CN110954518B - 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 - Google Patents
一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110954518B CN110954518B CN201911273379.2A CN201911273379A CN110954518B CN 110954518 B CN110954518 B CN 110954518B CN 201911273379 A CN201911273379 A CN 201911273379A CN 110954518 B CN110954518 B CN 110954518B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dumbbell
- solution
- dna
- atp
- copper nanoparticle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000010949 copper Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 62
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 61
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 61
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 claims description 17
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 claims description 17
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 claims description 17
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 claims description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 15
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims description 10
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 54
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 abstract description 51
- ZIALXKMBHWELGF-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cu] Chemical compound [Na].[Cu] ZIALXKMBHWELGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 abstract 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 2
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100483399 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC34 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Pathology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用，将5＇端磷酸化的DS DNA在T4 DNA连接酶和ATP的作用下，制备得到哑铃型DNA，进一步在哑铃型DNA的基础上制备结合了铜钠米粒子的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，并且随着加入的三磷酸腺苷浓度的增大，哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度随之增大，从而构建ATP浓度与荧光强度之间的线性关系，实现了对三磷酸腺苷的高灵敏性、特异性的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低的优点。
Description
技术领域
本发明属于荧光传感制备技术领域，具体涉及一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是一种多功能的核苷酸，它不仅是一个普遍的能源，而且也是一种细胞外信号传导介质，涉及许多生物过程包括膜离子通道，DNA复制，生物合成，也被用作生物体的细胞活性和细胞损伤指标。因此，在生化研究以及临床诊断方面应用广泛,对于ATP的高灵敏和高选择性的检测是必不可少的。目前已经开发了对于ATP检测的策略，许多基于主-客体，肽，共轭聚合物，DNA/RNA适配体和ATP依赖的连接反应，即使有一些方法表现出非常好的分析性能，他们通常涉及到信号标记，且时间比较长，成本较高。基于此，我们通过实验探究设计并提出了一个最佳发光体哑铃型(DS)的DNA模板结构，用来生长CuNPs，以此作为荧光探针，实验ATP的高灵敏检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用，将5＇端磷酸化的DS DNA在T4 DNA连接酶和ATP的作用下，制备得到哑铃型DNA，进一步在哑铃型DNA的基础上制备结合了铜钠米粒子的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，其可实现对于ATP的高灵敏性检测。
本发明采取的技术方案为：
一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将5＇端磷酸化的DS DNA溶液在缓冲溶液中，然后加入T4 DNA连接酶和ATP，反应50～60min，得到哑铃型DNA溶液；
(2)将步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液加入到缓冲溶液中，再加入Cu2+溶液和抗血酸钠溶液，混合均匀并反应至少5min，即可得到哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器。
所述5′端磷酸化的DS DNA的基因序列为：
5’-PO4-ATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATAT-3’。
所述步骤(1)之后还包括：向所述的哑铃型DNA溶液中加入Exo I和Exo III，反应60min，然后于80℃孵育5分钟。通过Exo I和Exo III的加入证明本发明制备的哑铃型DNA不会被Exo I和Exo III破坏。
