BRPI0520067B1 - método para detectar ácido nucléico de streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, sonda de oligonucleotídeo, composição e kit - Google Patents

Abstract

desenvolvimento de um ensaio de pcr em tempo real para a detecção de dna pneumocócico e diagnóstico da doença pneumocócica. a presente invenção refere-se a composições e métodos para detectar uma seqúência específica do gene psaa usando pcr em tempo real para a diagnose da doença pneumocócica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA DETECTAR ÁCIDO NUCLÉICO DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, SONDA DE OLIGONUCLEOTÍ-DEO, COMPOSIÇÃO E KIT".

I. ANTECEDENTES A presente invenção refere-se a Streptococcus pneumoniae que é a principal causa de pneumonia adquirida em comunidade, meningite e otite média nos Estados Unidos. (Brown et al., 1998). Enquanto que a terapia antimicrobiana tradicional provou ser um tratamento eficaz no passado, a emergência de cepas resistentes a penicilina e a múltiplos fármacos resultou em um número crescente de casos de doenças e fatalidades (Doern et al., 1999; Jacoby, 1996). O isolamento e a identificação pneumocócica são complicadas pela supressão antimicrobiana do crescimento em cultura e pela contaminação por alfa-estreptococos da flora normal. A detecção por técnicas clássicas, métodos de cultivo e sorológicos podem ser consumidores de tempo e indeterminados. Ensaios sensíveis e específicos que podem ser rapidamente completados no laboratório clínico são essenciais para a diagnose precoce e a terapia eficaz. Ensaios moleculares são inerentemente valiosos porque a detecção pode ser alcançada com sensibilidade e especificidade aumentada, e a detecção não é diminuída com organismos não-viáveis. Vários métodos moleculares foram empregados para ajudar nas investigações (Gillespie, 1999; Hall, 1998; Olive and Bean, 1999). O diagnóstico da doença pneumocócica exato foi freqüentemen-te dificultado não somente pelas dificuldades em obter isolados do organismo a partir de modelos de pacientes, mas também pela falta de identificação de espécies de estreptococos viridans semelhantes ao Pneumococcus (P-LVS) como Streptococcus pneumoniae (Spn). Isso é especialmente crítico quando o modelo considerado vem do sítio respiratório.

Uma área principal de foco na pesquisa da doença pneumocócica tem sido no desenvolvimento de vacinas. A falha da vacina de polissaca-rídeos 23-valente licenciada de proporcionar proteção em crianças novas (< 2 anos de idade), em pessoas de idade avançada, ou nos imunocomprome- tidos (Forrester etal., 1987) levou ao desenvolvimento de uma vacina prote-ína-conjugada de segunda geração, brevemente para ser licenciada. Essa vacina, composta dos sete sorotipos capsulares causadores de doença mais freqüentemente invasivos, pode superar os problemas da fraca imunogenici-dade associada com a vacina 23-valente. Entretanto, há indicações de que essa vacina conjugada de proteína pode não prevenir a substituição do car-reamento de sorotipos não contidos na vacina (Obaro et ai, 1996). Essas preocupações, juntamente com relatórios de um aumento nos pneumococos resistentes a antibióticos (Centers for Disease Control and Prevention, 1997), mudaram o interesse em direção ao desenvolvimento de uma vacina baseada nas proteínas comuns de espécies pneumocócicas imunogênicas de S. pneumoniae (Hammerschmidt etal.,, 1997). A mais promissora dessas proteínas inclui a pneumolisina (Paton, 1996), a proteína de superfície pneumocócica (PspA) (Briles etal., 1988) e do foco particular nesse estudo, a adesina A de superfície pneumocócica (PsaA) (Sampson etal., 1994).

PsaA, codificado pelo gene psaA, é uma proteína de superfície de 37 KDa primeiramente identificada por Russell etal{Russell etal., 1990). Estudos de anticorpos monoclonais sugerem que o PsaA é expresso em todos os 90 sorotipos de S. pneumoniae (Crook et al., 1998) e análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição de PCR dos 23 sorotipos da vacina demonstraram a conservação do gene psaA (Sampson et ai, 1997).

II. RESUMO São descritos os métodos e composições relacionadas com a detecção de DNA pneumocócico e com o diagnóstico da doença pneumocócica. Mais especificamente, é descrito um método de PCR em tempo real para a detecção do gene da proteína de adesão da superfície pneumocócica (psaA).

III. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos associados, os quais são incorporados na e constituem uma parte desse relatório descritivo, ilustram várias modalidades e juntos com a descrição ilustram as composições e métodos descritos.

Figura 1 mostra o método geral do uso de sondas TaqMan® em uma reação de PCR em tempo real para detectar uma seqüência de interesse.

Figura 2 mostra a localização dos iniciadores para frente e reverso e a sonda usada para detectar o gene psaA do Streptococcus pneumoniae.

Figura 3 mostra o perfila térmico do método de PCR em tempo real usado para detectar o gene psaA de Streptococcus pneumoniae.

Figura 4 mostra a curva de diluição/concentração dos gráficos de amplificação da psaA da cepa de ATCC 3340QT de S. pneumoniae.

Figura 5 mostra os gráficos de amplificação para a psaA da cepa ATCC 33400T de S. pneumoniae.

IV, DESCRIÇÃO DETALHADA

Antes dos presentes compostos, composições, artigos, dispositivos e/ou métodos serem descritos e descritos, é para ser entendido que eles não estão limitados a métodos sintéticos específicos ou a métodos de biotecnologia recombinante específicos a não ser que seja diferentemente especificado, ou a reagentes particulares, a não ser que seja diferentemente especificado, ou a reagentes particulares, a não ser que seja diferentemente especificado, uma vez que eles podem, claramente, variar. Também é para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito somente de descrever modalidades particulares e não é tencionado para ser limitante. A. Definições Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um", “uma" e "o" incluem referentes plurais a não ser que o contexto claramente diga outra coisa. Consequentemente, por exemplo, referência a "um veículo farmacêutico" inclui misturas de dois ou mais tais veículos, e similares.

As faixas podem ser aqui expressas como de "cerca de" um valor particular, e/ou para "cerca de" outro valor particular. Quando tal faixa é expressa, outra modalidade inclui de um valor particular e/ou até o outro valor particular. Similarmente, quando os valores são expressos como aproxi- mações, pelo uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular forma outra modalidade. Será ainda entendido que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final, e independentemente do outro ponto final. Também é entendido que existe uma variedade de valores aqui descritos, e que cada valor é também aqui descrito como "cerca de" aquele valor particular além do próprio valor. Por exemplo, se o valor "10" é descrito, então "cerca de 10" também é descrito. Também se entende que quando um valor é descrito que "menos do que ou igual ao" valor, "maior do que ou igual ao valor" e faixas possíveis entre os valores também são descritas, conforme apropriadamente entendido pelo versado na técnica. Por exemplo, se o valor "10" é descrito, o "menos do que ou igual a 10", assim como o "maior do que ou igual a 10" também é descrito. Também é entendido que por todo o pedido de patente, dados são fornecidos em uma variedade de diferentes formatos, e que esses dados representam os pontos finais e os pontos de partida, e faixas para qualquer combinação dos pontos de dados. Por exemplo, se um ponto de dados particular "10" e um ponto de dados particular 15 são descritos, é entendido que maior do que, maior do que ou igual a, menos do que, menos do que ou igual a, e igual a 10 e 15 são considerados descritos, assim como entre 10 e 15.

Nesse relatório descritivo e mais reivindicações as quais se seguem, será feita referência a uma variedade de termos os quais devem ser definidos para ter os seguintes significados: "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância subsequentemente descrita pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui exemplos onde o referido evento ou circunstância ocorre e exemplos onde isso não ocorre. "Iniciadores” são um subgrupo de sondas as quais são capazes de suportar algum tipo de manipulação enzimática e as quais podem hibridi-zar com um ácido nucléico alvo, tal como pode ocorrer a manipulação enzimática. Um iniciador pode ser feito a partir de qualquer combinação de nu-cleotídeos ou de derivados de nucleotídeos ou análogos disponíveis na téc- nica, os quais não interferem com a manipulação enzimática. "Sondas" são moléculas capazes de interagir com um ácido nu-cléico alvo, tipicamente em uma forma específica da seqüência, por exem-pio, através de hibridização. A hibridização dos ácidos nucléicos é bem-entendida na técnica e aqui discutida. Tipicamente uma sonda pode ser feita a partir de qualquer combinação de nucleotídeos ou derivados de nucleotí-deos ou análogos disponíveis na técnica.

Reação em cadeia da polimerase é abreviada como "PCR". O termo "PCR em tempo real" é tencionado para significar qualquer técnica de amplificação a qual torna possível monitorar a evolução de uma reação de amplificação contínua.

Um "sujeito" é um indivíduo. Consequentemente, o "sujeito” pode incluir animais domesticados, tais como gatos, cachorros, etc., criações (por exemplo, gado, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, etc.), animais de laboratório (por exemplo, camundongo, coelho, rato, porquinho-da-índia, etc.) e passarinhos. Preferivelmente, o sujeito é um mamífero tal como um primata, e mais preferivelmente, um ser humano.

Conforme aqui utilizado, "condições estringentes" se refere às condições de lavagem usadas em um protocolo de hibridização. Em geral, as condições de lavagem devem ser uma combinação de temperatura e concentração salina escolhida de forma que a temperatura de desnaturação seja de aproximadamente 5 - 20 °C abaixo da Tm calculada (a temperatura de fusão na qual metade das moléculas se dissociam a partir de seus parceiros de hiridização) do híbrido de ácido nucléico sob estudo. A temperatura e as condições salinas são prontamente determinadas empiricamente em experimentos preliminares, nos quais as amostras do DNA de referência imobilizadas em filtros são hibridizadas para a sonda ou o ácido nucléico que codifica a proteína de interesse e, a seguir, lavadas sob condições de diferentes estringências. A Tm de tal oligonucleotídeo pode ser estimada deixando 2 °C para cada nucleotídeo A ou T, e 4 °C para cada G ou C. Por exemplo, uma sonda de 18 nucleotídeos de 50% de G + C podería, dessa forma, ter uma Tm aproximada de 54 °C. Condições estringentes são conhecidas para uma pessoa versada na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et ai (2001). Um exemplo de condições de lavagem estringentes é 4 x SSC a 65 °C. Condições de lavagem altamente estringentes incluem, por exemplo, 0,2 x SSC a 65 °C.

