CN102796827B - 一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102796827B CN102796827B CN201110136184.0A CN201110136184A CN102796827B CN 102796827 B CN102796827 B CN 102796827B CN 201110136184 A CN201110136184 A CN 201110136184A CN 102796827 B CN102796827 B CN 102796827B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- encephalitis
- primer
- correlated
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种同时检测多种脑炎相关病毒的方法，包括在聚合酶反应体系中，用特异性的针对脑炎相关病毒的引物集进行PCR反应，从而获得扩增产物；以及用特异性探针或探针微球进行检测。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定多种脑炎相关病毒，其中包括：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。
背景技术
东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)，西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)，委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus，VEEV)，森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)，乙型脑炎(日本脑炎)病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)都是高致病性病病毒。
东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒属典型的人兽共患病毒性疾病，该病毒属A组虫媒病毒披膜病毒科甲病毒属，含单股RNA，因先后从美国东部、西部和委内瑞拉的病马脑组织中分离出病毒，故而得名。随后从病人脑组织中也分离出同样病毒，其引起的人类脑炎症状十分危急而凶险，其临床表现与乙型脑炎很相似，病死率可达35％左右。该病毒也是目前国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，国内属一类管理的病毒种类，备受关注。
森林脑炎病毒(简称森脑病毒)由蜱传播，在春夏季节流行于俄罗斯及我国东北森林地带，故又称苏联春夏脑炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus)，本病主要侵犯中枢神经系统，临床上以发热，神经症状为特征，有时出现瘫痪后遗症。森脑病毒核酸也为单正链RNA。
日本(乙型)脑炎，又称流行性乙型脑炎，由日本脑炎病毒引起，潜伏期为5-15天。主要的症状为发烧、抽筋与深度昏迷，乃至危及生命，治愈后也常常流下后遗症，目前为止，日本脑炎的治疗并未有很大的突破，仍是以支持疗法为主，给予生命症候的支持，以及降脑压药物。
上述五种脑炎病毒引起的症状比较相似。在中国，日本脑炎发病最多，森林脑炎次之，东方马脑炎、西方马脑炎和委内瑞拉马脑炎很少见。
日本脑炎目前的检测主要依靠血清学，由于抗体产生有一定窗口期，所以早期难以诊断出来，容易延误病情。森林脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒的检测还处于比较空白的阶段，没有令人满意的成熟的检测方法。
针对病毒核酸进行分子检测是目前的应用趋势，主要是通过普通逆转录-链式聚合酶反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法进行检测。此方法窗口期短，检测灵敏，有很好的发展前景。这两种方法都有一个缺点，即只能一次检测一种病毒。由于几种脑炎病毒引起的症状比较相似，只检测一种病毒(目前常常只检测日本脑炎)会造成漏检。
综上所述，本领域尚缺乏令人满意的、能够同时检测多种脑炎相关病毒的技术。因此，本领域迫切需要开发高灵敏的、简便快捷的、同时检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏的、简便快捷的、同时检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤：
(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集，其中所述的脑炎相关病毒选自：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在另一优选例中，所述的反应体系中含有特异性扩增以下5种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：由含SEQ ID NO.：1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO.：4和5所示序列的引物所构成的引物对。
在另一优选例中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO.：1-5所示的引物。
在另一优选例中，该方法还包括步骤：
(b)对步骤(a)获得的扩增产物用脑炎相关病毒的特异性探针进行检测。
在另一优选例中，所述引物的5’末端标记生物素。
在另一优选例中，所述的特异性探针带有可检测标记。
在另一优选例中，所述的可检测标记包括：荧光团、荧光微球。
在另一优选例中，在步骤(b)还包括使用作为阴性对照的探针。较佳地，所述的阴性探针含有SEQ ID NO.：6所示的序列。
在另一优选例中，步骤(b)中用Luminex xMAP进行检测。
在另一优选例中，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。
在另一优选例中，所述的间隔臂选自下组：
(i)连续的脱氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，n＝10-15；