步骤(1)中，所述5′端磷酸化的DS DNA溶液、缓冲溶液、T4 DNA连接酶、ATP的体积之比为50:144:1:5；所述5′端磷酸化的DS DNA溶液的浓度为1μM；所述T4 DNA连接酶的浓度为350U/μL。
所述缓冲溶液为PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液。
步骤(2)中，所述哑铃型DNA溶液、缓冲溶液、Cu2+溶液、抗血酸钠溶液的体积之比为1:1:1:1；所述哑铃型DNA溶液的浓度为1μM；所述Cu2+溶液的浓度为0.8mM；所述抗坏血酸钠的溶液的浓度为8mM。
进一步地，5′端磷酸化的DS DNA、Exo I、Exo III的体积之比为10:1:1。
本发明还提供了所述的制备方法制备得到的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器在定量检测ATP中的应用。
所述ATP的定量检测方法包括以下步骤：
(a)分别将5′端磷酸化的DS DNA溶液在缓冲溶液中，然后分别加入T4DNA连接酶和不同浓度的ATP，反应50～60min，得到哑铃型DNA溶液；
(b)分别将步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液加入到缓冲溶液中，再加入Cu2+溶液和抗血酸钠溶液，混合均匀并反应至少5min，分别得到铜纳米粒子荧光生物传感器；
(c)分别测试步骤(b)得到的各铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，以ATP浓度为横坐标，各铜纳米粒子荧光生物传感器在630nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建标准曲线，得到线性方程；
(d)根据标准曲线或者线性方程，即可根据待测ATP重复步骤(a)和(b)制备的铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，计算出待测ATP的浓度。
步骤(c)中，设置荧光分光光度计的激发波长和发射波长分别为340nm、630nm。
本发明提供的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，基于T4 DNA连接酶和ATP的连接作用，5′端磷酸化的粘性末端在目标物三磷酸腺苷存在的情况下，5′端能与3′端连接起来形成哑铃型DNA，当外切酶Ⅰ和III同时存在时，此哑铃型DNA模板保持完好，不会被破坏。并且在抗坏血酸钠和铜离子的存在下，可在此哑铃型DNA模板上生成铜纳米粒子，以此构建哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，并且随着加入的三磷酸腺苷浓度的增大，哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度随之增大，从而构建ATP浓度与荧光强度之间的线性关系，实现了对三磷酸腺苷的高灵敏性、特异性的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低。
与现有技术相比，本发明提供的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光传感器的制备方法，使用的5＇端磷酸化的DS DNA在DNA连接酶和ATP作用下形成哑铃型DNA，操作简单，成本很低，避免任何化学标记和修饰且背景信号低。
附图说明
图1为哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的原理图；
图2为不同ATP浓度下构建的哑铃型DNA/铜纳米粒子的荧光光谱图，a-k所对应的ATP终浓度分别为0.1、1、10、20、50、100、200、500、1000、5000、10000nM；
图3为ATP浓度与哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光强度的线性关系；
图4为哑铃型DNA/铜纳米粒子对于ATP检测的可行性图，a表示DS DNA+100nM ATP+T4 ligase+Exo I+Exo III；b表示DS DNA+Exo I+Exo III；c表示DS DNA+T4 ligase+Exo I+Exo III；
图5为编号为1～4的发夹DNA制备的荧光CuNPs荧光光谱图；
图6为编号为5～8的发夹DNA制备的荧光CuNPs荧光光谱图；
图7为编号为1～4的发夹DNA制备的荧光CuNPs模板结构示意图；
图8为编号为5～8的发夹DNA制备的荧光CuNPs模板结构示意图；
图9为哑铃型DNA/铜纳米粒子的形成时间荧光光谱图；
图10为抗坏血酸钠浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图；
图11为铜离子浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图；
图12为不同pH值对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图；
图13为不同分析物对哑铃型DNA/铜纳米粒子的荧光光谱：空白，GTP，CTP，UTP，ATP及其混合物；
图14为T4 DNA连接酶浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子影响的荧光光谱图；
图15为T4 DNA连接酶的连接时间对哑铃型DNA/铜纳米粒子影响的荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明进行详细说明。
实施例1
一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将50μL 1μM的5＇端磷酸化的DS DNA溶液溶解在34μL PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液中，然后加入1μL 350U/μL T4 DNA连接酶和5μL ATP，并补加PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液至反应体系的体积为200μL，在室温下，50分钟即可发生ATP引发的连接反应，得到哑铃型DNA溶液；
所述5＇端磷酸化的DS DNA的基因序列为：
5’-PO4-ATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATAT-3’；
(2)将步骤(1)得到的50μL哑铃型DNA溶液加入到50μL PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液中，再加入50μL 0.8mM CuSO4溶液和50μL 8mM抗血酸钠溶液，混合均匀并反应6min，即可得到哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器，且随步骤(1)中ATP浓度的增大，其荧光强度依次增大，结果如图2所示，进而可以实现对于ATP的定量检测。
实施例2
一种ATP的定量检测方法，其他同实施例1，只是步骤(1)中分别加入不同浓度的ATP，使ATP在反应体系中的终浓度分别为0.1、1、10、20、50、100、200、500、1000、5000、10000nM；