Através desse pedido de patente, várias publicações são referenciadas. As descobertas dessas publicações nas suas totalidades são por meio desta incorporadas por referência nesse pedido de patente para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual elas pertencem. As referências descritas são também individualmente e especificamente incorporadas aqui por referência para o material contido nelas que é discutido na sentença na qual a referência é confiada. B. Composições São descritos os componentes a serem usados para preparar s composições descritas, assim como as próprias composições a serem usadas nos métodos aqui descritos. Esses e outros materiais são aqui descritos, e é entendido que quando combinações, subgrupos, interações, grupos, etc. desses materiais são descritos, que enquanto referência específica de vários indivíduos e combinações e permutações coletivas desses compostos podem não ser explicitamente descritas, cada um é especificamente contemplado e aqui descrito. Por exemplo, se uma sonda particular for descrita e discutida e uma quantidade de modificações que podem ser feitas a uma quantidade de moléculas incluindo a sonda forem discutidas, é especificamente contemplada cada e toda combinação e permutação de sondas e as modificações que são possíveis, a não ser que seja especificamente indicado o contrário. Conseqüentemente, se uma classe de moléculas A, B e C são descritas, assim como uma classe de moléculas D, E e F, e um exemplo de uma molécula de combinação, A- D é descrita, então mesmo se cada um não for individualmente citado, cada um é individual e coletivamente contemplado significando combinações, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, e CF são considerados descritos. Da mesma forma, qualquer subgrupo ou combinação desses também é descrita. Conseqüentemente, por exemplo, o subgrupo de A-E, B-F e C-E poderia ser considerado descoberto. Esse con- ceito se aplica a todos os aspectos desse pedido de patente incluindo, mas não limitado, aos passos nos métodos de fazer e usar as composições descritas. Conseqüentemente, se há uma variedade de passos adicionais que podem ser efetuados, é entendido que cada um desses passos adicionais pode ser efetuado com qualquer modalidade ou combinação de modalidades específica dos métodos descritos. 1. Similaridades de seaüências É entendido que, conforme aqui discutido, o uso dos termos ho-mologia e identidade significam a mesma coisa que similaridade. Conseqüentemente, por exemplo, se o uso da palavra homologia é usado entre duas seqüências não-naturais, é entendido que ele não está necessariamente indicando uma relação evolucionária entre essas duas seqüências, mas ao contrário, está considerando a similaridade ou relação entre suas seqüências de ácidos nucléicos. Muitos dos métodos para determinar a homologia entre duas moléculas evolutivamente relacionadas são rotineiramente aplicados a quaisquer dois ou mais ácidos nucléicos ou proteínas para o propósito de medir a similaridade de seqüências, sem considerar se eles são evolutivamente relacionados ou não.

Em geral, é entendido que uma forma de definir quaisquer variantes conhecidas e derivados ou aqueles que podem aparecer dos genes descobertos e proteínas aqui, é através da definição das variantes e derivados em termos de homologia com as seqüências conhecidas específicas. Essa identidade de seqüências particulares aqui descritas também é discutida em outros lugares aqui. Por exemplo, GCCCTA ATAAATTGGAGGATC-TAATGA (SEQ ID NO: 1), GACCAGAAGTTGTATCI III I I ICCG (SEQ ID NO: 2) e CTAGCACATGCTACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA (SEQ ID NO: 3) estabelecem seqüências particulares de uma série de iniciador e uma sonda, respectivamente, para a amplificação e detecção específica e sensível da psaA. Especificamente descritas são as variantes desses e outros genes e proteínas aqui descritas as quais têm, pelo menos, cerca de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 por cento de homologia com a seqüência estabelecida da seqüência natural. Os indivíduos versados na técnica prontamente entendem como determinar a homologia das duas proteínas ou ácidos nucléicos, tais como genes. Por exemplo, a homologia pode ser calculada depois do alinhamento das duas seqüências, de forma que a homologia esteja no seu nível mais alto.

Outra forma de calcular a homologia pode ser efetuada pelos algoritmos publicados. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 2444 (1988), pelas implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Programas de Computador Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por inspeção.

Os mesmos tipos de homologia podem ser obtidos para ácidos nucléicos, por exemplo, pelos algoritmos descritos em Zuker, M. Science 244: 48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183: 281-306,1989, os quais são aqui incorporados por referência por pelo menos material relacionado com o alinhamento do ácido nucléico. É entendido que qualquer um dos métodos tipicamente podem ser usados e que em certos exemplos os resultados desses vários métodos podem diferir, mas os versados na técnica entendem que se a identidade for encontrada com pelo menos um desses métodos, as seqüências poderiam ser ditas como tendo a identidade estabelecida, e ser aqui descritas.

Por exemplo, conforme aqui utilizado, uma seqüência citada como tendo uma homologia porcentual particular com outra seqüência se refere a seqüências que têm a homologia citada conforme calculada por qualquer um ou mais dos métodos de cálculo descritos acima. Por exemplo, uma primeira seqüência tem 80 por cento de homologia, conforme aqui definido, com uma segunda seqüência se a primeira seqüência for calculada como tendo 80 por cento de homologia com a segunda seqüência usando o método de cálculo de Zuker mesmo se a primeira seqüência não tiver 80 por cento de homologia com a segunda seqüência conforme calculado por quaisquer outros métodos de cálculo. Como outro exemplo, uma primeira seqüência tem 80 por cento de homologia, conforme aqui definido, com uma segunda seqüência se a primeira seqüência for calculada como tendo 80 por cento de homologia com uma segunda seqüência usando tanto o método de cálculo de Zuker quanto o método de cálculo de Pearson e Lipman, mesmo se a primeira seqüência não tiver 80 por cento de homologia com a segunda seqüência conforme calculado pelo método de cálculo de Smith e Waterman, pelo método de cálculo de Needleman e Wunsch, pelos métodos de cálculo de Jaeger ou qualquer um dos outros métodos de cálculo. Como ainda outro exemplo, uma primeira seqüência tem 80 por cento de homologia, conforme aqui definido, com uma segunda seqüência se a primeira seqüência for calculada como tendo 80 por cento de homologia com uma segunda seqüência, usando cada um dos métodos de cálculo (embora, na prática, os métodos de cálculo diferentes irão geralmente resultar em diferentes porcentagens de homologia calculada). 2. Hibridizacão / Hibridizacão seletiva O termo hibridização tipicamente significa uma interação direcionada pela seqüência entre pelo menos duas moléculas de ácido nucléico, tal como um iniciador ou uma sonda e um gene ou uma porção de um gene. A interação direcionada pela seqüência significa uma interação que ocorre entre dois nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos ou derivados de nucleotí-deos de uma forma nucleotídeo específica. Por exemplo, G interagindo com C ou A interagindo com T são interações direcionadas por seqüência. Tipicamente interações direcionadas por seqüência ocorrem na face Watson-Crick ou na face Hoogsteen do nucleotídeo. A hibridização dos dois ácidos nucléicos é afetada por uma variedade de condições e parâmetros conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, as concentrações salinas, pH e temperatura da reação todos afetam se duas moléculas de ácidos nucléicos irão hibridizar.

Parâmetros para hibridização seletiva entre duas moléculas de ácido nucléico são bem-conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, as condições de hibridização seletiva podem ser definidas como condições de hibridização estringentes. Por exemplo, a estringência da hibridização é controlada tanto pela temperatura quanto pela concentração salina de qualquer uma ou ambos os passos de hibridização e de lavagem. Por exemplo, as condições de hibridização para alcançar a hibridização seletiva podem envolver a hibridização em solução de alta força iônica (6X SSC ou 6X SSPE) em uma temperatura que é de cerca de 12 - 25 °C abaixo da Tm seguido pela lavagem em uma combinação de temperatura e concentração salina escolhida de forma que a temperatura de lavagem é de cerca de 5 °C até 20 °C abaixo da Tm. A temperatura e as condições salinas são prontamente determinadas empiricamente em experimentos preliminares nos quais as amostras de referência de DNA imobilizado nos filtros são hibridizadas a um ácido nucléico marcado de interesse e, a seguir, lavadas sob condições de diferentes estringências. As temperaturas de hibridização são tipicamente mais elevadas para as hibridi-zações de DNA-RNA e RNA-RNA. As condições podem ser usadas conforme descritas acima para alcançar estringência, ou conforme é sabido na técnica. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987: 154: 367, 1987, o qual é aqui incorporado na técnica por referência para o material pelo menos relacionado com a hibridização dos ácidos nucléicos). Uma condição de hibridização estringente preferível para uma hibridização de DNA:DNA pode ser em cerca de 68 °C (em solução aquosa) em 6X SSC ou 6X SSPE seguido por lavagem a 68 °C. A estringência da hibridização e da lavagem, caso desejado, pode ser reduzida de acordo com o grau de complementaridade desejada se diminuída e, além disso, dependendo da riqueza de G-C ou A-T em qualquer área em que a variabilidade é procurada. Da mesma forma, a estringência da hibridização e da lavagem, caso desejado, pode ser aumentada concordantemente, uma vez que a homologia desejada seja aumentada, e ainda, dependendo da riqueza de G-C ou A-T de qualquer área em que a alta homofogia seja desejada, conforme é sabido na técnica.

Outra forma de definir a hibridização seletiva é olhando a quantidade (porcentagem) de um dos ácidos nucléicos ligado ao outro ácido nu-cléico. Por exemplo, em algumas modalidades, as condições de hibridização seletiva poderíam ser quando pelo menos cerca de 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 por cento do ácido nucléico limitante está ligado ao ácido nucléico não-limitante. Tipicamente, o iniciador não-limitante está em, por exemplo, em um excesso de 10 ou 100 ou 1000 vezes. Esse tipo de ensaio pode ser efetuado sob condições onde tanto o iniciador limitante quanto o não-limitante estão, por exemplo, 10 vezes ou 100 vezes ou 1000 vezes abaixo de seus Kds, ou onde somente uma das moléculas de ácido nucléico está 10 vezes ou 100 vezes ou 1000 vezes ou onde uma ou ambas as moléculas de ácido nucléico está acima de seus Kds.

Outra forma de definir a hibridização seletiva é considerando a porcentagem do iniciador que é enzimaticamente manipulado sob condições onde a hibridização é necessária para promover a manipulação enzimática desejada. Por exemplo, em algumas modalidades, as condições de hibridização seletivas poderíam ser quando pelo menos cerca de 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100 por cento do iniciador é enzimaticamente manipulado sob condições as quais promovem a manipulação enzimática, por exemplo, se a manipulação enzimática for extensão de DNA, então as condições de hibridização poderíam ser quando pelo menos cerca de 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100 por cento das moléculas do inicia- dor são estendidas. As condições preferidas também incluem aquelas sugeridas pelo fabricante ou indicadas na técnica como sendo apropriadas para a enzima desempenhar a manipulação.

