异性、专一性较好。
3、本发明将银纳米簇应用于复杂样品中生物小分子的检测，处理步骤简单，选择性好，抗干扰能力强。ssDNA/AgNCs 在高盐、高蛋白质的复杂生物样品中仍可荧光检测，荧光强度与Target-DNA浓度成正比。
4、本发明可以快速检测样品中T4 PNK浓度，对于检测相关基因和预防疾病的发生有很好的指导作用。
5、本发明的方法经过Zn2+、Ce4+和 Pb2+等离子简单处理，高盐高蛋白复杂生物基质样品可直接用于检测，无需高倍数稀释操作。
附图说明
图1为T4 PNK酶存在下的核酸反应示意图。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。本发明所用到的各种试剂均有市售。
实施例1
下面结合附图和具体实施案例对本发明进行详细说明。
一种寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T4 多聚合核苷酸激酶（T4 PNK）活性检测的新方法，其特征在于：经过1 mMZn2+, Ce4+, Pb2+简单处理，高盐、高蛋白质复杂生物基质样品可直接用于样品检测，无需多次过滤及稀释操作；ssDNA/AgNCs在高盐高蛋白复杂生物基质样品中仍能产生稳定的荧光输出，从而使ssDNA/AgNCs抗干扰能力强，适用范围更广具体操作为：
（1）以单链T2-DNA为起点；首先，T4 PNK存在时，催化磷酸基团(Pi) 从三磷酸腺苷(ATP)的 γ 位置转移和交换到单链 T2-DNA 的 5'-OH末端，实现5'-OH末端到5'-PO4末端的转换，便于后续T2-DNA与T1-DNA的连接；然后，T2-DNA与T1-DNA经 T4 DNA连接酶作用形成一条长链结构T-DNA。L-DNA与T-DNA形成互补的双链DNA，经 Vent® (exo-) DNA聚合酶作用，dNTPs排列在L-DNA互补序列上，形成有缺口的双链DNA，缺口内切酶Nt.BstNBI作用于dsDNA的缺口，切割下富G序列Target-DNA，循环DNA聚合和切刻过程，富集Target-DNA。该部分由T2-DNA经酶作用一步步合成Target-DNA；
（2）加入定量AgNO3溶液，使 Ag+ 与 Cl- 充分结合，加入NaIO4溶液或者加入Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，过量的Ag+用(NH4)2S2O8氧化除去，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液。向上清液中，加入SDS溶液；按照ssDNA、AgNO3、NaBH4摩尔比1:1:1，加入AgNO3水溶液和NaBH4溶液，形成暗态ssDNA/AgNCs，暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光。测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm；
（3）当复杂生物基质样品内不存在T4 PNK时，T2-DNA 无法完成5’磷酸化过程，不能进一步反应，从而得不到Target-DNA；溶液中的ssDNA/AgNCs仍然处于暗态，无法转换成能产生强荧光发射的亮态ssDNA/AgNCs；所述的复杂生物基质样品指的是Hela细胞、人血清和尿液。
实施例2
定量检测 Hela 细胞抽提物中 T4 PNK 活性
1.富C序列ssDNA稳定的AgNCs的制备方法特征包括如下步骤：
(a) 配制0.02 mM 100 mL pH7.0的PBS溶液：称取0.7 g Na2HPO4和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。称取0.3 g NaH2PO4·2H2O和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。前面两种溶液经任意比例混合，得到最终pH为7.0的PBS溶液；
(b) 配制0.3 mM 4 mL AgNO3溶液：称取40 mg AgNO3，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.3 mM 4 mL AgNO3溶液；
(c) 配制0.6 M 4 mL NaBH4溶液：称取18 mg NaBH4，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.6 mM 4 mL NaBH4溶液；
(d) 75 µL 0.02 mM PBS、10 µL 50 µM ssDNA和10 µL 0.3 mM新制的AgNO3溶液，涡旋混匀，避光于冰箱中保存10 min；之后加入5 µL 0.6 mM NaBH4溶液，涡旋混匀，避光于4 ℃保存6 h以上；
2.以T2-DNA为起点的核酸反应
