CN111944879B - 一种非疾病诊断目的的基于crispr技术的基因检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法，其主要步骤包括：（1）目的基因的引物设计及扩增；（2）sgRNA的设计、转录和纯化；（3）Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备；（4）信号探针的制备；（5）检测载体的制备；（6）样品的检测与结果读取。本发明还包括两种基于所述检测方法的试剂盒及其应用。本发明可以实现精准的基因检测，结果稳定，并且杂交探针通用，操作简单，特异性极高，方便推广。

Description

一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法及试剂盒与非疾病诊断目的应用。
背景技术
近年来用于基因检测的核酸试纸条得到不断发展，为实现定点简便的核酸检测提供了一种很有前景的方法。它的原理是基于三明治氏核酸杂交反应，结合金纳米粒子或者其他纳米颗粒以及酶联免疫法等在侧向流动试纸条上实现比色检测。已报道的方法中结合核酸扩增方法如非对称PCR扩增以及其他恒温扩增方法，以得到一种单链DNA或RNA产物，与预先设计好包埋在试纸条上的T线和C线探针特异性杂交并且利用底物显色而达到检测效果。然而，这种方法不具有广普性，针对不同的检测物需要设计不同的特异性杂交探针，而且扩增设计相对复杂，易出现假阳性且特异性不强的问题。
CRISPR技术是近年来发展的一种基因组工程学工具，该工具已经彻底革新了生命科学领域，在生物医学、农业等领域具有极大的应用前景。它的强大之处在于它能够对基因进行指定位置的精确编辑。具体来说，在Cas蛋白和向导RNA的共同作用下，细胞基因组DNA或其他外源DNA可以被精确剪切。被CRISPR/Cas系统剪切需要满足以下几个条件。首先，被编辑的基因区域需要存在相对保守的PAM序列（前间隔序列邻近基序）。其次，向导RNA要和PAM上游的序列碱基（一般20个碱基左右）互补配对。Cas蛋白在和向导RNA结合后，会搜寻基因序列，当识别到指定的序列，便可以靶向上去进行特定位点切割。通过对这种向导RNA的设计以及对PAM位点的甄别，可以实现单碱基分辨率的基因检测。并且，整个过程只需要在恒温37℃条件下反应15-30min即可。但是目前利用CRISPR技术来进行基因检测的方法大都利用荧光定量的方法来实现，这种方法依赖昂贵的仪器来实现，不适用于资源有限的地区使用。
近期研究发现，DNA在被Cas9蛋白剪切后，只会在特定位点断开，但并不会从Cas9-sgRNA结构中脱离。类似的还有dCas9蛋白，它虽然没有切割DNA的能力，但仍能够在sgRNA的引导下与特定DNA序列结合。对于Cas12a蛋白，在将目标DNA区域剪切完之后，PAM远端的DNA片段脱离，而PAM近端的DNA片段仍然结合在蛋白-crRNA复合结构中。本发明基于此设计了一种结合CRISPR技术的核酸纸芯片基因检测技术。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法及其试剂盒与非疾病诊断目的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法，具体包括以下步骤：
（1）目的基因的引物设计及扩增。
根据目的基因设计两条引物，其中一条引物的一端修饰有功能基团，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板进行扩增。所述的功能基团可以为生物素等。所述的扩增方法可以为PCR、RPA或LAMP等方法。
（2）sgRNA的设计、转录和纯化。
首先设计sgRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，其中上游引物包含有T7启动子区和20-nt的与靶DNA相关序列等，下游引物主要用于编码sgRNA的3’末端序列；
然后通过PCR扩增得到sgRNA转录模板DNA，经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而体外转录出sgRNA。得到的sgRNA产物用RNA纯化试剂盒纯化，纯化后的sgRNA冻存在-80℃以备使用。
（3）Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备。
所述Cas蛋白为Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步骤（2）得到，所述靶标为步骤（1）得到的修饰有功能基团的扩增产物。
DNA在被Cas9蛋白剪切后，只会在特定位点断开，但并不会从Cas9-sgRNA结构中脱离。dCas9蛋白虽然没有切割DNA的能力，但仍能够在sgRNA的引导下与特定DNA序列结合。Cas12a蛋白在将目标DNA区域剪切完之后，PAM远端的DNA片段脱离，而PAM近端的DNA片段仍然结合在蛋白-crRNA复合结构中。因此，Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白可以与Cas蛋白/sgRNA形成复合物。
先将Cas蛋白和sgRNA以一定的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育一段时间，形成Cas蛋白/sgRNA复合体；然后将该复合体与步骤（1）中扩增得到的带有功能基团的靶标相互作用，反应条件为37℃孵育一段时间，由此得到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物。
（4）信号探针的制备。
所述信号探针为可以被探测信号的分子标记物、酶或者纳米颗粒；所述信号探针能够与步骤（3）所述Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合。
分子标记物可以为：荧光探针、吸收探针、化学发光探针、生物发光探针等。
酶的种类可以为：辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、纳米酶等其他具有催化活性的酶。
纳米颗粒可以为纳米金、纳米棒、量子点、石墨烯、上转换纳米粒子、氧化铁等有机和无机纳米粒子。
（5）检测载体的制备。
所述检测载体为侧向流或垂直流，且检测载体的检测线或点上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质。
（6）样品的检测与结果读取。
将步骤（3）所述的Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物通过检测载体进行检测，如果检测线或点检测到所述信号探针相应的信号，则待测样品中含有目的基因，否则待测样品中不含目的基因。