Exatamente como com homologia, é entendido que existe uma variedade de métodos aqui descritos para determinar o nível de hibridização entre duas moléculas de ácido nucléico. É entendido que esses métodos e condições podem proporcionar diferentes porcentagens de hibridização entre duas moléculas de ácido nucléico, mas a não ser que seja indicado de outra forma, o atendimento dos parâmetros de qualquer um dos métodos podería ser suficiente. Por exemplo, se 80% de hibridização fosse requerido e contanto que a hibridização ocorresse nos parâmetros requeridos em qualquer um desses métodos, isso é considerado aqui descrito. É entendido que os indivíduos versados na técnica entendem que se uma composição ou método atende qualquer um desses critérios para determinar a hibridização ou coletiva ou individualmente, ela é uma composição ou método que é aqui descrito. Exemplos de condições de hi-bridização específicas são aqui fornecidas. Pelas razões estabelecidas acima, essas condições são somente exemplares e não limitam o método de PCR em tempo real descrito. 3. Ácidos nucléicos Existe uma variedade de moléculas aqui descritas que são baseadas em ácidos nucléicos, incluindo, por exemplo, os iniciadores e sonda que hibridizam especificamente o gene psaA do Streptococcus pneumoniae. Os ácidos nucléicos descritos são compostos, por exemplo, por nucleotí-deos, análogos de nucleotídeos ou substituintes de nucleotídeos. Exemplos não-limitantes dessas e de outras moléculas são aqui discutidos. É entendido que, por exemplo, quando um vetor é expresso em uma célula que o mRNA expresso irá ser tipicamente composto de A, C, G e U. Da mesma forma, é entendido que se, por exemplo, uma molécula anti-sentido for introduzida em uma célula ou ambiente celular através, por exemplo, da distribuição exógena, é vantajoso que a molécula anti-sentido seja composta de análogos de nucleotídeos que reduzem a degradação da molécula anti-sentido no ambiente celular. a^ Nucleotídeos e moléculas relacionadas Um nucleotídeo é uma molécula que contém uma porção de base, uma porção de açúcar e uma porção de fosfato. Nucleotídeos podem ser ligados juntos através de suas porções de fosfato e porções de açúcar, cri- ando uma ligação internucleosídeo. A porção de base de um nucleotídeo pode ser adenin-9-ila (A), citosin-1-ila (C), guanin-9-ila (G), iracila-1-ila (U) e timin-1-ila (T). A porção de açúcar de um nucleotídeo é uma ribose ou uma desoxirribose. A porção fosfato de um nucleotídeo é fosfato pentavalente. Um exemplo não-limitante de um nucleotídeo podería ser 3‘-AMP(monofos-fatode3'-adenosina)ou5'-GMP{monofosfatode5'-guanosina).

Um análogo de nucleotídeo é um nucleotídeo o qual contém algum tipo de modificação ou na porção de base, de açúcar ou de fosfato. As modificações na porção de base poderiam incluir modificações naturais e sintéticas de A, C, G e T/U, assim como diferentes bases de purina ou piri-midina, tais como uracila-5-ila (psi.), hipoxantin-9-ila (I) e 2-aminoadenin-9-íla. Uma base modificada inclui,, mas não está limitada, a 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila da adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propiniluracila e citosina, 6-azouracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluormetila e outras uracílas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Modificações de base adicionais podem ser encontradas, por exemplo, na Patente U.S. Ns 3.687.808, Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613, e Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research e Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Certos análogos de nucleotídeos, tais como pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. 5-metilcitosina pode aumentar a estabilidade da formação dúplex. Geralmente modificações de base em tempo podem ser combinadas com, por exemplo, uma modificação de açúcar, tal como 2'-0-metoxietila, para obter propriedades únicas, tal como estabilidade dúplex aumentada. Existem numerosas Patentes U.S., tais como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; e 5.681.941, as quais detalham e descrevem uma faixa de modificações de base. Cada uma dessas patentes são aqui incorporadas por referência.

Análogos de nucleotídeos também podem incluir modificações da porção de açúcar. Modificações na porção de açúcar poderiam incluir modificações naturais da ribose e da desoxirribose, assim como modificações sintéticas. Modificações de açúcar incluem, mas não estão limitadas, às seguintes modificações na posição 2': OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N-alquenila, O-, S- ou N-alquinila, ou O-alquila-O-alquila, em que o alqui-la, alquenila ou alquinila podem ser alquila Ci a Cio, ou alquenila e alquinila C2 a C10 substituídos ou não-substituídos. Modificações no açúcar 2' também incluem, mas não estão limitadas, a -0[(CH2)nO]m CH3, -0{CH2)n OCH3, -0(CH2)n NH2, -0(CH2)n CH3, -0(CH2)n -ONH2, e -0(CH2)n0N[<CH2)nCH3)]2, onde n e m são de 1 até cerca de 10.

Outras modificações na posição 2’ incluem, mas não estão limitadas, a: alquila inferior de C1 a C10, alquila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila inferior substituído, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SO-CH3, S02 CH3, ON02, N02i N3j NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquiiamino, polialquilamino, silila substituída e um grupo clivador de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo, e outros substituintes com propriedades similares. Modificações similares podem também ser feitas em outras posições no açúcar, particularmente, na posição 3' do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou nos oligonucleotídeos 2'-5'-ligados e na posição 5’ do nucleotídeo 5'-terminal. Açúcares modificados poderiam também incluir aqueles que contêm modificações no oxigênio do anel de ponte, tal como CH2 e S. Análogos de açúcares de nucleotídeos também podem ter miméticos de açúcar, tais como porções ciclobutila em lugar do açúcar pentofuranosila. Existem várias Patentes U.S. que ensinam o preparo de tais estruturas de açúcares modificadas, tais como a 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Análogos de nucleotídeos também podem ser modificados na porção fosfato. Porções de fosfato modificadas incluem, mas não estão limitadas, àquelas que podem ser modificadas de forma que a ligação entre dois nucleotídeos contenha um fosforotioato, um fosforotioato quiral, um fosforo-ditioato, um fosforotriéster, um aminoalquilfosfotriéster, metila e outros alquil-fosfonatos, incluindo 3'-alquilenofosforamidato e aminoalquilfosforoamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, e bora-nofosfatos. É entendido que essas ligações fosfato ou fosfato modificadas entre dois nucleotídeos pode ser através de uma ligação 3'-5' ou uma ligação 2'-5', e a ligação pode conter polaridade invertida, tal como de 3'-5'- para 5'-3' ou 2'-5'- para 5'-2'. Vários sais, sais misturados e formas de ácido livre também são incluídas. Várias Patentes U.S. ensinam como fazer e usar nucleotídeos contendo fosfatos modificados e incluem, mas não estão limitadas, a 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; e 5.625.050, cada uma das quais é por meio disto incorporada por referência. É entendido que os análogos de nucleotídeos somente precisam conter uma única modificação, mas também podem conter múltiplas modificações em uma das porções ou entre diferentes porções.

Substituintes de nucleotídeo são moléculas com propriedades funcionais similares a nucleotídeos, mas as quais não contêm uma porção fosfato, tais como um ácido peptidonucléico (PNA). Substituintes de nucleotídeos são moléculas que reconhecerão ácidos nucléicos de uma forma Watson-Crick ou Hoogsteen, mas os quais estão ligados juntos através de uma porção diferente de uma porção fosfato. Substituintes de nucleotídeos são capazes de conformar uma estrutura do tipo dupla hélice quando interagindo com o ácido nucléico alvo apropriado.

Substituintes de nucleotídeos são nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos que tiveram a porção fosfato e/ou as porções de açúcar substituídas. Substituintes de nucleotídeo não contêm um átomo de fósforo padrão. Substitutos para o fosfato podem ser, por exemplo, ligações internu-cleosídicas de cadeia alquila ou cicloalquila curtas, ligações internucleosídi-cas de alquila ou cicloalquila e heteroátomo misturados, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Essas incluem aquelas com ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção açúcar de um nucleosídeo); estruturas principais de siloxano; estruturas principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas principais de formacetila e tioformacetila; estruturas principais de metileno formacetila e tioformacetila; estruturas principais contendo alqueno, estruturas principais de sulfamato; estruturas principais de metilenimino e metilenidrazino; estruturas principais de sulfonato e de sulfonamida; estruturas principais de ami-da; e outras com partes de componentes N, O, S e CH2 misturadas. Várias Patentes U.S. descrevem como fazer e usar esses tipos de substituições fosfato e incluem, mas não estão limitadas, a 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. 44. É também entendido em um substituto de nucleotídeo que ambas as porções de açúcar e fosfato do nucleotídeo podem ser substituídas, por exemplo, por uma ligação do tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). As Patentes U.S. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262 ensinam como fazer e usar moléculas de PNA, cada uma das quais e aqui incorporada por referência. (Ver também Nielsen et al., Science, 1991,254,1497-1500). 45. Também é possível ligar outros tipos de moléculas (conjuga- dos) a nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos para aumentar, por exemplo, a absorção celular. Os conjugados podem ser quimicamente ligados ao nucleotídeo ou análogos de nucleotídeos. Tais conjugados incluem, mas não estão limitados, às porções de lipídeos tais como uma porção de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico {Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo por exemplo, hexila-S-tritiltiol {Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sei., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem.

Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de doecandiol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991,10,11111118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Bio-chimie, 1993, 75,49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, diexadecilrac-glicerol ou trietilamônio 1, 2-di-0-hexadecilrac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990,18, 3777-3783), uma cadeia de poliamina ou de polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) ou ácido adamantanoacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 36513654), uma porção de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), ou uma porção octadecilamina ou hexilaminocarboniloxico-lesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937. Várias Patentes U.S. ensinam o preparo de tais conjugados e incluem, mas não estão limitadas, as Patentes U.S. N2s 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; ' 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608,046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371 ; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.

Uma interação Watson-Crick é pelo menos uma interação com a face Watson-Crick de um nucleotídeo, análogo de nucleotídeo ou substituto nucleotídico. A face Watson-Crick de um nucleotídeo, análogo de nucleotídeo ou substituto nucleotídico inclui as posições C2, N1 e C6 de um nucleotídeo baseado em purina, análogo de nucleotídeo ou substituto nucleotídico e as posições C2, N3 e C4 de um nucleotídeo de base de pirimidina, análogo de nucleotídeo ou substituto nucleotídico.

Uma interação Hoogsteen é a interação que ocorre na face Ho-ogsteen de um nucleotídeo ou análogo de nucleotídeo, o qual é exposto no principal sulco do DNA dúplex. A face Hoogsteen inclui uma posição N7 e os grupos reativos (NH2 ou O) na posição C6 dos nucleotídeos de purina. bl Sequências Uma sequência particular estabelecida na SEQ ID NO: 1 é aqui usada, como um exemplo de um iniciador descrito. Uma seqüência particular estabelecida na SEQ ID NO: 2 é um exemplo de um iniciador descrito adicional. Uma seqüência particular estabelecida na SEQ ID NO: 3 é um exem-pio de uma sonda descrita. Iniciadores e/ou sondas podem ser designadas para serem específicas para as seqüências psaA, dada a informação aqui descrita. Existe uma variedade de seqüências relacionadas com, por exemplo, psaA, assim como qualquer outra proteína aqui descrita que é descrita no Genbank, e essas seqüências e outras são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades, assim como para subseqüências individuais contidas nesse ponto.

