CN113156124A - 一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条，本申请基于Cas12a的基因编辑，Cas12a能够在引物带领下特异性地识别新冠病毒N基因和ORF基因上的结合位点，随后Cas12a被激活，可以非特异性的剪切标记有荧光基团和猝灭基团的探针序列，切断后的探针可发出荧光，可以直接用qPCR检测新冠病毒，也可以用普通PCR扩增后，采用本申请设计的胶体金试纸条检测，本申请将基因编辑以及免疫层析技术试纸条技术结合起来，可快速完成对新冠病毒核酸的特异性检测，大大提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和效率。

Description

一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法和胶体金试纸条。
背景技术
为了应对新型冠状病毒(COVID-19)，迅速出现了多种新冠病毒检测方法，主要分为抗体检测，抗原检测，核酸检测等，由于新冠IgM/IgG抗体出现相对滞后，不利于及时发现感染，而抗原检测的检出率偏低，不能满足临床需要，因此临床确诊主要采用核酸检测法。
目前新冠病毒核酸检测的方法主要有荧光定量PCR，可以将微量的核酸序列放大到能够被仪器检测到的水平，检测灵敏度高，能够检测处于潜伏期的病原体，该方法获批的检测试剂生产厂家很多,产能也满足实际需求，但该方法需要BSL-2级实验室、实时荧光定量PCR仪和核酸提取仪等苛刻条件和昂贵设备，且检测周期较长(3-4小时)，试剂耗材成本高。
等温扩增技术是近年来新出现的一种简易核酸扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同温度下具有活性的酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。与PCR相比，等温扩增对仪器的要求大大简化甚至不需要仪器，反应时间也大大缩短，能更好满足快速简便检测的需求，常用的等温扩增法有环介导恒温扩增法(LAMP)，重组酶介导恒温扩增法(RAA)，和重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，在恒定温度也能高效扩增核酸，摆脱了热循环仪的限制，但是容易产生假阳性信号。
发明内容
针对上述技术背景中的问题，本发明目的是提供一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法与胶体金试纸条。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板，在所述底板上自左至右依次分布有样品垫、金标垫、层析垫和吸收垫；所述层析垫内含有 FAM单抗，所述层析垫包括粘贴在所述底板的硝酸纤维素膜、检测线与质控线，所述质控线平行排布于检测线的左侧，所述质控内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线内抗体为羊抗鼠IgG。
进一步地，所述底板的材料为PVC或PS；所述样品垫的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫长度为25～30mm；所述吸收垫的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。
进一步地，所述金标垫、吸收垫分别与层析垫两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫、吸收垫位于层析垫上方；所述金标垫与层析垫重叠 1mm-1.5mm；所述吸收垫与层析垫重叠2mm。
进一步地，所述样品垫与金标垫边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫位于样品垫与底板之间。
本发明的另一目的，使用上述胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，包括如下步骤：
1)N和ORF基因目标片段扩增
采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取 2*P6High-fidelitypre mix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N 和ORF目标片段进行扩增；
2)crRNA转录模板退火