(ii)烷基链-(CH2)m-，m＝6-12；和
(iii)乙二醇己醚(HEG)。
在另一优选例中，在步骤(b)中，先进行扩增产物与探针的杂交反应，杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的SA，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
在本发明的第二方面，提供了一种引物集，所述的引物集可特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物，其中所述的脑炎相关病毒选自：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：由含SEQ ID NO.：1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO.：4和5所示序列的引物所构成的引物对。
在另一优选例中，所述的引物集包括：由含SEQ ID NO.：1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO.：4和5所示序列的引物所构成的引物对。
在另一优选例中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO.：1-5所示的引物。
在本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，它包括：第一容器以及位于所述容器内本发明第二方面所述的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括：由含SEQ ID NO.：1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO.：4和5所示序列的引物所构成的引物对。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
在另一优选例中，所述的探针是针对东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒的特异性探针。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病毒的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参。
在本发明的第四方面，提供了本发明第二方面所述的引物集的用途，它被用于制备检测脑炎相关病毒的试剂盒。
在另一优选例中，所述的脑炎相关病毒包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于同时检测5种脑炎相关病毒。
在本发明的第五方面，提供了本发明第二方面所述的引物集或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，它们用于体外非诊断地检测样品中是否存在脑炎相关病毒。
在另一优选例中，用于检测在环境样品是否存在脑炎相关病毒。
在本发明的第六方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它们具有选自SEQ IDNO.1-17的核苷酸序列。所述的寡核苷酸可作为引物或探针。
在本发明的第七方面，提供了本发明上述特异性引物对和特异性探针的用途，它们被用于制备用于检测脑炎相关病毒的试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了部分脑炎病毒的相关核酸序列，其中下划线为引物所在位置，方框为探针所在位置。
具体实施方式
本发明人经过对多种脑炎病毒的核酸序列的广泛而深入的研究，并经过大量筛选，首次确定了多种脑炎病毒基因序列中相对保守的、且多病毒检测时相互干扰较小区域。针对所述区域不仅可以设计出特异性扩增多种脑炎病毒的引物，还可设计出特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定多种脑炎病毒(包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本(乙型)脑炎病毒)的同时检测。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“脑炎相关病毒”包括引起哺乳动物(如人)的脑炎的病毒，其中包括(但并不限于)：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
如本文所用，术语“日本脑炎病毒”和“乙型脑炎病毒”可互换使用，都指Japaneseencephalitis virus。
引物
如本文所用，术语“脑炎相关病毒特异性引物”指这样的引物(对)，它的扩增产物具有脑炎相关病毒基因组保守区域的核苷酸序列。
本发明的脑炎相关病毒的保守区域是基本对应的。作为代表，东部马脑炎病毒、日本(乙型)脑炎病毒、森林脑炎病毒的保守区域的核苷酸序列示于图1(SEQ ID NO.：18、19和20)。
如本文所用，术语“特异性引物”，指长度通常为18-28nt的寡核苷酸链，其与多种脑炎相关病毒中一种病毒RNA逆转录后的cDNA序列完全互补或者相同。
在一个优选例中，本发明人提供了一个引物集(或称为引物组合)，该引物集可以同时扩增上述五种脑炎相关病毒的核酸。本发明人通过精心比对和分析这五种病毒的遗传序列，发现JEV和TBEV亲缘性较高，有一些区域可以设计通用引物同时扩增两种病毒，另外EEEV、WEEV和VEEV的亲缘性较高，也存在一些相对保守区域。然后，发明人通过更深入研究和试验，找到了一个引物组合可以以较少的引物数覆盖全部五种病毒，其特点包括以下几点。
第一、序列。本发明设计的引物组合通过精心的序列比对和筛选，选出了几个病毒基因序列相对保守的区域，并针对此区域设计引物，以保证对绝大部分病毒株都能进行扩增，防止漏检。
第二、引物组合，引物数量少，仅由5条引物构成。一般扩增一种病毒核酸需要一对引物，扩增五种病毒需要五对，即10条引物。本发明设计的引物组合通过精心的序列比对和筛选，选出了几个病毒基因序列相对保守的区域，并针对此区域设计引物，其中JEV和TBEV共用一对引物，EEEV、WEEV和VEEV共用一条上游引物，EEEV和WEEV共用一条下游引物，VEEV独自使用一条下游引物。引物序列见表1。注：R为简并碱基标志表示A或G。
表1PCR引物名称