Uma variedade de seqüências é fornecida aqui e essas e outras podem ser encontradas no Genbank, em www.pubmed.aov. Os indivíduos versados na técnica entendem como resolver discrepâncias e diferenças de seqüência e para ajustar as composições e métodos relacionados com uma seqüência particular a outras seqüências relacionadas. Iniciadores e/ou sondas podem ser designadas para qualquer seqüência dada a informação aqui descrita e conhecida na técnica. c) Iniciadores e sondas São descritas composições incluindo iniciadores e sondas, as quais são capazes de interagir com o gene psaA aqui descrito. Em certas modalidades, os iniciadores são usados para suportar as reações de amplificação de DNA. Tipicamente, os iniciadores serão capazes de ser estendidos em uma forma específica da seqüência. A extensão de um iniciador em uma forma específica da seqüência inclui quaisquer métodos em que a seqüência e/ou composição da molécula de ácido nucléico à qual o iniciador é hibridi-zado ou, de outra forma, associado, direciona ou influencia a composição ou seqüência do produto produzido pela extensão do iniciador. A extensão do iniciador de uma forma específica da seqüência, conseqüentemente, inclui, mas não é limitada, ao PCR, ao seqüenciamento de DNA, à extensão do DNA, à polimerização do DNA, à transcrição do DNA ou à transcrição reversa. As técnicas e condições que amplificam o iniciador de uma forma específica da seqüência são preferidas. Em certas modalidades, os iniciadores são usados para as reações de amplificação do DNA, tais como PCR ou seqüenciamento direto. É entendido que em certas modalidades os iniciadores também podem ser estendidos usando técnicas não-enzimáticas, onde por exemplo, os nucleotídeos ou oligonucleotídeos usados para estender o iniciador são modificados de forma que eles não reajam quimicamente para estender o iniciador em uma forma específica de seqüência. Tipicamente, os iniciadores descritos hibridizam com o gene psaA ou com a região do gene psaA ou eles hibridizam com o complemento do gene psaA ou com o complemento de uma região do gene psaA. O tamanho dos iniciadores ou sondas para interação com o gene psaA em certas modalidades pode ser qualquer tamanho que suporte a manipulação enzimática desejada do iniciador, tal como amplificação de DNA ou a simples hibridização da sonda ou do iniciador. Um iniciador ou sonda de psaA típico poderia ter pelo menos 15,16,17,18,19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25,26,27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos de comprimento.

Em outras modalidades, o iniciador ou sonda de psaA pode ser menor do que ou igual a 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, ou 30 nucleotídeos de comprimento.

Em certas modalidades, os iniciadores e sondas são projetados de forma que eles estão fora dos iniciadores cujo ponto mais próximo de interação com o gene psaA está nos 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ou 27 nucleotídeos dos nucleotídeos definidores mais externos da SEQ ID NO: 3.

Por exemplo, em relação ao gene psaA estabelecido na SEQ ID NO: 4 (Número de Acesso GenBank U53509), certas modalidades dos iniciadores ou sondas poderiam ser projetadas de forma que elas ficassem fora dos iniciadores cujo ponto mais próximo de interação com o gene psaA ocorre nas posições 217 e 254, respectivamente, da SEQ ID NO: 4.

Os iniciadores do gene psaA tipicamente serão usados para produzir um produto de DNA amplificado que contém uma região do gene psaA entre a posição 166 e 280 de SEQ ID NO: 4. Em geral, tipicamente o tamanho do produto será tal que o tamanho pode ser exatamente determinado até em 3,2 ou 1 nucleotídeos.

Em certas modalidades, esse produto é pelo menos 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,101,102,103,104, 105,106, 107, 108, 109, 110.111 ,112,113, ou 114 nucleotídeos de comprimento.

Em outras modalidades, o produto tem menos do que ou é igual a 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100,101,102, 103, 104,105,106,107, 108.109.110.111 ,112,113, ou 114 nucleotídeos de comprimento.

Também é descrito um intciador de sentido que é um oligonucfe- otídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: 5'-TCATTAG ATCCTCCAATTT ATT AG G G C- 3' (SEQ ID NO: 5); ou uma se- qüência complementar a ela, em que o oligonucleotídeo é de 15 - 30 nucleo-tídeos consecutivos.

Também é descrito um iniciador anti-sentido que é um oligonu-cleotídeo, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 2, ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com 5'- CGGAAAAAAAGATACAACTTCTGGTC-31 (SEQ ID NO: 6); ou uma seqüência complementar a ela, em que o oligonucleotídeo é de 15 - 30 nucleotídeos consecutivos. É também descrita uma sonda não-degenerada que é um oligonucleotídeo, compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 3, ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com 5'- TTTCTTTCTGCAATCATTCTTGTAGCATGTGCTAG-3 (SEQ ID NO: 7); ou uma seqüência complementar a essa. É também descrita uma sonda não-degenerada que é um oligonucleotídeo, compreendendo 5'-X-CTAGCACATGC"T"ACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA-Y-3', em que X é um fluoróforo, em que Y é um grupo fosfato ou grupos fosfato, em que "T" é uma timina com um supressor escuro ou um corante aceptor ligado a ele.

Em algumas modalidades, o fluoróforo pode ser carboxifluores-ceína (HEX), Fam, Joe, 6-carbóxi-X-rodam ina (Rox), Vermelho Texas ou Cy 5.

Também, em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 grupos fosfato podem ser ligados à extremidade 3' da sonda.

Em algumas modalidades, o supressor escuro está ligado ao resíduo "T" da sonda e pode ser um supressor de orifício preto (BHQ1-dT), Dabcyl-dT (Glen Research) ou QSY7 (Molecular probes) através de uma aminoligação dT modificada. d) Ácidos nucléicos funcionais Ácidos nucléicos funcionais são moléculas de ácidos nucléicos que têm uma função específica, tal como a ligação a uma molécula alvo ou uma catálise de uma reação específica. Moléculas de ácido nucléico funcio- nais podem ser divididas nas seguintes categorias, as quais não são tencio-nadas para serem limitantes. Por exemplo, ácidos nucléicos funcionais incluem moléculas anti-sentido, aptâmeros, ribozimas, moléculas formadoras de triplex e sequências de guia externas. As moléculas de ácido nucléico funcionais podem agir como transmissores, inibidores, moduladores e esti-muladores de uma atividade específica possuída por uma molécula alvo, ou as moléculas de ácido nucléico funcionais possuem uma atividade de novo independentemente de quaisquer outras moléculas.

Moléculas de ácido nucléico funcionais podem interagir com qualquer macromolécula, tais como DNA, RNA, polipeptídeos ou cadeias de carboidratos. Dessa forma, ácidos nucléicos funcionais podem interagir com o mRNA de psaA (por exemplo, mRNA codificado pela SEQ ID NO: 4) ou o DNA genômico da psaA (por exemplo, SEQ ID NO: 4) ou eles podem interagir com o polipeptídeo psaA codificado pela SEQ ID NO: 4. Geralmente, ácidos nucléicos funcionais são projetados para interagir com outros ácidos nucléicos baseando-se na homologia de seqüência entre a molécula alvo e a molécula de ácido nucléico funcional. Em outras situações, o reconhecimento específico entre a molécula de ácido nucléico funcional e a molécula alvo não é baseado na homologia de seqüência entre a molécula de ácido nucléi-co funcional e a molécula alvo, mas ao contrário, é baseado na formação da estrutura terciária que permite que ocorra o reconhecimento específico.

Moléculas anti-sentido são projetadas para interagir com uma molécula de ácido nucléico alvo através ou do pareamento de bases canônico ou não-canônico. A interação da molécula de anti-sentido e da molécula alvo é projetado para promover a destruição da molécula alvo através, por exemplo, da degradação do híbrido RNA-DNA mediada pela RNAseH. Alternativamente, a molécula anti-sentido é projetada para interromper uma função de processamento que normalmente poderia ocorrer na molécula alvo, tal como transcrição ou replicação. Moléculas anti-sentido podem ser projetadas baseando-se na seqüência da molécula alvo. Vários métodos para a otimização da eficiência anti-sentido pela descoberta das regiões mais acessíveis da molécula alvo existem. Métodos exemplares poderiam ser os expe- rimentos de seleção in vitro e estudos de modificação de DNA usando DMS e DEPC. É preferível que as moléculas anti-sentido se liguem à molécula alvo com uma constante de dissociação (kd) menor do que ou igual a 10'6, 10'8, 10‘1° ou 10'12. Uma amostra representativa dos métodos e técnicas os quais auxiliam no projeto e uso de moléculas anti-sentido pode ser encontrada na seguinte lista não-limitativa de Patentes U.S.:. 5.135.917, 5.294.533, 5.627.158, 5.641.754, 5.691.317, 5.780.607, 5.786.138, 5.849.903, 5.856.103, 5.919.772, 5.955.590, 5.990.088, 5.994.320, 5.998.602, 6.005.095, 6.007.995, 6.013.522, 6.017.898, 6.018.042, 6.025.198, 6.033.910, 6.040.296, 6.046.004, 6.046.319 e 6.057.437.

Aptâmeros são moléculas que interagem com uma molécula alvo, preferivelmente de uma forma específica. Aptâmeros típicos são pequenos ácidos nucléicos variando de 15 - 50 bases em comprimento que se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como semicirculares ("stem-loop") e quartetos em G. Aptâmeros podem se ligar a pequenas moléculas, tais como ao ATP (Patente U.S. 5.631.146) e teofilina (Patente U.S. 5.580.737), assim como a grandes moléculas, tais como à transcriptase reversa (Patente U.S. 5.786.462) e trombina (Patente U.S. 5.543.293). Aptâmeros podem se ligar muito firmemente com KdS da molécula alvo de menos de 10‘12 M. É preferível que os aptâmeros se liguem à molécula alvo com um kd menor do que 10'6,10'8,10'1° ou 10'12. Aptâmeros podem se ligar à molécula alvo com um grau muito alto de especificidade. Por exemplo, ap-tâmeros têm sido isolados que têm uma diferença maior do que 10.000 vezes nas afinidades de ligação entre a molécula alvo e outra molécula que difere somente em uma posição na molécula (Patente U.S. 5.543.293). É preferível que o aptâmero tenha um kd com a molécula alvo de pelo menos 10,100,1.000,10.000 ou 100.000 vezes mais baixo do que o kd com a molécula de ligação de segundo plano. É preferível ao fazer a comparação para um polipeptídeo, por exemplo, que a molécula antecedente seja um polipep-tídeo diferente. Por exemplo, ao determinar a especificidade dos aptâmeros de psaA, a proteína de segundo plano podería ser GADPH. Exemplos representativos de como fazer e usar aptâmeros para se ligarem a uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados na seguinte lista não-limitativa de Patentes U.S.: 5.476.766, 5.503.978, 5.631.146, 5.731.424, 5.780.228, 5.792.613, 5.795.721, 5.846.713, 5.858.660, 5.861.254, 5.864.026, 5.869.641, 5.958.691, 6.001.988, 6.011.020, 6.013.443, 6.020.130, 6.028.186, 6.030.776 e 6.051.698.