根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORF DNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；
利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，合成靶向N基因和ORF基因的crRNA-F/R两条寡核苷酸链，退火合成双链DNA；
3)体外转录crRNA
将crRNA-F/R退火合成双链DNA，体外转录并纯化获得N-crRNA、 ORF-crRNA；
4)构建新冠病毒检测体系
取体外转录并纯化的N-crRNA和ORF-crRNA，N和ORF稀释成1nM和10nM，与AsCas12a250nM、ssDNA-FQ 500nM、crRNA 500nM置于缓冲液中；
5)检测分析
对测试基因N和ORF进行检测：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，CRISPR产物用PBS或者纯水稀释到80μl，滴加到胶体金试纸条的样品垫上，等待5-10min，观察并分析检测结果。
进一步地，步骤1中N和ORF基因目标片段扩增引物名称与引物序列为：
N-target-PF-2：AAGGCCAACAACAACAAGGC
N-target-PR-2：TTTAGGCTCTGTTGGTGGGA
ORF-target-PF-2：ATCCTTTGGTGGTGCATCGT
ORF-target-PR-2：TTTAGCAAAACCAGCTACT。
进一步地，步骤2中退火合成双链DNA方法：在PCR反应管中加入Annealing Bufferfor DNA oligos(5×)20ul，DNA oligo A 20ul，DNA oligo B 20ul， DEPC水40ul，根据Annealing buffe for DNA Oligos说明书的退火程序合成双链DNA。
进一步地，步骤3中体外转录crRNA方法：根据测量的DNA浓度，将退火合成的DNA加入1μg所需的体积，按照T7外转录试剂盒流程进行体外转录。
进一步地，对测试基因N和ORF进行检测的另一方法：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，qPCR仪中37℃，1h，根据荧光分析新冠病毒检测结果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本申请基于Cas12a的基因编辑，Cas12a能够在引物带领下特异性地识别新冠病毒N基因和ORF基因上的结合位点，随后Cas12a被激活，可以非特异性的剪切标记有荧光基团和猝灭基团的探针序列，切断后的探针可发出荧光，可以直接用qPCR检测新冠病毒，也可以用普通PCR扩增后，采用本申请设计的胶体金试纸条检测，本申请将基因编辑以及免疫层析技术试纸条技术结合起来，可快速完成对新冠病毒核酸的特异性检测，大大提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和效率。
本发明胶体金试纸条中将质控线(C线)抗体更换为易包被的大分子生物素单抗，而且为了减少样本在等温扩增过程中产生的假阳性信号，创造性地将质控线(C线)和检测线(T线)位置互换，可以先让C线捕获样品中的未被切断探针而显色，然后让被切断的探针随着流动相继续向前流动，金标FAM可被T线捕获而显色，最终可根据显色结果对待测样本进行判读。
结果判读原理：若待测样本中含有新冠病毒，经过基因编辑体系的扩增，其中的ssDNA-FQ就会被切断，当待测样本流经金标垫，未被切断的探针中的 FAM端就会和金标垫中胶体金标记的FAM单抗结合形成抗原抗体复合物，通过毛细作用继续向前层析，结合物的生物素一端就会与C线上固定的生物素单抗结合，形成新的抗原抗体复合物被固定在控制线上，形成肉眼可见的红色，而被切断的探针也会在流经金标垫时和和金标垫中胶体金标记的FAM单抗结合形成抗原抗体复合物，继续向前层析与固定在T线的羊抗鼠IgG结合，形成肉眼可见的红色。
附图说明
图1为本发明中N和ORF基因目标片段扩增后跑胶的凝胶成像图；
图2为本发明中N-crRNA和ORF-crRNA的电泳图；图中1为N-crRNA，2 为ORF-crRNA；
图3为CRISPR目标片段检测结果图；
图4为不同拷贝数标靶DNA检测结果图；
图5为本发明检测新冠病毒的胶体金试纸条的结构示意图；图中：1-底板； 2-样品垫；3-金标垫；4-层析垫；5-吸收垫；6-硝酸纤维素膜；7-检测线；8-质控线；
图6为使用本发明胶体金试纸条检测不同拷贝数CRISPR产物的结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