*SEQ ID NO.：1-5所示引物较佳地在5’末端标记有生物素。
第三、引物的5’末端可标记有生物素(biotin)，这样可以与亲和素(avidin)或链亲和素(streptavidin，SA)紧密结合，在后来检测时的起到信号放大、显示或标记等作用。
第四、该引物组合既可用于对使用随机引物逆转录后的病毒cDNA进行PCR扩增，有可以用作一步法RT-PCR时逆转录和PCR的特异性引物。
探针
如本文所用，术语“脑炎相关病毒特异性探针”指能够结合于脑炎相关病毒的扩增产物，但不结合于其他无关的扩增产物的探针。更佳地，所述的脑炎相关病毒特异性探针具有SEQ ID NO：7-11所示的核苷酸序列。
本发明的特异性探针带有可检测标记。所述的可检测标记的例子包括(但并不限于)：荧光团、荧光微球。
一种优选的可检测标记是荧光微球。利用Luminex xMAP法可方便地同时区分和检测多种不同的荧光微球。
Luminex xMAP是一个非常灵活的多功能技术平台。其原理是把微小的乳胶颗粒(Beads，简称为“微球”)分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的探针或蛋白以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物(被测物可以是血清或样品中的核酸(如扩增产物)、抗原、抗体、或酶等)。在悬液中的微球与被检测物特异性地结合，并加上荧光标记。然后，微球成单列通过两束激光，一束判定微球的颜色从而决定被测物的特异性(定性)；另一束测定微球上的荧光标记强度从而决定被测物的量(定量)，所得到的数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。
在Luminex检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的编码从而决定被测PCR扩增产物的种类；另一束测定微球上PE的荧光强度，经数据处理得出被测的PCR扩增产物的含量。
关于Luminex xMAP的技术平台详细资料，请参见产品说明书或文献，(1)CancerChemotherapy and Pharmacology，51：321-327，(2)Journal of Immunological Methods，227：41-52；(3)www.luminexcorp.com。
探针微球集
本发明还提供了可用于检测多种脑炎相关病毒的式I荧光微球和荧光微球集。
P-bead (I)
式中，“P”表示针对扩增产物的特异性探针，“bead”表示微球，“-”表示探针与微球之间的结合方式。
在本发明的一个优选例中，提供了一套检测五种脑炎相关病毒的探针微球集。该探针微球集具有一个或多个以下特征：
1.它包括6种不同的荧光编码微球；
2.一个微球上固定有一条不与任何一种病毒相关位置DNA序列相同的探针，其余的每种微球上固定有一种针对特定病菌的特异性核酸探针，每种探针在试剂盒描述的条件下仅能与对应的病毒的PCR扩增产物相结合，并且具有较强的结合能力，同时又不与其他任何病毒的产物结合；
3.为了与微球交联固定，探针的5’端均标记有氨基。
4.为了减小空间位阻，5’端氨基和探针之间插入有间隔臂(spacer)，典型的间隔臂是连续的10至15个脱氧胸腺嘧啶核苷即dT，也可以是烷基链，如C6[即-(CH2)6-]或C12[即-(CH2)12-]，也可以是乙二醇己醚(HEG)，等等。
*在SEQ ID NO.：6-11所述的探针的5’或3’端带有“NH2-间隔臂。
应理解，特异性探针是与特异性引物匹配使用的。例如，当对JEV病毒进行检测时，选用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2作为引物，SEQ ID NO：11作为探针实施PCR扩增。
参照物
本发明还提供了用于脑炎相关病毒检测的标准参照物(质粒标准分子)。所述的标准参照物可以是是脑炎相关病毒cDNA，或是含脑炎相关病毒扩增目的片段的质粒DNA(质粒标准分子)。
检测方法
本发明还提供了用于同时检测多种脑炎相关病毒的方法。包括步骤：用本发明的引物集进行扩增，以及用本发明的特异性探针(或探针微球)进行检测。
在本发明中，除了检测所针对的靶序列以及相应采用的引物(对)和探针等与现有技术不同之外，诸如从样品总抽提RNA、PCR扩增和荧光检测等步骤的条件可与现有技术相同，本领域技术人员完全可以用常规的条件进行上述各种步骤。当然，也可采用本申请实施例中所给出的优选条件。
例如，可用于本发明的RNA提取技术和方法没有特别的限制，可以是本领域应用较多、稳定性好、可靠性高的各种提取技术。一种优选方法是Trizol RNA提取法。
一种优选的方法是检测样本中是否存在五种脑炎相关病毒的方法，所述的方法包括：
(I)使用本发明的引物集对标本抽提出的DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
(II)将这些扩增产物与本发明上述的核酸探针微球集混合；
(III)检测微球上的核酸探针是否与扩增产物结合。
在另一优选例中，步骤(III)中的检测方法是Luminex xMAP。
本发明所称的杂交是PCR产物变性后和核酸探针微球集充分混合，在一定的条件下进行核酸的杂交。
本发明所称的信号标记是在杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的SA，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
试剂盒
本发明还提供了可用于同时检测多种脑炎相关病毒的检测试剂盒。
一般，本发明的试剂盒包括：第一容器以及位于所述容器内的本发明上述的引物集；和任选的说明书。
较佳地，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
此外，本发明的试剂盒还可含有以下任选组分：PCR扩增试剂、核酸探针微球集、杂交试剂和信号标记试剂。
一种优选的可用于检测五种脑炎相关病毒的试剂盒包括：容器以及位于容器内的PCR扩增试剂、引物组合(a)、核酸探针微球集(b)、杂交试剂和信号标记试剂。更佳地，还含有一个可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病毒的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参或称阳性质控，以监控检测过程是否符合标准。
