CN116064959A - 基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用 - Google Patents

基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于体外诊断领域，涉及基于CRISPR‑Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用。包括逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶、磁性纳米颗粒‑酶纳米复合物、crRNA、Cas12a核酸酶、显色液；本发明在可以在恒温条件下完成对于SARS‑Cov‑2病毒核酸的高效扩增，扩增产生的扩增子可以激活CRISPR‑Cas12a的反式切割活性，发挥CRISPR‑Cas12a的单链DNA酶切割性质，对于磁珠上修饰的酶标记的单链DNA报告单元进行切割，释放酶，释放的酶可以与显色液发生反应，产生颜色变化。本发明可以实现SARS‑Cov‑2病毒核酸的可视化、超灵敏检测分析。

Description

基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用
技术领域
本发明属于体外诊断领域，涉及基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前，对新冠(SARS-Cov-2)病毒核酸的检测主要依赖逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，然而，其在检测过程中的热循环需要精密、昂贵的仪器来对温度进行精准的控制。同时，在核酸的检测过程中，需要专业的技术人员以及清洁的实验室环境来保证检测的准确性。这些问题限制了RT-PCR在资源有限地区的应用。比如居家核酸自检，如果利用RT-PCR进行检测还存在诸多问题。虽然，恒温核酸扩增方法能够避免热循环，但是需要借助荧光仪器完成信号分析。基于胶体金的试纸对于扩增子的检测灵敏度较低，因而需要进一步发展便携、高灵敏、可视化的检测SARS-Cov-2病毒核酸的试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用，本发明提供的比色传感器、试剂盒能够实现SARS-Cov-2病毒核酸的可视化、超灵敏检测分析。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，包括逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶、磁性纳米颗粒-酶纳米复合物、crRNA、Cas12a 核酸酶、显色液；
所述逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶能够与SARS-Cov-2 病毒核酸进行逆转录重组酶聚合酶扩增反应产生若干SARS-Cov-2扩增子；
所述磁性纳米颗粒-酶纳米复合物由磁性纳米颗粒通过单链DNA连接显色酶，所述SARS-Cov-2扩增子能够与crRNA、Cas12a核酸酶产生CRISPR-Cas12a 的反式切割活性，对单链DNA进行切割，使得显色酶从磁性纳米颗粒表面释放；
所述显色酶能够与显色液发生反应，并使显色液产生颜色变化。
另一方面，一种试剂盒，包括上述基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、缓冲液、dNTP。
第三方面，一种上述基于CRISPR-Cas12a的比色传感器或试剂盒在检测病毒核酸中的应用，所述病毒核酸为SARS-Cov-2病毒核酸。
本发明可以在恒温条件下完成对于SARS-Cov-2病毒核酸的高效扩增，扩增产生的扩增子可以激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性，发挥 CRISPR-Cas12a的单链DNA酶切割性质，对于磁珠上修饰的酶标记的单链DNA 连接单元进行切割，释放酶。释放的酶可以与显色液发生反应，产生颜色变化，从而可以实现SARS-Cov-2病毒核酸的可视化检测分析。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒，从核酸扩增到信号检测的整个过程，无需任何大型仪器设备的使用，整个过程可在恒温条件下进行反应，操作简便，最终信号可以通过肉眼进行可视化分析。
2、本发明提供的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒，在检测SARS-Cov-2病毒核酸的整个过程中，所需时间短，可在50min内获取可视化信号；灵敏度高，可达到0.01fM，与现有的金标准检测方法RT-PCR检测灵敏度相当。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中聚丙烯酸包覆的磁性纳米颗粒电镜图；
图2为本发明实施例中不同浓度基因片段(1:marker；2:0aM；3：10aM；4： 100aM；5：1fM；6：10fM；7：100fM)恒温扩增凝胶成像图；
图3为本发明实施例中靶标激活的CRIPPR-Cas12a切割磁性纳米颗粒-酶纳米复合物显色图；
图4为本发明实施例中试剂盒用于靶标基因选择性检测图；
图5为本发明实施例中试剂盒用于不同浓度SARS-Cov-2 RNA片段(0fM, 0.001fM,0.01fM,0.1fM,1fM,10fM,100fM,1000fM)检测图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了实现便携、高灵敏、可视化地检测SARS-Cov-2病毒核酸，本发明提出了基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、试剂盒及其在检测病毒核酸中的应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，包括逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶、磁性纳米颗粒-酶纳米复合物、crRNA、Cas12a核酸酶、显色液；
