JP4891985B2 - 肺炎球菌dna検出用リアルタイムpcrアッセイの開発および肺炎球菌疾患の診断 - Google Patents
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Description
肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)は、米国における市中感染性肺炎、髄膜炎および中耳炎の主要原因である(Brown et al., 1998)。過去においては従来の抗菌療法が効果的な治療法であると証明されているが、ペニシリン耐性株および多剤耐性株の出現によって、罹患者および死亡者は増加することとなった(Doern et al., 1999; Jacoby, 1996)。培養における増殖が抗菌的の抑制によって、および正常細菌叢のα型溶血連鎖球菌による混入によって、肺炎球菌の単離および同定は複雑になる。古典的な技術、培養、および血清学的方法による検出は、時間を消費し結果は明瞭ではない。臨床検査室において、迅速に完了することができる敏感で特異的な分析は、早期診断および効果的な治療にとって不可欠である。分子的分析は、鋭敏な感度および特異性で検出することができるので、本質的な価値があり、検出は生存不能生物で減少しない。様々な分子的方法は検査を補助するために使用された(Gillespie, 1999; Hall, 1998; Olive and Bean, 1999)。
肺炎球菌DNAの検出および肺炎球菌疾患の診断に関する方法ならびに組成物が開示される。より具体的には、肺炎球菌表面の接着タンパク質(psaA)遺伝子検出のためのリアルタイムPCR法が開示される。
本化合物、組成物、物品、装置、および/または方法が開示および記述される前に、それらは特別の定めのない限り特異的な合成法または特異的な組換え生物工学的方法に限定されておらず、または特別の定めのない限り特定の試薬に限定されておらず、そのためもちろん変化してもよいことが理解されるべきである。ここに用いられる用語は、特定の態様を記述するためだけにあり、限定を意図しないことも理解されるべきである。
本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられたように、文脈が明白にそうではないと指示しない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」は、複数の指示物を含む。したがって例えば、「薬学的担体」への言及は、2つまたはそれ以上のそのような担体などの混合物を含む。
本明細書において開示された方法の中で使用される組成物自体と同様に、開示された組成物を調製するために使用される構成要素も開示される。これらおよび他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、様々な各個体ならびにこれらの化合物の集合的な組み合わせおよび順列の特異的な参照は明確に開示されなくとも、本明細書において各々は具体的に検討され記述されることが理解される。例えば、特定のプローブが開示および考察され、プローブを含む多くの分子を作製することができる多くの修飾が考察される場合、反する内容が具体的に示されない限り可能であるような、各々およびすべてのプローブの組み合わせおよび順列ならびに修飾が、具体的に検討される。したがって、分子D、EおよびFのクラスと同様に、分子A、BおよびCのクラスが開示され、組み合わせ分子例のA-Dが開示される場合、その後各々が個別に列挙されなくても、各々が個別的におよび集団的に検討された、A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-EおよびC-Fを意味する組み合わせが開示されたと考えられる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも開示される。したがって例えば、A-E、B-FおよびC-Eのサブグループが開示されたと考えられるであろう。この概念は、開示された組成物の作製および使用方法における工程を含むが、それらに限定されない本出願のすべての局面に適用される。したがって、行なうことができる様々な付加的な工程がある場合、任意の特異的な態様または開示された方法の態様の組み合わせにより、これらの付加的な工程の各々を行なうことができることは理解される。
本明細書において考察されるように、相同性および同一性という用語の使用は、類似性と同じものを意味することが理解される。したがって例えば、相同性という単語の使用が2つの非天然性の配列間で使用される場合、必ずしもこれら2つの配列間の進化的関係を示していないが、むしろこれらの核酸配列間の類似性または関連性を注目しているということは理解される。進化的に関連する2つの分子間の相同性を決定する方法の多くは、それらが進化的に関連するどうかにかかわらず、配列類似性を測定する目的で、任意の2つもしくはそれ以上の核酸またはタンパク質に慣例的に適用される。
および