首先，在1×T4 PNK反应缓冲液中，加入10 µL 过滤后的Hela 细胞抽提物、1 µL10 µM T2-DNA、1 µL 10 mM ATP和5 U T4 PNK进行5’磷酸化过程。该反应条件为37 ℃加热1h，于65℃加热20 min停止反应。其次，在1×T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1:1的T2-DNA和T1-DNA，200 U T4 DNA连接酶进行连接反应。该反应条件为25℃加热1 h，于65℃加热10分钟停止反应。然后5.4 µL 10 µM T-DNA和2.7 µL 10 µM L-DNA于90 ℃加热10 min，进行预处理，连同5 µL 10×ThermoPol 反应缓冲液、2.5 µL 10×NEBuffer、0.5 U Vent (exo-)DNA聚合酶、2.5 U Nt.BstNBI切刻内切酶和 1 µL 10 mM dNTPs一起加到连接反应液中，并用水稀释至50 µL，于55 ℃反应1.5 h，最终加热至85 ℃ 20 min以停止反应，自然冷却至室温；
3. 反应完成后的处理方式
向反应液中加入适量且过量0.2 M AgNO3，以K2CrO4为指示剂，产生砖红色沉淀为终点。过量的Ag+用少量 (NH4)2S2O8氧化除去。然后加入一定体积1.25 mM NaIO4溶液又或者加入1.25 mM Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液。向上清液中加入3 µL 0.4 mM SDS溶液和3 µL 50%丙三醇溶液，然后加入暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光。激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm。
实验结果显示：在最佳条件下，T4 PNK 的检测限估计为 5× 10−5 U/mL，线性范围为0.0002-20.0 U/mL。
实施例3
定量检测人血清中 T4 PNK 活性
1.富C序列ssDNA稳定的AgNCs的制备方法特征包括如下步骤：
(a) 配制0.02 mM 100 mL pH7.0的PBS溶液：称取0.7 g Na2HPO4和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。称取0.3 g NaH2PO4·2H2O和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。前面两种溶液经任意比例混合，得到最终pH为7.0的PBS溶液；
(b) 配制0.3 mM 4 mL AgNO3溶液：称取40 mg AgNO3，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.3 mM 4 mL AgNO3溶液；
(c) 配制0.6 M 4 mL NaBH4溶液：称取18 mg NaBH4，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.6 mM 4 mL NaBH4溶液；
(d) 75 µL 0.02 mM PBS、10 µL 50 µM ssDNA和10 µL 0.3 mM新制的AgNO3溶液，涡旋混匀，避光于冰箱中保存10 min；之后加入5 µL 0.6 mM NaBH4溶液，涡旋混匀，避光于4℃保存6 h以上；
2.以T2-DNA为起点的核酸反应
首先，在1×T4 PNK缓冲液中，加入10 µL 人血清、1 µL 10 µM T2-DNA、1 µL 10 mMATP和5 U T4 PNK进行5’磷酸化过程。该反应条件为37℃加热1 h，于65℃加热20 min停止反应。其次，在1×T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1:1的T2-DNA和T1-DNA，200 U T4 DNA连接酶进行连接反应。该反应条件为25℃加热1 h，于65℃加热10 min停止反应。然后5.4 µL 10 µM T-DNA和2.7 µL 10 µM L-DNA于90 ℃加热10 min，进行预处理，连同5 µL 10×ThermoPol 反应缓冲液、2.5 µL 10×NEBuffer、0.5 U Vent (exo-) DNA聚合酶、2.5 UNt.BstNBI切刻内切酶和 1 µL 10 mM dNTPs一起加到连接反应液中，并用水稀释至50 µL，于55 ℃反应1.5 h，最终加热至85 ℃ 20 min以停止反应，自然冷却至室温；
3.反应完成后的处理方式
向反应液中加入适量且过量0.2 M AgNO3，以K2CrO4为指示剂，产生砖红色沉淀为终点。过量的Ag+用少量 (NH4)2S2O8氧化除去，研究发现少量还原产物SO4 2-对荧光信号影响甚小。然后加入一定体积1.25 mM NaIO4溶液又或者加入1.25 mM Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液。向上清液中，加入0.4mM SDS溶液和3 µL 50%丙三醇溶液，暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光。测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm。实验结果显示：在最佳条件下，T4 PNK 的检测限估计为 5× 10−5 U/mL，线性范围为0.0002-20.0 U/mL。