本发明的主要优点在于：
1、高通量，相对于普通的实时荧光定量PCR，本方法可以同时检测五种病毒。
2、高灵敏度，只用五条进行扩增，解决了多对引物多重PCR扩增时带来的灵敏度降低的问题。
3、操作简便，微球杂交及后续检测如果与Luminex xMAP技术配合使用时，杂交后可以直接上机读数，不需要像固态芯片一样反复洗涤多次。
4、结果稳定，重复性高，悬浮微球(又称液态芯片)杂交相对于固态芯片杂交可以提高杂交效率，每次检测是读取一百或更多颗微球上的信号后取中位数作为检测最终读数，相当于做了一百或更多次重复实验。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1脑炎相关病毒的检测
一、探针微球包被：
1.按照下面的列表合成探针
注：间隔臂为10个T构成的poly(T)10，故SEQ ID NO.：12等于poly(T)10+SEQIDNO.：6，SEQ ID NO.：13等于poly(T)10+SEQ ID NO.：7，依此类推。
2.选取编号24、28、31、33、36和42号6种荧光编码微球【购自Luminex公司】，依次与上表中各探针对应进行探针的包被，方法如下：
(1)将各种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于室温下平衡30分钟；
(2)取各对应的探针用双蒸水溶解，浓度为0.01mM(10pmol/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50ul(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的1.5ml离心管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)每一种探针各自取2μl(10pmol/μL)加到上步骤中的对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(9)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(10)取2.5μl上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg or≈[0.5μg/μL]final)，用振荡器混匀；
(11)避光，37℃静置30分钟；
(12)重复(10)-(11)步骤；
(13)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(14)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(15)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(16)弃去上清液，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(17)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10μl到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
(18)将包被好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，各种微球的终浓度为1.2×103个/μl，2-10℃条件下避光保存，即为检测EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV的液态芯片。
二、样本的制备
将1～8号来自疾控中心病毒标本，使用QIAGEN公司的QIAamp Virus mini kit试剂盒，按说明书操作，所抽提产物直接用于RT-PCR，如暂时不用，可于-20℃或-80℃保存。
三、RT-PCR扩增
1.按照如下的序列合成病菌检测PCR扩增的通用引物：
| 引物名称 | 引物序列 | SEQ ID NO.： |
| J-T EV-F | 5’-生物素-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA-3’ | 1 |
| J-T EV-R | 5’-生物素-GTGTCCCATCCGGCGGTGTCATC-3’ | 2 |
| EEV-F | 5’-生物素-ATGGGATGCTGCTGGGCTTT-3’ | 3 |
| EEV-R | 5’-生物素-ACGCTRCCTGCTCCTGCCT-3’ | 4 |
| VEEV-R | 5’-生物素-TTCCAGAGTGGGCTCCTCAA-3’ | 5 |
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100μmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液2μl加入同一容器中，加入双蒸水196μl补足体积到200μl，混合均匀为混合引物工作液；
3.逆转录(RT)反应
1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：约1μg的病毒RNA；2μlRandom 9引物；2μl超纯dNTP(各2.5mM)；补RNase-free ddH2O定容至14.5μl。
2)70℃加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟。简短离心收集反应液后加入以下
各组分：4μl 5×First-Strand Buffer(含有DTT)；0.5μl RNasin。
3)加1μl(200U)TIANScript M-MLV【购自北京天根生化科技公司】，轻轻用移液器混匀。并将离心管置25℃温浴10分钟。
4)42℃温浴50分钟。
5)95℃加热5分钟终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。如果需要用RNaseH处理，进行步骤6。否则，进行步骤7。
6)加RNase H 1μl(2U)，37℃温浴20分钟以降解RNA。然后95℃加热5分钟使酶失活。
7)用RNase-free ddH2O将反应体系稀释到50μl，取2μl进行PCR扩增反应。
4.PCR反应
反应体系：20μl
扩增程序：95℃5分钟→[95℃30秒、51℃1分钟、72℃1分钟]共38个循环→72℃5分钟→4℃保温.