所述逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶能够与SARS-Cov-2 病毒核酸进行逆转录重组酶聚合酶扩增反应产生若干SARS-Cov-2扩增子；
所述磁性纳米颗粒-酶纳米复合物由磁性纳米颗粒通过单链DNA连接显色酶，所述SARS-Cov-2扩增子能够与crRNA、Cas12a核酸酶产生CRISPR-Cas12a 的反式切割活性，对单链DNA进行切割，使得显色酶从磁性纳米颗粒表面释放；
所述显色酶能够与显色液发生反应，并使显色液产生颜色变化。
在一些实施例中，磁性纳米颗粒与单链DNA通过生物素和链霉亲和素的亲和作用连接。
在一些实施例中，单链DNA与显色酶通过巯基与双键的加成反应连接。
在一些实施例中，磁性纳米颗粒-酶纳米复合物的制备过程为：提供单链 DNA、显色酶和磁性纳米颗粒；所述单链DNA的一端修饰为巯基，单链DNA 的另一端修饰为生物素；所述显色酶标记马来酰亚胺基团；所述磁性纳米颗粒表面修饰链霉亲和素；将单链DNA与标记马来酰亚胺基团的显色酶进行加成反应获得酶标记的单链DNA报告单元，将酶标记的单链DNA报告单元与修饰链霉亲和素的磁性纳米颗粒进行混合，即得。
在一种或多种实施例中，采用三(2-羧基乙基)磷酸盐溶液对单链DNA的巯基进行活化，然后与标记马来酰亚胺基团的显色酶进行加成反应。
在一些实施例中，所述单链DNA如SEQ ID NO.9所示。
在一些实施例中，所述crRNA如SEQ ID NO.6所示。
本发明的另一种实施方式，提供了一种试剂盒，包括上述基于 CRISPR-Cas12a的比色传感器、缓冲液、dNTP。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述基于CRISPR-Cas12a的比色传感器或试剂盒在检测病毒核酸中的应用，所述病毒核酸为SARS-Cov-2病毒核酸。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
实验材料及仪器：
材料：CRISPR RNA(crRNA)和DNA由生工生物技术有限公司合成纯化。含有SARS-Cov-2基因的质粒由生工生物技术有限公司合成。RPA试剂盒以及 RT-RPA试剂盒购自安普未来。葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶来自源叶生物科技有限公司。Cas12a核酸酶购自近岸科技有限公司。三(2-羧基乙基)磷酸盐(TCEP)购自阿达玛斯试剂。磺基琥珀酰亚基-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1- 羧酸酯(sulfo-SMCC)购自麦克林试剂。其他实验用水溶液采用去离子水(18.2 MΩ·cm)配制。本实施例采用的核酸序列如表1所示。
仪器：NanoDrop One；FLS-920型荧光光度计(Edinburgh Instruments Ltd)；凝胶电泳仪(Bio-Rad)；全自动凝胶成像系统(JS-680D)。
表1核酸序列
Figure BDA0003920674750000051
Figure BDA0003920674750000061
Figure BDA0003920674750000071
Figure BDA0003920674750000081
Figure BDA0003920674750000091
核酸的恒温扩增：
SARS-Cov-2 RNA片段通过基因转录获取。基因转录过程：3μL的10*缓冲， 4μL的NTPs,10μL的含有T7启动子序列SARS-Cov-2基因片段(如SEQ ID NO.5 所示)，0.5μL的RNA酶抑制剂(40U/μL)，1μL的T7 RNA聚合酶，11.5μL 的水，反应12h。将DNA酶I用水稀释成10mg/mL，然后加入3μL的DNaseI到30 μL的转录体系中，37℃孵育2h，然后利用RNA纯化试剂盒对SARS-Cov-2 RNA 片段进行了提取，即得SARS-Cov-2 RNA片段(如SEQ ID NO.10所示)。恒温扩增过程：向含有冻干试剂(含有逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶)的离心管中加入29.4μL的buffer A，然后加入2μL的正向引物(10μM) (如SEQ ID NO.7所示)，2μL的反向引物(10μM)(如SEQ ID NO.8所示)，加入10μL SARS-Cov-2 RNA片段溶液以及4.1μL的去离子水，然后加入2.5μL 的buffer B到离心管的盖子上，之后上下混合10次，42℃孵育30min。
磁性纳米颗粒-酶纳米复合物的合成：
1OD的巯基化DNA连接链(如SEQ ID NO.9所示)加入30μL的去离子水和2μL的磷酸二氢钠缓冲溶液，然后加入2μL的TCEP溶液对巯基化DNA进行活化。经过活化的巯基化DNA通过超滤管进行超滤。将8mg的葡萄糖氧化酶以及1mg的sulfo-SMCC分别溶于300μL和100μL的缓冲当中，然后混合，混合溶液在30℃下孵育3h。多余的sulfo-SMCC通过离心去除。获得的标记马来酰亚胺基团的酶通过超滤管进行超滤。然后，混合标记马来酰亚胺的酶以及巯基激活的DNA，在30℃下震荡混合48h。获取的酶标记的单链DNA报告单元通过超滤管进行超滤，分散于PBS中。最终浓度通过NanoDrop One进行测定。酶标记的单链DNA报告单元与修饰链霉亲和素的磁性纳米颗粒进行混合，然后利用含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液进行清洗，最终获取磁性纳米颗粒-酶纳米复合物。