进一步地，步骤（4）所述的信号探针与第一特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第一特定DNA序列与步骤（1）所述的扩增产物存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与Cas/sgRNA复合物识别解旋的扩增产物的非靶向链杂交结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。
或者，步骤（4）所述的信号探针可以与步骤（2）所述的sgRNA发生共价或非共价偶联，从而使其能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。共价偶联可以通过在sgRNA的端头修饰巯基、氨基、羧基、羟基、醛基等活性基团与信号探针共价连接。非共价偶联可以通过在sgRNA的端头修饰poly(A)或者poly(C)等与信号探针如金纳米颗粒具有亲和作用的碱基发生偶联反应。
或者，步骤（2）所述sgRNA的茎环结构的环区域添加有一段序列，步骤（4）所述的信号探针与第二特定DNA序列共价或非共价结合从而得到被标记的DNA-信号探针，所述第二特定DNA序列与所述sgRNA的添加序列存在部分互补序列，使所述DNA-信号探针能够与sgRNA结合，从而使信号探针能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。此处的共价偶联可以通过在特定DNA序列的端头修饰巯基、氨基、羧基、羟基、醛基等活性基团与信号探针共价连接。非共价偶联可以通过在特定DNA序列的端头修饰poly(A)或者poly(C)等与信号探针如金纳米颗粒具有亲和作用的碱基发生偶联反应。
或者，步骤（4）所述的信号探针可以与步骤（3）所述的Cas蛋白共价或者非共价偶联，从而使其能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。此处的共价偶联可以通过在Cas蛋白中天然氨基酸或者通过基因工程嵌入的氨基酸内含有的巯基、氨基、羧基、羟基、醛基等活性基团与信号探针共价连接。非共价偶联可以通过信号探针如金纳米颗粒与Cas蛋白具有亲和作用（如吸附）发生的偶联反应。
进一步地，步骤（5）所述侧向流检测载体为试纸条，所述试纸由底板样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质，所述质控线上包被有能够与步骤（4）所述信号探针牢固结合的捕获探针。
进一步地，步骤（5）所述垂直流检测载体为纸芯片，所述纸芯片上阵列的设有检测点，所述检测点上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质。首先制作丝网模具，再将一定大小的纤维素膜滤纸固定到丝网的底面。然后在丝网的反面印刷固体蜡，经加热后固体蜡融化进入纸基，形成疏水区，没有蜡渗漏的区域形成亲水区，这样制得具有亲疏水通道的纸芯片。再将纸芯片的一端选取所需点阵的亲水区去除，嵌入玻璃纤维素膜再滴加信号探针，作为结合垫使用。
本发明还包括两种基于CRISPR技术的基因检测试剂盒，具体为：
一种基于CRISPR技术的核酸试纸条基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A、B、C三个分试剂盒：
A分试剂盒包含目的基因的扩增引物、三蒸水、醋酸镁溶液、扩增反应所需的试剂及其相配的酶缓冲液，所述扩增引物的一端标记有生物素；
B分试剂盒包括sgRNA转录模板的PCR引物、rTaq DNA聚合酶混合液、三蒸水、10×RNA聚合酶缓冲液、NTP混合物、RNA酶抑制剂、T7聚合酶；
C分试剂盒包括纳米金探针、Cas9蛋白、相应的蛋白缓冲液以及胶体金核酸试纸条，所述纳米金探针可以与Cas9蛋白结合；所述的胶体金核酸试纸条包括底板以及粘贴在底板上且依次紧密相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述的连接的方式为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，结合垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，样品垫位于结合垫的上部与之重叠2mm，吸水垫位于硝酸纤维素膜上部相对于结合垫和样品垫的另一侧，并与硝酸纤维素膜重叠2mm，结合垫包埋有纳米金探针；硝酸纤维素膜上设有检测T线和控制C线，所述T线靠近结合垫，所述C线靠近吸水垫；检测线宽度为2mm与结合垫相隔6mm，控制线宽度为2mm与结合垫相隔12mm，所述T线包被有链霉亲和素，所述C线包被有链霉亲和素以及一端标记有生物素的捕获探针，所述捕获探针可以与纳米金探针牢固结合。
一种基于CRISPR技术的核酸纸芯片基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A、B、C三个分试剂盒：
A分试剂盒包含目的基因的扩增引物、三蒸水、醋酸镁溶液、扩增反应所需的试剂及其相配的酶缓冲液，所述扩增引物的一端标记有生物素；
B分试剂盒包括sgRNA转录模板的PCR引物、rTaq DNA聚合酶混合液、三蒸水、10×RNA聚合酶缓冲液、NTP混合物、RNA酶抑制剂、T7聚合酶；
C分试剂盒包括纳米金探针、Cas9蛋白、相应的蛋白缓冲液以及胶体金纸芯片，所述纳米金探针可以与Cas9蛋白结合；所述纸芯片上阵列间隔的设有检测点，所述检测点上包被有链霉亲和素。纸芯片采用折叠式芯片的结构，折叠上层作为基底芯片，用于识别反应和信号读取。折叠下层作为吸水层，用于吸取折叠上层多余探针、其他杂质的洗涤。纸芯片的检测通路为3x 3孔，芯片大小为3 x 3cm。
本发明还包括上述两种基因检测试剂盒在基因检测中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、CRISPR/Cas系统靶向目的基因需要目的基因含有PAM位点并且向导RNA要和PAM上游的序列碱基（一般20个碱基左右）互补配对，由此可以精准靶向目的基因，杜绝了非特异性扩增带来的干扰以及假阳性的产生。当检测单碱基突变时，可通过调整PAM位点，设计不同的sgRNA序列，从而实现单碱基分辨率的检测。
2、CRISPR/Cas系统靶向目的基因是在恒温37℃下进行，反应条件温和，无需昂贵的变温加热仪器。
3、将CRISPR技术与核酸试纸条技术结合可以实现精准的基因检测，结果稳定。
4、检测速度快，探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是实施例1中基于CRISPR技术的侧向流核酸试纸条检测原理图。
图2是实施例2中基于CRISPR技术的垂直流纸芯片检测原理图。
图3是侧向流试纸条的组装结构及各部分的尺寸图。
图4是垂直流纸芯片的组装结构图。
图5是13nm胶体金的吸收光谱图，在520nm处有最大吸收峰。
图6是实施例3中基于CRISPR技术的核酸试纸条检测非洲猪瘟病毒的结果图。