原料：Cas12a酶、T7体外转录试剂盒均为购买所得，实验用新冠基因片段、引物及探针均为人工合成。用于扩增的2*P6High-fidelitypre mix试剂盒购自 TOLOBIO。
CRISPR体系反应buffer为自制，配方如下：100mM NaCl，50mM Tris-HCI，Magnesium acetate(4合水)10mM，BSA 100μg/ml，最终PH为7.5，以上为20ul 反应体系所需量。
实施例1基因编辑方法的建立
1)N和ORF基因目标片段扩增
本实验用于检测N和ORF基因的样本来自上海生工合成的含有N和ORF 基因部分序列的质粒，采用使用Primer3Plus在线引物设计软件设计出引物。
引物序列如下：
表1N和ORF目的片段扩增PCR引物对序列信息
Figure BDA0002870556850000051
取扩增试剂盒，根据说明书要求，利用PCR仪对目标片段进行扩增，取10μl PCR产物加2μl 6×Loading Buffer，在140V下跑1％琼脂糖凝胶20分钟后在凝胶成像仪下记录结果。
如图1所示，说明引物对T-clone-Orf-P2和T-clone-N-P2(表1)可以很好的扩增出N和ORF目的片段。
2)crRNA转录模板退火
根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORF DNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列，利用T7启动子 (TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的 20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R。合成靶向N基因和ORF基因的crRNA-F/R两条寡核苷酸链。
在PCR反应管中加入Annealing Buffer for DNA oligos(5×)(该试剂盒购自碧云天)20ul，DNA oligo A 20ul，DNA oligo B 20ul，DEPC水40ul，根据 Annealing buffefor DNA Oligos说明书的退火程序合成双链DNA。
3)体外转录crRNA
根据测量的DNA浓度，将退火合成的DNA加入1μg所需的体积，按照 T7外转录试剂盒流程进行体外转录，转录模板如表2。
表2转录模板
Figure BDA0002870556850000061
将crRNA进行体外转录，将表2的crRNA-F/R退火合成双链DNA，测量其浓度，将1μg的DNA于37℃体外转录并体纯化获得N-crRNA、ORF-crRNA。分别吸取2μL进行琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶浓度为3％，电泳仪设为200V。为防止RNA电泳时间过长，会发生降解，影响crRNA结果鉴定，故电泳时间调整至10min。对crRNA转录进行鉴定：N和ORF crRNA 体外转录琼脂糖凝胶电泳图结果如图2所示，结果表明：电泳条带单一且清晰明亮，N和ORF成功被体外转录并纯化，没有降解，可用于后续试验。
4)CRISPR-Cas12a检测目标片段
测试CRISPR-Cas12a目标片段检测，对测试基因N和ORF进行检测，将体外转录并纯化的N-crRNA和ORF-crRNA分别与ssDNA-FQ reporter(探针序列 /56-FAM/TTATT/3BHQ1/)和Cas12a蛋白按照表3的反应体系(靶标DNA N 和ORF稀释成1nM和10nM)加入到去RNase的PCR中，qPCR仪中37℃， 1h。如图3所示，针对N和ORF基因设置了不含标靶DNA的阴性对照组(5、 6)，和对照组(5、6)相比，不同靶标DNA浓度的实验组荧光均被释放。
说明：ssDNA探针成功被切开，6-FAM荧光基团与BHQ-1猝灭基团分开，当体系内含有10nM和1nM的靶标N和ORF DNA时，都可成功切割，表明 CRISPR-Cas12a新冠检测体系初步建成。
表3 20μl CRISPR目标片段检测体系
Figure BDA0002870556850000062
Figure BDA0002870556850000071
5)CRISPR-Cas12a检测灵敏度测试
将含有N基因和ORF基因部分序列的载体梯度稀释到1copy、10copy、100 copy、1000copy、104copy、105copy。以稀释后的载体为模板进行PCR扩增，取2μl扩增产物到CRISPR-Cas12a反应体系中，测试CRISPR-Cas12a检测灵敏度。检测体系具有高灵敏度，可检测到的靶标DNA低至100copy。如图4所示。