扩增子激活CRISPR-Cas12a切割磁性纳米颗粒-酶纳米复合物，产生颜色信号：
将1μL的crRNA(如SEQ ID NO.6所示)与1μL的Cas12a核酸酶预先混合。然后取2μL的磁性纳米颗粒-酶纳米复合物，通过磁分离去掉上清液，然后加入 70μL的Tris-HCl缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5),50mM NaCl,20mM MgCl2, 0.05％吐温20)。然后将该溶液加入到Cas12a核酸酶和crRNA的混合物中，并加入核酸扩增子，37℃混合孵育10min，然后通过磁分离，取出上清液，加入显色液，37℃孵育5min，然后观察溶液颜色变化。
结果与讨论
本研究首先合成了聚丙烯酸包覆的磁性纳米颗粒，如图1透射电镜图所示，磁性纳米颗粒呈现球形，直径在300nm左右，其具有明显的核壳结构，表明聚丙烯酸的成功包覆。该磁性纳米颗粒表面带有羧基官能团，可用于修饰链霉亲和素，并进一步结合单链DNA修饰的葡萄糖氧化酶，形成磁性纳米颗粒-酶纳米复合物。
本实施例通过琼脂糖凝胶电泳对模型靶标的RPA扩增反应进行了研究。如图2所示，当不加入模型靶标时，在泳道2中只能观察到引物的条带。随着模型靶标浓度的不断增加，会出现迁移速度减慢的DNA条带，而且，DNA条带的亮度逐渐变强。上述结果表明，低浓度的模型靶标可以通过RPA进行高效放大。
本实施例对激活的CRISPR-Cas12a切割磁性纳米颗粒-酶纳米复合物上单链DNA的能力进行了研究。如图3所示，当加入模型靶标之后，溶液的颜色能够发生明显的变化。结果表明，模型靶标能够有效激活CRISPR-Cas12a，激活的CRISPR-Cas12a能够切割磁性纳米颗粒-酶纳米复合物上的单链DNA连接单元，从而释放葡萄糖氧化酶。释放的葡萄糖氧化酶可以高效催化底物反应，生成颜色变化。
然后，本实施例进行检测特异性的研究。分别对模型靶标(如SEQ ID NO.1 所示)、MERS-CoV基因片段(如SEQ ID NO.3所示)、Ebola基因片段(如SEQ ID NO.2所示)以及Zika基因片段(如SEQ ID NO.4所示)进行了检测。如图4 所示，MERS-CoV基因片段、Ebola基因片段以及Zika基因片段均不能够使溶液颜色产生变化。只有当模型靶标存在时，才能够使得溶液产生明显的颜色变化。结果证实了本实施例方法具有良好的检测特异性。
利用本实施例的方法对SARS-Cov-2 RNA基因片段进行了检测。如图5所示，当不加入SARS-Cov-2或者SARS-Cov-2的浓度为1aM(0.001fM)时，溶液不会有颜色信号的产生，当SARS-Cov-2的浓度达到10aM(0.01fM)时，溶液会出现颜色变化，并且随着SARS-Cov-2浓度不断增加，溶液的颜色会不断加深并最终不再变化。结果表明，该发明方法可以成功实现SARS-Cov-2的高灵敏检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，包括逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶、磁性纳米颗粒-酶纳米复合物、crRNA、Cas12a核酸酶、显色液；
所述逆转录酶、重组酶、单链DNA结合蛋白、聚合酶能够与SARS-Cov-2病毒核酸进行逆转录重组酶聚合酶扩增反应产生若干SARS-Cov-2扩增子；
所述磁性纳米颗粒-酶纳米复合物由磁性纳米颗粒通过单链DNA连接显色酶，所述SARS-Cov-2扩增子能够与crRNA、Cas12a核酸酶产生CRISPR-Cas12a的反式切割活性，对单链DNA进行切割，使得显色酶从磁性纳米颗粒表面释放；
所述显色酶能够与显色液发生反应，并使显色液产生颜色变化。
2.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，磁性纳米颗粒与单链DNA通过生物素和链霉亲和素的亲和反应连接。
3.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，单链DNA与显色酶通过巯基与双键的加成反应连接。
4.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，磁性纳米颗粒-酶纳米复合物的制备过程为：提供单链DNA、显色酶和磁性纳米颗粒；所述单链DNA的一端修饰为巯基，单链DNA的另一端修饰为生物素；所述显色酶标记马来酰亚胺基团；所述磁性纳米颗粒表面修饰链霉亲和素；将单链DNA与标记马来酰亚胺基团的显色酶进行加成反应获得酶标记的单链DNA报告单元，将酶标记的单链DNA报告单元与修饰链霉亲和素的磁性纳米颗粒进行混合，即得。
5.如权利要求4所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，采用三(2-羧基乙基)磷酸盐溶液对单链DNA的巯基进行活化，然后与标记马来酰亚胺基团的显色酶进行加成反应。
6.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，所述单链DNA如SEQ ID NO.9所示。
7.如权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器，其特征是，所述crRNA如SEQID NO.6所示。
8.一种试剂盒，其特征是，包括权利要求1～8任一所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器、缓冲液、dNTP。
9.一种权利要求1～8任一所述的基于CRISPR-Cas12a的比色传感器或试剂盒在检测病毒核酸的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，所述病毒核酸为SARS-Cov-2病毒核酸。
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