图7是实施例4中基于CRISPR技术的垂直流纸芯片检测李斯特菌的结果图。
具体实施方式
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1
一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法（核酸试纸条）
具体步骤如下所示：
（1）目的基因的引物设计及扩增
提取所检测物的基因组DNA或RNA。根据目的基因设计两条引物：引物1和引物2，其中引物1的5’端修饰有生物素，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板采用RAP扩增方法进行扩增。
（2）sgRNA的设计、转录和纯化
设计sgRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物：
引物3:5'-CCTCTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAGAGCTATGCTGGAAAAAAGAAAAATGCAAGTGGAATACCAAAAAGA-3'（SEQ ID NO:1）(划单横线部分为T7启动子序列，倾斜字体部分的20个N代表为与靶序列互补配对的部分，N为A、T、G或C)
引物4:5'-AAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTTTTTCTTTTTGGTATTCC -3'（SEQ ID NO:2）；
首先利用引物3和引物4，通过桥式PCR扩增的方法得到用于体外转录sgRNA的DNA模板。其中上游引物包含有T7启动子区（TAATACGACTCACTATA）和20-nt的与靶DNA相关序列等，下游引物主要用于编码sgRNA的3’末端序列。PCR扩增得到sgRNA转录模板DNA，经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而体外转录出sgRNA。得到的sgRNA产物用RNA纯化试剂盒纯化，纯化后的sgRNA冻存在-80℃以备使用。
步骤（2）中的桥式PCR扩增体系（50µL）为：
步骤（2）中的桥式PCR扩增条件为：首先95℃下变性2分钟；接着95℃变性20秒，63℃退火10秒，72℃延伸45秒，循环35次；最后72℃延伸15秒。
步骤（2）中的sgRNA体外转录体系（50µL）如下：
步骤（2）中所述的sgRNA体外转录条件为：37℃恒温4小时；
步骤（2）中所述的sgRNA序列为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3’（SEQ ID NO:3）（其中单下划线部分代表和靶向链互补配对的20个碱基，倾斜字体部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列，N为碱基A、U、G或C）
（3）Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备
先将Cas蛋白和sgRNA以1：1的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育10min，形成Cas蛋白/sgRNA复合体；然后将该复合体与步骤（2）中扩增得到的生物素化靶标相互作用，反应条件为37℃孵育1h；由此得到Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物；最终体系中Cas和sgRNA的终浓度为100nM。
（4）信号探针的制备
本实施例中的信号探针为纳米金探针。
纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸（）为原料制备纳米金，且其粒径为13nm，其胶体金的吸收光谱图如图5所示；
纳米金探针的制备：设计一条5’端为多聚A、中间为与C线探针互补配对、3’末端为与步骤（2）所述sgRNA茎环处添加的序列互补配对的标记探针，然后将标记探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。其中，包埋缓冲液为：20mM,Tween-20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比10%，BSA（牛血清白蛋白）质量百分比5%。
本实施例中的纳米金标记探针序列为：5'-AAAAAAAAAATTTTTCATTGCTAGAGCAGG GG TATTCCACTTGCA-3'（SEQ ID NO:4），其中单横线部分为与步骤（5）中所述的控制线探针杂交部分，倾斜字体部分为与步骤（2）所述sgRNA茎环添加序列杂交部分；
（5）检测载体的制备
本实施例中采用的检测载体为侧向流的核酸试纸条。
如图3所示，31为样品垫，32为结合垫，33为硝酸纤维素膜（NC膜），34为检测线（T线），35为控制线（C线），36为吸水垫，37为底板。
核酸试纸条由样品垫31、结合垫32、NC膜33、吸水垫36和底板37组成，具体组装方式为：底板37位于最下层，NC膜33粘贴在底板37上部的中间位置，结合垫32置于NC膜33上部的一层并与之重叠2mm，样品垫31位于结合垫32的上部与之重叠2mm，吸水垫36位于NC膜33的上部相对于结合垫32和样品垫31的另一侧并与NC膜33重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的试纸条。
所述样品垫31为玻璃纤维，它的处理方法为：用样品垫处理液饱和浸润处理，37℃干燥2h，置于干燥器中室温保存；所述的样品垫处理液为：体积百分比为0.25%的Triton X-100，0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl,pH8.0；
所述的结合垫32为玻璃纤维，其处理方法为：用足量的步骤（4）中所述的用于包埋的纳米金探针喷于其上，37℃干燥2h，4℃干燥保存；
所述NC膜33的处理方法为：用喷膜仪将6µL链霉亲和素溶液喷到检测线34的位置，将6µL链霉亲和素溶液和控制线捕获探针混合液喷到控制线35的位置，室温下干燥1h,4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1mg/mL，所述的控制线捕获探针的浓度为100µM；所述的检测线宽2mm与结合垫相隔6mm,所述的控制线宽2mm与结合垫相隔12mm；
吸水垫36的材料为吸水纤维；所述的底板37的材料为PVC塑料。
控制线捕获探针的制备：设计一条5’端修饰有功能基团的与纳米金标记探针中间部分序列互补配对的控制线捕获探针。本实施例中的控制线捕获探针序列为：5’-CCTGCTCTAGCAATG-3'（SEQ ID NO:5），且在其序列的5’端修饰有生物素功能基团。
（6）样品的检测与结果读取。