实施例2胶体金试纸条的制作
如图5所示，胶体金试纸条，包括底板1，在所述底板1上自左至右依次分布有样品垫2、金标垫3、层析垫4和吸收垫5；所述层析垫4内含有FAM单抗，所述层析垫4包括粘贴在所述底板1的硝酸纤维素膜(NC膜)6、检测线7与质控线8，所述质控线8平行排布于检测线7的左侧，所述质控线8内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线7内抗体为羊抗鼠IgG。
底板1的材料为PVC或PS；样品垫2的材料为玻璃纤维素膜；金标垫3 的材料为聚酯纤维素膜；吸收垫5的材料为吸水纸。
1 40nm胶体金制备(柠檬酸三钠还原法)
(1)取1g四氯金酸加入1ml超纯水溶解，标记浓度为100％；
(2)取干净烧杯一只，内放干净的搅拌子，加入100ml超纯水，盖上培养皿加热
(3)超纯水沸腾后，拿开玻璃皿，加入0.5％柠檬酸三钠、1％氯金酸，10min 后停止加热。
(4)放在磁力搅拌器上持续搅拌直至冷却至室温。
2金标FAM单抗及金标垫制备
(1)取1.5ml离心管，加入1ml胶体金，用0.2M K2CO3溶液，调节pH 6.4 左右(调胶体金溶液的pH值时请勿使用pH计，胶体金可致使pH电极报废，可使用精密pH试纸判定胶体金溶液的pH值)。
(2)向调节好pH的胶体金溶液加入3.9μg FAM单抗，旋转反应30min；
(3)加入100μl 10％BSA，旋转封闭30min；10000g，4℃离心20min，弃上清；
(4)加入1ml 200mM硼酸/PEG20000重悬液重悬，10000g，4℃离心20min，弃上清，按照15％的胶体金溶液比例加入200mM硼酸/PEG20000/BSA重溶液重溶回收。
(5)聚酯纤维素膜经含有海藻糖、BSA、蔗糖、PVP的磷酸盐缓冲液浸泡 10min，37℃过夜烘干，裁剪成6mm宽。
(6)将回收的金标液铺于已处理裁剪的聚酯纤维素膜上，37℃烘烤干燥2h。
3样品垫制备
玻璃纤维素膜经含有海藻糖、BSA、Triton-100、PVA的磷酸盐缓冲液浸泡 10min，37℃过夜烘干，裁剪成17mm宽。
4NC膜包被
(1)将25mm*300mm的NC膜粘贴在PVC底板上，室温平衡30min。
(2)检测线(T线)包被液：用含有蔗糖和甲醇的磷酸盐缓冲液配制1.0mg/ml 羊抗鼠IgG；
(3)质控线(C线)包被液：用含有蔗糖和甲醇的磷酸盐缓冲液配制2.5mg/ml 生物素单抗；
(4)质控线包被液和检测线包被液均以0.8μl/cm的速率用划膜喷金仪包被于硝酸纤维素膜上，质控线与检测线距离为4.0mm，37℃过夜烘干。
5试纸条的组装
(1)将上述制备好的样品垫、金标垫、粘贴NC膜、17mm吸水纸依次粘贴在PVC底板上；金标垫与与NC膜重叠0.1cm-0.15cm；吸水纸与NC膜重叠 0.2cm；
(2)用切条机切成4.0mm宽的试纸条备用。
实施例3 N基因及ORF基因扩增产物的检测
分别将不同拷贝数的CRISPR产物用PBS或者纯水稀释到80μl，滴加到试纸条的样品垫上，等待5-10min，观察结果。结果如图6。
如图6所示，从左到右拷贝数为阴性、1copy、10copies、100copies、1000 copies、104copies、105copies。
从结果可以看出，该胶体金试纸条对本申请中使用基因编辑体系扩增新冠病毒N基因及ORF基因的检测限为100copies。
本发明将质控线(C线)抗体更换为易包被的大分子生物素单抗，而且为了减少假阳性，创造性地将质控线(C线)和检测线(T线)位置互换，可以先让C线捕获样品中的未被切断探针而显色，然后让被切断的探针随着流动相继续向前流动，金标FAM可被T线捕获而显色，最终可根据显色结果对待测样本进行判读。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (9)

1.一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，该层析试纸条包括底板(1)，在所述底板(1)上自左至右依次分布有样品垫(2)、金标垫(3)、层析垫(4)和吸收垫(5)；其特征在于，所述层析垫(4)内含有FAM单抗，所述层析垫(4)包括粘贴在所述底板(1)的硝酸纤维素膜(6)、检测线(7)与质控线(8)，所述质控线(8)平行排布于检测线(7)的左侧，所述质控线(8)内抗体为易包被的大分子生物素单抗，所述检测线(7)内抗体为羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述底板(1)的材料为PVC或PS；所述样品垫(2)的材料为玻璃纤维素膜，其长度为15～20mm；所述金标垫(3)的材料为聚酯纤维素膜，其长度为5～8mm；所述层析垫(4)长度为25～30mm；所述吸收垫(5)的材料为吸水纸，其长度为15～20mm。