然后分别测试步骤(2)得到的各哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，荧光分光光度计的激发波长和发射波长分别为340nm、630nm。如图2所示，以0～20nM范围内的ATP浓度为横坐标，各哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器在630nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建标准曲线，如图3所示，得到线性方程F＝27.06CATP+874.09，其相关系数为R2＝0.992；
根据标准曲线或者线性方程，即可根据待测ATP重复步骤(1)和(2)制备的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，计算出待测ATP的浓度。
实施例3
为了验证哑铃型DNA溶液的稳定性，其他同实施例1，只是固定步骤(1)中的ATP终浓度为100nM，向实施例1的步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液中，加入5μL 5U/μL Exo I和5μL200U/μL Exo III，室温下剪切60分钟，60分钟后于80℃孵育5分钟，用于终止降解反应。然后将50μL 8mM抗坏血酸钠加入上述混合液中，充分混合，再将50μL 0.8mM CuSO4加入上述溶液充分混合，于室温下6分钟，检测反应体系的荧光强度，发现所得产物即制备得到的生物传感器依然具有较强的荧光，说明哑铃型DNA结构不会被外切酶剪切，当铜离子与抗坏血酸存在时，依然能够形成荧光铜纳米粒子，其具有较强的荧光强度，如图4中曲线a所示。
并在同样的条件下，分别将50μL 1μM的5＇端磷酸化的DS DNA溶液溶解在150μL PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液中，然后加入5μL 5U/μL Exo I和5μL 200U/μL Exo III，室温下剪切60分钟，60分钟后于80℃孵育5分钟，然后将50μL 8mM抗坏血酸钠加入上述混合液中，充分混合，再将50μL 0.8mM CuSO4加入上述溶液充分混合，于室温下6分钟，测试体系的荧光强度，结果如图4中曲线b所示；
并在同样的条件下，分别将50μL 1μM的5＇端磷酸化的DS DNA溶液溶解在149μL PH＝7.6的10mM MOPS缓冲溶液中，然后加入1μL 350U/μL T4DNA连接酶，反应50分钟，再加入5μL 5U/μL Exo I和5μL 200U/μL Exo III，室温下剪切60分钟，60分钟后于80℃孵育5分钟，然后将50μL 8mM抗坏血酸钠加入上述混合液中，充分混合，再将50μL 0.8mM CuSO4加入上述溶液充分混合，于室温下6分钟，测试体系的荧光强度，结果如图4中曲线c所示；
从图4中曲线b、c可以看出，当没有添加ATP时，5＇端磷酸化的DS DNA的5＇端与3＇端不会连接起来，在外切酶的作用下，会将DS DNA模板剪切，此时没有模板用于生长铜纳米粒子，就不会形成荧光铜纳米粒子，说明只有在ATP的存在下，5＇端磷酸化的DS DNA的5＇端与3＇端才会连接起来，使DS DNA的模板不会被外切酶破坏，提供铜纳米粒子的模板。
实施例4
各反应条件的筛选
4.1DNA模板优化
(1)分别将2μL八个1μM发夹DNA(编号1、2、3、4、5、6、7、8)溶液加入98μL的PH＝7.610mM MOPS缓冲溶液中，95℃孵育5分钟，使发夹DNA解螺旋，培养，得到混合溶液；所述发夹DNA溶液制备方法为：将发夹序列溶解在10mM MOPS PH＝7.6的缓冲溶液中，使发夹DNA序列的浓度为1μM；
(2)分别在步骤(1)制备的八个发夹DNA溶液中，加入50μL 0.8mM CuSO4溶液和50μL 8mM抗坏血酸钠溶液，培养10分钟，分别测试各反应体系的荧光强度，结果如图5、6所示，从图中可以看出编号5的发夹DNA的荧光强度最大，从而获得最佳发光体，因此选用5＇端磷酸化的DS DNA的基因序列为：
5’-PO4-ATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATAT-3’，以通过T4 DNA连接酶和ATP的连接构建哑铃型DNA。
各反应体系所形成的荧光通纳米粒子模板结构示意图如图7、8所示。各发夹DNA的基因序列如下所示：
DNA1，编号1：
3’-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-5’；
DNA2，编号2：
3’-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-5’；
DNA3，编号3：
3’-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-5’；
DNA4，编号4：
3’-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC-5’；
DNA5，编号5：
3’-ATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATAT-5’；
DNA6，编号6：
3’-ATATATATATATATATATATATATGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCATATATATATATATATATATATAT-5’；
DNA7，编号7：
3’-ATATATATATATATATATATATATGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCATATATATATATATATATATATAT-5’；
DNA8，编号8：
3’-ATATATATATATATATATATATATGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCATATATATATATATATATATATAT-5’。
4.2各反应条件优化
哑铃型DNA/铜纳米粒子的形成时间荧光光谱图如图9所示，从图中可以看出在反应至6min时反应体系的荧光强度已趋于稳定，说明此时已形成稳定的荧光传感器。
抗坏血酸钠终浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图如图10所示，从图中可以看出反应体系中抗坏血酸钠终浓度在2mM时反应体系的荧光强度最大，因此反应时抗坏血酸钠终浓度为2mM。
铜离子终浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图如图11所示，从图中可以看出反应体系中铜离子终浓度在100mM时反应体系的荧光强度最大，因此反应时铜离子终浓度为100mM。
不同pH值对哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光影响的荧光光谱图，如图12所示，从图中可以看出反应体系pH为7.6时反应体系的荧光强度最大，因此反应时反应所使用的MOPS缓冲溶液的pH为7.6。