将步骤（3）中得到的Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物与30ul驱动缓冲液混合，滴加到核酸试纸条的样品垫上，等待5分钟后，再滴加50ul驱动缓冲液，5min之内读取结果。检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测的基因序列。仅有控制线变成红色表明没有待检测的基因序列。
其中，驱动缓冲液成分为：4×SSC溶液，体积百分比为0.05%的Tween-20，1×的PBS，质量百分比为1%的BSA（牛血清白蛋白）；
本实施例的基本原理如图1所示：
11 非标记引物12 标记引物121 生物素13 待测样品基因组DNA或RNA
14 带标记的基因扩增产物141 第一特定DNA序列15 纳米金探针 151 第二特定DNA序列 161 sgRNA162 Cas蛋白163 sgRNA茎环结构添加的序列17 侧向流检测载体171检测线172 控制线
A部分表示根据目的基因设计的一条标记有生物素的引物12与另一条未标记引物11，以待测样品基因组的DNA或RNA 13为模板进行扩增，得到带有标记的基因扩增产物14。
B部分表示纳米金探针与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合的原理。其中B1表示纳米金15与Cas蛋白162通过共价或者非共价结合，从而使纳米金探针15能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B2表示纳米金探针可以与sgRNA通过共价或非共价结合，从而使纳米金探针15能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B3表示纳米金探针15可以与第二特定DNA序列151通过共价或非共价结合得到DNA-纳米金探针，第二特定DNA序列151与sgRNA161在其茎环结构处添加的序列163存在部分互补序列，使DNA-纳米金探针能够与Cas/sgRNA复合物结合，从而使纳米金探针15能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B4表示纳米金探针15可以与第一特定DNA序列141通过共价或非共价结合得到DNA-信号探针，第一特定DNA序列141与扩增产物14存在部分互补序列，使所述DNA-纳米金探针能够与Cas/sgRNA复合物识别解旋的扩增产物14的非靶向链杂交结合，从而使纳米金探针15能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上（B4要结合C部分对应的图）。
在本实施例中采用B3的方式，即通过DNA-纳米金探针与sgRNA茎环结构添加的序列互补配对结合，从而使纳米金探针与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合。本实施例采用纳米金探针来进行检测，当然也可以采用其他的信号探针，如分子标记物、酶或者纳米颗粒等。
C部分表示纳米金探针15与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合的示意图以及在侧向流检测载体17上进行检测。其中171为检测线，其上包被有链霉亲和素，能够与生物素标记121进行结合。本实施例优选的使用试纸条来进行检测，其控制线172包被有链霉亲和素以及一端标记有生物素的捕获探针，该捕获探针可以与纳米金探针15牢固结合。
当检测体系中含有目的基因时，通过扩增生成生物素化的扩增产物14，Cas9蛋白/sgRNA复合物会精确识别并靶向该扩增产物14，从而组装成Cas9蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物。该复合物滴加到样品垫上时，由于层析作用，先与结合垫处已经包埋的纳米金探针15杂交，当其到达包埋有链霉亲和素的检测线171（T线）时，Cas9蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物、纳米金探针15和链霉亲和素形成“三明治结构”，就会形成一条红色的线，过量的纳米金探针15继续层析，到达已包埋有捕获探针的控制线172（C线）时形成第二条红色的线；而不含目的基因时， T线处因不能形成“三明治”结构的杂交产物，而没有红色的线出现，只有过量的纳米金探针15继续层析，到达已包埋有捕获探针的C线时形成一条红色的线；若T线和C线都无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。
实施例2
一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法（纸芯片）
本实施例的基本步骤与实施例1类似，只是使用的检测载体不同。
本实施例的基本原理如图2所示：
21 非标记引物22 标记引物221 生物素23 待测样品基因组DNA或RNA24 带标记的基因扩增产物241 第一特定DNA序列25 纳米金探针 251 第二特定DNA序列 261sgRNA262 Cas蛋白263 sgRNA茎环结构添加的序列27 侧向流检测载体271 检测点
A部分表示根据目的基因设计的一条标记有生物素的引物22与另一条未标记引物21，以待测样品基因组的DNA或RNA 23为模板进行扩增，得到带有标记的基因扩增产物24。
B部分表示纳米金探针与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合的原理。其中B1表示纳米金25与Cas蛋白262通过共价或者非共价结合，从而使纳米金探针25能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B2表示纳米金探针可以与sgRNA通过共价或非共价结合，从而使纳米金探针25能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B3表示纳米金探针25可以与第二特定DNA序列251通过共价或非共价结合得到DNA-纳米金探针，第二特定DNA序列251与sgRNA261在其茎环结构处添加的序列263存在部分互补序列，使DNA-纳米金探针能够与Cas/sgRNA复合物结合，从而使纳米金探针25能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上。B4表示纳米金探针25可以与第一特定DNA序列241通过共价或非共价结合得到DNA-信号探针，第一特定DNA序列241与扩增产物24存在部分互补序列，使所述DNA-纳米金探针能够与Cas/sgRNA复合物识别解旋的扩增产物24的非靶向链杂交结合，从而使纳米金探针25能够结合到Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物上（B4要结合C部分对应的图）。
