CN109154022A - 用于寨卡病毒的快速差别检测的组合物和方法 - Google Patents
用于寨卡病毒的快速差别检测的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及使用一步测定差别检测多种病毒的组合物和方法。待检测的病毒包括寨卡病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒(基因型1‑4)和基孔肯雅病毒。特别地，本发明涉及使用经设计用于在病毒之间进行检测和区分的特异性引物和探针差别检测所述病毒的方法和测定。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月17日提交的美国专利申请序列号62/309,770和2016年12月8日提交的序列号62/431,550的优先权，其在此通过引用整体并入。
发明领域
本发明涉及使用一步测定差别检测多种病毒的组合物和方法。待检测的病毒包括寨卡病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒(基因型1-4)和基孔肯雅病毒。特别地，本发明涉及使用经设计用于在病毒之间进行检测和区分的特异性引物和探针差异检测病毒的方法。
发明背景
寨卡病毒(ZIKV)是一种新出现的蚊媒病毒，其影响包括非洲、亚洲和美洲在内的几个主要大陆，并被世界卫生组织(WHO)视为全球性紧急事件。ZIKV感染对孕妇具有高风险，因为其与严重的胎儿脑异常(诸如小头畸形、颅内钙化和胎儿脑破坏序列(fetal braindisruption sequence)以及眼部异常)具有因果关系(Rasmussen等，2016)。此外，ZIKV感染可能触发格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)的风险增加(Broutet等，2016)。
在城市和郊区环境中，ZIKV在人-蚊-人传播周期中传播。除了蚊子传播以外，证据表明ZIKV可以在妊娠期间从母亲传播给胎儿。另外，还报导了向伴侣的性传播。最后，尽管尚未报导ZIKV通过输血的传播，但鉴于其它相关黄病毒的传播，ZIKV可能会通过这种途径传播。
寨卡病毒是一种黄病毒，与登革热病毒(DENV)密切相关。ZIKV诊断通常基于临床症状和流行病学联系。寨卡病毒和登革热毒感染以及来自其它病毒，即西尼罗河病毒(一种黄病毒)和基孔肯雅病毒(一种甲病毒)的感染呈现相似的临床症状，导致差别诊断困难。
迄今为止，没有用于这四种相关虫媒病毒的差别检测的方法或测定。
发明内容
本发明提供了旨在通过检测血清和尿液样本(其可与同一患者的血清样本同时收集)中的病毒RNA来检测和诊断寨卡病毒感染的测定(即，CII-ArboPlex rRT-PCR测定)，多重一步法逆转录实时聚合酶链式反应测试。该测定还可用于血清和尿液样品中来自登革热病毒(DENV 1-4型)、基孔肯雅病毒(CHIKV)和西尼罗河病毒(WNV)的RNA的差别检测。ZIKVRNA通常在感染的急性期期间和在症状发作后长达两周的血清和/或尿液中可被检测到。使用CII-ArboPlex rRT-PCR测定的阳性结果表明急性病毒感染。
本发明提供了用于检测某些虫媒病毒的核酸存在的组合物、方法和试剂盒。具体地，本发明允许对某些虫媒病毒进行差别检测。具体地，本发明允许使用聚合酶链式反应形式在一步测定中差别检测寨卡病毒以及登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒。本发明的方法和测定法是快速、廉价、灵敏且有特异性的，并且允许检测和诊断寨卡病毒以及登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒。在某些实施方案中，本发明允许检测和确定在单个样品中发现哪种或哪些种特定病毒。在一个方面，本发明是引物和探针，其不仅可以检测单个样品中的病毒，而且还可区分单个样品中包含的哪种或哪些种病毒。
在某些方面，本发明提供了用于在一步测定(即，单个样品)中检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在可检测标记的寡核苷酸探针存在的情况下扩增病毒的核酸。在一些实施方案中，所述方法包括使用引物扩增病毒的核酸，其中所述引物包含SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11或12。在一些实施方案中，所述方法包括在引物对或组中使用不止一种引物来扩增病毒的核酸，其中引物对或引物组包含：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含SEQ ID NO:3、6、10或13。在一些实施方案中，所述方法包括在引物对或引物组中使用不止一种引物来扩增病毒的核酸，并用可检测标记的探针检测核酸的存在，其中所述引物对或引物组和探针包含：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10；和SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。在该方法的一些实施方案中，所有引物组和探针用于在同一时间(即，同时)检测同一个样品中的病毒核酸。在该方法的一些实施方案中，所有引物组和探针用于在连续时间(即，并发地)检测同一个样品中的病毒核酸。在一些实施方案中，待检测的核酸是RNA。在一些实施方案中，待检测的核酸是cDNA。
在某些实施方案中，探针包含可检测部分。可检测部分可以是本领域技术人员已知的任何可检测部分而没有限制。例如，可检测部分可以是荧光部分。在某些实施方案中，荧光部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列/系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料。
在某些实施方案中，探针包含猝灭剂部分。猝灭剂部分可以是本领域技术人员已知的任何猝灭剂部分而没有限制。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列/系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTTM-系列染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。
在某些实施方案中，所述方法包括在可检测标记的核酸探针存在的情况下扩增寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸，所述核酸探针包含荧光部分和猝灭剂部分。在某些实施方案中，可检测标记的探针通过具有5'-3'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶的片段化将荧光部分与猝灭剂部分分开。在某些实施方案中，可通过监测荧光的发射来检测探针的片段化并因此检测病毒核酸的存在。
本发明还提供了在一步测定(即，单个样品)中检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用至少一种寡核苷酸在允许开始扩增来自所述寡核苷酸的至少部分核苷酸序列的条件下扩增寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸，所述寡核苷酸包含选自由以下组成的序列：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；并检测扩增的核酸，从而检测病毒。在一些实施方案中，所述方法包括在引物对或引物组中使用不止一种引物来扩增病毒的核酸，其中所述引物对或引物组包含：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；以及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含SEQ ID NO:3、6、10或13。在一些实施方案中，所述方法包括在引物对或引物组中使用不止一种引物来扩增病毒的核酸，并用可检测标记的探针检测所述核酸的存在，其中引物对或引物组和探针包含：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；以及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。在该方法的一些实施方案中，所有引物组和探针用于在同一时间(即，同时)检测同一个样品中的病毒核酸。在该方法的一些实施方案中，所有引物组和探针用于在连续时间(即，并发地)检测一个样品中的病毒核酸。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是cDNA。
在某些实施方案中，探针包含可检测部分。可检测部分可以是本领域技术人员已知的任何可检测部分而没有限制。例如，可检测部分可以是荧光部分。在某些实施方案中，所述荧光部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料，噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料。
在某些实施方案中，探针包含猝灭剂部分。所述猝灭剂部分可以是本领域技术人员已知的任何猝灭剂部分而没有限制。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料，噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料和非荧光所述猝灭剂部分。在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTTM-系列染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。
在某些实施方案中，所述方法包括在可检测标记的核酸探针存在的情况下扩增寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸，所述核酸探针包含荧光部分和猝灭剂部分。在某些实施方案中，可检测标记的探针通过具有5'-3'核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶的片段化将荧光部分与猝灭剂部分分开。在某些实施方案中，可以通过监测荧光的发射来检测探针的片段化并因此检测病毒核酸的存在。
除了前述方法以外，本发明还提供了用于检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸的核酸引物和探针。在某些方面，本发明提供了用于检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸引物。
在某些实施方案中，本发明提供了用于检测寨卡病毒的核酸引物，其包含SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测包含西尼罗河病毒的核酸引物，其包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测登革热病毒的核酸引物，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测基孔肯雅病毒的核酸引物，其包含SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12。
在其它方面，本发明提供了用于检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸探针。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测寨卡病毒的核酸探针，其包含SEQ ID NO:3。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测西尼罗河病毒的核酸探针，其包含SEQ ID NO:6。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测登革热病毒的核酸探针，其包含SEQ ID NO:10。在某些实施方案中，本发明提供了用于检测基孔肯雅病毒的核酸探针，其包含SEQ ID NO:13。
在某些实施方案中，本发明提供了包含荧光部分和猝灭剂部分的核酸探针。在某些实施方案中，将荧光部分相对于猝灭剂部分定位，使得当探针完整时，荧光部分发射的光子被猝灭剂部分吸收。具有5'核酸酶活性的酶对探针的片段化将荧光部分与猝灭剂部分分开，从而使得可检测由荧光部分发射的光子。