不同分析物对哑铃型DNA/铜纳米粒子的荧光光谱，如图13所示，从图中可以看出该反应体系可排除其他物质的干扰。
T4 DNA连接酶终浓度对哑铃型DNA/铜纳米粒子影响的荧光光谱图，如图14所示，从图中可以看出T4 DNA连接酶的终浓度在1.75U/uL时，反应体系的荧光强度趋于稳定，因此反应时加入的T4 DNA连接酶在反应体系中的终浓度为1.75U/uL
T4 DNA连接酶的连接时间对哑铃型DNA/铜纳米粒子影响的荧光光谱图，如图15所示，从图中可以看出加入T4 DNA连接酶后反应50min时，反应体系的荧光强度趋于稳定，因此T4 DNA连接酶和ATP加入后反应50min即可得到稳定的哑铃型DNA。
上述各反应条件，均是在实施例1或3的条件下，固定ATP的浓度为100nM，对单一条件变化后进行的实验。
上述参照实施例对一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP中的应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测ATP
中的应用
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 108
<212> DNA
<213> DS DNA
<400> 1
5'-PO4-atatatatat attttttttt tttttttttt tttttttttt ttatatatat atatatatat 60
atatattttt tttttttttt tttttttttt ttttttatat atatatat-3' 108
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> DNA1
<400> 2
5'-gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt tttttttttt tttttttttt ttttgcgcgc 60
gcgcgcgcgc gcgcgcgc-3' 78
<210> 3
<211> 83
<212> DNA
<213> DNA2
<400> 3
5'-gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt tttttttttc cccctttttt tttttttttg 60
cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgc-3' 83
<210> 4
<211> 93
<212> DNA
<213> DNA3
<400> 4
5'-gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt tttttttttc cccccccccc cccctttttt 60
tttttttttg cgcgcgcgcg cgcgcgcgcg cgc-3' 93
<210> 5
<211> 108
<212> DNA
<213> DNA4
<400> 5
5'-gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt tttttttttt tttttttttt ttttcccccc 60
cccccccccc cccccccccc ccccgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgc-3' 108
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> DNA5
<400> 6
5'-atatatatat atatatatat atattttttt tttttttttt tttttttttt ttttatatat 60
atatatatat atatatat-3' 78
<210> 7
<211> 98
<212> DNA
<213> DNA6
<400> 7
5'-atatatatat atatatatat atatgcgcgc gcgctttttt tttttttttt tttttttttt 60
ttttgcgcgc gcgcatatat atatatatat atatatat-3' 98
<210> 8
<211> 118
<212> DNA
<213> DNA7
<400> 8
5'-atatatatat atatatatat atatgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt tttttttttt 60
tttttttttt ttttgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcatatat atatatatat atatatat-3' 118
<210> 9
<211> 138
<212> DNA
<213> DNA8
<400> 9
5'-atatatatat atatatatat atatgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgctttttt 60
tttttttttt tttttttttt ttttgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcgcgcgc gcgcatatat 120
atatatatat atatatat-3' 138
Claims (8)
1.一种哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将5＇端磷酸化的DSDNA溶液在缓冲溶液中，然后加入T4 DNA连接酶和ATP，反应50～60min，得到哑铃型DNA溶液；
(2)将步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液加入到缓冲溶液中，再加入Cu2+溶液和抗血酸钠溶液，混合均匀并反应至少5min，即可得到哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器；
所述5′端磷酸化的DSDNA的基因序列为：
5’-PO4-ATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATATATATATATATATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATATAT-3’；
步骤(2)中，所述哑铃型DNA溶液、缓冲溶液、Cu2+溶液、抗血酸钠溶液的体积之比为1:1:1:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)之后还包括：向所述的哑铃型DNA溶液中加入Exo I和Exo III，反应60min，然后于80℃孵育5分钟。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述5′端磷酸化的DSDNA溶液、缓冲溶液、T4 DNA连接酶、ATP的体积之比为50:144:1:5；所述5′端磷酸化的DSDNA溶液的浓度为1μM；所述T4 DNA连接酶的浓度为350U/μL。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为PH＝7.6的10mMMOPS缓冲溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，5′端磷酸化的DS DNA、Exo I、Exo III的体积之比为10:1:1。