在本实施例中采用B3的方式，即通过DNA-纳米金探针与sgRNA茎环结构添加的序列互补配对结合，从而使纳米金探针与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合。本实施例采用纳米金探针来进行检测，当然也可以采用其他的信号探针，如分子标记物、酶或者纳米颗粒等。
C部分表示纳米金探针25与Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合的示意图以及在垂直流检测载体27上进行检测。其中271为检测点，其上包被有链霉亲和素和纳米金探针25，能够与生物素标记221进行结合。本实施例优选的使用纸芯片来进行检测。
当检测体系中含有目的基因时，通过扩增生成生物素化的扩增产物14，Cas9蛋白/sgRNA复合物会精确识别并靶向该扩增产物14，从而组装成Cas9蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物。该复合物滴加到样品垫上时，Cas9蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物、纳米金探针25和链霉亲和素形成“三明治结构”，检测点271会变红；而不含目的基因时， 检测点271不会变红。
实施例3
基于CRISPR技术的基因检测方法检测非洲猪瘟病毒
1、非洲猪瘟病毒DNA的提取和RPA扩增
采用TIANamp Virus DNA kit提取非洲猪瘟病毒基因组DNA。
2、扩增引物的设计及核酸探针设计
根据非洲猪瘟的保守基因p72基因区域设计一对RPA扩增（重组酶聚合酶扩增）引物，分别为引物5和引物6。sgRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，分别为引物7和引物8。各序列的碱基序列及标记如下表所示：
3、病毒基因组DNA的扩增
采用TwistAmp Basic Kit（购自英国TwistDx公司）来进行病毒DNA的扩增
针对非洲猪瘟病毒DNA的RPA扩增（50µL）体系如下：
4、sgRNA体外转录及纯化
引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海，中国）合成，PCR产物纯化试剂盒和三磷酸核苷酸的（NTP）混合物从生工生物工程（上海）股份有限公司购买。PCR扩增用到的Taq DNA聚合酶混合液以及RNA酶抑制剂是从宝生物工程（大连）有限公司购买。T7RNA聚合酶及10×RNA聚合酶反应缓冲液是从NEB（北京，中国）购买。RNA纯化试剂盒从天根生化科技（北京）有限公司（北京，中国）购买。
通过PCR的方法扩增得到用于转录sgRNA的DNA模板，反应体系如下：
PCR扩增条件为：首先95℃下变性2分钟；接着95℃变性20秒，63℃退火10秒，72℃延伸45秒，循环35次；最后72℃延伸15秒。
T7RNA聚合酶介导的转录反应体系如下：
sgRNA体外转录条件为：37℃恒温4小时；
经转录得到的针对非洲猪瘟病毒的sgRNA序列为：5'-GGUGAUAGUAUUUAGGGGUUUGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3'（SEQ ID NO:9）（下划线部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列）
5、纳米金的制备
采用柠檬酸盐还原法制备纳米金，将100mL 1mM的加热沸腾，快速磁搅拌下迅速加入10mL38.8mM的柠檬酸钠溶液，2min内溶液颜色由金黄色→灰色→酒红色→透亮的红色，继续搅拌20min，冷却至室温得到纳米金胶体溶液，用紫外吸收光谱测得其吸收峰在520nm左右处（图2所示），即得到13nm的纳米金胶体溶液。
6、纳米金标记探针与纳米金的连接
采用冷冻法标记纳米金探针，具体如下：用500µL纳米金胶体溶液溶解1OD的纳米金标记探针，-20℃冷冻3h；然后12000rpm，4℃离心30min,重复3次，最后用400µL包埋缓冲液（20mM,Tween-20体积百分比0.25%，蔗糖质量百分比10%，BSA（牛血清白蛋白）质量百分比5%）重悬，从而得到纳米金探针，用于试纸条结合垫处的包埋。
7、胶体金核酸试纸条的组装与准备
（1）样品垫：用样品垫处理液（体积百分比为0.25%的Triton X-100，0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl,pH8.0）饱和浸润处理，37℃干燥2h，置于干燥器中室温保存；
（2）结合垫：用足量的纳米金探针溶液喷于其上，37℃干燥2h，4℃干燥保存；
（3）NC膜：用喷膜仪将6µL链霉亲和素溶液喷到检测线（T线）的位置，将6µL链霉亲和素溶液和控制线捕获探针混合液喷到控制线（C线）的位置，室温下干燥1h,4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1mg/mL，所述的控制线捕获探针的浓度为100µM；所述的检测线宽2mm与结合垫垫相隔6mm,所述的控制线宽2mm与结合垫相隔12mm；
（4）组装：核酸试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫和底板组成，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫和底板按图3所示结构组装：组装方式为：底板位于最下层，NC膜粘贴在底板上的中间位置，结合垫置于NC膜的上部的一层并与之重叠2mm，样品垫位于结合垫的上部与之重叠2mm，吸水垫位于NC膜的上部相对于结合垫和样品垫的另一侧并与NC膜重叠2mm，最后用切条机切成4mm宽的试纸条。
8、Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物的制备
先将Cas9蛋白和sgRNA以1：1的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育10min，形成Cas蛋白/sgRNA复合体。然后将该复合体与步骤3中扩增得到的生物素化靶标相互作用,反应条件为37℃孵育1h。由此得到Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物。最终体系中Cas9和sgRNA的终浓度为100nM。
9、样品准备与检测
将步骤8中得到的Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物与驱动缓冲液（4×SSC溶液，体积百分比为0.05%的Tween-20，1×的PBS，质量百分比为1%的BSA）混合，滴加到胶体金核酸试纸条的样品垫上，等待5分钟后(在这段时间内，包埋在结合垫上的胶体金探针便会和Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物中的sgRNA的茎环的15个碱基通过碱基互补配对结合，由此会形成Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物/胶体金复合物)，再滴加驱动缓冲液，10min内读取结果。