在其它方面，本发明提供了用于检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸和/或检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括本发明的一种或多种引物和探针的组合。在某些实施方案中，试剂盒包括选自由SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12组成的组的一种或多种引物。在某些实施方案中，试剂盒包括选自由SEQ ID NO:3、6、10和13组成的组的一种或多种探针。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于阳性对照序列的引物和探针。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于检测人RNA酶的引物和探针。在某些实施方案中，试剂盒包括含有SEQID NO:14-16的引物和探针。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括可用作核酸探针的寡核苷酸，其中一个或多个可检测部分与核酸探针连接。在某些实施方案中，一个或多个可检测部分是荧光部分。在某些实施方案中，荧光部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料，噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括可用作核酸探针的寡核苷酸，其中至少一个猝灭剂部分与核酸探针连接。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料，噁嗪系列染料、噻嗪类染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素染料和-系列染料和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，所述非荧光猝灭剂部分可以是BHQTTM-系列染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。在其它实施方案中，探针包含至少一个可检测部分，例如，荧光部分和至少一个猝灭剂部分。在一个实施方案中，使用双标记的标记探针。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括耐热DNA聚合酶。在某些实施方案中，耐热DNA聚合酶具有逆转录活性。在某些实施方案中，根据本发明的方法，本发明的试剂盒另外包含用于检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸和/或寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的说明书。在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括对照，包括但不限于所有病毒和人核酸的阳性对照，以及阴性对照。
附图说明
图1是显示测定结果和报告说明的解释的表。
图2是利用用登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒加标的人为血清和尿液样品验证CII-ArboPlex rRT-PCR测定的结果的表。
具体实施方式
根据本发明，可以有在本领域技术范围内的许多工具和技术，诸如通常用于分子免疫学、细胞免疫学、药理学和微生物学的那些工具和技术。参见，例如，Sambrook等,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Ausubel等编辑(2005)Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Bonifacino等编辑(2005)Current Protocols in Cell Biology,John Wiley和Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan等编辑(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coico等编辑(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley和Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan等编辑(2005)Current Protocols in ProteinScience,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；和Enna等编辑(2005)CurrentProtocols in Pharmacology,John Wiley和Sons,Inc.:Hoboken,N.J.。
“扩增反应”是指导致模板核酸序列的拷贝增加或表明模板存在的信号增加的任何反应(例如，化学、酶促或其它类型的反应)。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)(参见美国专利第4,683,195号和第4,683,202号；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等，编辑，1990))、链置换扩增(SDA)(Walker等，Nucleic Acids Res.20(7):1691-6(1992)；Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6(1993))、转录介导的扩增(Phyffer等，J.Clin.Microbiol.34:834-841(1996)；Vuorinen等，J.Clin.Microbiol.33:1856-1859(1995))、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton,Nature 350(6313):91-2(1991)、滚环扩增(RCA)(Lisby,Mol.Biotechnol.12(1):75-99(1999))；Hatch等，Genet.Anal.15(2):35-40(1999))、支链DNA信号放大(bDNA)(Iqbal等，Mol.Cell.Probes 13(4):315-320(1999))和Q-β复制酶(Lizardi等，Bio/Technology 6:1197(1988))。
如本文所用，“样品”是指含有或假定含有核酸的任何物质。样品可属于天然或合成来源，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。样品可以是从一个或多个个体分离的组织或液体样品，包括但不限于例如皮肤、血浆、血清、全血、脊髓液、精液、精液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、肿瘤、支气管肺泡灌洗液，以及体外细胞培养成分的样品(包括但不限于由细胞在细胞培养基中生长而产生的条件培养基、重组细胞和细胞成分)。可通过本领域已知的任何方法从生物样品中获得核酸。优选样品包括血清和尿液。
如本文中所用，术语“受试者”是指任何生物，包括但不限于哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在优选实施方案中，受试者是人、宠物或家畜。
如本申请中所用，术语“患者”是指人受试者。
如本文中所用，术语“检测(detection)”、“检测(detect)”、“检测(detecting)”等意指发现事物的出现或存在。
如本文中所用，术语“区分(differentiate)”、“差别的(differential)”等意指鉴定或识别为不同的。
如本文中所用，术语“虫媒病毒”意指由蚊子、蜱或其它节肢动物传播的病毒，所述病毒包括寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和基孔肯雅病毒以及黄热病和脑炎病毒。
如本文中所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探针、待测寡聚体片段、寡聚体对照和未标记的阻断寡聚体，并且对于聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)的线性聚合物以及嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任何其它N-糖苷是通用的。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含磷酸二酯键联或经修饰的键联，包括但不限于磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯或砜键联，以及此类键联的组合。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含五种生物学上存在的碱基(biologicallyoccurring base)(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除所述五种生物学上存在的碱基外的碱基。这些碱基可用于许多目的，例如稳定杂交或使杂交去稳定；促进或抑制探针降解；或作为可检测部分或猝灭剂部分的连接点(attachment point)。例如，本发明的多核苷酸可含有一个或多个经修饰的非标准的或衍生的碱基部分，包括但不限于N6-甲基-腺嘌呤、N6-叔丁基-苄基-腺嘌呤、咪唑、取代的咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基辫苷(beta-D mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。修饰的非标准的或衍生的碱基部分的其它实例可见于美国专利第6,001,611号、第5,955,589号、第5,844,106号、第5,789,562号、第5,750,343号、第5,728,525号和第5,679,785号。
此外，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
本发明并不旨在受核酸、多核苷酸或寡核苷酸来源限制。核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以来自人或非人哺乳动物，或任何其它生物体，或源自任何重组来源(体外合成的或通过化学合成的)。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、杂合体(hybrid)或其任何混合物，并且可存在于双链、单链或部分双链形式核苷酸中。核酸还可以是如美国专利第5,696,248号中所述的衍生核酸。本发明的核酸包括纯化或未纯化形式的核酸及其片段，包括基因、染色体、质粒、生物材料诸如微生物(例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌)、植物、动物、人等的基因组。
术语核酸、多核苷酸和寡核苷酸之间在长度上没有特意的区别，并且这些术语可互换使用。这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。本发明的寡核苷酸可用作引物和/或探针。因此，本文中称为“引物”的寡核苷酸可以充当探针，并且称为“探针”的寡核苷酸在一些实施方案中可以充当引物。
如本文中所用，术语“残基”是指如上定义的核酸内的核苷酸或碱基。残基可以是本领域技术人员已知的任何核苷酸而没有限制，包括上述所有生物学上存在的核苷酸和非生物学上天然核苷酸。
术语“引物”是指当被置于允许合成与模板链互补的引物延伸产物的条件下时，能够充当沿模板核酸链的多核苷酸合成的起始点的寡核苷酸。引物可获自重组来源，如在纯化的限制性片段中，或合成产生。引物延伸条件通常包括在合适的缓冲液(“缓冲液”可包含作为辅因子，或影响pH、离子强度的的取代物)中并且在适当的温度下存在四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和具有聚合活性的试剂(诸如DNA聚合酶或逆转录酶)。引物优选是单链的，以获得最大的扩增效率。本发明的引物可以为5个至500个核苷酸，并且在一些实施方案中，将具有至少10个、20个、30个、25个、30个、40个、50个、75个或100个核苷酸和/或具有少于500个、300个、200个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、25个或20个核苷酸。
术语“杂交”是指单链核酸或双链核酸的局部单链区域与另一个具有互补序列的单链核酸或双链核酸的局部单链区域的结合。如本领域技术人员所知，两条核酸链不必完全互补以彼此杂交。取决于杂交条件，即使在一条或两条链中存在很少、一些或许多错配、缺失或添加，核酸也可与其互补序列杂交。在某些实施方案中，本发明的引物和探针可以选择性地与至少部分互补的核酸杂交，如下文所定义的。在某些实施方案中，本发明的引物和探针可在严格条件下与至少部分互补的序列杂交。
如本文所用，术语“探针”是指寡核苷酸，所述寡核苷酸可由于探针中的至少一个序列与核酸的区域中的序列的互补性而与所述核酸的区域形成双链体结构。探针优选不含与引物的一个或多个序列互补的序列。如下所述，探针可以是标记的或未标记的。可以“封闭”探针的3'末端以禁止探针掺入引物延伸产物中。“封闭”可通过使用非互补碱基或通过将化学部分(诸如生物素或磷酸基团)添加到最后一个核苷酸的3'羟基(取决于所选择的部分，这也可通过充当用于随后检测的标记物或捕获与标记物连接的核酸用作双重目的)来实现。封闭也可通过除去3'羟基或使用缺乏3'羟基的核苷酸诸如双脱氧核苷酸来实现。
如本文中所用，术语“可检测部分”是指可用于提供可检测(任选地可定量)信号的任何原子或分子，其可连接于核酸或蛋白质。可检测部分可提供可通过荧光、放射性、比色法、重量分析、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。用于本发明的方便的可检测部分包括有利于检测寡核苷酸片段大小的那些可检测部分。
如本文中所用，术语“荧光部分”是指可在适合于特定部分的条件下发射光的化学部分。通常，特定荧光部分可以在吸收较短波长的光之后发射特定波长的光。由特定荧光部分发射的光的波长是该部分的特征。因此，可以通过用较短波长的光激发荧光部分后检测适当波长的光来检测特定的荧光部分。可用于本发明的方法和组合物的荧光部分的实例包括但不限于荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁染料系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪系列染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素系列染料和-系列染料。
如本文中所用，术语“猝灭剂部分”是指当猝灭剂部分足够接近荧光部分时可(例如，当猝灭剂和荧光部分都与共同部分连接时)多核苷酸以吸收荧光部分发射的能量的化学部分。该现象在本领域中通常称为荧光共振能量转移(“FRET”)。猝灭剂部分可以以该猝灭剂部分特有的信号重新发射从荧光部分吸收的能量，因此猝灭剂也可以是“荧光部分”。或者，猝灭剂部分可以将从荧光部分吸收的能量作为热量消散。
如本文中所定义的，“5'至3'核酸酶活性”或“5'核酸酶活性”是指酶籍以以顺序方式从寡核苷酸的5'末端除去核苷酸的活性。5'核酸酶活性可以是5'至3'外切核酸酶活性或5'至3'核酸内切酶活性。例如，许多模板特异性核酸聚合酶表现出传统上与一些DNA聚合酶相关联的5'至3'外切核酸酶活(即，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I具有该活性，而大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段不具有该活性)。5'至3'外切核酸酶活性还可离底物的5'末端超过一个磷酸二酯键(核苷酸)切割底物核酸。
术语“约”或“大致”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或测定该值，即，测量系统的限制，即，特定目的(诸如药物制剂)所需的精确程度。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”可表示最高达给定值的20％，优选最高达定值的10％，更优选最高达定值的5％，更优选最高达定值的1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示数值的一个数量级，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。
除非另外说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
用于检测虫媒病毒的引物和探针
本发明提供了分离的核酸序列，诸如来自病毒基因组特定部分(包括寨卡病毒和登革热病毒的3'UTR、西尼罗河病毒基因组的NS5部分和基孔肯雅病毒基因组的NSP2部分)的引物和探针。考虑到基于序列比对和测定灵敏度的可能的交叉反应性来设计这些特异性引物和探针，因此，本发明的引物和探针特别有用，因为它们可以用于在单个样品和/或反应中检测并区分四种不同的虫媒病毒，包括寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和基孔肯雅病毒。
另外，本发明的引物和探针是非天然存在的组合物。寡核苷酸所源自的虫媒病毒是黄病毒(ZKV、DKV和WNV)和甲病毒(CHV)，其全部均为单链RNA病毒。因此，本发明的引物和探针包含在自然界中不存在的cDNA，并且本发明的核酸序列在结构上与天然存在的病毒RNA序列显著不同。
在一个方面，本发明提供至少一种引物，其可用于检测寨卡病毒的核酸和/或寨卡病毒本身的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及包含引物的引物组，所述引物包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了至少一种引物，其可用于检测西尼罗河病毒的核酸和/或西尼罗河病毒本身的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及包含引物的引物组，所述引物包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了至少一种引物，其可用于检测登革热病毒的核酸和/或登革热病毒本身的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及包含引物的引物组，所述引物包含SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供了至少一种引物，其可用于检测基孔肯雅病毒的核酸和/或基孔肯雅病毒本身的存在。在某些实施方案中，引物包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在某些实施方案中，本发明涉及包含引物的引物组，所述引物包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
本领域技术人员将理解，可以从SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12的末端删除一些碱基或向所述末端添加一些碱基，并且所述引物仍然可以扩增所述核酸。因此，本发明包括其中删除了SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12的序列的一些碱基或向所述序列添加了一些碱基的引物。
在某些方面，本发明涉及包含如本文所述的分离的核酸的寡核苷酸探针，该探针适于在合适的条件下与来自寨卡病毒的核酸杂交。在某些实施方案中，探针包含SEQ IDNO:3的核酸。
在某些方面，本发明涉及包含如本文所述的分离的核酸的寡核苷酸探针，该探针适于在合适的条件下与来自西尼罗河病毒的核酸杂交。在某些实施方案中，该探针包含SEQID NO:7的核酸。
在某些方面，本发明涉及包含如本文所述的分离的核酸的寡核苷酸探针，该探针适于在合适的条件下与来自登革热病毒的核酸杂交。在某些实施方案中，该探针包含SEQID NO:11的核酸。
在某些方面，本发明涉及包含如本文所述的分离的核酸的寡核苷酸探针，该探针适于在合适的条件下与来自基孔肯雅病毒的核酸杂交。在某些实施方案中，探针包含SEQID NO:13的核酸。
本发明的核酸引物和探针可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备而没有限制。
除探针核苷酸序列外，探针还可包含额外的核苷酸序列或不抑制本发明方法的其它部分。在本发明的方便实施方案中，探针可包含额外的核苷酸序列或促进本发明方法的其它部分。例如，可在其3'末端封闭探针以防止探针引发不希望的核酸聚合。此外，探针内部还可存在稳定探针或探针片段与核苷酸序列的杂交或使所述杂交去稳定的部分。本发明的探针还可包含如上定义的经修饰的非标准的或衍生的核苷酸。
在本发明的某些实施方案中，探针可包含可检测部分。可检测部分可以是本领域技术人员已知的任何可检测部分而没有限制。另外，可检测部分可通过本领域技术人员已知的任何方法检测而没有限制。例如，可检测部分可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测。
可用于检测本发明的探针的各种可检测部分以及用于它们与探针键联的方法是本领域已知的，包括但不限于酶(例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)和酶底物、放射性部分、荧光部分、发色团、化学发光标记物、电化学发光标记物诸如OriginTM(Igen,Rockville,Md.)、具有特异性结合伴侣的配体，或可以彼此相互作用以增强、改变或减少信号的任何其它标记物。如果在升高的温度下使用耐热DNA聚合酶进行5'核酸酶反应，则可检测部分不应被降解或以其它方式使得在这样的升高的温度下检测不到。
在某些实施方案中，可检测部分可以是荧光部分。荧光部分可以是本领域技术人员已知的任何荧光部分而没有限制。通常，具有宽斯托克斯位移的荧光部分是优选的，其允许使用具有滤光器而非单色器的荧光计并提高检测效率。在某些实施方案中，荧光部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料(Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,Iowa)、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料(Molecular Probes,Inc.,Eugene,Or)、罗丹明系列染料(Integrated DNA Technologies,Inc.)、菁系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪系列染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素系列染料、-系列染料(Molecular Probes,Inc.)和6-羧基荧光素(FAMTM)(IntegratedDNA Technologies,Inc.)。可以在本发明的探针、方法和试剂盒中使用的荧光部分的其它实例可见于美国专利第6,406,297号、第6,221,604号、第5,994,063号、第5,808,044号、第5,880,287号、第5,556,959号和第5,135,717号中。
在其它实施方案中，可检测部分可以是除荧光部分外的可检测部分。在放射性部分中，32P-标记的化合物是优选的。可使用本领域技术人员已知的任何方法(而没有限制)将32P引入探针中。例如，探针可用32P标记(通过用激酶进行5'标记或通过切口平移随机插入)。作为酶的可检测部分通常可通过它们的活性来检测。例如，可通过测量通过碱性磷酸酶对合适的底物化合物的作用产生的荧光来检测该碱性磷酸酶。当特异性结合伴侣的成员用作可检测部分时，可通过检测分子与特异性结合伴侣的成员的特异性结合来检测探针的存在。例如，可将抗原与探针连接，并且对该抗原有特异性的单克隆抗体可用于检测抗原的存在，从而检测探针的存在。可用作可检测部分的其它特异性结合伴侣包括生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A，以及本领域公知的许多其它受体-配体对。作为非荧光部分的可检测部分的其它实例仍可见于美国专利第5,525,465号、第5,464,746号、第5,424,414号和第4,948,882中。
以上对可检测部分的描述并不意味着将各种标记分类为不同的类别，因为相同的标记物可以以几种不同的模式起作用。例如，125I可用作放射性部分或用作电子致密试剂。辣根过氧化物酶可用作酶，或用作针对单克隆抗体的抗原。另外，可以组合各种可检测部分以获得所需效果。例如，可用生物素标记探针，并用125I标记的抗生物素蛋白或用辣根过氧化物酶标记的抗生物素单克隆抗体检测其存在。其它排列和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，并且被认为是在本发明范围内的等同物。
当然，将可检测部分与探针连接或缀合的方法取决于一种或多种所用可检测部分的类型和可检测部分在探针上的位置。
可通过多种技术将可检测部分与探针直接或间接连接。取决于所用可检测部分的确切类型，可检测部分可位于探针的5'或3'末端，位于探针核苷酸序列内部，或连接于各种大小和组成的间隔臂以促进信号相互作用。通过使用商购可得的亚磷酰胺试剂，可通过适当保护的亚磷酰胺在任一末端产生含有官能团(例如，硫醇或伯胺)的寡核苷酸，并且可使用例如PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，由Innis等编辑的，Academic Press,Inc.,1990中描述的方案将可检测部分连接到其上。
在某些实施方案中，可将可检测部分与探针的5'末端连接。在某些实施方案中，可将可检测部分与探针的3'末端连接。在其它实施方案中，可将可检测部分在探针内的残基处与探针连接。可将可检测部分与探针残基的任何部分连接。例如，可将可检测部分与探针中核苷酸的糖、磷酸或碱基部分连接。在其它实施方案中，可在探针的两个残基之间连接可检测部分。
在本发明的某些实施方案中，探针可包含荧光部分和猝灭剂部分。在此类实施方案中，荧光部分可以是如上所述的本领域技术人员已知的任何荧光部分。另外，猝灭剂部分可以是本领域技术人员已知的任何猝灭剂部分而没有限制。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁染料系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪系列染料、方酸菁系列染料、螯合镧系元素系列染料、-系列染料和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTTM-系列染料(包括WO 01/86001中描述的猝灭剂)、Iowa BlackTM或Dabcyl(Integrated DNA Technologies,Inc)。特定猝灭剂部分的其它实例包括，例如但不限于，TAMRA(N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明)(Molecular Probes,Inc.)、DABCYL(4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸)、Iowa BlackTM(Integrated DNATechnologies,Inc.)、Cy3TM(Integrated DNA Technologies,Inc.)或Cy5TM(IntegratedDNA Technologies,Inc.)。可以在本发明的探针、方法和试剂盒中使用的猝灭剂部分的其它实例可见于美国专利第6,399,392号、第6,348,596号、第6,080,068号和第5,707,813号。
在某些实施方案中，可将猝灭剂部分与探针的5'末端连接。在某些实施方案中，可将猝灭剂部分与探针的3'末端连接。在其它实施方案中，可将猝灭剂部分在探针内的残基处与探针连接。可将猝灭剂部分与探针残基的任何部分连接。例如，可将猝灭剂部分与探针中核苷酸的糖、磷酸或碱基部分连接。在其它实施方案中，可在探针的两个残基之间连接猝灭剂部分。
可用于本发明该方面的荧光部分和猝灭剂部分的示例性组合包括但不限于双重标记的探针。双重标记的BHQ探针是线性的，双重标记的5'-3'外切核酸酶探针，其掺入了分别与寡核苷酸的5'和3'末端共价连接的荧光团和猝灭剂。通过Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性产生荧光信号，所述Taq聚合酶在消化与靶链中的其互补序列杂交的探针的过程中从探针切掉荧光染料标记的核苷酸，从而将猝灭剂与荧光团分离。
特别地，将用于检测寨卡病毒的示例性探针SEQ ID NO:3在5'末端用CAL FluorRed 610修饰，在3'末端用BHQ-2修饰。
将用于检测西尼罗河病毒的示例性探针SEQ ID NO:7在5'末端用Quasar 670修饰，在3'末端用BHQ-2修饰。
将用于检测登革热病毒的示例性探针SEQ ID NO:11在5'末端用CAL FluourOrange 56修饰，在3'末端用BHQ-1plus修饰。
将用于检测基孔肯雅病毒的示例性探针SEQ ID NO:13在5'末端用FAM修饰，在3'末端用BHQ-1plus修饰。
虫媒病毒的多重检测方法
本发明提供了使用核酸引物和探针检测某些虫媒病毒的核酸和/或病毒本身的方法。在一些方面，本发明提供了使用核酸引物和探针来定量样品中某些虫媒病毒的核酸的方法。如本文中所述，可使用本领域技术人员已知的或后来开发的使用核酸引物和探针检测核酸的任何方法(而没有限制)检测可检测的虫媒病毒的核酸。在某些实施方案中，该方法提供使用引物和探针来检测虫媒病毒的核酸。在其它实施方案中，该方法提供使用不止一种引物和探针来检测虫媒病毒的核酸。在一些实施方案中，在单个样品中检测一种虫媒病毒的核酸。在一些实施方案中，在单个样品中检测不止一种虫媒病毒的核酸。
检测虫媒病毒的核酸的一种方法通常包括使与病毒核酸杂交的引物与具有5'核酸酶活性的酶接触。然后具有5'核酸酶活性的酶在5'核酸酶反应中将与病毒核酸杂交的探针片段化。探针可用可检测部分标记，该部分使得能够检测探针的片段化。此类方法基于美国专利第6,214,979号、第5,804,375号、第5,487,972号和第5,210,015号描述的那些方法。
在5'核酸酶反应中，可使核酸、引物和探针与本领域技术人员已知的具有5'至3'核酸酶活性的任何酶(而没有限制)接触。优选选择条件以允许聚合酶切割探针并从核酸释放探针的多个片段。具有5'核酸酶活性的优选酶包括模板依赖性核酸聚合酶。此类聚合酶的已知的天然和重组形式包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I(Fermentas,Inc.,Hanover,Md.)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶和夜蛾热球菌(Thermococcus littoralis)DNA聚合酶(Fermentas,Inc.,Hanover,MD)。
在优选实施方案中，具有5'核酸酶活性的酶是耐热的和热活性的核酸聚合酶。此类耐热聚合酶包括但不限于来自真菌细胞属栖热菌属(Thermus)、热袍菌属(Thermatoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)的各种物种的天然和重组形式的聚合酶。
5'核酸酶反应包括在其中引物和探针与核酸杂交的条件下使待测核酸与引物、探针和具有5'至3'核酸酶活性的酶接触。5'核酸酶反应的组分可以以任何顺序接触待测核酸，例如，引物可以首先接触待测核酸，然后接触探针和具有5'核酸酶活性的酶，或者可选地具有5'核酸酶活性的酶可以首先接触待测核酸，然后接触探针和引物。在某些实施方案中，可以将不止一种引物或探针添加至5'核酸酶反应。在某些优选实施方案中，一对引物可以在5'核酸酶反应中与核酸接触。引物可以是能够引发DNA合成反应的任何引物。当仅使用一种引物时，引物应与探针上游的核酸杂交，即引物的3'末端应指向探针的5'末端。引物的3'末端可在探针的5'末端相邻处杂交，或者引物的3'末端可以在探针的5'末端的更上游杂交。在使用不止一种引物的情况下，如上所述，至少一种引物应与探针上游的待测核酸杂交。
本发明的5'核酸酶反应的某些实施方案基于本领域技术人员已知的几种5'核酸酶反应。此类反应的实例详细描述于，例如，美国专利第5,210,015号中。
简言之，在5'核酸酶反应中，在引物和探针与核酸链杂交的条件下，使靶核酸与引物和探针接触。还使核酸、引物和探针与具有5'至3'核酸酶活性的酶(例如核酸聚合酶)接触。具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶可切割与引物下游的核酸杂交的探针。引物的3'末端提供了用于通过核酸聚合酶延伸新核酸(如基于模板核酸的)的底物。当聚合酶延伸新核酸时，其遇到探针的5'末端并开始从探针切割片段。
可以设计引物和探针使得它们彼此非常接近地与靶核酸杂交，使得核酸聚合酶与引物的3'末端的结合使其与探针的5'末端接触。在该过程中，不需要核酸延伸来使核酸聚合酶就位以完成切割。术语“不依赖于聚合的切割”是指该过程。
或者，如果引物和探针与核酸的相隔更远的区域退火，则核酸延伸必须在核酸聚合酶遇到探针的5'末端之前发生。随着聚合的继续，聚合酶逐渐切割来自探针5'末端的片段。这种切割一直持续到探针的其余部分已被去稳定至其与模板分子解离的程度。术语“聚合依赖性切割”是指该过程。
在任一过程中，提供了含有核酸的样品。如果核酸是双链的，则应首先使其变性，例如，核酸的链彼此分开。可使用本领域技术人员已知的任何合适的变性方法，包括物理、化学或酶方法(而没有限制)来分离核酸链。
应注意，可用本发明的引物、探针、方法和试剂盒检测的病毒是单链正链RNA病毒。因此，不需要天然病毒基因组的变性来检测未扩增的病毒基因组。然而，如果根据本发明的某些实施方案将天然病毒基因组逆转录成DNA，则在用本发明的引物和探针检测之前必需使扩增的病毒核酸变性。
如果待测核酸是RNA，则RNA可以用作如上所述的5'核酸酶反应的RNA模板，或者RNA可以用作用于逆转录成cDNA的模板，或同时用作两者。在某些实施方案中，可使用本发明的方法检测RNA而无需逆转录成cDNA。如上所述的不依赖聚合的切割方法特别适合于此类实施方案。在其它实施方案中，可以在不存在探针的情况下首先将RNA逆转录成cDNA，然后可根据本发明的方法检测cDNA产物。在其它实施方案中，可在探针存在的情况下逆转录RNA，同时产生随后可以扩增和/或检测的cDNA，并通过评估如本文所述的探针的片段化来检测RNA的存在。
在于探针不存在的情况下逆转录RNA时，可通过本领域技术人员已知的任何方法将RNA逆转录成cDNA。然后可根据本文所述的方法像检测任何可检测的核酸一样检测此类逆转录的产物。
当RNA在探针存在下被逆转录时，RNA可以被具有5'-3'核酸酶活性的DNA聚合酶逆转录，所述DNA聚合酶可使用RNA作为DNA链合成的模板。与所有已知的DNA聚合酶合成活性一样，此类合成需要存在引物，诸如本文所述的那些引物。可使用RNA作为模板的DNA聚合酶优选是耐热的，因此可在不破坏聚合酶的情况下发生多个变性和DNA合成循环。另外，用于逆转录的DNA聚合酶也可以优选地使用DNA模板合成DNA。此类聚合酶描述于，例如，美国专利第6,468,775号(生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenformans)DNA聚合酶)、第5,968,799号(非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)DNA聚合酶)、第5,736,373号(苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)DNA聚合酶)、第5,674,738号(栖热菌属物种Z05DNA聚合酶)和第5,407,800号(水生栖热菌(Thermus aquaticus)和嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)DNA聚合酶)中。另外，使用具有逆转录活性的耐热DNA聚合酶逆转录RNA的方法和组合物描述于美国专利第5,693,517号、第5,561,058号、第5,405,774号、第5,352,600号、第5,310,652号和第5,079,352号中。
无论是RNA还是DNA，然后在杂交条件下使变性的核酸链与引物和探针接触，这使得引物和探针能够与核酸链结合。在某些实施方案中，两种引物可用于扩增核酸。在此类实施方案中，可选择两个引物，使得它们沿着核酸的相对位置使得从一个引物合成的延伸产物在延伸产物与其模板(互补链)分离后，可以用作模板，用于延伸另一引物以产生确定长度的扩增产物。产物的长度取决于两个引物之间的序列的长度和两个引物本身的长度。
探针优选与待测核酸杂交，然后聚合酶结合所述核酸和引物并开始基于可检测核酸的模板从引物延伸新的核酸链。在探针与可检测核酸接触之前，聚合酶可能结合引物和待测的核酸；然而，除非进行多个引物延伸循环，否则这种排列可导致探针片段化减少，如在下文所述的优选的基于PCR的5'核酸酶反应中。因此，优选地探针在开始通过聚合酶进行引物延伸之前与待测核酸杂交。
可使用本领域技术人员已知的各种技术来增加探针在引物延伸聚合到达该双链体区域之前或在聚合酶在不依赖于聚合的过程中连接至上游寡核苷酸之前，与可检测核酸杂交的可能性。例如，短引物分子通常需要较低的温度以与核酸形成足够稳定的杂合复合物。因此，探针可被设计得比引物长，使得探针相对于引物退火在更高温度下优先与核酸退火。
还可使用基于其核苷酸组成具有不同热稳定性的引物和探针。例如，可选择探针以具有更大的G/C含量，并因此具有比引物更高的热稳定性。可选地或另外地，可将一种或多种经修饰的非标准的或衍生的DNA碱基掺入引物或探针中以产生与仅具有常规DNA碱基的引物或探针相比，更高或更低的热稳定性。此类经修饰的非标准的或衍生的碱基的实例可见于美国专利第6,320,005号、第6,174,998号、第6,001,611号和第5,990,303号中。
另外，还可改变反应温度以利用探针和引物的差异热稳定性。例如，在如上所述在高温下变性后，可在允许探针而非引物结合的中间温度下孵育反应物，然后进一步降温以允许引物退火和随后的延伸。
在由适当的盐、金属阳离子和pH缓冲系统组成的反应介质中，如上所述，在足量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或类似物(例如dUTP)存在的情况下，由DNA聚合酶催化一种或多种寡核苷酸引物的模板依赖性延伸。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性DNA合成并具有5'至3'核酸酶活性的酶。此类酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、夜蛾热球菌DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermatoga maritima)DNA聚合酶以及那不勒斯栖热袍菌(Thermatoga neapolitana)DNA聚合酶和Z05DNA聚合酶。另外，使用这些DNA聚合酶进行DNA合成的反应条件是本领域公知的。为了用于本发明的方法，聚合剂应具有5'核酸酶活性，其可高效切割寡核苷酸并释放标记的片段，使得直接或间接地产生可检测信号。
合成的产物是由模板链和引物延伸链组成的双链体分子。该合成的副产物是探针片段，其可由单核苷酸、二核苷酸和寡核苷酸片段的混合物组成。在优选实施方案中，可进行变性、探针和引物退火以及引物延伸和探针的切割的重复循环，导致由引物限定的扩增区域的指数积累和标记片段的指数产生。此类重复热循环在本领域中通常称为聚合酶链式反应(PCR)。可以进行足够的循环以获得足够量的探针以区分阳性反应(即存在待测核酸)与阴性反应(即不存在待测核酸)。通常，阳性反应将显示比阴性反应高几个数量级的信号。
在某些优选实施方案中，将PCR反应作为利用耐热酶的自动化方法来进行。在该方法中，使反应混合物通过以下步骤进行循环：变性步骤、探针和引物退火步骤，以及合成步骤，由此切割和置换与引物依赖性模板延伸同时发生。在本发明的某些此类实施方案中，待测核酸可以在不存在可检测标记的探针的情况下扩增，然后在单独的反应中检测扩增产物。或者，可在探针存在的情况下扩增待测核酸，从而允许在单一反应中进行扩增和检测。
温度稳定的聚合酶在该自动化方法中是优选的，因为使双链延伸产物变性的优选方法是在PCR循环期间将它们暴露于高温。例如，美国专利第4,889,818号公开了从耐热细菌水生栖热菌中分离的代表性耐热酶。另外的代表性温度稳定聚合酶包括例如从耐热细菌黄栖热菌(Thermus flavus)、Thermus Tuber、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(其具有比所列出的另外的温度稍低的最适温度)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermusrubens)、海栖热袍菌、炽热甲烧嗜热菌(Methanothermus fervidus)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)提取的聚合酶(Stratagene,La Jolla,Calif.)。如上所述，这些耐热聚合酶中的某些酶可以从RNA模板合成DNA。在将根据本发明的方法检测RNA分子的情况下，应该使用能够从RNA模板合成DNA的DNA聚合酶，即，具有逆转录活性的DNA聚合酶。
本文所述的引物和探针可用于利用PCR形式的方法和系统，所述方法和系统包括上述那些方法和系统，其中许多是商购可得的并且存在于自动化系统中。本文中示例的是称为CII-ArboPlex rRT-PCR的测定，其利用SEQ ID NO:1-13以及对照SEQ ID NO:14-16。参见实施例1和表2。在示例性测定中，使用双标记的BHQ探针，其是线性的、双重标记的5'-3'外切核酸酶探针，掺入了分别共价连接至寡核苷酸的5'和3'末端的荧光团和猝灭剂。通过Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性产生荧光信号，所述Taq聚合酶在消化与与靶链中的互补序列杂交的探针的过程中从探针中切掉荧光染料标记的核苷酸，从而将猝灭剂与荧光团分离。五个引物和探针组被设计来检测患者的血清和尿液中来自ZIKV、DENV、CHIKV、WNV和RNA酶P的RNA，所述患者呈现相应病毒感染的体征和症状和/或与病毒暴露一致的流行病学风险因素。在实验室收集和接收患者样本后，可使用 自动提取平台(bioMérieux)从样品中分离总核酸。通过使用RNA UltraSenseTM一步定量RT-PCR系统(ThermoFisher)，并在CFX96 TouchTM实时PCR检测系统(Bio-Rad)上进行热循环和检测，可以逆转录并扩增纯化的核酸。在该过程中，特异性探针与位于特定正向和反向引物之间的特定靶序列退火，产生荧光信号，在PCR循环的延伸期结束期间测量该荧光信号。随着PCR的每个循环进行，更多的探针被消化，从而导致与靶核酸的量成比例的荧光增强。分析荧光信号强度并通过CFX ManageTM软件收集数据。参见实施例1-4。如实施例5中所述分析测定结果。
特别地，使用单个bioMérieux和CFX96 TouchTM实时PCR检测平台(Bio-Rad)以及本发明的测定，可评价最多58个样品/天(从临床样本提取到结果)的ZIKV、DENV(血清型1-4)、CHIKV和WNV。提取58个样品所需的时间约为60分钟，乘以3次运行约等于3小时，设置和执行CII-ArboPlex rRT-PCR检测所需的时间约为2小时，使得测试一个96孔板(代表29个样本/每个仪器运行)所需的总时间约为5小时。
使用示例性测定以及引物和探针SEQ ID NO:1-13，评价测定的灵敏度、特异性和交叉反应性，并且确定根据需要进行测定以差别检测血清和尿液中的虫媒病毒，包括ZIKV、DENV、CHIKV和WNV。参见实施例6-9。另外，还评价了使用已知对特定病毒呈阳性或阴性的临床样品(血清和尿液)的测定的性能特征，并且发现其根据需要进行。参见实施例10-13。
本发明包括利用本发明的引物和探针在任何样品中检测来自ZIKV、DENV、CHIKV和WNV的核酸的方法和系统。
本发明的方法和系统可用于在研究和临床环境中检测来自ZIKV、DENV、CHIKV和WNV的核酸。
优选样品是生物样品。生物样品可以从受试者的组织或受试者的体液获得，包括但不限于鼻咽抽吸物、血液、脑脊髓液、唾液、血清、血浆、尿液、痰液、支气管灌洗液、心包液或腹膜液或诸如粪便的固体。优选样品是血清、血浆和尿液。受试者可以是任何动物、特别是脊椎动物，更特别是哺乳动物、包括但不限于牛、狗、人、猴、小鼠、猪或大鼠。在一个实施方案中，受试者是人。
样品也可以是研究、临床或环境样品。
其它应用包括但不限于血液产品的筛选(例如，筛选血液产品的传染因子)的检测、生物防御、食品安全、环境污染、法医学和遗传可比性研究。本发明还提供了用于检测细胞、细胞培养物、细胞培养基和用于开发药物和治疗剂的其它组合物中的病毒核酸的方法和系统。
因此，本发明的一个实施方案提供了用于在任何样品中检测来自ZIKV、DENV、CHIKV和WNV的核酸或检测病毒本身的系统。该系统包括至少一个子系统，其中子系统包括：引物组，其包含SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:4和5；SEQ ID NO:7、8和9；和SEQ ID NO:11和12；以及探针组，其包含SEQ ID NO:3、6、10和13。该系统还可包括另外的子系统，用于以下目的：从样品中提取核酸；逆转录样品中的核酸；扩增反应；和检测扩增产物。
本发明提供了在任何样品中检测来自ZIKV、DENV、CHIKV和WNV的核酸或检测病毒本身的方法，其包括以下步骤：获得样品；从样品中提取核酸；使样品中的核酸与至少一种选自由SEQ ID NO:1、2、4、5、8、9、10、11和12组成的组的引物接触；使核酸和引物经历扩增条件；和检测扩增产物的存在，其中扩增产物的存在表明样品中存在病毒核酸。
在一个实施方案中，该方法包括使来自样品的核酸与包含SEQ ID NO:1和2、SEQID NO:4和5、SEQ ID NO:7、8和9及SEQ ID NO:11和12的引物组接触；在另外的实施方案中，该方法包括进一步使来自样品的核酸与包含SEQ ID NO:3、6、10和13的探针接触。在另一个实施方案中，探针是可检测的，以便检测样品中扩增产物的存在。
试剂盒
在另一方面，本发明提供了可用于检测虫媒病毒的核酸或虫媒病毒本身的试剂盒。该试剂盒可用于检测来自寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的核酸和/或检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒。在某些实施方案中，试剂盒包括本发明的探针。在一些实施方案中，试剂盒包括本发明的引物。在一些实施方案中，试剂盒包括本发明的一种或多种引物和探针的组合。
在某些实施方案中，试剂盒包括本发明的一种或多种引物和探针的组合。在某些实施方案中，试剂盒包括选自SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12组成的组的一种或多种引物。在某些实施方案中，试剂盒包括选自由SEQ ID NO:3、6、10和13组成的组的一种或多种探针。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于阳性对照序列的引物和探针。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于检测人RNA酶的引物和探针。在某些实施方案中，试剂盒包括含有SEQID NO:14-15的引物和的探针。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括可用作核酸探针的寡核苷酸，其中一个或多个可检测部分与核酸探针连接。在某些实施方案中，一种或多种可检测部分是荧光部分。在某些实施方案中，荧光部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪系列染料、方酸菁染料、螯合镧系元素染料和-系列染料。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括可用作核酸探针的寡核苷酸，其中至少一个猝灭剂部分与核酸探针连接。在某些实施方案中，猝灭剂部分可选自由以下组成的组：荧光素系列染料、多卤代荧光素系列染料、六氯荧光素系列染料、香豆素系列染料、罗丹明系列染料、菁系列染料、噁嗪系列染料、噻嗪系列染料、方酸菁染料、螯合镧系元素染料和-系列染料和非荧光猝灭剂部分。在某些实施方案中，非荧光猝灭剂部分可以是BHQTTM-系列染料、Iowa BlackTM或Dabcyl。在其它实施方案中，探针包含至少一个可检测部分，例如，荧光部分和至少一个猝灭剂部分。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒包括耐热DNA聚合酶。在某些实施方案中，耐热DNA聚合酶具有逆转录活性。在某些实施方案中，本发明的试剂盒还包括用于根据本发明的方法检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅热病毒和西尼罗河病毒的核酸的说明书。
在其它实施方案中，试剂盒包括一个或多个容器以容纳试剂盒的组分。
在某些实施方案中，试剂盒可含有包含本发明引物的组合物。试剂盒还可含有包含本发明探针的组合物。试剂盒还可含有包含耐热DNA聚合酶的组合物。在一些实施方案中，耐热DNA聚合酶选自生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶、非洲栖热腔菌DNA聚合酶、苍白芽孢杆菌DNA聚合酶、栖热菌属物种Z05DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、嗜热栖热菌DNA聚合酶、海栖热袍菌DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶和栖热菌属sps17DNA聚合酶的组。包含本发明的引物或探针或耐热DNA聚合酶的组合物还可包含另外的试剂。例如，组合物可包含防止组合物降解的合适防腐剂，调节组合物pH的合适缓冲剂，改变组合物粘度的合适稀释剂等。
如上所述，试剂盒可另外包含用于进行5'核酸酶反应的其它试剂。另外，试剂盒可包含以促进片段化探针的检测的试剂，所述片段化探针指示存在ZIKV、WNV、DENV和CHIKV的核酸。
在本发明的某些实施方案中，试剂盒包括5个小瓶，每个小瓶中含有针对每一个靶标的引物和探针，4个小瓶含有每种病毒的提取核酸作为阳性对照(测量的)，两个小瓶的人样本对照(HSC)(用作提取对照)和rRT-PCR对照(病毒阴性，RNA酶P阳性)和两个小瓶的无菌蒸馏水(用作非模板对照)(NTC)，并提供用于100个反应的足够的试剂。
本发明的一个实施方案是包含各种容器的试剂盒，所述容器包含用于在单个样品中差别检测寨卡病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的各种组分，如表1中所述。
表1-试剂盒试剂
在优选实施方案中，探针包含可检测部分。在一个更优选的实施方案中，用于检测寨卡病毒的探针SEQ ID NO:3在5'用CAL Fluor Red 610修饰，并在3'用BHQ-2修饰；用于检测西尼罗病毒的探针SEQ ID NO:7，在5'用Quasar 670，并在3'用BHQ-2修饰；于检测登革热病毒的探针SEQ ID NO:11，用CAL Fluour Orange 56修饰5'，并用BHQ-1修饰3'；用于检测基孔肯雅病毒的探针SEQ ID NO:14，用FAM修饰5'，并用BHQ-1plus修饰3'。用于检测RNA酶-P的探针SEQ ID NO:16，用Quasar 705修饰5'，并用BHQ-3修饰3'。
在一个实施方案中，试剂盒提供关于预期结果的阳性、阴性和HSC提取对照和说明书。
在一个实施方案中，阳性对照(小瓶6-9)包含来自感染的培养细胞的提取的核酸。用于ZIKV、WNV、DENV和CHIKV的RNA阳性对照应在预期的Ct值范围(25-28)内为阳性。
试剂盒的人样本对照(HSC)(小瓶10)提供人提取对照，其与测试样品同时提取并在rRT-PCR期间作为样品包括在内。HSC应对ZIKV、DENV、CHIKV和WNV引物和探针组产生阴性结果，但对RNA酶P产生阳性结果。如果未记录RNA酶P信号，则核酸提取可能失败。针对RNA酶P和一种或多种病毒引物/探针组的阳性测定表明交叉污染。如果获得这样的结果，则忽略所有样本结果。
该试剂盒还提供了rRT-PCR对照(eHSC)(小瓶11)，其是从人样本对照(HSC)中提取的核酸，以及阴性对照(NTC)(小瓶12)，其是无菌无核酸酶H2O，用于NTC。NTC应该是阴性的。阳性NTC表明污染，并且必须忽略掉所有样本的结果；每个样本的RNA酶P-结果应为阳性，以确认从样品样本中成功提取核酸。必需忽略掉未检测到RNA酶P信号的样品的结果。
该试剂盒的其它组分可包括具有逆转录活性的耐热DNA聚合酶、稳定剂、核糖核酸酶抑制剂、缓冲剂和说明书。
实施例
通过参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，给出所述实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案。它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1-用于测定的引物和探针
在实施例中使用以下探针和引物。
表2-引物和探针
所有引物和探针都是通用的。寨卡引物和探针靶向ZIKV基因组RNA的3'UTR(SEQID NO:1-3)。西尼罗河病毒引物和探针靶向WNV基因组RNA的NS5基因(SEQ ID NO:4-6)。登革热病毒引物和探针靶向DENV基因组RNA的3'UTR(SEQ ID NO:7-10)。基孔肯雅病毒引物和探针的基因靶标是CHIKV基因组RNA的NSP2基因(SEQ ID NO:11-13)。
SEQ ID NO:14-16是对照引物和探针。基因靶标是人核糖核酸酶P亚基p30mRNA。
实施例2-用于多重测定的试剂和材料
将表2中列出的探针和引物以冻干形式提供在每种病毒的一个小瓶中，以在100μlH2O中复原。标记为ZIKV-MIX的小瓶含有引物和探针SEQ ID NO:1-3。标记为WNV-MIX的小瓶含有引物和探针SEQ ID NO:4-6。标记为DENV-MIX的小瓶含有引物和探针SEQ ID NO:7-10。标记为CHIK-MIX的小瓶含有引物和探针SEQ ID NO:11-13。标记为RP-MIX的小瓶含有引物和探针SEQ ID NO:14-16。见表1和2。
另外的试剂包括标记的小瓶中的测定对照，如表1和3中所示。
所有测定对照应包括在每个平板中并与临床样品同时测试。这些测定对照包括提取对照试剂、针对每种病毒的阳性对照等。
提取对照是人样本对照(HSC，提取对照)，并且是已知含有RNA酶P模板的人培养细胞提取物，但对于所研究的病毒靶标是阴性的。HSC对照包含在每批样本中并同时提取。可将提取的HSC对照核酸和与其同提取的测试样品一起包含在每个PCR板上并通过rRT-PCR分析。
HSC对照应对DENV、CHIKV、WNV和ZIKV产生阴性结果(无来自相应的探针/染料的荧光信号)，但对于核RNA酶P应获得阳性结果(针对Quasar 705染料的荧光信号)。
病毒的阳性对照应仅对一种病毒呈阳性。应在每个PCR板上测试以下阳性对照：
ZIKV阳性对照：从ZIKV感染的培养细胞中提取的核酸用作履行ZIKV引物/探针组和PCR试剂的功能的对照。
CHIKV阳性对照：从CHIKV感染的培养细胞中提取的核酸用作履行ZIKV引物/探针组和PCR试剂功能的对照。
WNV阳性对照：从WNV感染的培养细胞中提取的核酸用作履行ZIKV引物/探针组和PCR试剂功能的表现的对照。
DENV阳性对照：从DENV-1感染的培养细胞提取的核酸用作履行ZIKV引物/探针组和PCR试剂功能的对照。
其它对照包括无模板对照(NTC)和RT-PCR对照(eHSC)。两个无模板对照(NTC；无菌、无核酸酶的水)可以在每个PCR板上运行。从已知含有RNA酶P的人培养细胞(eHSC)提取的核酸被用作RNA完整性和不存在rRT-PCR抑制剂的对照。
用于测定的每个小瓶中的这些试剂和量列于表3中。
表3-测定的另外组分
| ZPC | ZIKV阳性对照 | 1 | 30μl |
| WPC | WNV阳性对照 | 1 | 30μl |
| DPC | DENV阳性对照 | 1 | 30μl |
| CPC | CHIKV阳性对照 | 1 | 30μl |
| HSC | 人样本提取对照(HSC) | 2 | 1.5ml/小瓶 |
| eHSC | 从HSC提取的核酸 | 1 | 30μl |
| NTC | 蒸馏水阴性对照 | 2 | 每个小瓶中750μl |
在该方法和测定中使用的其它试剂以及材料和设备包括用于从自动化总核酸提取方法中使用的样品中分离核酸的那些，并且包括磁性二氧化硅(bioMérieux目录号280133)；Disposables(bioMérieux目录号280135)；缓冲液1(bioMérieux目录号280130)；缓冲液2(bioMérieux目录号280131)；缓冲液3(bioMérieux目录号280132)；和裂解缓冲液(bioMérieux目录号280134)以及bioMérieux系统(bioMérieux；目录号280140)。
用于该方法和测定的另外试剂和材料包括用于聚合酶链式反应的那些，包括分子级水、无核酸酶和RNA UltraSenseTM一步定量RT-PCR系统(ThermoFisher Scientific，目录号11732927)以及CFX96 TouchTM实时PCR检测系统(Bio-Rad)。
按照制造商的说明进行核酸提取和聚合酶链式反应。
实施例3-核酸提取和储存
制造商对的说明通常遵循提取过程和机器接口操作。
简言之，使用250μL的样本输入体积和50μL总核酸的洗脱体积。
将先前收集和冷冻的生物样品(包括尿液和血清)在冰上解冻。移取250μL样品并与750μL裂解缓冲液混合，并在室温下孵育10-15分钟(标准比例为1:3的样品:裂解缓冲液)。
将50μL磁性二氧化硅珠加入样品+裂解缓冲液混合物中，并通过上下吸打样品和磁性二氧化硅珠来充分混合。将样品转移到样品盒中。将磁性二氧化硅盒与移液管盒一起加载至机器中并处理样品。
当运行完成时，将50μL洗脱的总核酸转移到干净的反应管中用于PCR测定设置。或者，将样品在≤-70℃储存。
实施例4-rRT-PCR测定设置
使用以下组分制备主混合物。对于多于一个的反应，应相应地修改配方。
表4-用于rRT-PCR的主混合物合组分
| 测定组分 | 体积/反应(μl) |
| RNA UltraSense<sup>TM</sup> 5X反应混合物 | 5 |
| RNA UltraSense<sup>TM</sup>酶混合物* | 1.25 |
| CHIKV-MIX<sup>#</sup> | 1 |
| DENV-MIX<sup>#</sup> | 1 |
| ZIKV-MIX<sup>#</sup> | 1 |
| WNV-MIX<sup>#</sup> | 1 |
| RP-MIX<sup>#</sup> | 1 |
| H<sub>2</sub>O | 3.75 |
| 模板(TNA/RNA) | 10 |
| 总反应体积 | 25 |
将主混合物等分到PCR平台的孔中。每个运行应包括实施例2中描述的所有对照，包括CHIKV、ZIKV、DENV、WNV的阳性对照、人提取对照(HSC)、rRT-PCR对照(提取的HSC对照；eHSC)和3阴性无模板对照(NTC)(表3)。将样品以一式三份进行测试。
将样本在CFX96 TouchTM实时PCR检测平台上运行，所述检测平台根据制造商的关于多重检测选择染料通道FAM、Cal Orange 560、Cal Red 610、Quasar 670和Quasar 705的说明以及以下循环简况(cycling profile)和染料选择(根据以下循环方案)进行编程。
1. 50.0℃持续30分钟
2. 95.0℃持续2分钟
3. 95.0℃持续15秒
4. 60.0℃持续1分钟
+板读数
5.转到步骤3，进行44次
6.结束
实施例5-结果的解释和患者样本结果的检查
在解释患者结果之前，应检查来自测试对照的所有数据。如果对照无效，则无法解释患者结果。每个测定应使用适当的阳性和阴性对照来进行。CII-ArboPlex rRT-PCR测定提供阳性、阴性和HSC提取对照。所有对照必须产生预期结果：
人样本对照(HSC)-CII-ArboPlex rRT-PCR测定试剂盒提供人提取对照，其与测试样品同时提取并在rRT-PCR期间作为样品包括在内。HSC应对ZIKV、DENV、CHIKV和WNV引物和探针组产生阴性结果，但对RNA酶P产生阳性结果。如果未记录到RNA酶P信号，则核酸提取可能失败(另见下文中的'rRT-PCR对照'和'RNA酶P')。RNA酶P和一种或多种病毒引物/探针组的阳性测定表明交叉污染。如果获得这样的结果，则忽略掉所有样本的结果。
rRT-PCR对照(eHSC)-从人样本对照(HSC)中提取的核酸。
阳性对照-CII-ArboPlex rRT-PCR检测试剂盒为ZIKV、WNV、DENV和CHIKV提供了提取的RNA阳性对照，其在预期的Ct值范围(25-28)内应为阳性。如果一个或多个阳性对照产生阴性结果或增加的Ct值(Ct>31)，则重复rRT-PCR。
NTCs-CII-ArboPlex rRT-PCR试剂盒为NTC提供无菌无核酸酶H2O。NTC应该是阴性的。阳性NTC表明污染，并且必须忽略掉所有样本的结果。
RNA酶P-每个样本的结果应为阳性，以确认从样品样本中成功提取核酸。未检测到RNA酶P信号的样品的结果必须被忽略掉。从新样本等分试样重复提取。如果RNA酶P为阳性的，则报告病毒特异性结果，如果RNA酶P仍为阴性的，则无法报告结果。
临床样本试验结果的评估应在已检查阳性和阴性对照并确定其有效和可接受之后进行。如果对照无效，则可能无法解释患者结果。如果PCR扩增曲线(基于递增的引物探针组的荧光发射)在(≤)38个循环内超过阈值，则结果为阳性，如果引物探针组的扩增曲线在等于或高于(≥)38个循环时超过阈值，则结果为阴性。图1列出了临床样本结果的解释。
用户可以遵循CII-ArboPlex rRT-PCR结果解释和报告说明(图1)。所有对照应产生预期结果，以进一步分析样本数据。真阳性应产生指数曲线(其中Ct值≤38)。在38个或更少循环中未显示指数扩增或未超过阈值的样品被认为是阴性的。如果三个测试孔中的两个是阳性的，则样品的结果为阳性；如果三个孔中的两个为阴性，则样品的结果为阴性。
实施例6-血清中测定的分析灵敏度评估
使用实施例1-5中所述的材料和方法以及表5中描述的病毒原种，在血清中测试该测定的分析灵敏度。
使用针对每个靶标校准的合成T7体外转录的RNA转录物的连续稀释物，估计每种病毒的病毒拷贝数(基因组等效量，GEQ/ml)。
表5-用于分析灵敏度测试的病毒原种
为了找到检测限(LoD)的范围估计，制备表5中描述的病毒原种的系列稀释物以提供LoD的初始估计。对于核酸提取，将225μL单供体血清等分试样分别用25μL的每种连续稀释的病毒原种加标。通过(bioMérieux)提取加标的血清混合物(总共250μL)。将总核酸在50μL洗脱缓冲液中洗脱，并立即在冰上储存以用于进一步的步骤。每种样品以一式三份提取并使用实施例1中描述的引物和探针以及实施例2-4中描述的材料和方法，在CFX96TM触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)上使用CII-ArboPlex rRT-PCR测定进行测试。如果样品对RNA酶P呈阳性，则测试结果仅有效(参见实施例5)。将所有三个重复被测试为阳性时的最低浓度评分为假定的LoD。血清LoD(基因组拷贝当量/ml)结果描述于表6中。
表6-初步血清LoD结果
根据在测距研究中确定的LoD估计值，将病毒原种稀释成20份血清样品等分试样，以在推定的LoD中给出最终的病毒浓度。通过(bioMérieux)提取核酸。如实施例1-4中所述，在CFX96TM触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)上用CII-ArboPlexrRT-PCR测定法测试所有20份提取的样品。血清中所有病毒的结果显示在表7中。
表7-使用CII-ArboPlex rRT-PCR测定确认血清中所有病毒的LoD
实施例7-尿液中的测定的分析灵敏度评估
使用实施例1-5中所述的材料和方法以及表5中描述的病毒原种，在尿液中测试该测定的分析灵敏度。
对于核酸提取，将225μL单供体尿液等分试样用25μL的每种连续稀释的病毒原种单独加标。通过(bioMérieux)提取加标的尿液混合物(总共250μL)。将总核酸在50μL洗脱缓冲液中洗脱并立即在冰上储存。每个样品以一式三份提取并使用实施例1中描述的引物和探针以及实施例2-4中描述的材料和方法，在CFX96TM触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)上使用CII-ArboPlex rRT-PCR测定进行测试。如果样品对RNA酶P呈阳性，则测试结果才有效(参见实施例5)。将所有三个重复被测试为阳性时的最低浓度评分为推定的LoD(对于每种病毒加以粗体和突出显示)。尿液LoD(GEQ/ml)结果描述于表8中。
表8-试验性尿液LoD结果
根据推定的LoD，将稀释的病毒原种在试验性LoD下加标到20份尿液样品等分试样中。通过(bioMérieux)提取核酸。如实施例1-4中所述，在CFX96TM触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)上用CII-ArboPlex rRT-PCR测定法测试所有20份提取的样品。表9中显示了血清中所有病毒的结果。
表9-使用CII-ArboPlex rRT-PCR测定确认尿液中所有病毒的LoD
实施例8-分析特异性测试
通过使用实施例1-5的材料和方法对代表非洲分离株的寨卡病毒的另外分离株(MR776和ArD158095)进行湿试验来评价CII-ArboPlex rRT-PCR的反应性。
表10-通过CII-ArboPlex rRT-PCR评价的另外的ZIKV的细节
还使用实施例2-5的材料和方法，在计算机上用ZIKV、DENV、CHIKV和WNV的其它代表性分离株测试实施例1中描述的引物和探针的反应性。
使用以下西尼罗河病毒株(后跟GenBank登录号)：ARC10-06(JF957161)；ARC13-06(JF957162)；ARC-17-06(JF957163)；ARC23-06(JF957164)；ARC27-06(JF957165)；ARC33-06(JF957166)；BSL106-06(JF957167)；AR140-07(JF957168)；CO4-07(JF957169)；CO5-07(JF957170)；ID21bird-07(JF957171)；ID28bird-07(JF957172)；BSL173-08(JF957173)；BSL176-08(JF957174)；BSL2-09(JF957175)；BSL5-09(JF957176)；BSL6-09(JF957177)；BSL11-09(JF957178)；BSL18-09(JF957179)；BSL20-09(JF957180)；BSL22-09(JF957181)；BSL24-09(JF957182)；BSL27-09(JF957183)；CO7-09(JF957184)；BSL2-10(JF957185)；BSL3-10(JF957186)；NY10-03(JQ700437)；BSL4-11(JQ700438)；BSL6-11(JQ700439)；BSL23-11(JQ700440)；BSL24-11(JQ700441)和BSL26-11(JQ700442)。
使用以下寨卡病毒株(后跟GenBank登录号)：PRVABC59(KU501215)；MR 766(AY632535)；FLR(KU820897)；C1/C2(KX087102)；IbH_30656(HQ234500)；IbH-30656(KU963574)；SEN-DAK(KU955592)；17271(KU758877)；Paraiba_01(KX280026)；103451(KX262887)；ZKC(KX253996)；COL/UF-1(KX247646)；MEX_I_7(KX247632)；PAN/BEI-259634_V4(KX198135)；Brazil/PE243(KX197192)；CN/SZ02(KX185891)；ZIKVNL00013(KU937936)；PAN/CDC-259359(KX156776)；/PAN/CDC-259249(KX156775)；PAN/CDC-259359(KX156774)；Bahia01(KX101066)；Zhejiang04(KX117076)；Haiti/1/2016(KX051563)；Haiti/1225/2014(KU509998)；SZ-WIV01(KU963796)；Brazil/2016/INMI1(KU991811)；Bahia07(KU940228)；Bahia09(KU940224)；Z16006(KU955589)；FB-GWUH-2016(KU870645)；Rio-S1(KU926310)；Rio-U1(KU926309)；MEX/InDRE/Sm/2016(KU922960)；MEX/InDRE/Lm/2016(KU922923)；SZ01(KU866423)；GZ01(KU820898)；GD01(KU740184)；DR/2016/PD2(KU853013)DR/2016/PD1(KU853012)；ZJ03(KU820899)；BeH823339(KU729217)；BeH828305(KU729218)；GDZ16001(KU761564)；THA/2014(KU681081)；VE_Ganxian(KU744693)；Brazil-ZKV2015(KU497555)；SSABR1,(KU707826)；Natal RGN(KU527068)；MRS_OPY(KU647676)；8375(KU501217)；103344(KU501216)；BeH815744(KU365780)；BeH819966(KU365779)；BeH819015(KU365778)；BeH818995(KU365777)；Z1106033(KU312312)；ZikaSPH2015,(KU321639)；H/PF/2013(KJ776791)；GZ02/2016(KX056898)；Z16019(KU955590)；KHM/2010(KU955593)；PLCal_ZV(KF993678)；FSS13025(JN860885)；CPC-0740(KU681082)；Tahiti(KJ461621)；ArD128000(KF383117)；P6-740(HQ234499)；SEN/DAK-AR-41524(KX198134)；41671-DAK(KU955595)；41525-DAK(KU955591)；ArD142623(KF383120)；ArD7117(KF383116)；ArD_41519(HQ234501)；ArD158095(KF383121)；ArD158084(KF383119)；ArD157995(KF383118)；ARB7701(KF268950)；ARB15076(KF268949)；ARB13565(KF268948)和ArB1362(KF383115)；