Ribozimas são moléculas de ácido nucléico que são capazes de catalisar uma reação química, seja intramolecular ou intermolecularmente. Ribozimas são, conseqüentemente, ácido nucléico catalítico. É preferível que as ribozimas catalisem reações intermoleculares. Existe uma variedade de diferentes tipos de ribozimas que catalisam reações do tipo polimerase de ácido nucléico ou nuclease, as quais são baseadas em ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como ribozimas cabeça-de-marteío (por exemplo, mas sem se limitar, às Patentes Ü.S.: 5.334.711, 5.436.330, 5.616.466, 5.633.133, 5.646.020, 5.652.094, 5.712.384, 5.770.715, 5.856.463, 5.861.288, 5.891.683, 5.891.684, 5.985.621, 5.989.908, 5.998.193, 5.998.203, WO 9858058 por Ludwig e Sproat. WO 9858057 por Ludwig e Sproat e WO 9718312 por Ludwig e Sproat), ribozimas grampo (por exemplo, mas sem se limitar, às seguintes Patentes U.S.: 5.631.115, 5.646.031, 5.683.902, 5.712.384, 5.856.188, 5.866.701, 5.869.339 e 6.022.962), e ribozimas tetraimena (por exemplo, mas sem se limitar, às seguintes Patentes U.S.: 5.595.873 e 5.652.107). Também existe uma variedade de ribozimas que não são encontradas em sistemas naturais, mas as quais foram projetadas para catalisar reações específicas de novo (por exemplo, mas sem se limitar, às seguintes Patentes U.S.: 5.580.967, 5.688.670, 5.807.718 e 5.910.408). Ribozimas preferidas clivam substratos de RNA ou DNA, e mais preferivelmente clivam substratos de RNA. Ribozimas tipicamente clivam substratos de ácido nucléico através do reconhecimento e ligação do substrato alvo com subseqüente divagem. Esse reconhecimento é geralmente baseado na sua maior parte nas interações de pares de base canônicos ou não-canônicos. Essa propriedade torna as ribozimas particularmente boas candidatas para a divagem específica alvejada de ácidos nucléicos porque o reconhecimento do substrato alvo é baseado na sequência de substratos alvo. Exemplos representativos de como fazer e usar ribozimas para catalisar uma variedade de diferentes reações podem ser encontrados na seguinte lista não-limitante de patentes U.S.: 5.646.042, 5.693.535, 5.731.295, 5.811.300, 5.837.855, 5.869.253, 5.877.021, 5.877.022, 5.972.699, 5.972.704, 5.989.906 e 6.017.756.

Moléculas de ácido nucléico funcionais formadoras de triplex são moléculas que podem interagir com ácidos nucléicos ou de filamento duplo ou de filamento único. Quando moléculas triplex interagem com uma região alvo, uma estrutura chamada triplex é formada, na qual há três filamentos de DNA formando um complexo dependente tanto em um emparelhamento Watson-Crick quanto em um Hoogsteen. Moléculas triplex são preferidas porque elas podem se ligar às regiões alvo com grande afinidade e especificidade. É preferível, que as moléculas formadoras de triplex se liguem à molécula alvo com um kd menor do que 10'6, 10'8, 10'10 ou 10'12. Exemplos representativos de como fazer e usar moléculas formadoras de triplex para se ligar a uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados na seguinte lista não-limitante de patentes U.S.: 5.176.996, 5.645.985, 5.650.316, 5.683.874, 5.693.773, 5.834.185, 5.869.246, 5.874.566 e 5.962.426.

Sequências guia externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula de ácido nucléico alvo formando um complexo, e esse complexo é reconhecido pela RNase P, a qual cliva a molécula alvo. EGSs podem ser projetados para alvejar especificamente uma molécula de RN A de escolha. RNAse P ajuda no processamento de RNA transportador (RNAt) em uma célula. RNAse P bacteriano pode ser recrutado para clivar virtualmente qualquer seqüência de RNA pelo uso de uma EGS que faça com que o complexo RNA:EGS alvo mimetize o substrato RNAt natural. (WO 92/03566 por Yale, e Forster e Altman, Science 238:407-409 (1990)).

Semelhantemente, a divagem direcionada a EGS/RNAse P eu-cariótica do RNA pode ser utilizada para clivar alvos desejados em células eucarióticas. (Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 8006-8010 (1992); WO 93/22434 por Yale; WO 95/24489 por Yale; Yuan e Altman, EMBO J 14: 159-168 (1995), e Carrara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 92: 2627-2631 (1995)). Exemplos representativos de como fazer e usar moléculas EGS para facilitar a divagem de uma variedade de moléculas alvo diferentes são encontrados na seguinte lista não-limitante de Patentes U.S.: 5.168.053, 5.624.824, 5.683.873, 5.728.521 , 5.869.248 e 5.877.162. 4. Peotídeos al Variantes de proteína Conforme discutido aqui, existem diferentes sorotipos de Streptococcus pneumonia que contêm variantes da proteína PsaA que são conhecidos e aqui incorporados. Os métodos aqui descritos têm a vantagem de detectar todos os sorotipos de Streptococcus pneumonia. 5. Pastilhas e microarranios São descritas pastilhas onde pelo menos um endereço é as sequências de parte das sequências estabelecidas em qualquer uma das se-qüências de ácidos nucléicos aqui descritas. Também descritas são pastilhas onde pelo menos um endereço é as sequências ou porção de sequências estabelecidas em qualquer uma das seqüências de peptídeos aqui descritas. São também descritas pastilhas onde pelo menos um endereço é uma variante das seqüências ou parte das seqüências estabelecidas em qualquer uma das seqüências de ácido nucléico aqui descritas. São também descritas pastilhas onde pelo menos um endereço é uma variante das seqüências ou porção de seqüências estabelecida em qualquer uma das seqüências peptídicas aqui descritas. 6. Meios legíveis oor computador É entendido que os ácidos nucléicos e proteínas descritos podem ser representados como uma seqüência consistindo nos nucleotídeos de aminoácidos. Existe uma variedade de formas para apresentar essas seqüências, por exemplo, o nucleotídeo guanosina pode ser representado por G ou g. Da mesma forma, o aminoácido valina pode ser representado por Vai ou V. Os indivíduos versados na técnica entendem como mostrar e expressar qualquer ácido nucléico ou seqüência de proteína em qualquer uma de uma variedade de formas que existem, cada uma das quais é considerada aqui descrita. Especificamente aqui contemplado é a apresentação dessas seqüências em meios legíveis por computador, tais como, disquetes, fitas, pastilhas, discos rígidos, discos compactos e vídeo discos comercialmente disponíveis, ou outros meios legíveis por computador. Também descritos são as representações de código binário das seqüências descritas. Os indivíduos versados na técnica entendem quais meios legíveis por computador. Conseqüentemente, meios legíveis por computador nos quais as seqüências de ácidos nucléicos ou proteínas são registrados, armazenados ou salvos. São descritos meios legíveis por computador, compreendendo as seqüências e informação considerando as seqüências aqui estabelecidas. São também descritos meios legíveis por computador, compreendendo as seqüências e informação considerando as seqüências estabelecidas aqui. 7. Kits São aqui descritos kits que são delineados para reagentes que podem ser usados na prática dos métodos aqui descritos. Os kits podem incluir qualquer reagente ou combinação de reagentes aqui discutidos ou que poderíam ser entendidos como sendo necessários ou benéficos na prática dos métodos descritos. Por exemplo, os kits poderiam incluir iniciadores para efetuar as reações de amplificação discutidas em certas modalidades dos métodos, assim como os tampões e enzimas necessárias para usar os iniciadores conforme tencionado. Por exemplo, é descrito um kit compreendendo reagentes para a reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus pneumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciadores anti-sentido e uma sonda não-degenerada. Por exemplo, o kit pode detectar o gene psaA do Streptococcus pneumoniae. É também descrito um kit compreendendo reagentes para reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus pneumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciadores anti-sentido e uma sonda não-degenerável, em que o iniciador de sentido é um oligonu-cleotídeo compreendendo a SEQID NO: 1 ou uma sequência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 5 ou uma sequência complementar a ela, em que o oligonucleo-tídeo é de 15 - 30 nucleotídeos consecutivos e, em que o iniciador anti-sentido é um oligonucleotídeo, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 6, ou uma sequência complementar a ela, em que o oligonucleotídeo é de 15 - 30 nucleotídeos e em que a sonda não-degenerada é um oligonucle-otídeo, compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 3 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7; ou uma seqüência complementar a ela. Os kits descritos podem incluir qualquer uma das sondas conforme aqui definidas, por exemplo, uma sonda com um fluo-róforo ligado à extremidade 5' da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato é ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda.

Também descrito é um kit compreendendo reagentes para a reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus pneumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciadores anti-sentido e uma sonda não-degenerada em que o iniciador de sentido é um oligonucleotídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, como a SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência complementar a ela, em que o oligonucleotídeo é de 15 - 30 nucleotídeos consecutivos. É Também descrito um kit compreendendo reagentes para a reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus pneumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciadores anti-sentido e uma sonda não-degenerada em que o iniciador anti-sentido é um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 6; ou com uma seqüência complementar a ela.