6.如权利要求1-5任意一项所述的制备方法制备得到的哑铃型DNA/铜纳米粒子荧光生物传感器在定量检测ATP中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，ATP的定量检测方法包括以下步骤：
(a)分别将5′端磷酸化的DSDNA溶液在缓冲溶液中，然后分别加入T4 DNA连接酶和不同浓度的ATP，反应50～60min，得到哑铃型DNA溶液；
(b)分别将步骤(1)得到的哑铃型DNA溶液加入到缓冲溶液中，再加入Cu2+溶液和抗血酸钠溶液，混合均匀并反应至少5min，分别得到铜纳米粒子荧光生物传感器；
(c)分别测试步骤(b)得到的各铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，以ATP浓度为横坐标，各铜纳米粒子荧光生物传感器在630nm处的荧光强度值为纵坐标作图，构建标准曲线，得到线性方程；
(d)根据标准曲线或者线性方程，即可根据待测ATP重复步骤(a)和(b)制备的铜纳米粒子荧光生物传感器的荧光强度，计算出待测ATP的浓度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(c)中，设置荧光分光光度计的激发波长和发射波长分别为340nm、630nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911273379.2A CN110954518B (zh) | 2019-12-12 | 2019-12-12 | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911273379.2A CN110954518B (zh) | 2019-12-12 | 2019-12-12 | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110954518A CN110954518A (zh) | 2020-04-03 |
| CN110954518B true CN110954518B (zh) | 2022-08-02 |
Family
ID=69981155
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911273379.2A Active CN110954518B (zh) | 2019-12-12 | 2019-12-12 | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110954518B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111650169A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-09-11 | 吉林大学 | 一种基于断裂活性脱氧核酶构成的荧光型铜离子传感器 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087765A (zh) * | 2014-05-16 | 2015-11-25 | 深圳先进技术研究院 | 聚胸腺嘧啶模板、基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、atp的检测方法 |
| CN105203515A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-30 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 |
| CN106282175A (zh) * | 2015-06-07 | 2017-01-04 | 复旦大学 | 荧光纳米铜簇的发卡式dna模板及其应用 |
| CN106442446A (zh) * | 2016-09-21 | 2017-02-22 | 安徽师范大学 | 荧光生物传感器，其制备方法及其用途 |
| CN107037021A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-11 | 信阳师范学院 | 一种聚腺嘌呤dna模板的荧光铜纳米粒子及其制备方法和应用 |
| CN107084954A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-08-22 | 安徽师范大学 | 一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法 |
| CN107937480A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-04-20 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器、制备方法及其检测有机磷农药的应用 |
-
2019
- 2019-12-12 CN CN201911273379.2A patent/CN110954518B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087765A (zh) * | 2014-05-16 | 2015-11-25 | 深圳先进技术研究院 | 聚胸腺嘧啶模板、基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、atp的检测方法 |
| CN106282175A (zh) * | 2015-06-07 | 2017-01-04 | 复旦大学 | 荧光纳米铜簇的发卡式dna模板及其应用 |
| CN105203515A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-30 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器的制备方法及其应用 |
| CN106442446A (zh) * | 2016-09-21 | 2017-02-22 | 安徽师范大学 | 荧光生物传感器，其制备方法及其用途 |
| CN107037021A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-11 | 信阳师范学院 | 一种聚腺嘌呤dna模板的荧光铜纳米粒子及其制备方法和应用 |
| CN107084954A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-08-22 | 安徽师范大学 | 一种荧光传感器的制备方法、一种检测酪氨酸酶的方法 |