四、探针杂交
1.取上述1-8号8份样本的PCR扩增产物各5μl至1-8号的洁净1.5ml离心管中，分别加入12μl TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33μl 1.5×杂交液(含6种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟。
五、信号标记及检测
1、分别加入150μl内含有2ng/ml SA-PE的TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
样本结果如下：
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-8号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性对照探针读数≥2.5为阳性(+)，
检测读数/阴性对照探针读数＜2.5为阴性(-)；
结果表明：
1号样本含东方马脑炎病毒；
2号样本不含所检测病毒；
3号样本含日本(乙型)脑炎病毒；
4号样本含委内瑞拉马脑炎病毒；
5号样本含森林脑炎病毒；
6号样本含日本(乙型)脑炎病毒；
7号样本含不含所检测病毒；
8号样本含委内瑞拉马脑炎病毒。
这些检测结果与各样品的实际所含的病毒品种完全一致。
实施例2脑炎相关病毒的检测
一、探针微球包被：
1.按照下面的列表合成探针
2.选取编号24、28、31、33、36和42号6种荧光编码微球【购自Luminex公司】，依次与上表中各探针对应进行探针的包被，方法如下：
(1)将各种微球和-20℃保存的一份EDC粉末置于室温下平衡30分钟；
(2)取各对应的探针用双蒸水溶解，浓度为0.01mM(10pmol/μL)；
(3)用振荡器将微球混合均匀；
(4)各取50ul(6.0×105)微球，放入预先标记号码的洁净的1.5ml离心管中；
(5)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，小心弃取上清液；
(6)加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮微球，8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(7)弃去上清液，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(8)每一种探针各自取2μl(10pmol/μL)加到上步骤中的对应的微球悬液中，用振荡器混匀；
(9)按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；
(10)取2.5μl上步骤的EDC溶液加入各微球悬液中(25μg or≈[0.5μg/μL]final)，用振荡器混匀；
(11)避光，37℃静置30分钟；
(12)重复(10)-(11)步骤；
(13)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(14)弃去上清液，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(15)8000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球；
(16)弃去上清液，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮微球，并用振荡器混匀；
(17)微球计数：
a.将连接好的微球悬液用水稀释50倍；
b.振荡器混匀；
c.取10μl到计数板上；
d.对四个角上的计数室内的微球计数；
e.计算微球悬液的浓度；
(18)将包被好的微球避光保存在2-10℃条件下。
3.芯片制备：
取等体积的上述包被有探针的微球进行混合，各种微球的终浓度为1.2×103个/μl，2-10℃条件下避光保存，即为检测EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV的液态芯片。
二、样本的制备
将9-14号来自疾控中心病毒标本，使用QIAGEN公司的QIAamp Virus minikit试剂盒，按说明书操作，所抽提产物直接用于RT-PCR，如暂时不用，可于-20℃或-80℃保存。
三、RT-PCR扩增
1.按照如下的序列合成病菌检测PCR扩增的通用引物：
2.混合引物工作液的配制：
(1)合成的每条引物配制成100μmol/L的储备液；
(2)分别取各引物储备液2l加入同一容器中，加入双蒸水196μl补足体积到200μl，混合均匀为混合引物工作液；
3.RT-PCR反应
反应体系使用北京天根生化科技公司Quant一步法RT-PCR试剂盒，在冰上配置
| 反应成分 | 体积 |
| 10×RT-PCR缓冲液 | 5μl |
| 超纯dNTP混合物(各10mM) | 2μl |
| 5×RT-PCR enhancer | 10μl |
| RNasin(40U/μl) | 0.5μl |
| Hotmaster Taq聚合酶(2.5U/μl) | 2.5μl |
| Quant RTase | 0.5μl |
| 上游特异性引物(10μM) | 3μl |
| 下游特异性引物(10μM) | 3μl |
| 模板 | 样本抽提的50～500ng总RNA |
| RNase-free ddH2O | 补水至50μl |
| 总体系 | 50μl |
RT-PCR反应
步骤 反应时间 温度
1)反转录反应 30min 50℃
2)PCR初始变性 2min 94℃
3)变性 0.5-1min 94℃
4)退火 0.5-1min 51℃
5)延伸 0.5-2min 65℃
6)从3-5步进行38个循环
7)最终延伸 10min 65℃
四、杂交
1.取上述1-6号6份样本的PCR扩增产物各5μl至1-8号的洁净1.5ml离心管中，分别加入12μl TE缓冲液混匀后95℃变性5分钟，立即放在冰上5分钟；
2.分别加入33μl 1.5×杂交液(含6种微球，数量是2000个/种)，混匀，48℃杂交15分钟。
五、信号标记及检测
1、分别加入150μl内含有2ng/ml SA-PE的TE缓冲液，混匀，48℃保温5分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物；
2、使用Luminex xMAP对杂交的结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
样本结果如下：
六、数据分析
依据本试剂盒判定规则判定上述1-6号样本的检测结果如下：
检测读数/阴性对照探针读数≥2.5为阳性(+)，
检测读数/阴性对照探针读数＜2.5为阴性(-)；
结果表明：
9号样本含日本(乙型)脑炎病毒；
10号样本西方马脑炎病毒；
11号样本不含所检测病毒；
12号样本含森林脑炎病毒；
13号样本含委内瑞拉马脑炎病毒；
14号样本含日本(乙型)脑炎病毒。
这些检测结果与各样品的实际所含的病毒品种完全一致。
实施例3脑炎相关病毒的检测
重复实施例2，不同点在于，用15和16号样本替换样本9-14。其中，将1号和9号样本合并，作为15号样品。将4号和10号样本合并，作为16号样品。
检测结果表明，15号样品含有东方马脑炎病毒和日本(乙型)脑炎病毒；16号样品含有委内瑞拉马脑炎病毒和西方马脑炎病毒。检测结果与样品实际情况相符。
实施例4
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中的以下引物(集)：
| 引物名称 | 引物序列 | SEQ ID NO.： |
| J-T EV-F | 5’-生物素-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA-3’ | 1 |
| J-T EV-R | 5’-生物素-GTGTCCCATCCGGCGGTGTCATC-3’ | 2 |
| EEV-F | 5’-生物素-ATGGGATGCTGCTGGGCTTT-3’ | 3 |
| EEV-R | 5’-生物素-ACGCTRCCTGCTCCTGCCT-3’ | 4 |
| VEEV-R | 5’-生物素-TTCCAGAGTGGGCTCCTCAA-3’ | 5 |
(b)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测五种脑炎相关病毒：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
实施例5
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中序列如SEQ ID NO.：1-5所述的引物：
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例1中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：6-11的24、28、31、33、36和42号微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测五种脑炎相关病毒：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
实施例6
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中的以下引物(集)：
| 引物名称 | 引物序列 | SEQ ID NO.： |
| EEV-F | 5’-生物素-ATGGGATGCTGCTGGGCTTT-3’ | 3 |
| EEV-R | 5’-生物素-ACGCTRCCTGCTCCTGCCT-3’ | 4 |
| VEEV-R | 5’-生物素-TTCCAGAGTGGGCTCCTCAA-3’ | 5 |
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例1中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：12-15的荧光微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测三种脑炎相关病毒：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒。
实施例7
检测试剂盒
制备一试剂盒，该试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于该容器中的以下引物(集)：
| 引物名称 | 引物序列 | SEQ ID NO.： |
| J-T EV-F | 5’-生物素-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA-3’ | 1 |
| J-T EV-R | 5’-生物素-GTGTCCCATCCGGCGGTGTCATC-3’ | 2 |
(b)第二容器，以及位于该容器中的实施例1中制备的分别带有特异性探针SEQ IDNO.：12、16和17的荧光微球；
(c)使用说明书。
该试剂盒可用于同时检测二种脑炎相关病毒：森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (28)
1.一种非治疗非诊断性的聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤：
(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集，其中所述的脑炎相关病毒选自：森林脑炎病毒TBEV和日本脑炎病毒JEV，其中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括如下所示的引物：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中含有特异性扩增以下5种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒，其中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO.:1-5所示的引物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中还含有特异性扩增以下2种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒，且所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集还包括如下所示的引物：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中还含有特异性扩增以下3种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎，且所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集还包括如下所示的引物：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO.:1-5所示的引物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
(b)对步骤1获得的扩增产物用脑炎相关病毒的特异性探针进行检测；其中，所述特异性探针选自下组：SEQ ID NO.:7-11所示的序列。
7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述引物的5’末端标记生物素。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的特异性探针带有可检测标记。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记包括：荧光团、荧光微球。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(b)还包括使用作为阴性对照的探针，所述的阴性探针选自下组：SEQ ID NO.:6所示的序列。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)中用Luminex xMAP进行检测。
12.如权利要求6所示的方法，其特征在于，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的间隔臂选自下组：
(i)连续的脱氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，n＝10-15；
(ii)烷基链-(CH2)m-，m＝6-12；和
(iii)乙二醇己醚(HEG)。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，先进行扩增产物与探针的杂交反应，杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的链亲和素(streptavidin，SA)，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。