Também é descrito um kit compreendendo reagentes para a reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus prteumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciadores anti-sentido e uma sonda não-degenerada em que a sonda não-degenerada é um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7; ou com uma seqüência complementar a ela. Os kits descritos podem incluir qualquer uma das sondas conforme aqui definidas, por exemplo, uma sonda com um fluoróforo ligado à extremidade 5' da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato é ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda. 8. Composições com funções similares É entendido que as composições aqui descritas têm certas funções, tais como a iniciação da síntese de DNA ou a ligação à psaA. São aqui descritos certos requerimentos estruturais para efetuar as funções descritas, e é entendido que existe uma variedade de estruturas as quais podem efetuar a mesma função as quais estão relacionadas com as estruturas descritas, e que essas estruturas irão enfim alcançar o mesmo resultado, por exemplo, a iniciação da síntese de DNA ou a ligação à psaA. C. Métodos para fazer as composições As composições aqui descritas e as composições necessárias para efetuar os métodos descritos podem ser feitas usando qualquer método conhecido pelos indivíduos versados na técnica para aquele reagente ou composto particular, a não ser que seja especificamente notado. 1. Síntese de ácido nucléico Por exemplo, os ácidos nucléicos, tais como os oligonucleotí-deos a serem usados como iniciadores, podem ser feitos usando métodos de síntese química padrão ou podem ser produzidos usando métodos enzi-máticos ou qualquer outro método conhecido. Tais métodos podem variar de digestão enzimática seguida por isolamento de fragmento de nucleotídeo (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 23 edição (Cotd Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Capítulos 5, 6) até métodos puramente sintéticos, por exemplo, pelo método de cianoetilfosforamidita, usando um sintetizador de DNA Milligen ou Beckman System 1 Plus (por exemplo, sintetizador automático Modelo 8700 da Milligen-Biosearch, Burlington, MA ou ABI Modelo 380B). Métodos sintéticos úteis para fazer oligonucleotídeos também são descritos por Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster e fosfito-triéster), e Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (método fosfotriéster). Moléculas de ácido nucléico de proteína podem ser feitas usando métodos conhecidos tais como aqueles descritos por Nielsen et al., Bioconjug, Chem. 5:3-7 (1994). 2. Processo oara fazer as composições São descritos processos para fazer as composições assim como para fazer os intermediários que levam às composições. Por exemplo, são descritos ácidos nucléicos nas SEQ ID Nos: 1,2 e 3.

Existe uma variedade de métodos que pode ser usada para fazer essas composições, tais como métodos químicos sintéticos e métodos de biologia molecular padrão. É entendido que os métodos para fazer essas e outras composições descritas são especificamente descritos. São também descritas moléculas de ácido nucléico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de uma forma operativa a uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência com pelo menos 80% de identidade a uma seqüência estabelecida nas SEQ ID Nos: 1,2 e 3, e uma seqüência controlando a expressão do ácido nucléico. São também descritas moléculas de ácido nucléico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de uma forma operativa a uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID NO: 3 a um fluoróforo na extremidade 5’. São também descritas moléculas de ácido nucléico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de uma forma operativa a uma molécula de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID NO: 3 a porções fosfato na extremidade 3'. São também descritas moléculas de ácido nucléico produzidas pelo processo compreendendo a ligação de uma forma operativa a uma mo-lécuia de ácido nucléico compreendendo a SEQ ID NO: 3 {CTAGCA-CATGC"T"ACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA) a um supressor escuro no resíduo "T" interno da SEQ ID NO: 3. A molécula supressora escura pode ser ligada à sonda por uma ligação aminoácido, entretanto qualquer método padrão de ligação de um supressor escuro a um resíduo "T" interno pode ser usado nesse método. D. Métodos de uso das composições 1. Métodos de uso das composições como ferramentas de pesquisa As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, podem ser usadas de uma variedade de formas. Por exemplo, as composições descritas, tais como as SEQ ID Nos: 1, 2 e 3, seja sozinhas ou em combinação, podem ser usadas para detectar a presença do gene psaA.

As composições, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para detectar sorotipos de Streptococcus pneumoniae, por exemplo, infecções por Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para diferenciar entre espécies de Streptococcus pneumoniae verdadeiras e espécies de estreptococos viridan semelhantes aos pneumococos.

Espécies de estreptococos viridan semelhantes aos pneumococos incluem: S. pseudopneumoniae, S. mitis, S. oralis, S. sanguinis,S. para-sanguinis, S. peroris, S. infantis, S. gordonii, S. cristatus, S. saiivarius, S. vestibularis, S. australis, S. sinensis, S. oligofermentans, S. intestinalis); e outros organismos respiratórios superiores, tais como S. pyogenes, S. aga-iactiae, Staphylococcus aureus, Dolosigranulum pigrum, Enterococcus fae-calis e Escherichia coli.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas em qualquer método conhecido para isolar ou identificar polimorfismos de nucleotídeo individuais. As composições também podem ser usadas de qualquer forma conhecida ou usando as modalidades legíveis por computador das composições descritas, por exemplo, para estudar a relação ou para efetuar análise de modelagem molecular relacionada com as composições descritas.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas como composições para executar uma reação em cadeia da polimerase (PCR).

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas como composições para executar uma reação de PCR em tempo real.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para detectar diferencialmente a presença de Streptococcus pneumoniae verdadeiro de espécies de estreptococos viridan semelhantes aos pneumococos. a) Reação em cadeia da polimerase (PCR^ A tecnologia do PCR permite a amplificação e a subsequente detecção de quantidades mínimas de ácido nucléico alvo. Detalhes do PCR são bem descritos na técnica, incluindo, por exemplo, as Patentes U.S. Nas 4.683.195 para Mullis eia/., 4.683.202 para Mullis e 4.965.188 para Muliis et al. Geralmente, iniciadores de oligonucleotídeos são anelados com os filamentos desnaturados de um ácido nucléico alvo, e produtos de extensão de iniciador são formados pela polimerização dos desoxinucleosídeo trifosfatos por uma polimerase. Um método de PCR típico envolve os ciclos repetitivos da desnaturação do moide de ácido nucléico, o anelamento do iniciador e a extensão dos iniciadores anelados pela ação de uma polimerase termoestá-vel. O processo resulta na amplificação exponencial do ácido nucléico alvo, e dessa forma permite a detecção de alvos existentes em concentrações muito baixas em uma amostra. O PCR é amplamente usado em uma variedade de aplicações, incluindo pesquisa biotecnológica, diagnósticos clínicos e forenses. b^ PCR em tempo real Na implementação da presente invenção, pode ser feita opcionalmente referência a uma revisão geral de técnicas de PCR e à nota expia- natória intitulada "Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection" publicada por Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) e aos Protocolos de PCR (Academic Press Nova Iorque, 1989). PCR em tempo real monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção de amplícon durante cada ciclo de PCR (isto é, em tempo real) ao contrário da detecção do ponto final (por exemplo, ver Figura 1; Higuchi, 1992; Higuchi, 1993). O progresso em tempo real da reação pode ser visto em alguns sistemas. O sistema de PCR em tempo real é baseado na detecção de um repórter fluorescente (Lee, 1993; Livak, 1995). Esse sinal aumenta em proporção direta com a quantidade de produto de PCR em uma reação. Pelo registro da quantidade de emissão de fluorescência em cada ciclo, é possível monitorar a reação de PCR durante a fase exponencial onde o primeiro aumento significativo na quantidade de produto de PCR é correlacionada com a quantidade inicial do molde alvo. Quanto mais elevada a quantidade de cópias de início do alvo do ácido nucléico, mais rápido é observado um aumento significativo na fluorescência.

Um limiar de fluorescência fixo é ajustado significativamente acima da linha de base que pode ser alterada pelo operador. O parâmetro Ct (ciclo limiar) é definido como o número do ciclo no qual a emissão de fluorescência excede o limiar fixado.

Existem três principais sistemas de monitoramento de flúores-cência para a amplificação do DNA (Wittwer, 1997 (a)): (1) sondas de hidró-lise; (2) sondas hibridizantes (ver Hvbridisation Probe Chemistrv. aqui incorporada por referência quanto ao seus ensinamentos de sistemas de monitoramento de fluorescência); e (3) agentes de ligação ao DNA (Wittwer, 1997; van der Velden, aqui incorporada quanto ao seus ensinamentos de agentes de ligação de DNA). Sondas de hidrólise incluem sondas TaqMan® (Heid et al, aqui incorporada por referência quanto aos seus ensinamentos de sondas de hidrólise), sinais moleculares (Mhlanga, 2001 ; Vet, 2002; Abravaya, 2003; Tan, 2004; Vet & Marras, 2005, aqui incorporado por referência quanto aos seus ensinamentos de sinais moleculares) e escorpiões (Saha, 2001;

Solinas, 2001; Terry, 2002, aqui incorporado por referência para os seus ensinamentos de escorpiões). Eles usam a atividade da exonuclease 5' fluoro-gênica da Taq polimerase para medir a quantidade de seqüências alvo em amostras de DNAc (ver também Svanvik, 2000, aqui incorporado por referência pelos seus ensinamentos de sondas luminosas).

Sondas TaqMan® são oligonucleotídeos mais longos do que os iniciadores (20 - 30 bases de comprimento com um valor de Tm de 10 °C mais elevado) que contêm um corante fluorescente geralmente na base 5', e um corante supressor tipicamente na base 3'. Quando irradiado, o corante fluorescente excitado transfere energia para a molécula corante supressora vizinha (isto é chamado de FRET - Fõrster ou fluorescência de transferência de energia de ressonância) (Hiyoshi, 1994; Chen, 1997). Conseqüentemen-te, a íntima proximidade do repórter e do supressor previne a detecção de qualquer fluorescência, enquanto a sonda está intacta. Sondas TaqMan® são designadas para anelar a uma região interna de um produto de PCR. Quando a polimerase replica um molde no qual uma sonda TaqMan® está ligada, sua atividade da exonuclease 5' cliva a sonda (Holland, 1991). Isso finaliza a atividade do supressor (sem FRET) e o corante repórter começa a emitir fluorescência, a qual aumenta em cada ciclo proporcionalmente à taxa de divagem da sonda. O acúmulo de produtos de PCR é detectado pelo monitoramento do aumento na fluorescência do corante repórter (notar que os iniciadores não são marcados). O ensaio TaqMan® usa os parâmetros de ciclização térmicos universais e as condições de reação de PCR. Devido ao fato da divagem ocorrer somente se a sonda hibridizar para o alvo, a origem da fluorescência detectada é a amplificação específica. O processo de hibri-dização e divagem não interfere com o acúmulo exponencial do produto. Um requerimento específico para as sondas fluorogênicas é que não existe G na extremidade 5'. Um "G" adjacente ao corante repórter pode suprimir a fluorescência repórter mesmo após a divagem.

Sinais moleculares também contêm corantes fluorescentes (FAM, TAMRA, TET, ROX) e supressores (tipicamente DABCYL) em qualquer extremidade, mas eles são projetados para adotar uma estrutura em grampo enquanto livres em solução para trazer o corante fluorescente e o supressor em íntima proximidade para ocorrer o FRET. Eles têm dois braços com sequências complementares que formam um híbrido ou haste muito estável. A íntima proximidade do repórter e do supressor na sua configuração de grampo suprime a fluorescência do repórter, quando o sinal hibridiza para o alvo durante o passo de anelação, o corante repórter é separado do supressor e o repórter fluoresce (o FRET não ocorre). Sinais moleculares permanecem intactos durante o PCR e devem se religar ao alvo a cada ciclo para emissão de fluorescência. Isso irá ser correlacionado com a quantidade de produto de PCR disponível. Todas as químicas de PCR em tempo real permitem a detecção de múltiplas espécies de DNA (multiplexação) pelo projeto de cada sonda/sinal com um par de flúor/supressor espectral mente único, contanto que a plataforma seja adequada para a análise de curva de fusão. Por multiplexação, o(s) alvo{s) e controle endógeno pode ser amplificado em um único tubo. Para exemplos, ver Bernard, 1998; Vet, 1999; Lee, 1999; Donohoe, 2000; Read, 2001; Grace, 2003; Vrettou, 2004; Rickert, 2004.