实施例 4
定量检测尿液中 T4 PNK 活性
1.富C序列ssDNA稳定的AgNCs的制备方法特征包括如下步骤：
(a) 配制0.02 mM 100 mL pH7.0的PBS溶液：称取0.7 g Na2HPO4和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。称取0.3 g NaH2PO4·2H2O和1.7 g NaNO3，溶解于去离子水中，并稀释至100 mL。前面两种溶液经任意比例混合，得到最终pH为7.0的PBS溶液；
(b) 配制0.3 mM 4 mL AgNO3溶液：称取40 mg AgNO3，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.3 mM 4 mL AgNO3溶液；
(c) 配制0.6 mM 4 mL NaBH4溶液：称取18 mg NaBH4，溶于8 mL去离子水中，稀释100倍得到0.6 mM 4 mL NaBH4溶液；
(d) 75 µL 0.02 mM PBS、10 µL 50 µM ssDNA和10 µL 0.3 mM新制的AgNO3溶液，涡旋混匀，避光于冰箱中保存10 min；之后加入5 µL 0.6 mM NaBH4溶液，涡旋混匀，避光于4℃保存6 h以上；
2.以T2-DNA为起点的核酸反应
首先，在1×T4 PNK缓冲液中，加入10 µL 过滤后的尿液、1 µL 10 µM T2-DNA、1 µL10 mM ATP和5 U T4 PNK进行5’磷酸化过程。该反应条件为37℃加热1 h，于65℃加热20分钟停止反应。其次，在1×T4 DNA连接酶缓冲液中，加入1:1的T2-DNA和T1-DNA，200 U T4 DNA连接酶进行连接反应。该反应条件为25℃加热1 h，于65℃加热10分钟停止反应。然后5.4 µL 10 µM T-DNA和2.7 µL 10 µM L-DNA于90 ℃加热10 min，进行预处理，连同5 µL 10×ThermoPol 反应缓冲液、2.5 µL 10×NEBuffer、0.5 U Vent (exo-) DNA聚合酶、2.5 UNt.BstNBI切刻内切酶和 1 µL 10 mM dNTPs一起加到连接反应液中，并用水稀释至50 µL，于55 ℃反应1.5 h，最终加热至85 ℃ 20 min以停止反应，自然冷却至室温；
3.反应完成后的处理方式
向反应液中加入适量且过量0.2 M AgNO3，以K2CrO4为指示剂，产生砖红色沉淀为终点。过量的 Ag+ 用少量 (NH4)2S2O8 氧化除去，研究发现少量还原产物 SO4 2- 对荧光信号影响甚小。然后加入一定体积1.25 mM NaIO4 溶液又或者加入1.25 mM Zn(NO3)2 溶液氧化蛋白质，然后涡旋使 AgCl 沉淀分散防止包裹 Target-DNA，离心取出上清液。向上清液中，加入0.4 mM SDS溶液和3 µL 50%丙三醇溶液，暗态ssDNA/AgNCs 与 Target-DNA 混合后测荧光。测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm。实验结果显示：在最佳条件下，T4PNK 的检测限估计为 5× 10−5 U/mL，线性范围为0.0002-20.0 U/mL。
总体结论：
本实验可用作敏感的有效方法 T4 PNK 的检测。对照实验使用不同的对照蛋白和T4 PNK 抑制剂证明了该方法检测 T4 PNK 具有一定的选择性。此外，检出限到5× 10−5 U/mL，具有宽动态范围 从0.0002-20.0 U/mL。因此，本实验不仅可以定量监测 T4 PNK的活性，也可用于药物中 T4 PNK 的抑制剂筛选发展。
实施例 5
分析方法性能对比
将本专利与相关分析方法性能指标进行对比：
[备注1] Z. M. Zhu, R. Q. Yu, X. Chu, Amplified fluorescence detectionof T4 polynucleotide kinase activity and inhibition via a coupled λexonuclease reaction and exonuclease III-aided trigger DNA recycling. Anal.Methods, 2014, 6, 6009–6014.
[备注2] C. X. Song, X. H. Yang, K. M. Wang, Q. Wang, J. B. Liu, J.Huang, L. L. He, P. Liu, Z. H. Qing, W. Liu, A sensitive detection of T4polynucleotide kinase activity based on β-cyclodextrin polymer enhancedfluorescence combined with an exonuclease reaction. Chem. Commun., 2015, 51,1815–1818.