检测结果如图6所示：1号试纸条（非洲猪瘟病毒阳性）在C线和T线处都形成红线，2号试纸条（非洲猪瘟病毒阴性）只在C线处形成红线，表明该试纸条能正确检测样品中是否含有目的基因片段，进而确定所检测样品。
实施例4
基于CRISPR技术的基因检测方法检测李斯特菌
1、李斯特DNA的提取和PCR扩增
采用TIANamp Virus DNA kit提取李斯特菌基因组DNA。
2、扩增引物的设计及核酸探针设计
根据李斯特的HylA(GenBank: KJ504109.1)基因区域设计一对PCR扩增引物，具体为引物9和引物10。sgRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，具体为引物11和引物12。各序列的碱基序列及标记如下表所示：
3、细菌基因组DNA的扩增
采用Premix TaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)（购自Takara公司）来进行李斯特DNA的PCR扩增。
李斯特菌DNA的PCR扩增（50µL）体系
李斯特菌DNA的PCR扩增条件为：首先95℃变性5分钟；接着95℃变性10秒、51℃退火30秒、72℃延伸45秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。
4、sgRNA体外转录及纯化
引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海，中国）合成，PCR产物纯化试剂盒和三磷酸核苷酸的（NTP）混合物从生工生物工程（上海）股份有限公司购买。PCR扩增用到的Taq DNA聚合酶混合液以及RNA酶抑制剂是从宝生物工程（大连）有限公司购买。T7RNA聚合酶及10×RNA聚合酶反应缓冲液是从NEB（北京，中国）购买。RNA纯化试剂盒从天根生化科技（北京）有限公司（北京，中国）购买。
通过PCR的方法扩增得到用于转录sgRNA的DNA模板，反应体系如下：
PCR扩增条件为：首先95℃下变性2分钟；接着95℃变性20秒，63℃退火10秒，72℃延伸45秒，循环35次；最后72℃延伸15秒。
T7RNA聚合酶介导的转录反应体系如下：
sgRNA体外转录条件为：37℃恒温4小时；
经转录得到的针对李斯特菌的sgRNA序列为：5'-GGGAUGAAGUUCAAAUCAUCGAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3'（SEQ ID NO:14）（下划线部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列）
5、量子点信号探针的制备
将修饰有生物素的DNA探针（SEQ ID NO:13）和修饰链霉亲和素的量子点(QDs-605, 1 μM) 按30:1的摩尔比进行混合孵育30分钟，再移至超滤管中2000 rpm转速离心，移除多余未结合的生物素探针。并用PBS清洗两次。再将量子点信号探针溶于重悬液中，保存于4℃备用。重悬液成分为20 mM Na3PO4，5% BSA, 0.25% Tween-20, and 10%蔗糖。
6、垂直流纸芯片的制作
如图4所示，41为上层芯片层，42为下层吸水层，43为亲水检测区，44为疏水腊印区。
首先制作丝网模具，再将一定大小的纤维素膜滤纸固定到丝网的底面。然后在丝网的反面印刷固体蜡，经加热后固体蜡融化进入纸基，形成疏水区，没有蜡渗漏的区域形成亲水区，这样制得具有亲疏水通道的纸芯片。再将纸芯片的一端选取所需点阵的亲水区去除，嵌入玻璃纤维素膜再滴加量子点信号探针，作为结合垫使用。纸芯片其他点阵区分别滴加链霉亲和素，再用含1%BSA的PBS封闭液进行封闭多余的结合位点。晾干后进行折叠备用。纸芯片的结构如图4所示。芯片大小根据检测阵列的通量而定，在本实施例中，检测通路为9（3x 3孔），芯片大小为3 x 3cm 尺寸。但实际使用中可以任意调节检测孔尺寸，因此芯片尺寸大小也是可变的。
7、Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物的制备
先将Cas9蛋白和sgRNA以1：1的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育10min，形成Cas蛋白/sgRNA复合体。然后将该复合体与步骤3中扩增得到的生物素化靶标相互作用,反应条件为37℃孵育1h。由此得到Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物。最终体系中Cas9和sgRNA的终浓度为100nM。
8、样品准备与检测
将步骤7中得到的Cas蛋白/sgRNA/生物素化靶标复合物与缓冲液（4×SSC溶液，体积百分比为0.05%的Tween-20，1×的PBS，质量百分比为1%的BSA）混合，滴加到垂直流芯片检测点上，等待5分钟后，再滴加冲洗缓冲液，10min内用紫外激发读取结果。
检测结果如图7所示：
本实施例采用不同拷贝的基因组来进行基因检测。从上往下，A为104拷贝李斯特基因组的检测结果，B为103拷贝李斯特基因组的检测结果，C为102拷贝李斯特基因组的检测结果，D为对照。结果表明，该检测方法以及纸芯片能正确检测样品中是否含有目的基因片段，进而确定所检测样品。
本实施例的基本原理与实施例2类似：
在垂直流芯片检测中，因为芯片分为上下两层，下层是吸水垫，因此加入上层检测孔中的探针杂交反应后，多余的探针即被下层吸水垫吸走，从而当仅有正确靶标的时候，上层检测孔中才会结合探针。在本实施例中检测探针为量子点，因此当用紫外激发的时候，就可以检测检测孔中量子点的荧光信号，从而实现检测目的基因序列。
本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：
（1）CRISPR/Cas系统靶向目的基因需要目的基因含有PAM位点并且向导RNA要和PAM上游的序列碱基（一般20个碱基左右）互补配对，由此可以精准靶向目的基因，杜绝了非特异性扩增带来的干扰以及假阳性的产生。当检测单碱基突变时，可通过调整PAM位点，设计不同的sgRNA序列，从而实现单碱基分辨率的检测。
（2）CRISPR/Cas系统靶向目的基因是在恒温37℃下进行，反应条件温和，无需昂贵的变温加热仪器；
（3）将CRISPR技术与核酸试纸条技术结合可以实现精准的基因检测，结果稳定；
（4）检测速度快，探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>华南师范大学