Com sondas de escorpião, a iniciação seqüência específica e a detecção de produto de PCR é alcançada usando um único oligonucleotí-deo. A sonda de escorpião mantém uma configuração semicircular no estado não-hibridizado. O fluoróforo é ligado à extremidade 5' e é suprimido por uma porção acoplada à extremidade 3'. A porção 3' do tronco também contém seqüência que é complementar ao produto de extensão do iniciador. Essa seqüência está ligada à extremidade 5' de um iniciador específico através de um monômero não-amplificável. Depois da extensão do iniciador do escorpião, a seqüência da sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento no amplicon estendido, abrindo dessa forma o laço do grampo. Isso previne que a fluorescência seja suprimida e um sinal seja observado.

Outra alternativa é a química do corante de ligação de DNA de dupla fita, a qual quantifica a produção de amplicon (incluindo a amplificação não-específica e o complexo iniciador-dímero) pelo uso de um agente inter-calante fluorescente que não é específico para seqüência (SYBR-verde I ou brometo de etídio). Ele não se liga ao DNAss. SYBR verde é um corante de ligação de sulco menor fluorogênico que exibe pouca fluorescência quando em solução, porém emite um forte sinal de fluorescência na ligação ao DNA de dupla fita (Morrison, 1998). Desvantagens do PCR em tempo real baseado em SYBR-verde inclui o requerimento pela otimização extensiva. Além disso, amplificações não-específicas requerem ensaios de acompanhamento {curva de ponto de fusão ou análise de dissociação) para identificação do amplicon (Ririe, 1997). O método foi usado na genotipagem de HFE-C282Y (Donohoe, 2000). CSUfco problema controlável é que amplicons mais longos criam um sina^-jriais forte (se combinado com outros fatores, isso pode causar a saturação da câmera CCD, ver abaixo). Normalmente, o SYBR verde é usado em reações de único plexo, entretanto quando acoplado com análise de ponto de fusão, ele pode ser usado para reações multiplexo (Siraj, 2002). O ciclo limiar ou o valor Cr é o ciclo no qual um aumento significativo em ARn é primeiramente detectado (para definição de ARn, ver abai- «L. xo). O ciclo limiar é quando o sistema começa a detectar o aumento no sinal associado com um crescirttento exponencial de produto de PCR durante a fase log linear. Essa fase proporciona a informação mais útila acerca da reação (certamente mais importante do que o ponto final). A inclinação da fase log linear é um reflexo da eficiência de amplificação. A eficiência (Eff) da reação pode ser calculada pela fórmula: Eff - io(-1Anc,inaç*# -1. A eficiência do PCR deve ser de 90 -110% (-3,6 > inclinação > -3,1). Um número de variáveis pode afetar a eficiência do PCR. Esses fatores incluem a extensão do amplicon, a estrutura secundária e a qualidade do iniciador. Embora dados válidos possam ser obtidos que caiam fora da faixa de eficiência, o PCR em tempo real deve ser ainda otimizado ou amplicons alternativos devem ser projetados. Para a inclinação ser um indicador da amplificação real (ao invés do desvio de sinal), tem que haver um ponto de inflexão. Esse é o ponto na curva de crescimento quando a fase log linear começa. Ele também representa a maior taxa de alteração ao longo da curva de crescimento. (Desvio de sinal é caracterizado pelo aumento ou redução gradual na fluorescência sem a amplificação do produto). O parâmetro importante para a quantifica- ção é o Cj. Quanto mais alto for a quantidade inicial de DNA genômico, mais antecipadamente o produto acumulado é detectado no processo de PCR, e mais baixo é o valor Cj. O limiar deve ser colocado acima de qualquer atividade de linha de base e na fase de aumento exponencial (a qual aparenta ser linear na transformação log). Alguns programas de computador permitem a determinação do ciclo limiar (Ct) por uma análise matemática da curva de crescimento. Isso proporciona uma melhor reprodutibilidade corrida-a-corrida. Além de ser usado para quantificação, o valor CT pode ser usado para análise qualitativa como uma medida de passagem/falha.

Err^lguns aspectos do método de PCR em tempo real descrito, ensaios multiplexo TaqMan® podem ser efetuados com instrumentos ABI usando corantes múltiplos com comprimentos de emissão distintos. Corantes disponíveis para esse propósito são FAM, TET, VIC e JOE (o mais oneroso). TAMRA é reservado, uma vez que o supressor na sonda e ROX como a referência passiva. Para melhores resultados, a combinação de FAM (alvo) e VIC (controle endógeno) é recomendada (eles têm a maior diferença na emissão máxima), enquanto que JOE e VIC não devem ser combinados. É importante que se a camada de corante não tiver sido escolhida corretamente, a máquina ainda lerá os outros espectros de corante. Por exemplo, tanto VIC quanto FAM emitem fluorescência em faixas similares entre si e quanto fazendo um único corante, as cavidades devem ser marcados corretamente. No caso da multiplexação, a compensação espectral para a análise posterior à corrida deve ser acionada (em ABI 7700: Instrumen-to/Diagnósticos/Opções Avançadas/Miscelânea). A ativação da compensação espectral aumenta a resolução espectral do corante.

Além disso, a reação de PCR em tempo real pode ser executada em uma ampla variedade de plataformas incluindo, mas sem se limitar, ao ABI 700 (ABI), ao LightCycler (Roche Diagnostis), iCycler (RioRad), Sistema de Detecção de Fluorescência Contínua DNA Engine Opticon (MJ Resear-ch), MX400 (Stratagene), sistema de Detecção Quantitativa Chimaera (Thermo Hybaid), Rotor-Gene 3000 (Corbett Research), Smartcycler (Ce-pheid) ou o formato MX3000P (Stratagene). É descrito um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nu-cleotídeos de Streptococcus pneumoniae usando iniciadores de sentido e iniciadores anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos a partir de oligonucleotídeos que hibridizam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae; e a detecção do referido produto de amplificação, por meio do qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada. É também descrito um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real usando: um iniciador consistindo na SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência complementar a ela, e um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência complementar a ela, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso: de uma sonda consistindo na SEQ ID NO: 3 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 7, ou uma seqüência complementar a ela, que hibridiza, sob condições adequadas para a reação em cadeia de polimerase por meio da qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada. É também descrito um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real, usando: um iniciador consistindo da SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polime-rase, com a SEQ ID NO: 5; ou uma sequência complementar a ela, e um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência complementar a ela, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso: de uma sonda consistindo da SEQ ID NO: 3 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7; ou uma seqüência complementar a ela, em que um fluoróforo é ligado à extremidade 5' da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato é ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, por meio da qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada. ct Quantificação de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também pode ser usado um método para a quantificação de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real usando iniciadores de sentido e iniciadores anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos a partir de oligonucleotídeos que hibridizam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso de uma sonda não-degenerada compreendendo um oligonucleotídeo que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae] e a quantificação do referido produto de amplificação na referida amostra biológica pela medição de um sinal de detecção a partir da referida sonda e pela comparação do referido sinal de detecção com um sinal de detecção de uma segunda sonda a partir do padrão de quantificação, em que o referido padrão de quantificação compreende uma sonda de sentido e um padrão de ácido nucléico.

Para todos os métodos aqui descritos, uma amostra biológica pode ser a partir de qualquer organismo e pode ser, mas não está limitada, ao soro, sangue periférico, amostras de medula óssea, seções de tecidos embebidos, seções de tecidos congelados, preparações de células, preparações citológicas, amostras de esfoliado (por exemplo, esputo), aspirações de agulha finas, células de âmnio, tecido fresco, tecido seco e células ou tecido cultivado. Tais amostras podem ser obtidas diretamente a partir de um indivíduo, comercialmente obtidas ou obtidas através de outros meios. Conse-qüentemente, a invenção aqui descrita pode ser utilizada para analisar uma amostra de ácido nucléico que compreende DNA genômico, DNA amplificado (tal como um produto de PCR), DNAc, RNAc, um fragmento de restrição ou qualquer outra amostra de ácido nucléico desejada. Quando uma pessoa efetua um dos métodos aqui descritos em DNA genômico, tipicamente o DNA genômico será tratado de uma forma a reduzir a viscosidade do DNA e permitir um melhor contato de um iniciador ou sonda com uma região alvo do DNA genômico. Tal redução na viscosidade pode ser alcançada por quaisquer métodos desejados, os quais são conhecidos pelo artífice habilitado, tal como tratamento da DNAse ou corte do DNA genômico, preferivelmente levemente. 2. Métodos de uso das composições como ferramentas de diagnóstico As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas ferramentas de diagnóstico relacionadas com doenças, tal como a doença pneumocócica. Por exemplo, as composições descritas, tais como as SEQ ID NOs: 1,2 e 3, podem ser usadas para diagnosticar Pneumococccal pneumoniae, pela detecção da presença do gene psaA.

As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma sequência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae usando iniciadores de sentido e iniciadores anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos dentre oligonucleotídeos que hibridizam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma sequência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae; e a detecção do referido produto de amplificação, por meio do qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada, em que a detecção do ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae diagnostica a infecção por Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma sequência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real usando: um iniciador consistindo da SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência complementar a ela, e um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência complementar a ela, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso: de uma sonda consistindo da SEQ ID NO: 3 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7; ou uma seqüência complementar a ela, em que um fluoróforo está ligado à extremidade 5' da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato está ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, por meio da qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada, em que a detecção de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae di- agnóstica a infecção por Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas também podem usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae usando iniciador de sentido e iniciador anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos a partir de oligonucleotídeos que hibridi-zam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae-, e a detecção do referido produto de amplificação, por meio do qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada, em que o iniciador de sentido consiste na SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência complementar a ela, em que a detecção de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae diagnostica a infecção pòr Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas também podem ser usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real usando: iniciadores de sentido e iniciadores anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos a partir de oligonucleotídeos que hibridizam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae1, e a detecção do referido produto de amplificação, por meio do que a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada, em que o iniciador anti-sentido consiste na SEQ ID NO: 2 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência complementar a ela, em que a detecção de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae diagnostica a infecção por Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas também podem ser usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica usando PCR em tempo real, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma sequência de nu-cleotídeos de Streptococcus pneumoniae usando iniciadores de sentido e iniciadores anti-sentido, em que os referidos iniciadores são escolhidos a partir de oligonucleotídeos que hibridizam, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com uma seqüência do gene psaA de Streptococcus pneumoniae’, e a detecção do referido produto de amplificação, por meio do que a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada, em que a sonda não-degenerada consiste em SEQ ID NO: 3 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para a reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7 ou com uma-seqüência complementar a ela, em que um fluoróforo é ligado à extremidade 5’ da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato é ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda, em que a detecção de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae diagnostica a infecção por Streptococcus pneumoniae.