| CN107937480A (zh) * | 2017-11-09 | 2018-04-20 | 安徽师范大学 | 一种荧光生物传感器、制备方法及其检测有机磷农药的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Multifunctional Dumbbell-Shaped DNA-Templated Selective Formation of Fluorescent Silver Nanoclusters or Copper Nanoparticles for Sensitive Detection of Biomolecules;Jinyang Chen et al.;《APPLIED MATERIALS & INTERFACES》;20151231;第8卷;第1786-1787页，第1790-1791页 3.2 荧光 AgNCs 和 CuNPs 的表征、3.3 ATP检测原理及可行性、3.4 ATP检测性能，图2、图4，support information第S-2页 * |
| 激酶检测方法的最新研究进展;刘杨 等;《分析化学》;20180131;第46卷(第1期);第11-19页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110954518A (zh) | 2020-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102719526B (zh) | 一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法 | |
| Leung et al. | Detection of base excision repair enzyme activity using a luminescent G-quadruplex selective switch-on probe | |
| CN107760762B (zh) | 一种检测dna腺嘌呤甲基转移酶的荧光化学传感器及其检测方法 | |
| CN109161579B (zh) | 基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用 | |
| CN109576342B (zh) | 一种用于检测碱性磷酸酶的荧光化学方法与应用 | |
| CN109001167A (zh) | 一种基于适配体和碳点的链置换信号放大荧光传感器检测三磷酸腺苷的方法及试剂盒 | |
| Zhu et al. | Highly sensitive and specific mass spectrometric platform for miRNA detection based on the multiple-metal-nanoparticle tagging strategy | |
| KR20180074800A (ko) | 표적 분석물질에 대한 데이터 세트의 보정 방법 | |
| CN102653789A (zh) | 一种生物分子的定量检测方法 | |
| CN107937482A (zh) | 一种检测多核苷酸激酶的试剂盒及其检测方法 | |
| Xie et al. | A novel electrochemical aptasensor for highly sensitive detection of thrombin based on the autonomous assembly of hemin/G-quadruplex horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme nanowires | |
| Ma et al. | A novel kinase-based ATP assay using molecular beacon | |
| JPWO2009144914A1 (ja) | Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ検出方法、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ検出方法およびテロメラーゼ活性測定方法 | |
| Chen et al. | Ultra-sensitive MicroRNA-21 detection based on multiple cascaded strand displacement amplification and CRISPR/Cpf1 (MC-SDA/CRISPR/Cpf1) | |
| CN110954518B (zh) | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 | |
| CN102495125B (zh) | 利用dna序列自断裂和高能指数面的纳米金晶体检测l-组氨酸的方法 | |
| Guo et al. | A multiple amplification strategy for nucleic acid detection based on host–guest interaction between the β-cyclodextrin polymer and pyrene | |
| CN112011597B (zh) | 一种诱导型变构探针结合滚环扩增的镉离子传感方法 | |
| Liu et al. | A label-free electrochemical sensor for the detection of two kinds of targets based on CRISPR/Cas12a system | |
| CN113640268A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法 | |
| Yuan et al. | CATCH: high specific transcriptome-focused fusion gene variants discrimination | |
| CN104087655B (zh) | 基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法 | |
| CN105950755A (zh) | 基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测microRNA的方法 | |
| Chi et al. | Luminescence determination of microRNAs based on the use of terbium (III) sensitized with an enzyme-activated guanine-rich nucleotide | |
| Yan et al. | A fluorescence strategy for the rapid detection of miRNA-21 based on G-quadruplex and cyclic amplification signal |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |