CN103215379B - 腹泻病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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CN103215379B CN201310123289.1A CN201310123289A CN103215379B CN 103215379 B CN103215379 B CN 103215379B CN 201310123289 A CN201310123289 A CN 201310123289A CN 103215379 B CN103215379 B CN 103215379B
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Abstract

本发明适用于生物技术及医学检测技术领域，提供了一种腹泻病毒检测试剂盒及其检测方法，该检测试剂盒包含PCR反应液，该PCR反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包含分别针对札如病毒1型及2、4型、诺如病毒1型、诺如病毒2型、轮状病毒、腺病毒、星状病毒的引物对及探针序列，其中各条探针序列5’端均连接有荧光基团，3’端均连接有淬灭基团，该PCR反应液还包含Homo-tag。本发明的检测试剂盒可一次性检测七种与腹泻相关的病毒（亚型），相对于现有技术中的检测方法操作简便，读取结果快速，避免了假阳性。

Description

腹泻病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术及医学检测技术领域，尤其涉及一种腹泻病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
在危害人体健康的感染性疾病中，感染性腹泻的发病率居第3位。感染性腹泻广义系指由各种病原体（除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒菌以外）引起的、以腹泻为主要临床特征的一组肠道传染病，其临床特点为起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，排水样便或稀便，也可有发热及全身不适等症状，病程短，病死率低。引起感染性腹泻的病原体主要有三大类：细菌、病毒、寄生虫，在我国主要以细菌和病毒为主。细菌性腹泻主要以志贺氏菌、肠致泻性大肠杆菌、致泻性弧菌为主。病毒性腹泻在感染性腹泻中占有很大的比例，与之相关的病原体种类较多，主要包括：轮状病毒(rotavirus)、诺如病毒(norovirus)、星状病毒(astrovirus)和肠道腺病毒（adenovirus），此外札如病毒（Sapovirus）也可引起病毒性腹泻。
目前，实验室检测腹泻病毒的方法主要包括：电镜法、病毒分离培养法，免疫学和分子生物学检测。就方法学的特点而论，电镜法直观、可靠，但是敏感性低，技术要求高，不适合大规模流行病学调查。病原体培养是病原学诊断的标准，但许多病毒培养很困难且阳性率较低或有些病毒不能培养。免疫荧光检测(IFA)较灵敏、特异，但需较昂贵的荧光显微镜，操作较复杂，应用受到较大制约；血清学方法较简便，但受机体产生抗体的时间制约，对病原体早期诊断的价值不大；与前几种方法比较，分子生物学方法的敏感性和特异性均较高，能育观地反映胃肠道局部的病原体，操作也不很复杂，试剂效期也较长。但同时检测七种病毒（亚型）的检测方法却未见报道。如果针对每种腹泻病毒分别检测势必延长了检测周期，因此有必要开发一种操作简便，准确高效，周期短的针对引起腹泻的病毒的检测方法。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种腹泻病毒检测试剂盒及其检测方法，旨在解决现有检测技术中准确度不高，检测周期长的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种PCR反应液，包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包含：
针对札如病毒1型的引物对SAP1-F(SEQ ID NO:1)、SAP1-R(SEQ ID NO:2)及探针SAP1-probe(SEQ ID NO:3)；
针对札如病毒2、4型的引物对SAP2-F(SEQ ID NO:4)、SAP2-R(SEQ ID NO:5)及探针SAP2-probe(SEQ ID NO:6)；
针对诺如病毒1型的引物对NV1-F(SEQ ID NO:7)、NV1-R(SEQ ID NO:8)及探针NV1-probe(SEQ ID NO:9)；
针对诺如病毒2型的引物对NV2-F(SEQ ID NO:10)、NV2-R(SEQ ID NO:11)及探针NV2-probe(SEQ ID NO:12)；
针对轮状病毒的引物对RV-F(SEQ ID NO:13)、RV-R(SEQ ID NO:14)及探针RV-probe(SEQ ID NO:15)；
针对腺病毒的引物对Ade-F(SEQ ID NO:16)、Ade-R(SEQ ID NO:17)及探针Ade-probe(SEQ ID NO:18)；
针对星状病毒的引物对Ast-F(SEQ ID NO:19)、Ast-R(SEQ ID NO:20)及探针Ast-probe(SEQ ID NO:21)；
其中各条探针序列5’端均连接有荧光基团，3’端均连接有淬灭基团；
该PCR反应液还包含Homo-tag(SEQ ID NO:22)。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测腹泻病毒的PCR试剂盒，该试剂盒包括本发明的PCR反应液，该试剂盒可针对引起腹泻的七种病毒（亚型）进行同步检测。
本发明实施例的再一目的在于提供一种腹泻病毒的检测方法，该检测方法利用本发明的PCR试剂盒通过荧光定量PCR反应进行检测，可针对引起腹泻的七种病毒（亚型）进行同步检测。
本发明提供的针对引起腹泻的病毒的检测试剂盒利用荧光定量PCR技术，同时应用了同源加尾引物和改良分子信标探针技术，可一次性检测七种与腹泻相关的病毒（亚型），缩短检测时间，提高了检测特异性，避免了假阳性的出现。本发明的腹泻病毒检测方法相对于现有技术具有操作简便、检测效率高、快速读取结果等优点。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种针对引起腹泻的七种病毒（亚型）的PCR反应液，该PCR反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包括以下引物和探针：
针对札如病毒1型的引物和探针：
SAP1-F：5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGTGTCYTGTGCCATTGAGG-3’(SEQ IDNO:1)，
SAP1-R：5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGTATGGAACATTGTGGC TYTC-3’(SEQ ID NO:2)，
SAP1-probe：5’-CGCTGCATCAAYCATATGATATATGTGGCGGCAGCG-3’(SEQ ID NO:3)；
针对札如病毒2、4型的引物和探针：
SAP2-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGACCAGGCTCTCGCCAC-3’(SEQ IDNO:4)，
SAP2-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGGTCCAATGGTGTCCTGDG-3’(SEQ IDNO:5)，
SAP2-probe:5’-CCCTCCACYACCAAATTAGTGTTTGAAATGGAGGG-3’(SEQ ID NO:6)；
针对诺如病毒1型的引物和探针：
NV1-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACGCTGGATGCGNTTCCAT-3’(SEQ ID NO:7)，
NV1-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’(SEQID NO:8)，
NV1-probe:5’-CCGTGGAAGATYGCGRTCTCCTGTCCACGG-3’(SEQ ID NO:9)；
针对诺如病毒2型的引物和探针：
NV2-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’(SEQ ID NO:10)，
NV2-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCGACGCCATCTTCATTCACA-3’(SEQ IDNO:11)，
NV2-probe:5’-CGCACGATCGCCCTCCCACGTGCG-3’(SEQ ID NO:12)；
针对轮状病毒的引物和探针：
RV-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACCATCTACACATGACCCTC-3’(SEQ IDNO:13)，
RV-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACACATAACGCCCCTATAGCC-3’(SEQ IDNO:14)，
RV-probe:5’-CCGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCGCTCGG-3’(SEQ ID NO:15)；
针对腺病毒的引物和探针：
Ade-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATACTTCAGCCTGGGGAACAAG-3’(SEQ IDNO:16)，
Ade-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGCGTAAAGCGCACTTTG-3’(SEQ IDNO:17)，
Ade-probe:5’-CCCACGCCTGTCTGTGGTTACATCGTGGG-3’(SEQ ID NO:18)；
针对星状病毒的引物和探针：
Ast-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATCCGTGATGTTAATGGG-3’(SEQ ID NO:19)，
Ast-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACGTTGCCAGAAAAGAAGC-3’(SEQ ID NO:20)，
Ast-probe:5’-CGCGACACCCCTGAAGGGAAAGGGACAGTCGCG-3’(SEQ ID NO:21)；
其中各条探针序列5’端均连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团；
该PCR反应液还包含如下序列的Homo-tag：
5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3’(SEQ ID NO:22)。
本发明参考国内外文献，根据不同病毒致病特点，选取结构蛋白基因、致病基因、核酸酶基因等特异性序列，利用CLASTW，PRIMER，BLAST和OLIGO软件对上述病毒特异基因保守序列进行引物和探针的设计，使这些引物和探针具有同一退火温度并适用于同一反应条件。
具体地，上述引物中利用了简并引物的技术方案，简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。上述引物中Y=C/T，R=A/G，W=A/T，N=A/C/G/T。
具体地，上述PCR反应液中，连接至探针5’端的荧光基团可发出荧光信号，连接至探针3’端的淬灭基团可以抑制该荧光信号，在荧光定量PCR反应进行过程中，通过探针与目的序列的结合，淬灭基团与荧光基团分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。上述各条探针序列3’端的淬灭基团可以为DABCYL，也可为其他可用于荧光定量PCR反应的淬灭基团。上述探针序列5’端的荧光基团如表1所示：
表1探针序列与荧光基团对应关系
病毒类型 探针序列 荧光基团
札如病毒1型 SEQ ID NO:3 FAM
札如病毒2、4型 SEQ ID NO:6 FAM
诺如病毒1型 SEQ ID NO:9 ROX
诺如病毒2型 SEQ ID NO:12 FAM/HEX
轮状病毒 SEQ ID NO:15 HEX
腺病毒 SEQ ID NO:18 Cy5
星状病毒 SEQ ID NO:21 FAM/ROX
上表1中，FAM/HEX表示诺如病毒2型探针序列中部分探针连接FAM，另一部分连接HEX荧光基团，连接有FAM的探针量与连接有HEX的探针量的比例为1：（1.8-2），优选为1：2；FAM/ROX表示星状病毒的探针部分连接有FAM，另一部分连接有ROX荧光基团，两者的量的比例为1：（0.8-1），优选为1：1。本领域技术人员能理解的是，各条探针序列的5’端与其连接的荧光基团不限于上述对应关系。
本发明实施例中，探针、引物均制成储存液保存，储存液浓度为45-55μM，优选浓度为50μM。
本发明实施例的PCR反应液中，采用了同源加尾技术，其中Homo-tag连接于每对特异性引物的上游，并且有Homo-tag单独存在于该PCR反应液中，其可减少引物二聚体的生成，提高检测效率和准确度，提高特异性。在本发明的PCR反应液中，该Homo-tag序列浓度优选为0.2-0.24μmol，更优选为0.24μmol。
具体地，本发明实施例的PCR反应液中，MgCl2的工作浓度为2-4mmol，优选为3mmol；dNTP的浓度为0.1-0.3mmol，优选为0.2mmol；DNA聚合酶用量为0.8-1.2U，优选为1U。
在本发明实施例中使用的DNA聚合酶可使用任何适用于荧光定量PCR反应的DNA聚合酶，优选为rTaq酶。
本发明实施例还提供一种针对七种病毒（亚型）进行检测的PCR检测试剂盒，该PCR检测试剂盒包括本发明的PCR反应液。该PCR试剂盒可用于札如病毒1型，札如病毒2、4型，诺如病毒1型，诺如病毒2型，轮状病毒、腺病毒和星状病毒同时进行检测，由于上述七种病毒（亚型）中只有腺病毒为DNA病毒，其余六种均为RNA病毒，且腺病毒体内含有mRNA，也可逆转录成cDNA，因此可以先提取病毒核酸（RNA和DNA），然后将RNA逆转录成cDNA再进行PCR检测，以此确认对应病毒的存在。该操作可使得七种病毒（亚型）的检测可同步进行。提取核酸并将RNA反转录成cDNA以及获得基因组DNA的过程及操作方法为本领域技术人员熟知。
具体地，本发明的PCR检测试剂盒还可包括用于提取病毒总RNA的试剂，以及将提取的RNA逆转录为cDNA的逆转录酶。
具体地，本发明的PCR检测试剂盒还可包括阳性对照液，以确认荧光定量PCR的正确运行，该阳性对照液通过将对应七种病毒（亚型）的cDNA加入至本发明的PCR反应液中与加入待测样品的cDNA的PCR反应液同时进行荧光定量PCR反应。阳性对照的PCR检测结果为阳性时该检测结果才可以接受，否则要重新检测。
此外，本发明实施例还提供一种腹泻病毒的检测方法，该检测方法利用本发明的试剂盒，通过PCR反应实现。具体地，该PCR反应的条件可设定为：
92-95℃预变性3-5min；
92-95℃变性10-15s，58-60℃退火20-25s，70-72℃延伸15-20s，共5个循环；
92-94℃变性10-15s，52-55℃退火20-25s，70-72℃延伸15-20s，共40个循环。
优选的反应条件为：
95℃预变性3min；
95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸15s，共5个循环；
94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸15s，共40个循环。
在上述PCR反应中在第二个循环周期的退火阶段进行荧光信号检测，该检测过程由荧光定量PCR仪自动完成。
在本发明实施例中，获得检测结果后需对检测结果进行判定，以读取最终的检测结果，即对应的病毒是否被检出，根据PCR检测结果判定的标准如下：
阳性：标本检测结果Ct≤32，有明显指数期增长；
阴性：标本检测结果Ct>35或无Ct值；
对于标本检测结果32<Ct≤35，且有明显指数增长期，则处于可疑的情况。需将标本重新进行PCR检测，如果检测结果Ct≤35，则判定为阳性，若重测结果Ct>35或无Ct值，则判定为阴性。
本发明实施例的针对腹泻病毒的荧光定量PCR检测方法可对待检测样本中的引起腹泻的病毒的存在进行检测，可用于实验室研究及食品安全检测，也可用于医学检测分析。本发明实施例的荧光定量PCR检测方法特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例一
1.PCR反应液的制备
（1）按照如下序列合成引物和探针，其中各条探针序列5’端均连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团：
针对札如病毒1型的引物和探针：
SAP1-F：5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGTGTCYTGTGCCATTGAGG-3’(SEQ ID NO:1)，
SAP1-R：5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGTATGGAACATTGTGGCTYTC-3’(SEQ ID NO:2)，
SAP1-probe：FAM-CGCTGCATCAAYCATATGATATATGTGGCGGCAGCG-DABCYL(SEQ ID NO:3)；
针对札如病毒2、4型的引物和探针：
SAP2-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGACCAGGCTCTCGCCAC-3’(SEQ IDNO:4)，
SAP2-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGGTCCAATGGTGTCCTGDG-3’(SEQID NO:5)，
SAP2-probe:FAM-CCCTCCACYACCAAATTAGTGTTTGAAATGGAGGG-DABCYL(SEQ ID NO:6)；
针对诺如病毒1型的引物和探针：
NV1-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACGCTGGATGCGNTTCCAT-3’(SEQ IDNO:7)，
NV1-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’(SEQ ID NO:8)，
NV1-probe:ROX-CCGTGGAAGATYGCGRTCTCCTGTCCACGG-DABCYL(SEQ ID NO:9)；
针对诺如病毒2型的引物和探针：
NV2-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’(SEQ ID NO:10)，
NV2-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCGACGCCATCTTCATTCACA-3’(SEQ IDNO:11)，
NV2-probe:FAM/HEX-CGCACGATCGCCCTCCCACGTGCG-DABCYL(SEQ ID NO:12)，对于该探针，5’端连接有FAM的数量与连接有HEX的数量比为1：2；
针对轮状病毒的引物和探针：
RV-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACCATCTACACATGACCCTC-3’(SEQ IDNO:13)，
RV-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACACATAACGCCCCTATAGCC-3’(SEQ IDNO:14)，
RV-probe:HEX-CCGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCGCTCGG-DABCYL(SEQ ID NO:15)；
针对腺病毒的引物和探针：
Ade-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAATACTTCAGCCTGGGGAACAAG-3’(SEQ IDNO:16)，
Ade-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGCGTAAAGCGCACTTTG-3’(SEQ IDNO:17)，
Ade-probe:Cy5-CCCACGCCTGTCTGTGGTTACATCGTGGG-DABCYL(SEQ ID NO:18)；
针对星状病毒的引物和探针：
Ast-F:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATCCGTGATGTTAATGGG-3’(SEQ ID NO:19)，
Ast-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACGTTGCCAGAAAAGAAGC-3’(SEQ ID NO:20)，
Ast-probe:
FAM/ROX-CGCGACACCCCTGAAGGGAAAGGGACAGTCGCG-DABCYL(SEQ ID NO:21)，对于该探针，5’端连接FAM的数量与连接ROX的数量相同，即各占一半；
同时合成如下序列的Homo-tag：
5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3’(SEQ ID NO:22)。
上述探针、引物均制成储存液保存，储存液浓度均为50μM。
（2）按照如下表2所示制备PCR反应液：
表2PCR反应液组成
反应液组分 用量(μL） 原料来源
10x buffer(不含镁离子） 2.5 TaKaRa
MgCl2(25mM) 2.5 TaKaRa
dNTP 2.0 TaKaRa
Homo-Tag(50mM) 1.2 上海生工
SAP1F+R+Probe 0.05+0.05+0.1 上海生工
SAP2F+R+Probe 0.02+0.03+0.1 上海生工
NV1F+R+Probe 0.25+0.45+0.05 上海生工
NV2F+R+Probe-FAM/HEX 0.25+0.45+0.05+0.1 上海生工
RV F+R+Probe 0.03+0.05+0.1 上海生工
Ade F+R+Probe 0.03+0.05+0.1 上海生工
Ast F+R+Probe-FAM/ROX 0.15+0.25+0.05+0.05 上海生工
Taq酶（5U/μL） 0.2 TaKaRa
灭菌超纯水 余量 自制
合计 20
上表中连接FAM的NV2探针的量为0.05μL，连接HEX的NV2探针的量为0.1μL；连接FAM的Ast探针的量与连接ROX的Ast探针的量相同，均为0.05μL。