15.一种引物集，其特征在于，所述的引物集可特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物，其中所述的脑炎相关病毒选自：森林脑炎病毒TBEV和日本脑炎病毒JEV，其中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括如下所示的引物：
16.如权利要求15所述的引物集，其特征在于，所述的引物集还特异性扩增以下2种脑炎相关病毒的扩增产物：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒，且所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集还包括如下所示的引物：
17.如权利要求15所述的引物集，其特征在于，所述的引物集还特异性扩增以下3种脑炎相关病毒的扩增产物：东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎，且所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集还包括如下所示的引物：
18.如权利要求17所述的引物集，其特征在于，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO.:1-5所示的引物。
19.一种检测试剂盒，其特征在于，它包括：第一容器以及位于所述容器内权利要求15-18中任一所述的引物集。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括使用说明书。
21.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：第二容器以及位于所述容器内的核酸探针；其中，所述探针选自下组：SEQ ID NO.:7-11所示的序列。
22.如权利要求21所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的探针是针对东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒的特异性探针。
23.如权利要求21所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病毒的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参。
24.如权利要求15-18中任一所述的引物集的用途，其特征在于，用于制备检测脑炎相关病毒的试剂盒。
25.如权利要求24所述的引物集的用途，其特征在于，所述的脑炎相关病毒包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
26.权利要求25所述的引物集的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于同时检测5种脑炎相关病毒。
27.一种权利要求15-18任一所述的引物集或权利要求19所述的试剂盒的用途，其特征在于，它们用于体外非诊断地检测样品中是否存在脑炎相关病毒。
28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，用于检测在环境样品是否存在脑炎相关病毒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110136184.0A CN102796827B (zh) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | 一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110136184.0A CN102796827B (zh) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | 一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102796827A CN102796827A (zh) | 2012-11-28 |
| CN102796827B true CN102796827B (zh) | 2016-11-09 |
Family
ID=47196124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110136184.0A Active CN102796827B (zh) | 2011-05-24 | 2011-05-24 | 一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102796827B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104928401A (zh) * | 2015-06-09 | 2015-09-23 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列及其试剂盒 |
| CN105603128B (zh) * | 2016-03-30 | 2019-09-20 | 江苏省疾病预防控制中心 | 一种脑炎相关的病毒检测试剂盒及其应用 |
| CN106399586B (zh) * | 2016-08-31 | 2019-09-06 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 多重pcr检测脑炎脑膜炎相关病毒用引物组和试剂盒 |
| CN109490523A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-03-19 | 北京纳晶生物科技有限公司 | 用于标记的纳米材料、核酸探针及核酸与纳米材料偶联的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101967524A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-09 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 实时荧光定量rt-pcr检测东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的试剂盒 |
| CN102286641A (zh) * | 2011-08-18 | 2011-12-21 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 生物恐怖因子的检测芯片、检测试剂盒及检测方法 |
| CN102808042A (zh) * | 2012-03-14 | 2012-12-05 | 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 | 一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法 |
-
2011
- 2011-05-24 CN CN201110136184.0A patent/CN102796827B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101967524A (zh) * | 2010-09-26 | 2011-02-09 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 实时荧光定量rt-pcr检测东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的试剂盒 |