はそれぞれ、psaAの特異的で敏感な増幅および検出のための、プライマーセットおよびプローブの特定の配列を示す。明示された配列または天然の配列に、少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの相同性を有する、本明細書において開示されたこれらおよび他の遺伝子ならびにタンパク質の変異体が具体的に開示される。当業者は、2つのタンパク質、または遺伝子などの核酸の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最大レベルになるように2つの配列をアライメントさせた後に、相同性を計算することができる。
ハイブリダイゼーションという用語は、典型的には、プライマーまたはプローブおよび遺伝子または遺伝子の一部のような少なくとも2つの核酸分子間の、配列によって行なわれる相互作用を意味する。配列によって行なわれる相互作用は、ヌクレオチド特異的な様式で、2つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間に生じる相互作用を意味する。例えば、Cと相互作用するG、またはTと相互作用するAは、配列によって行なわれる相互作用である。典型的には、配列によって行なわれる相互作用は、ヌクレオチドのワトソン-クリック面またはフーグスティーン面で生じる。2つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメーターによって影響される。例えば、2つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかには、反応の塩濃度、pHおよび温度のすべてが影響する。
本明細書において開示された様々な分子があり、それらは例えば肺炎連鎖球菌のpsaA遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーおよびプローブを含む核酸に基づいたものある。開示された核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物で構成される。これらおよび他の分子の非限定例は、本明細書において考察される。例えばベクターが細胞において発現される場合、発現されたmRNAは、典型的には、A、C、GおよびUで構成されるであろうことが理解される。同様に、例えばアンチセンス分子が、細胞または細胞の周囲へ、例えば外来性の送達によって導入される場合、細胞の周囲でのアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチドアナログでアンチセンス分子が構成されることが有利であることが理解される。
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含んでいる分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を生成するリン酸部分および糖部分によって相互に結合することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン-9-イル(A)、シトシン-1-イル(C)、グアニン-9-イル(G)、ウラシル-1-イル(U)およびチミン-1-イル(T)であり得る。ヌクレオチドの糖部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は5価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、3'-AMP(3'-アデノシン一リン酸)または5'-GMP(5'-グアノシン一リン酸)であるだろう。
SEQ ID NO:1に示された特定の1つの配列は、開示されたプライマーの例として本明細書において使用される。SEQ ID NO:2に示された特定の1つの配列は付加的な開示されたプライマーの例である。SEQ ID NO:3に示された特定の1つの配列は開示されたプローブの例である。プライマーおよび/またはプローブは、本明細書において開示された情報を与えられたpsaA配列に対して特異的になるように設計することができる。本明細書において開示された任意の他のタンパク質と同様に、Genbankで開示されたタンパク質に関する様々な配列、例えばpsaAがあり、これらの配列および他の配列は、そこに含まれる個々の部分配列と同様に、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、それらは本明細書において開示されたpsaA遺伝子と相互作用することができる。特定の態様では、プライマーはDNA増幅反応を支援するために使用される。典型的には、プライマーは配列特異的な様式で伸長できるであろう。配列特異的様式のプライマーの伸長は、プライマーがハイブリダイズされるかさもなくば結合される核酸分子の配列および/または組成物が、プライマーの伸長により生成された生成物の組成物もしくは配列を、方向付けるかまたはそれに影響を与える任意の方法を含む。したがって、配列特異的な様式によるプライマー伸長は、PCR、DNA配列決定、DNA伸長、DNA重合、RNA転写、または逆転写を含むが、それらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の態様では、プライマーは、PCRまたは直接配列決定などのDNA増幅反応に使用される。特定の態様では、非酵素的手法を使用してプライマーを伸長することもまた可能であり、その場合例えば、それらが化学的に反応し、配列特異的様式でプライマーを伸長するように、プライマー伸長用に使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは修飾されることが理解される。典型的には、開示されたプライマーはpsaA遺伝子またはpsaA遺伝子領域とハイブリダイズするか、またはそれらはpsaA遺伝子の相補体もしくはpsaA遺伝子領域の相補体とハイブリダイズする。
またはそれに相補的な配列とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドであるセンスプライマーも開示され、オリゴヌクレオチドは連続した15〜30のヌクレオチドである。
;またはそれに相補的な配列とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドであるアンチセンスプライマーも開示され、オリゴヌクレオチドは連続した15〜30のヌクレオチドである。
;またはそれに相補的な配列とハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチドである非縮重プローブも開示される。
を含むオリゴヌクレオチドである非縮重プローブも開示され、配列中Xは蛍光団であり、Yは1つまたは複数のリン酸基であり、「T」はダーククエンチャーを有するチミンまたはチミンに結合されたアクセプター色素である。
機能的核酸は、標的分子を結合するかまたは特異的反応を触媒するような特異的機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は以下のカテゴリーに分類することができ、限定することを意味しない。例えば、機能的核酸はアンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子および外部ガイド配列を含む。機能的核酸分子は標的分子が有する特異的活性の作用因子、抑制因子、修飾因子および刺激因子として作用することができるか、または機能的核酸分子は、任意の他の分子に非依存的にデノボ活性を有することができる。
a)タンパク質変異体
本明細書において考察されるように、公知であり、かつ本明細書において検討されるPsaAタンパク質変異体を含む異なる肺炎連鎖球菌血清型がある。本明細書において開示された方法は、肺炎連鎖球菌血清型すべての検出という長所を有する。
少なくとも1つのアドレスは、本明細書において開示された核酸配列のうちのいずれかに示された配列または配列の一部であるチップが開示される。少なくとも1つのアドレスは、本明細書において開示されたペプチド配列のうちのいずれかに示された配列または配列の部分であるチップも開示される。
開示された核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドからなる配列として表わせることが理解される。これらの配列を表示する様々な方法があり、例えばヌクレオチドのグアノシンはGまたはgにより表わすことができる。同様に、アミノ酸のバリンはValまたはVにより表わすことができる。様々な方法のうちのいずれかによって、任意の核酸またはタンパク質の配列を表示し、かつ表す方法が存在し、その各々は本明細書において開示され考慮されることを当業者は理解する。具体的には、市販のフロッピーディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスク、または他のコンピューター読取り可能な媒体のようなコンピューター読取り可能な媒体上での、これらの配列の表示が本明細書において検討される。開示された配列の2進コード表示も開示される。当業者は、コンピューター判読可能な媒体が何であるかを理解する。したがって、核酸またはタンパク質配列が記録、記憶、または保存されるコンピューター読取り可能な媒体である。
本明細書において開示された方法の実行に使用できる試薬を含むキットが本明細書において開示される。キットは本明細書において考察された任意の試薬もしくは試薬の組み合わせも含むことができるか、または開示された方法の実行において必要または有益と理解されるであろう。例えばキットは、意図されるプライマーの使用に必要な緩衝液および酵素と同様に、方法の特定の態様で議論された増幅反応を実行するためのプライマーを含むことができるであろう。例えば、センスプライマー、アンチセンスプライマーおよび非縮重プローブを含む、肺炎連鎖球菌検出用リアルタイムPCR型増幅反応のための試薬を含むキットが開示される。例えばキットは、肺炎連鎖球菌のpsaA遺伝子を検出することができる。
本明細書において開示された組成物は、DNA合成のプライミングまたはpsaA結合のような特定の機能を有することが理解される。開示された機能の実行のための、特定の構造的な必要条件が本明細書において開示され、開示された構造に関連する同様な機能を実行することができる様々な構造があること、およびこれらの構造が最終的には同様な結果、例えばDNA合成のプライミングまたはpsaAの結合を達成することが理解される。
本明細書において開示された組成物および開示された方法を実行するのに必要な組成物は、具体的な言及がない限り、特定の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を使用して作製することができる。
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのような核酸は、標準の化学合成方法を使用して作製することが可能であるか、または酵素法もしくは任意の他の公知の方法を使用して生成することが可能である。そのような方法は、標準の酵素消化およびその後のヌクレオチド断片の単離(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6を参照されたい)から、純粋な合成法、例えばMilligenまたはBeckman Systeml Plus DNA合成装置を使用するシアノエチル・フォスフォアミダイト方法(例えば、Model 8700 automated synthesizer of Milligen- Biosearch, Burlington, MAまたはABI Model 380B)によるものまでわたることができる。オリゴヌクレオチドの作製に役立つ合成法も、Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)、(ホスホトリエステルおよびフォスファイトトリエステル法)、およびNarang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980)、(フォスフォトリエステル法)によって記述される。タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug, Chem. 5:3-7 (1994)によって記述されたものなどの公知の方法を使用して作製することができる。
組成物に結びつく中間物を作製する過程と同様に、組成物を作製する過程が開示される。例えば、SEQ ID NO:1、2および3の核酸が開示される。
を含む核酸分子をSEQ ID NO:3の内部「T」残基上でダーククエンチャーに、操作可能な方法で結合する段階を含む過程により生成された核酸分子も開示される。ダーククエンチャー分子はアミノ結合によりプローブに結合することができるが、内部「T」残基にダーククエンチャーを結合する任意の標準的な方法も、この方法において使用することができる。
1.研究ツールとして組成物を使用する方法
開示された組成物は、単独または組み合わせのいずれかで、様々な方法で使用することができる。例えばSEQ ID NO:1、2および3などの開示された組成物は、psaA遺伝子の存在を検出するために、単独または組み合わせのいずれかで使用することができる。
PCR技術は、微量の標的核酸の増幅およびその後の検出を可能にする。PCRの詳細は、例えばMullis et al.に対する米国特許第4,683,195号、Mullisに対する第4,683,202号、およびMullis et al.に対する第4,965,188号を含めて、当技術分野において十分に記述される。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは標的核酸の変性した鎖へアニールされ、プライマー伸長生成物はポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド三リン酸の重合により形成される。典型的なPCR法は、テンプレート核酸の変性、プライマーのアニーリング、および耐熱性ポリメラーゼ作用によるアニールされたプライマーの伸長の反復サイクルを含む。その過程は標的核酸の指数関数的な増幅をもたらし、それにより試料中の非常に低濃度で存在する標的の検出を可能にする。PCRは、生物工学研究、臨床診断および法医学を含む様々な応用で広く使用される。
本発明を実行する際に、Perkin Elmer Applied Biosystems (1999)により出版された「Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection」と題するPCR技術の一般的な総説および注釈、ならびにPCRプロトコール(Academic Press New York, 1989)を任意で参照してもよい。
開示された組成物は、単独または組み合わせのいずれかで、以下の工程を含む、生物試料中の肺炎連鎖球菌核酸を定量する方法においても使用することができる:センスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用してリアルタイムPCRにて肺炎連鎖球菌ヌクレオチド配列を増幅することにより増幅生成物を生成する工程であって、該プライマーはポリメラーゼ連鎖反応に適した条件下で肺炎連鎖球菌のpsaA遺伝子の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される、工程;およびポリメラーゼ連鎖反応に適した条件下で肺炎連鎖球菌のpsaA遺伝子の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む非縮重プローブの使用により該増幅生成物を検出する工程;ならびに該プローブからの検出シグナルの測定、および定量化基準からの第2プローブ検出シグナルと該検出シグナルの比較により、該生物試料中の該増幅生成物を定量する工程であって、該定量化基準はセンスプローブおよび核酸基準を含む、工程。
開示された組成物は、単独または組み合わせのいずれかで、肺炎球菌疾患などの疾患に関する診断ツールとして使用することもできる。例えばSEQ ID NO:1、2および3などの開示された組成物は、psaA遺伝子存在の検出により、肺炎球菌性肺炎を診断するために使用することができる。
開示された組成物は、単独または組み合わせのいずれかで、本明細書において考察されるように、マイクロアレイ中の試薬または既存のマイクロアレイを探索もしくは分析する試薬のいずれかとして使用することができる。
開示された組成物は、単独または組み合わせのいずれかで、本明細書において考察されるように、チップおよびマイクロアレイ中の試薬または既存のチップおよびマイクロアレイを探索もしくは分析する試薬のいずれかとして使用することができる。
以下の実施例は、当業者に対して、本明細書において特許請求された化合物、組成物、製品、装置および/または方法が、どのように作製および評価されるのかについての完全な開示および記述を提供するように提出され、純粋に例示的になるように意図され、開示を限定するようには意図されない。数値(例えば量、温度など)に関して正確さを保証する努力がなされたが、ある程度の誤差および偏差は考えられるべきである。特別の指示のない限り、部分は重量による部分であり、温度は℃であるか周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近である。
プローブ1:
、XはFAMであり、Yはリン酸基であり、ROXは「T」に結合される。
プローブ2:
、XはHEXであり、Yはリン酸基であり、ROXは「T」に結合される。
単離菌は連鎖球菌参照試験所より得た。検査した単離菌は以下からなっていた:40のSpn(28の異なる血清型);4の無莢膜性Spn(結膜炎発症の代表菌);51のP-LVS(S.シュードニューモニエ、S.ミティス、S.オラリス、S.サンギニス、S.パラサンギニス、S.ペロリス、S.インファンティス、S.ゴルドニ、S.クリスタツス、S.サリバリウス、S.ヴェスティブラリス、S.オーストラリス、S.シネンシス、S.オリゴファーメンタンス、S.インテスティナリス);S.ピオジェネス、S.アガラクティエ、黄色ブドウ球菌、ドロシグラヌラム-ピグラム、エンテロコッカス-フェカリス、および大腸菌などの他の上気道生物。
細菌DNAを、DNeasy Tissue Kit(QIAGEN GmbH)を使用して単離菌から抽出した。
使用したPCR条件は以下のとおりであった:25μlの全容積中に、500nMのプライマー、100nMのプローブ、1×TaqMan(商標)ユニバーサルPCRマスターミックス緩衝液、および2.5μlのDNA。2.5μl容積の滅菌水をDNAの代わりに加え、テンプレート対照を調製しなかった。2.5μl容積の滅菌水をDNAの代わりに加え、テンプレート対照を調製しなかった。
プライマーの最適化は、SYBRグリーンを使用して、iCyclerフォーマット(BIO-RAD)で勾配溶融温度検査を使用して行なった。
プライマー(1Fおよび1R;それぞれSEQ ID NO:1および2)の最初のセットは、iCyclerフォーマット(BIO-RAD)においてSYBRグリーンを使用して勾配溶融温度検査下で、肺炎連鎖球菌のpsaA遺伝子を特異的および鋭敏に同定した。
患者の標本から生物単離物を得る際の困難さだけではなく、肺炎球菌様緑色連鎖球菌種(P-LVS)を肺炎連鎖球菌(Spn)として誤同定することによっても、正確な肺炎球菌疾患の診断は頻繁に妨げられた。検討される標本が呼吸器系部位から来る場合、これは特に重大である。
al.)のための他の2つのアッセイも評価した。
(1)プライマーおよびプローブ
実施例1に記述されるように、psaAに特異的なプライマーおよびプローブを同定した。
単離菌は連鎖球菌参照試験所より得た。検査した単離菌は以下からなっていた:40のSpn(28の異なる血清型);4の無莢膜性Spn(結膜炎発症の代表菌);51のP-LVS(S.シュードニューモニエ、S.ミティス、S.オラリス、S.サンギニス、S.パラサンギニス、S.ペロリス、S.インファンティス、S.ゴルドニ、S.クリスタツス、S.サリバリウス、S.ヴェスティブラリス、S.オーストラリス、S.シネンシス、S.オリゴファーメンタンス、S.インテスティナリス);S.ピオジェネス、S.アガラクティエ、黄色ブドウ球菌、ドロシグラヌラム-ピグラム、エンテロコッカス-フェカリス、および大腸菌などの他の上気道生物。
細菌DNAを、DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)を使用して単離菌から抽出した。
使用したPCR条件は以下のとおりであった:25μlの全容積中に、500nMのプライマー、100nMのプローブ、1×TaqMan(商標)ユニバーサルPCRマスターミックス緩衝液、および2.5μlのDNA。2.5μl容積の滅菌水をDNAの代わりに加え、テンプレート対照を調製しなかった。2.5μl容積の滅菌水をDNAの代わりに加え、テンプレート対照を調製しなかった。使用したサイクル条件は以下のとおりであった:95℃10分の変性を1サイクル、続いて95℃15秒の変性および60℃60秒のアンプリコン伸長を40サイクル。(図3を参照されたい)。
リアルタイムPCR反応はすべてMX3000P機(Stratagene)を用いて行ない、その機械で蛍光プローブ(TaqMan(商標)プローブ)によってPCRサイクル間にシグナルを検出した。
検査した5つのアッセイはすべて、Spn単離菌のすべてに対して陽性で、15未満のDNAコピーを検出することができた。psaAおよびlytAを標的とする新しく開発したアッセイは、psaAアッセイに対して陽性だった1つのS.シュードニューモニエ単離菌以外は、すべての非Spn単離菌に対して陰性だった。同種類の単離菌は、McAlvinにより以前に開発されたlytA PCRアッセイに対して定義されなかった。両方のply PCRは、12の他のP-LVS単離菌と共に、S.シュードニューモニエのすべての単離菌に対して陽性だった。したがって、肺炎球菌の検出のためのply遺伝子の使用はP-LVSの誤同定に結びつく場合がある。psaAおよびlytAのための新しいアッセイは、McAlvin et al.およびCorless et al.により開発されたアッセイよりも、真のSpnの検出に対してより特異的だった。
Claims (18)
- SEQ ID NO:1の核酸配列を含む、27〜30ヌクレオチド長のセンスプライマー、および
SEQ ID NO:2の核酸配列の連続した少なくとも15ヌクレオチドを含む、15〜30ヌクレオチド長のアンチセンスプライマー
を用いて、リアルタイムPCRによる肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)ヌクレオチド配列を増幅することによって増幅生成物を生成する工程:ならびに
SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の核酸配列の連続した少なくとも20ヌクレオチドを含むプローブを用いて、該増幅生成物を検出する工程;
を含み、それによって肺炎連鎖球菌核酸の存在が検出される、生物試料中の肺炎連鎖球菌核酸を検出する方法。 - 肺炎連鎖球菌核酸の検出により肺炎連鎖球菌感染を検出する、請求項1記載の方法。
- センスプライマーがSEQ ID NO:1の核酸配列からなる、請求項1記載の方法。
- アンチセンスプライマーがSEQ ID NO:2の核酸配列からなる、請求項1記載の方法。
- 非縮重プローブがSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の核酸配列からなる、請求項1記載の方法。
- 前記プローブが、明らかにする分子または明らかにする分子のシステムを含む、請求項1記載の方法。
- SEQ ID NO:1の核酸配列を含む、27〜30ヌクレオチド長であるセンスプライマー;
SEQ ID NO:2の核酸配列の連続した少なくとも15ヌクレオチドを含む、15〜30ヌクレオチド長であるアンチセンスプライマー;および
SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の核酸配列の連続した少なくとも20ヌクレオチドを含む、非縮重プローブ
を含む、肺炎連鎖球菌検出用リアルタイムPCR型増幅反応のための試薬を含む、キット。 - 非縮重プローブが、
5'-X-TTTCTTTCTGCAA“T”CATTCTTGTAGCATGTGCTAGC-Y-3'
を含み、Xは蛍光団であり、Yは1つまたは複数のリン酸基であり、「T」はダーククエンチャーを有するチミンまたはそれに結合されたアクセプター色素である、請求項8記載のキット。 - 該プローブからの検出シグナルを測定し、センスプローブおよび核酸基準を含む定量化基準からの第2プローブ検出シグナルと該検出シグナルを比較することにより、該生物試料中の該増幅生成物を定量する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記定量化基準が前記生物試料と同時に抽出される、請求項12記載の方法。
- 前記核酸基準が、精製されかつ滴定量された肺炎連鎖球菌溶液を含む請求項12記載の方法。
- 前記プローブからの前記検出シグナルが、前記生物試料と同時に抽出された核酸試料からの第3プローブ検出シグナルとさらに比較され、該核酸試料が肺炎連鎖球菌の既知量および生物試料に類似する培地の既知量から抽出される、請求項12記載の方法。
- 非縮重プローブがSEQ ID NO:3の核酸配列からなる、請求項5記載の方法。
- 非縮重プローブがSEQ ID NO:7の核酸配列からなる、請求項5記載の方法。
- 非縮重プローブが
5'-X-TTTCTTTCTGCAA“T”CATTCTTGTAGCATGTGCTAGC-Y-3'
を含み、Xは蛍光団であり、Yは1つまたは複数のリン酸基であり、「T」はダーククエンチャーを有するチミンまたはそれに結合されたアクセプター色素である、請求項1記載の方法。
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