<120>一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法
<160>13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例1中sgRNA转录模板所需的扩增引物3
<400>1
cctctaatac gactcactat aggnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtttaag agctatgctg 60
gaaaaaagaa aaatgcaagt ggaataccaa aaaga 95
<210>2
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例1中sgRNA转录模板所需的扩增引物4
<400>2
aagaaaaaaa gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt 60
aaacttgcta tgctgttttt ttctttttgg tattcc 96
<210>3
<211>153
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例1中sgRNA序列
<400>3
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuaagagc uaugcuggaa aaaagaaaaa ugcaagugga 60
auaccaaaaa gaaaaaaaca gcauagcaag uuuaaauaag gcuaguccgu uaucaacuug 120
aaaaaguggc accgagucgg ugcuuuuuuu cuu 153
<210>4
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>纳米金标记探针序列
<400>4
aaaaaaaaaa tttttcattg ctagagcagg ggtattccac ttgca 45
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>控制线捕获探针序列
<400>5
cctgctctag caatg 15
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例3中的目的基因扩增引物5
<400>6
gccgaaggga atggatactg agggaatagc aa 32
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例3中的目的基因扩增引物6
<400>7
tcccgagaac tctcacaata tccaaacagc ag 32
<210>8
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例3中sgRNA转录模板所需的扩增引物7
<400>8
cctctaatac gactcactat aggtgatagt atttaggggt ttggtttaag agctatgctg 60
gaaaaaagaa aaatgcaagt ggaataccaa aaaga 95
<210>9
<211>155
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例3中sgRNA序列
<400>9
ggugauagua uuuagggguu ugguuuaaga gcuaugcugg aaaaaagaaa aaugcaagug 60
gaauaccaaa aagaaaaaaa cagcauagca aguuuaaaua aggcuagucc guuaucaacu 120
ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu uucuu 155
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例4中目的基因的扩增引物9
<400>10
ccgtaagtgg gaaatctg 18
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例4中目的基因的扩增引物10
<400>11
ttgttgtata ggcaatggg 19
<210>12
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例4中sgRNA转录模板所需的扩增引物11
<400>12
cctctaatac gactcactat agggatgaag ttcaaatcat cgagtttaag agctatgctg 60
gaaaaaagaa aaatgcaagt ggaataccaa aaaga 95
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例4中量子点标记探针序列
<400>13
Aaaaaaaaaa tttttggtat tccacttgca 30
<210>14
<211>155
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>实施例4中sgRNA序列
<400>14
gggaugaagu ucaaaucauc gaguuuaaga gcuaugcugg aaaaaagaaa aaugcaagug 60
gaauaccaaa aagaaaaaaa cagcauagca aguuuaaaua aggcuagucc guuaucaacu 120
ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu uucuu 155

Claims (5)

1.一种非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法，具体包括以下步骤：
（1）目的基因的引物设计及扩增；根据目的基因设计两条引物，其中一条引物的一端修饰有功能基团，然后以待测样品的基因组DNA或RNA为模板进行扩增；
（2）sgRNA的设计、转录和纯化；
（3）Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物的制备；所述Cas蛋白为Cas9蛋白、dCas9蛋白或Cas12蛋白，所述sgRNA由步骤（2）得到，所述靶标为步骤（1）得到的修饰有功能基团的扩增产物；
（4）信号探针的制备；所述信号探针为可以被探测到信号的纳米金颗粒，所述信号探针能够与步骤（3）所述Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物结合；
（5）检测载体的制备；所述检测载体为侧向流或垂直流载体，且检测载体的检测线或点上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质；