| CN102286641A (zh) * | 2011-08-18 | 2011-12-21 | 深圳国际旅行卫生保健中心 | 生物恐怖因子的检测芯片、检测试剂盒及检测方法 |
| CN102808042A (zh) * | 2012-03-14 | 2012-12-05 | 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 | 一种利用基因芯片方法检测黄病毒的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid,highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of Flaviviruses targeted to a conserved regeion of the NS5 gene sequences;Scaramozzino N,et al;《J.Clin Micro》;20011231;第39卷;15-16,19-20,22-30 * |
| Genetic characterization of a new insect flavivirus isolated from Culex pipiens mosquito in Japan;Keita Hoshino，et al;《Virology》;20071231;第359卷;405-414 * |
| Phylogency of the genus Flavivirus;Kuno G,et al;《J.Virol》;19981231;第72卷(第1期);73-83 * |
| 五种虫煤病毒悬浮芯片检测方法的建立;罗渊;《中国优秀硕士学位论文全文数据 基础科学辑》;20081115(第11期);摘要，第2、3部分，表6 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102796827A (zh) | 2012-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210355484A1 (en) | Primers for immune repertoire profiling | |
| ES2314378T3 (es) | Uso de arn intronico para medir la expresion genica. | |
| Komorowska et al. | Evaluation of several RT-PCR primer pairs for the detection of Apple stem pitting virus | |
| CN105018646B (zh) | 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN102796827B (zh) | 一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒 | |
| CN104232798B (zh) | 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 | |
| CN106868196A (zh) | 一种检测地中海贫血基因突变的探针、引物及试剂盒 | |
| CN103215379B (zh) | 腹泻病毒检测试剂盒及检测方法 | |
| US20140272972A1 (en) | Enhanced dna sensing via catalytic aggregation of gold nanoparticles by dna hybridization chain reaction | |
| CN102181532A (zh) | 用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针及方法 | |
| CN109154022A (zh) | 用于寨卡病毒的快速差别检测的组合物和方法 | |
| CN106191311B (zh) | 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo-3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂 | |
| CN107619885A (zh) | 一种用于检测登革病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法 | |
| CN103898240B (zh) | 检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法 | |
| JP6898736B2 (ja) | Ｈｅｖ核酸を検出するための組成物および方法 | |
| CN108796042A (zh) | 遗传性贫血检测用的核酸组合物、检测试剂盒及使用方法 | |
| Glais et al. | Detection and diagnosis of PVY | |
| CN107400735A (zh) | 检测寨卡病毒的实时荧光定量rt-pcr方法 | |
| CN106319069A (zh) | 一种精确测定病源细胞的试剂盒及其应用 | |
| CN106636474A (zh) | 多重免疫荧光检测小鼠六种病毒的引物组、试剂盒及方法 | |
| JP7125698B2 (ja) | ジカウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法 | |
| US9303292B2 (en) | Direct detection of unamplified hepatitis C virus RNA using unmodified gold nanoparticles | |
| CN102216771A (zh) | 用于检测基孔肯雅和登革热的基因序列 | |
| CN112553379B (zh) | 基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒 | |
| CN105274253B (zh) | 一种同时检测10种虫媒病病原的试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 201203 Shanghai City Songtao road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 646 3 floor Applicant after: Shanghai Tou Jing Life Science limited-liability company Address before: 201203 Shanghai City Songtao road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 646 3 floor Applicant before: Shanghai Toujing Life Sci. & Tech. Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: SHANGHAI TOUJING LIFE SCI. + TECH. CO., LTD. TO: SHANGHAI TELLGEN LIFE CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |