CN110981966A - 一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性t细胞检测试剂盒 - Google Patents

一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性t细胞检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒检测技术领域，公开了一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白，所述融合蛋白由寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白连接形成，所述寨卡E蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述寨卡NS5蛋白的编码序列如SEQ ID NO:3所示；利用该融合蛋白进行免疫分析检测，能够很好的区分寨卡病毒感染病人和健康人，检测特异性强，表现出了极好的临床应用效果，将该融合蛋白制成免疫分析检测试剂盒，方便大规模生产应用，能其检测规程简便，检测结果特异性强，灵敏度高，可为诊断病情提供依据。

Description

一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性T细胞 检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体的，涉及一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性T细胞检测试剂盒。
背景技术
寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一种虫媒、单链RNA病毒，是黄病毒科黄病毒属的成员。该病毒最早于1947年在乌干达寨卡森林(Zika forest)的一只恒河猴身上分离得到，随后在同一片森林的埃及伊蚊中也分离到该病毒，故命名为“寨卡病毒”。1954年，尼日利亚首先报道了3例人感染寨卡病毒病例。2007年以前，寨卡病毒感染病例主要集中于非洲的埃及、中非共和国、坦桑尼亚、乌干达、塞拉利昂以及亚洲的泰国、柬埔寨、印度尼西亚、印度、菲律宾和越南等国，被证实的人感染寨卡病毒病例仅14例。2007年以后，泰国、柬埔寨、印度尼西亚、印度、菲律宾和越南等国常有散发病例出现但没有大的疫情暴发。2015年寨卡病毒开始在美洲、西太平洋、非洲及亚洲暴发流行，至2016年3月底，已累计有超过55个国家和地区报告发生寨卡病毒的本地传播。我国已将寨卡病毒病列为第二类法定传染病，截止到2016年6月7日一共报告了18例输入性寨卡病毒感染病例。
寨卡病毒主要是通过蚊-人-蚊的传播方式进行传播，患者、隐性感染者和感染寨卡病毒的灵长类动物是该病的传染源。人感染寨卡病毒后，仅约20％会出现症状，且症状较轻，临床表现与其他已知虫媒病毒如登革病毒、西尼罗病毒及基孔肯亚病毒等感染相似。有研究表明，ZIKV感染与新生儿小头畸形、格林-巴利综合征等密切相关。ZIKV感染还可以造成神经损伤、胎儿发育缺陷、男性不育等多种并发症。因此，做好蚊虫滋生的控制以及寨卡病毒感染的早期诊断是寨卡病毒防控的重要措施。
虽然迄今寨卡病毒主要在赤道附近流行，我国还未报告本地感染病例，但暴发风险不可忽视，因此，亟需建立一种快速、高效检测寨卡病毒病原体的方法。
发明内容
针对现有技术中缺乏快速、高效检测寨卡病毒病原体的方法，本发明通过将制备得到的寨卡病毒融合蛋白与PBMC共培养，并利用免疫分析检测技术检测干扰素的释放，从而用于特异性区分寨卡病毒感染患者和健康人。
在上述发明构思的基础上，本发明首先提供了一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒。
本发明的第三个目的是提供上述检测试剂盒在制备辅助诊断寨卡病毒感染的产品中的应用。
一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白，所述融合蛋白由寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白连接形成；所述寨卡E蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述寨卡NS5蛋白的编码序列如SEQ ID NO:3所示。
寨卡病毒(简称为ZIKV)NS5蛋白可以激活Ⅱ型干扰素信号通路，该病毒的NS5蛋白可以使STAT2发生多聚泛素化修饰而降解，STAT1-STAT1同源二聚体形成增加,激活Ⅱ型干扰素信号通路，诱导细胞炎性因子IRF1和CXCL10的生成，导致炎症反应，进而促进病毒自身的复制，提示II型干扰素(简称为IFN-γ)可能促进ZIKV在感染细胞内的复制；寨卡病毒感染者外周血中存在特异性的记忆T细胞，这些记忆T细胞受到寨卡病毒特异性抗原刺激后,迅速活化增殖，迅速分泌细胞因子IFN-γ，因此可以通过免疫分析检测IFN-γ的存在，来确定是否存在寨卡病毒。
发明人经前期筛选，并且通过融合寨卡病毒不同的蛋白，结果表明将E蛋白和NS5蛋白进行融合后，检测的特异性好。
本发明上述所提供的融合蛋白可以作为寨卡病毒的特异性抗原，刺激已经感染了寨卡病毒的患者的外周血细胞内寨卡病毒自身的复制，以及体内记忆T细胞的迅速活化增殖，活化增殖的记忆T细胞则迅速分泌细胞IFN-γ，可以通过免疫分析检测IFN-γ的存在，来确定是否存在寨卡病毒。
本发明上述融合蛋白可以通过基因工程的方法，例如分子克隆、蛋白表达验证以及蛋白纯化的方式获得。
NS5蛋白共有3个可拆解的ORF片段，本研究经组合发现，ORF2片段编码得到的NS5蛋白与E蛋白融合后，其检测特异性更好，不会出现非特异性检测，结果重现性好；因此所述SEQ ID NO:1为ZIKV E蛋白的ORF1片段(第124到第582个碱基)，序列长459bp，SEQ ID NO:3为NS5蛋白的ORF2片段(第3到第98个碱基)，序列长96bp。