使用以下DENV病毒株(后跟GenBank登录号)：巴西2010(JX669466)；泰国2013(KF887994)；墨西哥2012(KJ189368)；巴西2010(JX669477)；秘鲁2011(KC294210)；印度尼西亚2010(KC762679)；沙特阿拉伯2014(KJ830750)；新加坡2012(KM279577)；泰国2010(HG316483)；巴西2009(JF808120)；印度尼西亚2010(KC762693)；中国2013(KJ622195)；新加坡2005(GQ398256)；委内瑞拉2007(HQ332174)；柬埔寨2008(JN638570)；巴西2010(JN983813)和巴基斯坦2009(KF041260)。
使用以下CHIKV病毒株(后跟GenBank登录号)：菲律宾2013(AB860301)；新加坡2008(FJ445463)；斯里兰卡2008(FJ513654)；马来西亚2008(FJ807899)；中国2008(GU199351)；印度2008(JN558835)；中国2012(KC488650)；泰国2013(KJ579186)；印度尼西亚2013(KM673291)；刚果共和国2011(KP003813)；墨西哥2014(KP851709)；特立尼达及多巴哥2014(KR046231)；巴西2014(KR264951)；萨尔瓦多2014(KR559471)；法属波利尼西亚2015(KR559473)；波多黎各2014(KR559474)；洪都拉斯2014(KR559488)；牙买加2014(KR559489)；圭亚那2014(KR559496)和印度2013(KT336782)。
在几乎每个测试中，来自每种病毒的引物和探针与所述病毒的代表性分离株100％反应，并且在极少数不是100％的情况下，反应性至少为95％。来自每种病毒的引物和探针与其它病毒的代表性分离株的反应性小于约24％至小于约70％。
实施例9-探针和引物的交叉反应性
CII-ArboPlex rRT-PCR的交叉反应性通过测试来自由于其它病毒和致病细菌感染引起的其它发热性疾病的另外黄病毒或经纯化的核酸来评价。
为了评价CII-ArboPlex rRT-PCR测定的分析特异性，使用来自实施例1-5的材料和方法，特别是利用表1中的引物和探针，含有代表在CII-ArboPlex rRT-PCR测定中未被靶向的多种人病原体的核酸的样品。从细胞培养物上清液中或从在感染和免疫中心(Centerfor Infection and Immunity)储存的或由NIH-综合研究机构(NIH-Integrated ResearchFacility，Fort Detrick,MD)提供的临床样本中提取核酸。在CFX96TM触摸实时PCR检测系统(Bio-Rad)上用CII-ArboPlex rRT-PCR测定法测试的样品未显示交叉反应性的证据。如果样品对宿主转录物对照RNA酶P呈阳性，则测试结果才被认为有效。结果示于表11中。
表11-CII-ArboPlex rRT-PCR测定的特异性的结果
对不可用于实验室测试的其它试剂进行计算机分析。评价实施例1和表1中的引物和探针序列的与针对表14中列出的物种的交叉反应性的证据。使用引物/探针的所有可能组合进行使用BLAST算法的分析。就PCR产物的潜在形成(通过彼此紧密接近并在探针两侧正确取向的引物在靶核酸上的结合)审查基于计算比对的任何相关性。
对于表14中列出的几乎每种物种，实施例1中所述的探针和引物具有低于20％的交叉反应性。
表12-用于测试测定的其它物种
实施例10-寨卡病毒的临床评价
通过在从患有发热性疾病但没有病毒感染的指征的各个患者收集的13份阴性对照血清样品和13份阴性对照尿液样品中用1X LoD和3X LoD病毒加标来制备用于临床评价研究的人为样品(Contrived sample)。通过NYCDOHMH、NYSDOH和Boca Biolistics,FL,USA获得阳性样本。用于鉴定ZIKV阳性样品的比较仪测定是在Boca Biolistics的LightMixZika rRT-PCR测试(Roche)或Aptima寨卡病毒测定(HOLOGIC,PRD-04037-D)或在NYCDOHMH和NYSDOH的NYS批准的LDT测定，其是Lanciotti等的CDC-公布的测定法的修改方法。用CII-ArboViroPlex rRT-PCR测定进行临床样品评价的结果示于表13-16中。配对的尿液和血清样品的结果示于表13中；未配对的血清样品的结果示于表14中；未配对的尿液样品的结果示于表15中；并且人为尿液和血清样品的结果示于表16中。
在所有情况下，使用引物SEQ ID NO:1和2以及探针SEQ ID NO:3的CII-ArboPlexrRT-PCR测定对于ZIKV阳性样品是阳性的。
使用引物SEQ ID NO:1和2以及探针SEQ ID NO:3，利用CII-ArboPlex rRT-PCR测定进行的寨卡病毒临床样品评价的概述。
表13-配对的尿液和血清样品中ZIKV的测定性能的结果
表14-未配对血清样品中ZIKV的测定性能结果
表15-未配对的尿液样品中ZIKV的测定性能结果
表16-人为尿液和血清样品中ZIKV的测定性能的结果
实施例11-登革热病毒的临床评价
使用实施例1-5中所述的材料和方法，特别是引物SEQ ID NO:7-9和探针SEQ IDNO:10和29个DENV阳性临床人血清样品(4个DENV-1、4个DENV-2、6个DENV-3、3个DENV-4和12个DENV阳性(针于其的血清型数据不可用))建立用于检测临床血清样品中DENV的CII-ArboPlex rRT-PCR测定的性能特征(表17)。除了临床样品以外，还有26个人为血清样品也用于验证(图2)。为了制备人为样品，在1X LoD和3X LoD下将DENV3加标到从患有发热性疾病但没有病毒感染的指征的各个患者中收集的13份阴性对照血清样品中。在NYCDOHMH、NYSDOH、Oswaldo Cruz(FIOCRUZ,Brazil)以及感染和免疫中心(哥伦比亚大学)收集阳性DENV临床血清样本。用于鉴定DENV阳性样品的比较仪测定是在NYCDOHMH和NYSDOH的CDC Trioplex实时RT-PCR测定(CII和FIOCRUZ)和登革热病毒实时RT-PCR测定(FDA批准的CDC测定-KK0128)。表17中描述了使用CII-ArboViroPlex rRT-PCR测定评价临床样品的DENV1-4的结果。在所有情况下，使用引物SEQ ID NO:7、8和9以及探针SEQ ID NO:10的CII-ArboPlex rRT-PCR测定对于DENV阳性样本呈阳性。
使用引物SEQ ID NO:7-9和探针SEQ ID NO:10，利用CII-ArboPlex rRT-PCR测定评价临床样品的登革热病毒的概述。
总血清样品 n＝56个阳性血清样品
临床 n＝29
人为 n＝26(在1x LoD下，n＝13，这是4.63E+03GEQ/ml以及在3x LoD下，n＝13，这是1.39E+04GEQ/ml)
表17-用登革热阳性临床样品验证CII-ArboPlex rRT-PCR测定
实施例12-基孔肯雅病毒临床评价
使用实施例1-5中所述的材料和方法，特别是引物SEQ ID NO:11和12以及探针SEQID NO:13，和20个CHIKV阳性样品建立用于检测CHIKV的CII-ArboPlex rRT-PCR测定的性能特征(表18)。在特立尼达拉岛的西印度群岛大学(University of the West Indies,Trinidad)收集阳性CHIKV样本。将CDC Trioplex实时RT-PCR测定用作比较仪测定以在哥伦比亚大学产生CHIKV阳性数据。除了临床样品以外，还使用26个人为的血清样品(在1X LoD和3X LoD下用CHIKV加标13个血清样品)进行验证(图2)。在所有情况下，使用引物SEQ IDNO:11和12以及探针SEQ ID NO:13的CII-ArboPlex rRT-PCR测定对于CHIKV阳性样品呈阳性。
使用引物SEQ ID NO:11和12以及探针SEQ ID NO:13，利用CII-ArboPlex rRT-PCR测定评价临床样品的基孔肯雅病毒的概述。
总样品 n＝46个阳性血清样品
临床 n＝20
人为 n＝26(在1x LoD下n＝13，这是3.65E+02GEQ/ml，以及在3xLoD下，n＝13，这是1.09E+04GEQ/ml)
表18-用基孔肯雅阳性临床样品验证CII-ArboPlex rRT-PCR测定
实施例13-西尼罗河病毒临床评价
使用实施例1-5中所述的材料和方法，特别是引物SEQ ID NO:4和5以及探针SEQID NO:6，和19个WNV阳性血清样品(表19)建立用于检测CHIKV的CII-ArboPlex rRT-PCR测定的性能特征。由血液系统研究所收集阳性WNV样本，并使用FDA批准的WNV TMA测定，由Creative Testing Solutions,Phoenix,AZ测试样品对WNV呈阳性。使用稍作改进的WNV-NS3RT-PCR测定(PMID:10821368)作为比较仪测定，以在哥伦比亚大学生成WNV实时数据。除了临床样品以外，还使用26份人为血清样品(在1X LoD和3X LoD下，将13份血清样品用WNV加标)进行验证(图2)。在所有情况下，使用引物SEQ ID NO:4和5以及探针SEQ IDNO:6的CII-ArboPlex rRT-PCR检测对于WNV阳性样品呈阳性。
使用引物SEQ ID NO:4和5以及探针SEQ ID NO:6，利用CII-ArboPlex rRT-PCR测定评价临床样品的西尼罗病毒的概述。
总样品 n＝45个阳性血清样品
临床 n＝19
人为 n＝26(在1x LoD下，n＝13，这是2.12E+02GEQ/ml，以及在3x LoD下，n＝13，这是6.36E+02GEQ/ml)
表19-利用西尼罗河病毒阳性临床样品验证CII-ArboPlex
rRT-PCR测定
实施例14-用加标了登革热病毒、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒的人为血清和尿液样品验证CII-ArboPlex rRT-PCR测定
在1X LoD和2X LoD下向13份血清和尿液样品各自加标DENV(血清型3)、CHIKV或WNV(26份DENV血清样品，26份DENV尿液样品，26份CHIKV血清样品，26份CHIKV尿液样品，26份WNV血清样品，26份WNV尿液样品)，使用实施例1-5和11-13中所述的材料和方法以及表2中所列的对DENV、CHIKV和WNV有特异性的引物和探针组测试所述样品。作为测定特异性对照，使用一小组来自发热性莱姆病患者的血清样品组(26)和在NYSDOH从疑似ZIKV感染但通过PCR检测对所有虫媒病毒呈阴性的受试者收集的尿液样品(26)。在所有情况下，都检测到100％的病毒。样品数据示于图2中。
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<150> 62/431,550
<151> 2016-12-08
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
artgttgtca ggcctgctag 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
cttgrtttcc cagcktctcc t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成探针
<400> 3
ggggaaagct gtgcagcctg t 21
<210> 4
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<212> DNA
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<220>
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<400> 4
catttgctcc gctgtccctg tgaa 24
<210> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
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ccactctcct cctgcatgga tggac 25
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<220>
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tgggtcccta ccggaagaac cacgt 25
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actagaggtt agaggagacc ccc 23
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catctgcacy caagtgtacc a 21