3.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫(3)、吸收垫(5)分别与层析垫(4)两端边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)、吸收垫(5)位于层析垫(4)上方；所述金标垫(3)与层析垫(4)重叠1mm-1.5mm；所述吸收垫(5)与层析垫(4)重叠2mm。
4.根据权利要求1所述的一种检测新冠病毒的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)与金标垫(3)边缘上下交叠，边缘上下交叠部分中金标垫(3)位于样品垫(2)与底板(1)之间。
5.一种使用如权利要求1-4任一所述的胶体金试纸条进行新冠病毒检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)N和ORF基因目标片段扩增
采用人工合成的含有新冠病毒N基因和ORF基因序列的质粒，取2*P6High-fidelitypremix试剂盒，在引物带领下，使用PCR仪对测试基因N和ORF目标片段进行扩增；
2)crRNA转录模板退火
根据Cas12a识别富含T的特性，针对靶标N和ORF DNA序列，设计一段在PAM序列后的20-23bp的靶点序列；
利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+AsCas12a的scaffold序列(TAATTTCTACTCTTGTAGAT)+靶点序列(靶标DNA PAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，合成靶向N基因和ORF基因的crRNA-F/R两条寡核苷酸链，退火合成双链DNA；
3)体外转录crRNA
将crRNA-F/R退火合成双链DNA，体外转录并纯化获得N-crRNA、ORF-crRNA；
4)构建新冠病毒检测体系
取体外转录并纯化的N-crRNA和ORF-crRNA，N和ORF稀释成1nM和10nM，与AsCas12a250nM、ssDNA-FQ 500nM、crRNA 500nM置于缓冲液中；
5)检测分析
对测试基因N和ORF进行检测：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，CRISPR产物用PBS或者纯水稀释到80μl，滴加到胶体金试纸条的样品垫上，等待5-10min，观察并分析检测结果。
6.根据权利要求5所述的一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤1中N和ORF基因目标片段扩增引物名称与引物序列为：
N-target-PF-2：AAGGCCAACAACAACAAGGC
N-target-PR-2：TTTAGGCTCTGTTGGTGGGA
ORF-target-PF-2：ATCCTTTGGTGGTGCATCGT
ORF-target-PR-2：TTTAGCAAAACCAGCTACT。
7.根据权利要求5所述的一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤2中退火合成双链DNA方法：在PCR反应管中加入Annealing Buffer for DNA oligos(5×)20ul，DNA oligo A 20ul，DNA oligo B 20ul，DEPC水40ul，根据Annealing buffe for DNAOligos说明书的退火程序合成双链DNA。
8.根据权利要求5所述的一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法，其特征在于，步骤3中体外转录crRNA方法：根据测量的DNA浓度，将退火合成的DNA加入1μg所需的体积，按照T7外转录试剂盒流程进行体外转录。
9.根据权利要求5所述的一种基于基因编辑的检测新冠病毒的方法，其特征在于，对测试基因N和ORF进行检测的另一方法：将步骤4构建的新冠病毒检测体系，加入到去RNase的PCR中，qPCR仪中37℃，1h，根据荧光分析新冠病毒检测结果。
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