在一些具体的实施方式中，上述融合蛋白还包括用于连接寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白的连接肽；这里的连接肽可以选用本领域常用的，具体普适性的具有连接作用的肽链。
在一些更为具体的实施方式中，所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示，以保证连接后寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白能够在空间上有足够的自由度以发挥其功能，同时也有助于增强融合蛋白的稳定性。
本发明还提供一种寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，该试剂盒上述融合蛋白。
本发明选用ELISPOT检测技术进行具体的免疫分析检测，当选用ELISPOT检测技术时，所述试剂盒还包括鼠抗人γ干扰素抗体、生物素化的抗IFN-γ、亲和素、显色底物。
在一些具体的实施方式中，所述亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP)；所述显色底物为AEC显色系统中所用到的物质。
在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括淋巴细胞分离液、阳性对照；淋巴细胞分离液可以用于分离样本中的T淋巴细胞，所述试剂盒中，阳性对照为植物凝集素PHA。
在一些具体的实施方式中，试剂盒中的鼠抗人γ干扰素抗体包被在孔板(例如96孔板)上，利用ELISPOT检测技术，在检测时，将人外周血T淋巴细胞与寨卡病毒特异性刺激物(试剂盒中的融合蛋白)在预包被了抗人IFN-γ的细胞培养板上共培养，寨卡病毒在感染的外周血淋巴细胞内迅速复制产生IFN-γ因子，IFN-γ被预包被在纤维素膜上的抗人IFN-γ抗体所捕获，经过酶联免疫显色，通过目测或使用放大镜等计数斑点，即确定样本感染寨卡病毒的实际情况。
在一些更为具体的实施方式中，所述试剂盒包括：淋巴细胞分离液、融合蛋白、阳性对照、包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被板、含有生物素标记的抗IFN-γ抗体(使用前按照要求稀释)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP)、显色液。
其中，融合蛋白的浓度为10μg/mL，用于检测而反应。
本发明还提供上述检测试剂盒在制备辅助诊断寨卡病毒感染的产品中的应用。
本发明还提供上述检测试剂盒在检测寨卡病毒感染中的应用。
本发明还提供上述测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.对待测样本进行前处理，利用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞；
S2.将S1获得的淋巴细胞和融合蛋白加入包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被板进行共孵育；
S3.清洗包被板，加入含有生物素标记的抗IFN-γ抗体；
S4.清洗包被板，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP)；
S5.清洗包被板，加入显色液进行显色反应，计数反应生成的斑点数目，进行结果判定。
本发明提供了一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白，利用该融合蛋白进行免疫分析检测，能够很好的区分寨卡病毒感染病人和健康人，检测特异性强，表现出了极好的临床应用效果，将该融合蛋白制成免疫分析检测试剂盒，方便大规模生产应用，能其检测规程简便，检测结果特异性强，灵敏度高，可为诊断病情提供依据。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将通过具体实施例作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1融合蛋白的制备
融合蛋白的组成为：ZIKV E蛋白、连接肽和NS5蛋白；其中ZIKV E蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示，连接肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示，NS5蛋白的编码序列如SEQ IDNO:3所示。
所述SEQ ID NO:1为ZIKV E蛋白的ORF1片段(第124到第582个碱基)，序列长459bp，SEQ ID NO:3为NS5蛋白的ORF2片段(第3到第98个碱基)，序列长96bp。
本发明融合蛋白可以通过基因工程的方法，例如分子克隆、蛋白表达验证以及蛋白纯化的方式获得。
实施例2寨卡病毒检测试剂盒的建立
寨卡病毒试剂盒包括：淋巴细胞分离液、实施例1制备得到的融合蛋白(10μg/mL)、阳性对照、包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被板、含有生物素标记的抗IFN-γ抗体(浓度1mg/mL，使用前按照要求稀释到10ug/mL)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP，工作液浓度为2.5ug/mL)、显色液(AEC)。
其中阳性对照为植物凝集素PHA。
实施例3利用寨卡病毒检测试剂盒检测临床样本
1、样本收集：
人外周血(PBMC)样本来源于寨卡病毒感染性病人及非寨卡病毒感染人群，数量为42个待测样本，其中11份寨卡阳性血清及31份健康血清。
每采样个体身上用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下8小时内运至实验室。
2、检测过程