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gcgcattttg ccttcgtaat g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成探针
<400> 16
tctgacctga aggctctgcg cg 22
Claims (58)
1.一种用于检测样品中寨卡病毒的存在的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与至少一种对所述寨卡病毒有特异性的引物接触；
b.使所述样品和所述引物经历扩增条件；
c.检测扩增产物的存在，其中来自对寨卡病毒有特异性的引物的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自寨卡病毒的核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1和2及其组合。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述样品与对所述寨卡病毒有特异性的探针接触。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述探针包含SEQ ID NO:3。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是天然来源的并且选自由以下组成的组：血浆、血清、全血、脊髓液、精液、羊水、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和组织。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是尿液或血清。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述样品来自人受试者。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸是RNA。
9.如权利要求3所述的方法，其中对寨卡病毒有特异性的引物和探针来自所述病毒基因组的3'UTR。
10.一种检测样品中寨卡病毒和至少一种选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的其它病毒存在的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与至少一种对所述寨卡病毒有特异性的引物和至少一种对选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的另一种病毒有特异性的引物接触；
b.使所述样品和所述引物经历扩增条件；
c.检测扩增产物的存在，其中来自对寨卡病毒有特异性的引物的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自寨卡病毒的核酸，并且来自对选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的至少一种病毒有特异性的引物的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自该病毒的核酸。
11.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括使所述样品与对寨卡病毒有特异性的探针和选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的至少一种其它病毒接触。
12.如权利要求10所述的方法，其中与所述寨卡病毒同时检测选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的至少两种病毒。
13.如权利要求10所述的方法，其中与所述寨卡病毒同时检测选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的所有三种病毒。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述样品是天然来源的并且选自由以下组成的组：血浆、血清、全血、脊髓液、精液、羊水、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和组织。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述样品是尿液或血清。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述样品来自人受试者。
17.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸是RNA。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述对寨卡病毒有特异性的引物和探针来自病毒基因组的3'UTR。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID NO:1和2，并且所述探针包含SEQ ID NO:3。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述探针包含CAL FluorRed610的5'修饰和BHQ-2的3'修饰。
21.如权利要求11所述的方法，其中所述对登革热病毒有特异性的引物和探针(基因型1-4)来自病毒基因组的3'UTR。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID NO:7、8和9，并且所述探针包含SEQ ID NO:10。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述探针包含CAL Fluor Orange 560的5'修饰和BHQ-1Plus的3'修饰。
24.如权利要求11所述的方法，其中所述对基孔肯雅病毒有特异性的引物和探针来自病毒基因组的NSP2部分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID NO:11和12，并且所述探针包含SEQ ID NO:13。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述探针包含FAM的5'修饰和BHQ-1Plus的3'修饰。
27.如权利要求11所述的方法，其中所述对西尼罗河病毒有特异性的引物和探针来自病毒基因组的NS5部分。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述引物包含SEQ ID NO:4和5，并且所述探针包含SEQ ID NO:6。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述探针包含Quasar 670的5'修饰和BHQ-2的3'修饰。
30.一种同时检测和区分样品中的寨卡病毒和选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的所有三种病毒的存在的方法，所述方法包括：
a.使所述样品与包含SEQ ID NO:1、4、7和11的第一引物接触；
b.进一步使所述样品与包含SEQ ID NO:2、5、8、9和12的第二引物接触；
c.使所述样品和所述引物经历扩增条件；以及
d.检测扩增产物的存在，其中来自引物SEQ ID NO:1和2的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自所述寨卡病毒的核酸，来自引物SEQ ID NO:4和5的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自所述西尼罗河病毒的核酸，来自引物SEQ ID NO:7、8和9的扩增产物的存在表明存在表明所述样品中存在来自所述登革热病毒(基因型1-4)的核酸，以及来自引物SEQID NO:11和12的扩增产物的存在表明所述样品中存在来自所述基孔肯雅病毒的核酸，并且其中所述引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12允许对所述样品中的每种病毒进行差别检测。
31.如权利要求30所述的方法，所述方法还包括使所述样品与包含SEQ ID NO:3、6、10和13的探针接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述探针是可检测标记的。
33.如权利要求30的方法，其中所述样品是天然来源的并且选自由以下组成的组：血浆、血清、全血、脊髓液、精液、羊水、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和组织。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述样品是尿液或血清。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述样品来自人受试者。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述样品是合成来源的并且包含体外细胞培养成分。
37.如权利要求30的方法，所述方法还包括使所述样品与包含SEQ ID NO:14和15的引物和包含SEQ ID NO:16的探针接触。
38.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸是RNA。
39.如权利要求1-38所述的方法，其中所述引物和探针是cDNA。
40.一种用于同时检测和区分寨卡病毒和至少一种选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的其它病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：包含SEQ IDNO:1、2、4、5、7、8、9、11和12的引物；和包含SEQ ID NO:3、6、10和13的探针。
41.如权利要求40所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于进行差别检测的试剂，所述试剂包括对照序列、核酸聚合酶和核酸提取试剂；和使用说明书。
42.如权利要求40所述的试剂盒，其中用于检测每种病毒的引物和探针存在于单一反应混合物中。
43.如权利要求40所述的试剂盒，其中所述探针还包含可检测标记物。
44.一种用于同时检测和区分寨卡病毒和至少一种选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的其它病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测寨卡病毒的引物和探针，其包含SEQ ID NO:1-3；用于检测西尼罗河病毒的引物和探针，其包含SEQ ID NO:4-6；用于检测登革热病毒(基因型1-4)的引物和探针，其包含SEQ ID NO:7-10；和用于检测基孔肯雅病毒的引物和探针，其包含SEQ ID NO:11-13。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述探针还包含可检测标记物。
46.如权利要求44所述的试剂盒，所述试剂盒还包括包含SEQ ID NO:14-16的对照引物和探针。
47.如权利要求44所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于进行检测的试剂和使用说明书，所述试剂包括对照序列、核酸聚合酶、缓冲剂、稳定剂、核酸提取试剂。
48.如权利要求46所述的试剂盒，其中所述引物和探针包含cDNA。
49.一种合成核酸，其具有选自SEQ ID NO:1-13中的任一种的核酸序列。
50.一组用于同时检测和区分寨卡病毒与来自选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的所有三种病毒的存在的引物，其中所述引物组包含具有选自SEQ ID NO:1和2的核酸序列的合成核酸。
51.如权利要求50所述的引物组，所述引物组还包含具有选自SEQ ID NO:4、5、7、8、9、11和12的核酸序列的合成核酸。
52.一种用于同时检测和区分寨卡病毒与选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的所有三种病毒的存在的探针，其中所述探针包含具有SEQ IDNO:3的核酸序列的合成核酸。
53.一种用于同时检测和区分寨卡病毒与选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的所有三种病毒的存在的探针，其中所述探针包含具有选自由SEQ ID NO:6、10和13组成的组的核酸序列的合成核酸。
54.如权利要求49所述的合成核酸，其中所述核酸是cDNA。
55.一种用于同时检测和区分寨卡病毒与至少一种选自由登革热病毒(基因型1-4)、基孔肯雅病毒和西尼罗河病毒组成的组的其它病毒的测定，所述测定包括：用于检测寨卡病毒的引物，其包含SEQ ID NO:1-3；用于检测西尼罗河病毒的引物和探针，其包含SEQ IDNO:4-6；用于检测登革热病毒(基因型1-4)的引物和探针，其包含SEQ ID NO:7-10；和用于检测基孔肯雅病毒的引物和探针，其包含SEQ ID NO:11-13，并且其中所述引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、9、11和12允许差别检测所述样品中的每种病毒。
56.如权利要求55所述的测定，其中所述探针还包含可检测标记物。
57.如权利要求55所述的测定，所述测定还包括包含SEQ ID NO:14-16的对照引物和探针。
58.如权利要求55所述的测定，所述测定还包括用于进行检测的试剂和使用说明书，所述试剂包括对照序列、核酸聚合酶、核酸提取试剂缓冲剂、稳定剂。
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