[备注3] H. Y. Zhou, C. Y. Tong, W. Zou, Y. P. Yang, Y. B. Liu, B. Li,Y. Qin, W. Y. Dang, B. Liu, W. Wang, A novel fluorescence method for activityassay and drug screening of T4 PNK by coupling rGO with ligase reaction.Analyst, 2019, 144, 1187–1196.
[备注4] H. X. Jiang, Y. P. Xu, L. H. Dai, X. W. Liu, D. M. Kong,Ultrasensitive, label-free detection of T4 ligase and T4 polynucleotide kinasebased on target-triggered hyper-branched rolling circle amplification. SensorActuat. B-Chem, 2018, 260, 70–77.
[备注5] H. Zhao, Y. Yan, M. J. Chen, T. T. Hu, K. F. Wu, H. S. Liu,C. B. Ma, Exonuclease III-assisted signal amplification strategy forsensitive fluorescence detection of polynucleotide kinase based on poly(thymine)-templated copper nanoparticles. Analyst, 2019, 144, 6689–6697。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
taggcaggag 10
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccccacccca ccccacccgc cacatgttat tccaaaatta gactcctcct gcctacgcca 60
ccacct 66
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggtggtgg 10
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccttaatcc ccgccacatg ttattccaaa 30
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttggaataa catgtggcgg gtggggtggg gtgggg 36

Claims (2)

1.一种用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T4 PNK活性检测的寡核苷酸序列，其特征在于它包括五条DNA链；DNA链分别是 T2-DNA链、L-DNA链、T1-DNA链、ssDNA 链和Target-DNA链；其中，T2-DNA链、T1-DNA链均与 L-DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target-DNA由两部分组成，3’端含有富G序列，5’端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L-DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L-DNA互补碱基个数；
传感中使用的 T2-DNA、L-DNA、T1-DNA、ssDNA 和 Target-DNA序列如下所示：
T2-DNA：TAGGCAGGAG；SEQ ID NO.1
L-DNA：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCCAAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；SEQ ID NO.2
T1-DNA：GAGGTGGTGG；SEQ ID NO.3
ssDNA：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；SEQ ID NO.4
Target-DNA:
TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG；SEQ ID NO.5。
2.采用权利要求1所述用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中T4 PNK活性检测的寡核苷酸序列进行检测的方法，其特征在于按下述步骤进行：
（1）以单链T2-DNA为起点；首先，T4 PNK存在时，催化磷酸基团Pi 从三磷酸腺苷ATP的γ 位置转移和交换到单链 T2-DNA 的 5'-OH末端，实现5'-OH末端到5'-PO4末端的转换，便于后续T2-DNA与T1-DNA的连接；然后，T2-DNA与T1-DNA经 T4 DNA连接酶作用形成一条长链结构T-DNA；L-DNA与T-DNA形成互补的双链DNA，经 Vent® exo-DNA聚合酶作用，dNTPs排列在L-DNA互补序列上，形成有缺口的双链DNA，缺口内切酶Nt.BstNBI作用于dsDNA的缺口，切割下富G序列Target-DNA，循环DNA聚合和切刻过程，富集Target-DNA；
（2）加入过量的AgNO3溶液，涡旋使Ag+与Cl-充分结合，加入NaIO4溶液或者加入Zn(NO3)2溶液氧化蛋白质，过量的Ag+用(NH4)2S2O8除去，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液；向上清液中，加入十二烷基磺酸钠SDS溶液；按照ssDNA、AgNO3、NaBH4摩尔比1:1:1~1:10:10，加入AgNO3水溶液和NaBH4溶液，形成暗态ssDNA/AgNCs，暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光；测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm；
（3）当复杂生物基质样品内不存在T4 PNK时，T2-DNA 无法完成5’磷酸化过程，不能进一步反应，从而得不到Target-DNA；溶液中的ssDNA/AgNCs仍然处于暗态，无法转换成能产生强荧光发射的亮态ssDNA/AgNCs；所述的复杂生物基质样品指的是Hela细胞、人血清和尿液。
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One-step highly sensitive florescence detection of T4 polynucleotide kinase activity and biological small molecules by ligation-nicking coupled reaction-mediated signal amplification;Feng Chen;Biosensors andBioelectronics;全文 *
激酶检测方法的最新研究进展;刘杨;邹笑然;李琛琛;张春阳;;分析化学(第01期);全文 *

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