将上述各组分混合即得本实施例的PCR反应液。
2.检测试剂盒的制备
将步骤1制得的PCR反应液分装至PCR反应八联管中，每管20μL PCR反应液，制得PCR检测反应管。
阳性对照的制备：获得札如病毒（1型及2、4型）、诺如病毒（1型和2型）、星状病毒、腺病毒、轮状病毒，这些病毒的阳性株分别由广东省疾控中心和中国国家疾病预防控制中心提供。利用Trizol分别提取上述七种病毒（亚型）的总RNA并反转录成cDNA，具体操作步骤按照Trizol说明书进行，将上述cDNA分别加入至步骤1获得的PCR反应液中，即制得阳性对照。将阳性对照液加入PCR反应八联管中，得到阳性对照反应管。由此获得针对腹泻病毒的PCR检测试剂盒。
3.样本处理
取0.2g(黄豆粒大小)粪便标本加到1.5ml EP管中，加入标本处理液（PBS缓冲液），震荡3次，每次10秒。然后静置10分钟，再以8000rpm离心5分钟，吸取上清进行下一步试验或-20℃短期保存（不超过3个月）。注意所有粪便标本和便悬液的处理在二级生物安全柜中进行，生物安全柜使用前应提前运转10-20分钟。确保离心管上的标号与原始标本上的标号一致。然后，利用Trizol提取RNA，按照说明书步骤操作，接下来进行逆转录cDNA，获得cDNA样本。
4.PCR检测
本实施例对2012年9月至12月深圳市某监测医院送检的123份样本进行检测。
向步骤2获得的PCR检测试剂盒的PCR检测反应管中分别加入5μL上述步骤3获得的cDNA样本，进行荧光定量PCR检测，同时进行荧光定量PCR反应的还有步骤2获得的阳性对照反应管。PCR反应条件设置为：
95℃预变性3min；
95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸15s（共5个循环）；
94℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸15s（共40个循环），在第二个循环周期的退火阶段进行荧光信号检测。其中阳性对照反应管结果为阳性的情况被采用，否则重新检测。
本次PCR检测采用ABI-7500荧光PCR仪进行检测，本实施例针对123份样本进行检测，同时利用单色荧光PCR检测试剂盒进行比对。
5.结果判断标准
阳性：标本检测结果Ct≤32，有明显指数期增长。
阴性：标本检测结果Ct>35或无Ct值。
可疑：标本检测结果32<Ct≤35，有明显指数增长期。将标本重新进行PCR检测，如果检测结果Ct≤35，则判定为阳性，若重测结果Ct>35或无Ct值，则判定为阴性。
6.检测结果
本实施例的检测结果与单色荧光PCR检测结果一致，具体检测结果如下：共123份样本，其中诺如病毒1型7份，诺如病毒2型62份，轮状病毒39份，腺病毒6份，星状病毒2份，札如病毒0份，未检出上述7种病毒（亚型）15份。该结果的总和大于123，说明存在同时感染两种以上病毒的情况。
本发明实施例实现了同时对七种病毒（亚型）进行检测，且检测结果与单独对每种病毒（亚型）一致，因此在保证特异性的基础上实现了对不同病毒的快速检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种PCR反应液，包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，还包含：
针对札如病毒1型的引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及探针SEQ IDNO:3；
针对札如病毒2、4型的引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及探针SEQ IDNO:6；
针对诺如病毒1型的引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及探针SEQ IDNO:9；
针对诺如病毒2型的引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11及探针SEQ IDNO:12；
针对轮状病毒的引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14及探针SEQ ID NO:15；
针对腺病毒的引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17及探针SEQ ID NO:18；
针对星状病毒的引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及探针SEQ ID NO:21；
其中各条探针序列5’端均连接有荧光基团，3’端均连接有淬灭基团，其中所述探针SEQ ID NO:12的5’端连接的荧光基团为FAM/HEX，且连接有FAM的探针量与连接有HEX的探针量的比例为1:1.8-1:2；所述探针SEQID NO:21的5’端连接的荧光基团为FAM/ROX，且连接有FAM的探针量与连接有ROX的探针量的比例为1:0.8-1:1，所述探针序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18上连接的荧光基团选自FAM、ROX、HEX和Cy5中的一种，所述淬灭基团为DABCYL；
所述PCR反应液还包含序列为SEQ ID NO:22的Homo-tag。
2.如权利要求1所述的PCR反应液，其特征在于，所述DNA聚合酶为rTaq酶。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的PCR反应液。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，还包括阳性对照液。
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