(1)用淋巴细胞分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为2.5×106个细胞/mL；将重悬的细胞加入包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被96孔板(即检测板)中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基溶解得到的终浓度为1ug/mL的融合蛋白50μL，混合均匀进行共孵育；同时设置阳性对照(植物凝集素PHA)和阴性对照(完全无血清培养基)；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育16-20小时，培养期间避免移动、碰撞检测板或培养箱；
(4)取出检测板，弃培养上清液，用装有PBS的洗涤瓶距离检测板20-30cm处挤压洗涤瓶，冲洗检测板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，200uL/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干；
(5)在每个孔中加入100uL含有生物素标记的抗IFN-γ抗体(工作夜浓度10ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(6)弃液体，用PBS洗板3-5次，200μl/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干，每个孔中加入100uL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(工作液浓度为2.5ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(7)再加入AEC显色底物进行显色反应，室温孵育10分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数，结果判定：当出现红色斑点，即为阳性，反之为阴性，结果如表1。
表1
Figure BDA0002279320540000061
阳性符合率：11/11＝100.00％；阴性符合率：29/31＝93.55％；总符合率：(11+29)/42＝95.24％。
实施例4利用寨卡病毒检测试剂盒检测临床样本
1、样本收集：
人外周血(PBMC)样本来源于寨卡病毒感染性病人及非寨卡病毒感染人群，数量为52个待测样本，其中15份寨卡阳性血清及37份健康血清。
每采样个体身上用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下8小时内运至实验室。
2、检测过程
(1)用淋巴细胞分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为2.5×106个细胞/mL；将重悬的细胞加入包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被96孔板(即检测板)中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基溶解得到的终浓度为1ug/mL的融合蛋白50μL，混合均匀进行共孵育；同时设置阳性对照(植物凝集素PHA)和阴性对照(完全无血清培养基)；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育16-20小时，培养期间避免移动、碰撞检测板或培养箱；
(4)取出检测板，弃培养上清液，用装有PBS的洗涤瓶距离检测板20-30cm处挤压洗涤瓶，冲洗检测板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，200uL/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干；
(4)在每个孔中加入100uL含有生物素标记的抗IFN-γ抗体(工作浓度浓度为10ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(5)弃液体，用PBS洗板3-5次，200μl/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干，每个孔中加入100uL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(工作液浓度为2.5ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(6)再加入AEC显色底物进行显色反应，室温孵育10分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数，结果判定：当出现红色斑点，即为阳性，反之为阴性，结果如表2。
表2
Figure BDA0002279320540000071
阳性符合率：14/15＝93.34％；阴性符合率：35/37＝94.60％；总符合率：(14+35)/52＝94.23％。
实施例5利用寨卡病毒检测试剂盒检测临床样本
1、样本收集：
人外周血(PBMC)样本来源于寨卡病毒感染性病人及非寨卡病毒感染人群，数量为57个待测样本，其中14份寨卡阳性血清及43份健康血清。
每采样个体身上用肝素钠收集管采集10mL血液，室温条件下8小时内运至实验室。
2、检测过程
(1)用淋巴细胞分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于无血清培养基中，细胞浓度为2.5×106个细胞/mL；将重悬的细胞加入包被有鼠抗人γ干扰素抗体的预包被96孔板(即检测板)中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；
(2)向各反应孔中加入由无血清培养基溶解得到的终浓度为1ug/mL的融合蛋白50μL，混合均匀进行共孵育；同时设置阳性对照(植物凝集素PHA)和阴性对照(完全无血清培养基)；
(3)5％二氧化碳培养箱36℃孵育16-20小时，培养期间避免移动、碰撞检测板或培养箱；
(4)取出检测板，弃培养上清液，用装有PBS的洗涤瓶距离检测板20-30cm处挤压洗涤瓶，冲洗检测板3-4遍，再用PBS洗板1-2次，200uL/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干；
(5)在每个孔中加入100uL含有生物素标记的抗IFN-γ抗体(工作液浓度为10ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(6)弃液体，用PBS洗板3-5次，200μl/孔，30秒/次，最后一次洗板后拍干，每个孔中加入100uL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(工作液浓度为2.5ug/mL)，置37℃孵育1小时；
(7)再加入AEC显色底物进行显色反应，室温孵育10分钟，孵育过程中观察斑点形成，计数反应生成的斑点数，结果判定：当出现红色斑点，即为阳性，反之为阴性，结果如表3。
表3
Figure BDA0002279320540000091
阳性符合率：14/14＝100.00％；阴性符合率：42/43＝97.68％；总符合率：(14+42)/57＝98.25％。
综上，用上述寨卡病毒检测试剂盒进行临床样本检测，其阳性符合率和阴性符合率均大于90％，与临床诊断符合率较高，该检测试剂盒成本低，适合工业规模化生产，检测方法检测方便快捷，稳定性高，特异性强，大大降低了传统寨卡病毒感染检测方法的检测成本，具有实际广泛的应用价值。
序列表
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
广州迪澳医疗科技有限公司
<120> 一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性T细胞检测试剂盒
<141> 2019-11-19
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> 寨卡病毒E蛋白(Zika virus E)
<400> 1
atggatggtg caaagggaag gctgtcctct ggccacttga aatgtcgcct gaaaatggat 60
aaacttagat tgaagggcgt gtcatactcc ttgtgtaccg cagcgttcac attcaccaga 120
tcccggctga aacactgcac gggacagtca cagtggaggt acagtacgca gggacagatg 180
gaccttgcaa ggttccagct cagatggcgg tggacatgca aactctgacc ccagttggga 240
ggttgataac cgctaacccc gtaatcactg aaagcactga gaactctaag atgatgctgg 300
aacttgatcc accatttggg gactcttaca ttgtcatagg agtcggggag aagaagatca 360
cccaccactg gcacaggagt ggcagcacca ttggaaaagc atttgaagcc actgtgagag 420
gtgccaagag aatggcagtc ttgggagaca cagcctggg 459
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 连接肽(人工序列（未知）)
<400> 2
ggaggaggag gatccggagg aggaggatcc ggaggaggag gatcc 45
<210> 3
<211> 99
<212> DNA
<213> 寨卡病毒NS 5蛋白(Zika virus NS 5)
<400> 3
gttgggatcg aggttcttgg agtacgaagc tcttgggttc ctgaacgagg accattgggt 60
ttccagggaa aacttggcat gtggtgtagg aggcattag 99

Claims (9)

1.一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白连接形成；
所述寨卡E蛋白的编码序列如SEQ ID NO:1所示，所述寨卡NS5蛋白的编码序列如SEQID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测寨卡病毒的融合蛋白，其特征在于，还包括用于连接寨卡E蛋白、寨卡NS5蛋白的连接肽。
3.根据权利要求2所述的用于检测寨卡病毒的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括鼠抗人γ干扰素抗体、生物素化的抗IFN-γ、亲和素、显色底物。
6.根据权利要求5所述的寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括淋巴细胞分离液、阳性对照。
7.根据权利要求6所述的寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人γ干扰素抗体包被在孔板上。
8.根据权利要求7所述的寨卡病毒特异性T细胞的检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白的浓度为10μg/mL。
9.权利要求5至8任一项所述的检测试剂盒在制备辅助诊断寨卡病毒感染的产品中的应用。
CN201911134862.2A 2019-11-19 2019-11-19 一种用于检测寨卡病毒的融合蛋白及寨卡病毒特异性t细胞检测试剂盒 Withdrawn CN110981966A (zh)

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