（6）样品的检测与结果读取；将步骤（3）所述的Cas蛋白/sgRNA/靶标复合物通过步骤（5）所述检测载体进行检测，如果检测线或点检测到所述信号探针相应的信号，则待测样品中含有目的基因，否则待测样品中不含目的基因；
其中步骤（2）中所述的sgRNA序列为：
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3’（SEQ ID NO:3），其中单下划线部分代表和靶向链互补配对的20个碱基，倾斜字体部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列，N为碱基A、U、G或C；
当所述检测载体为侧向流载体，步骤（4）中所述信号探针序列为：
5’-AAAAAAAAAATTTTTCATTGCTAGAGCAGG GGTATTCCACTTGCA-3'（SEQ ID NO:4），其中单横线部分为与步骤（5）中所述的检测线探针杂交部分，倾斜字体部分为与步骤（2）所述sgRNA茎环添加序列杂交部分；相应的检测线捕获探针序列为：
5’-CCTGCTCTAGCAATG-3'（SEQ ID NO:5）；
当所述检测载体为垂直流载体，步骤（4）中所述信号探针序列为：
5’-AAAAAAAAAATTTTTGGTATTCCACTTGCA-3'（SEQ ID NO:13），倾斜字体部分为与步骤（2）所述sgRNA茎环添加序列杂交部分。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤（5）所述侧向流检测载体为试纸条，所述试纸条由底板样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成，硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，且检测线靠近结合垫、质控线靠近吸水垫，所述检测线上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质，所述质控线上包被有能够与步骤（4）所述信号探针牢固结合的捕获探针。
3.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的基于CRISPR技术的基因检测方法，其特征在于，步骤（5）所述垂直流检测载体为纸芯片，所述纸芯片上阵列的设有检测点，所述检测点上包被有能够与步骤（1）所述功能基团牢固结合的物质。
4.一种基于CRISPR技术的核酸试纸条基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A、B、C三个分试剂盒：
A分试剂盒包含相应目的基因的扩增引物、三蒸水、醋酸镁溶液、扩增反应所需的试剂及其相配的酶缓冲液，所述扩增引物的一端标记有生物素；
B分试剂盒包括sgRNA转录模板的PCR引物、rTaq DNA聚合酶混合液、三蒸水、10×RNA聚合酶缓冲液、NTP混合物、RNA酶抑制剂、T7聚合酶；
C分试剂盒包括纳米金探针、Cas9蛋白、相应的蛋白缓冲液以及胶体金核酸试纸条，所述纳米金探针可以与Cas9蛋白结合；所述的胶体金核酸试纸条包括底板以及粘贴在底板上且依次紧密相连的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；连接的方式为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，结合垫位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，样品垫位于结合垫的上部与之重叠2mm，吸水垫位于硝酸纤维素膜上部相对于结合垫和样品垫的另一侧，并与硝酸纤维素膜重叠2mm，结合垫包埋有纳米金探针；硝酸纤维素膜上设有检测T线和控制C线，所述T线靠近结合垫，所述C线靠近吸水垫；检测线宽度为2mm与结合垫相隔6mm，控制线宽度为2mm与结合垫相隔12mm，所述T线包被有链霉亲和素，所述C线包被有链霉亲和素以及一端标记有生物素的捕获探针，所述捕获探针可以与纳米金探针牢固结合；
其中，B分试剂盒制得的sgRNA序列为：
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3’（SEQ ID NO:3），其中单下划线部分代表和靶向链互补配对的20个碱基，倾斜字体部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列，N为碱基A、U、G或C；
C分试剂盒中所述纳米金探针序列为：
5'-AAAAAAAAAATTTTTCATTGCTAGAGCAGG GGTATTCCACTTGCA-3'（SEQ ID NO:4），其中单横线部分为与所述的控制C线捕获探针杂交部分，倾斜字体部分为与所述sgRNA茎环添加序列杂交部分；控制C线捕获探针序列为：5'-CCTGCTCTAGCAATG-3'（SEQ ID NO:5）。
5.一种基于CRISPR技术的核酸纸芯片基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A、B、C三个分试剂盒：
A分试剂盒包含相应目的基因的扩增引物、三蒸水、醋酸镁溶液、扩增反应所需的试剂及其相配的酶缓冲液，所述扩增引物的一端标记有生物素；
B分试剂盒包括sgRNA转录模板的PCR引物、rTaq DNA聚合酶混合液、三蒸水、10×RNA聚合酶缓冲液、NTP混合物、RNA酶抑制剂、T7聚合酶；
C分试剂盒包括纳米金探针、Cas9蛋白、相应的蛋白缓冲液以及胶体金纸芯片，所述纳米金探针可以与Cas9蛋白结合；所述纸芯片为折叠式芯片的结构，折叠上层作为基底芯片，用于识别反应、和信号读取，折叠下层作为吸水层，用于吸取折叠上层多余探针、其他杂质的洗涤，纸芯片上阵列的设有检测点，检测通路为3 x 3孔，芯片大小为3 x 3cm，所述检测点上包被有链霉亲和素；
其中，B分试剂盒制得的sgRNA序列为：
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAAAAAGAAAAAUGCAAGUGGAAUACCAAAAAGAAAAAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUCUU-3’（SEQ ID NO:3），其中单下划线部分代表和靶向链互补配对的20个碱基，倾斜字体部分代表在sgRNA茎环部分添加的序列，N为碱基A、U、G或C；
C分试剂盒中所述纳米金探针序列为：5’-AAAAAAAAAATTTTTGGTATTCCACTTGCA-3'（SEQID NO:13），倾斜字体部分为与所述sgRNA茎环添加序列杂交部分。
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