As composições descritas também podem ser usadas em um método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, compreendendo: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real usando: um iniciador consistindo da SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência complementar a ela, e um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com: SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência complementar a ela, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso: de uma sonda consistindo da SEQ ID NO: 3 ou de uma seqüência que hibridize, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, com a SEQ ID NO: 7; ou uma seqüência complementar a ela, em que um fluoróforo está ligado à extremidade 5' da sonda, em que pelo menos um grupo fosfato está ligado à extremidade 3' da sonda, e em que um supressor escuro é ligado ao resíduo "T" da sonda, que hibridiza, sob condições adequadas para uma reação em cadeia da polimerase, por meio da qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para diagnosticar Pneumococcal pneumoniae, pela detecção da presença do gene psaA em espécies de Streptococcus pneumoniae verdadeiras. Espécies de Streptococcus pneumoniae verdadeiras são descritas em outros lugares aqui.

As composições descritas, seja sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para diagnosticar Pneumococcal pneumoniae, pela detecção da presença do gene psaA em espécies de Streptococcus pneumoniae em diferentes sorotipos.

As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, também podem ser usadas para diagnosticar diferencialmente a infecção por Streptococcus pneumoniae verdadeiro de infecções de espécies de estrep-tococos viridan semelhantes à pneumococos. 3. Métodos de avaliação da expressão do aene usando microarranios As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, podem ser usadas conforme aqui discutido como ou reagentes em microar-ranjos ou como reagentes para sondar ou analisar microarranjos existentes. 4. Métodos de ensaio de varredura usando uma pastilha/microarranio As composições descritas, sejam sozinhas ou em combinação, podem ser usadas conforme aqui discutido ou como reagentes em pastilhas e microarranjos ou como reagentes para sondar ou analisar pastilhas e mi-croarranjos existentes. E. Exemplos Os seguintes exemplos são estendidos de forma a proporcionar para os indivíduos versados na técnica com uma descoberta e descrição completa de como os compostos, composições, artigos, dispositivos e/ou métodos aqui reivindicados são feitos e avaliados, e são tencionados para serem puramente exemplares e não são tencionados para limitar a descoberta. Têm sido feitos esforços para assegurar a exatidão em relação aos números (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios devem ser contabilizados. A não ser que seja indicado de outra forma, partes são partes em peso, temperatura é em °C ou é em temperatura ambiente, e pressão é na ou próximo da atmosférica. 1. Exemolo 1: Deteccão do gene psaA de Streptococcus pneumoniae a) Métodos (1) Iniciadores e sondas Iniciadores foram projetados e avaliados quanto à sua capacidade de amplificar o gene psaA do Streptococcus pneumoniae: 1F: 5'GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA3' (SEQ ID NO: 1) 1R: 5'GACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG3' (SEQ ID NO: 2) 2F: 5'GCCCT A ATA AATTG GAG G ATCT AAT G A3' (SEQ ID NO: 8) 2R: 5ΊΤ G ACC AG AAGTTGT AT CTTTTTTTCC3' (SEQ ID NO: 9) 3F: 5'CCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGAAA3' (SEQ ID NO: 10) 3R: õOAACTTTTAGTTTTGACCAGAAGTTGTAS1 (SEQ ID NO: 11).

Os iniciadores foram avaliados pela testagem da capacidade de diferentes combinações dos iniciadores de amplificar o gene psaA de DNA d e Streptococcus pneumoniae.

Duas diferentes sondas foram projetadas e avaliadas quanto a sua capacidade de se ligar ao gene psaA de Streptococcus pneumoniae: Sondai: õXXj-TTTCTTTCTGCAAT^ATTCTTGTAGCATGTGCTAGC-ÍYÍS', onde X é FAM, Y é um grupo fosfato e ROX é ligado ao "T".

Sonda 2: 5'(X)CTAGCACATGC'T"ACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA-(Y)3', onde X é HEX, Y é um grupo fosfato e ROX está ligado ao llT". A seqüência de nucleotídeos da sonda 2 (SEQ ID NO: 3) foi projetada pela alteração da seqüência de nucleotídeos da Sonda 1 (SEQ ID NO: 7) para o complemento reverso e pela subtração do último nucleotídeo na extremidade 3'.

As sondas foram avaliadas pela testagem da capacidade de se ligar ao gene psaA de Streptococcus pneumoniae.

Combinações dos iniciadores e das sondas também foram avaliadas quanto à sua capacidade de detectar o gene psaA de Streptococcus pneumoniae em uma reação de PCR em tempo real pela combinação de um iniciador para frente e de um outro reverso listados acima com uma das duas sondas listadas acima. (2) Isolados de Streptococcus pneumoniae (Spnl e de espécies de estrepto-cocos viridans semelhantes aos pneumococos (P-LVS) Isolados foram obtidos a partir do laboratório de Referência de Estreptococos. Os isolados testados consistiam em: 40 Spn (28 diferentes sorotipos); 4 Spn não-encapsulados (representativos da deflagração de con-juntivite), 51 P-LVS (S. pseudopneumoniae, $. mitis, S. oralis, S. sanguinis, S. parasanguinis, S. peroris, S. infantis, S. gordonii, S. cristatus, S. salivarí-us, S. vestibuiaris, S. australis, S. sinensis, S, oligofermentans, S. intestina-lis)‘, outros organismos respiratórios superiores tais como S. pyogenes, S. agatactiae, Staphytococcus aureus, Dolosigranulum pigrum, Enterocoçcus faecalis, e Escherichia coli.

As cepas foram identificadas e caracterizadas por susceptibilidade à optoquina, solubilidade em bile e testes de Accuprobe [GENE-PROBE], e estocadas em sangue de ovelha desfibrinado a -70 °C.

(3) Extração do DNA D NA bacteriano foi extraído a partir dos isolados usando o kit de tecido DNeasy (QIAGEN GmbH).

As amostras foram preparadas pela cofeta das células (máximo de 2 x 109 células) em um tubo de microcentrífuga por centrifugação por 10 min a 5000 x g (7500 rpm) e, a seguir, pelo descarte do sobrenadante. O pélete bacteriano foi, a seguir, ressuspenso em 180 μΙ_ de tampão de lise contendo 0,02 g/mL de lisozima (Sigma) e 5 U/mL de mutanolisina (Sigma) por 1 hora a 37°C. 25 pL de proteinase K e 200 pL de tampão AL foram adicionados às amostras e as amostras foram misturadas por submissão ao vórtex.

As amostras foram, a seguir, incubadas a 70 °C por 30 min. A seguir, 200 μί de etanol (96 - 100%) foram adicionados às amostras. As amostras foram, a seguir, misturadas completamente por submissão ao vórtex. A mistura foi, a seguir, transferida na coluna de DNeasy Mini Spin colocada em um tubo de coleta de 2 mL. A amostra foi, a seguir, centrifugada a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. O fluxo contínuo e o tubo de coleta foram, então, descartados e a coluna DNeasy Mini Spin foi colocada em um novo tubo de coleta de 2 mL e foi adicionado 500 μί de tampão AW1. A nova mistura foi centrifugada por 1 min a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. Novamente fluxo contínuo e o tubo de coleta foram então descartados e a coluna DNeasy Mini spin foi colocada em um novo tubo de coleta de 2 mL. 500 μΐ de tampão AW2 foi adicionado à amostra e centrifugado por 3 min a 20.000 x g (14.000 rpm) para secar a membrana DNeasy. Depois da centrifugação, o fluxo contínuo e o tubo de coleta foram, então, descartados. A coluna DNeasy Mini spin foi colocada em um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL e 200 μΐ de tampão AE foi adicionado diretamente na membrana DNeasy e a amostra foi incubada em temperatura ambiente por 1 min e, a seguir, centrifugada por 1 min a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min para eluir a amostra. O passo de eluição foi, a seguir, repetido.

Os ácidos nucléicos foram conservados a 4 °C até o passo de PCR.

(41 Reação de PCR

As condições de PCR usadas foram as seguintes: 500 nM de iniciadores, 100 nM de sonda, tampão de mistura principal universal Taq-Man® 1x e 2,5 μΐ de DNA em um volume total de 25 μί. Controles sem molde foram preparados adicionando 2.5 μΐ de volume de água estérila ao invés de DNA. Controle sem moldes foram preparados adicionando 2,5 μί de volume de água estérila ao invés de DNA.

As condições de ciclização usadas foram as seguintes: um ciclo de desnaturação a 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e pela extensão do amplicon a 60 °C por 60 segundos. (Ver Figura 3 mostrando o Ajuste do Perfila Térmico). (5) Máauina e quantificação A otimização dos iniciadores foi executada usando testes de temperatura de fusão em gradiente usando SYBR verde em um formato iCy-cler (BIO-RAD). A sonda foi testada em um sistema de PCR quantitativo usando o formato MX3000P (Stratagene).

Todas as reações de PCR em tempo real foram executadas com a ajuda da máquina MX3000P (Stratagene), cuja máquina detectou o sinal com a ajuda de uma sonda fluorescente (sonda TaqMan®) durante os ciclos de PCR. O sistema MX3000P é um termociclizador, no qual cada cavidade (n = 96) foi conectada a uma fibra ótica, essa fibra ótica foi conectada a um laser. Uma câmera CCD coletou as emissões fluorescentes cerca de cada 6 segundos para cada cavidade. O programa de computador MX3000P analisou os dados de fluorescência e determinou a quantidade de cópias alvo em uma amostra. A quantificação foi baseada no princípio do PCR em tempo real. Especificamente, o produto de PCR foi caracterizado durante o ciclo de PCR no momento no qual a amplificação foi detectável pela degradação da sonda a qual foi ligada ao acúmulo dos produtos de PCR. (Ver Figuras 4 e 5). Quanto maior o número de cópias alvo iniciais, menos ciclos de PCR foram requeridos para detectar um aumento significativo na fluorescência.

Dados de PCR em tempo real foram quantificados em termos dos valores de limiar de ciclo (Ct). Os valores de Ct são inversamente relacionados com a quantidade de molde inicial; altos valores de Ct se correlacionam com baixas quantidades de cópias do gene psaA, enquanto que baixos valores de Ct se correlacionam com altos níveis do gene psaA. A quantidade de cópias alvo em uma amostra foi quantificada medindo o valor Ct, e usando uma curva padrão (Figuras 4 e 5). Na teoria, se o PCR funcionar em 100%, 3,32 ciclos foram requeridos para cada aumento de 10 vezes dos alvos. O segundo parâmetro (ARn) foi usado para confirmar que o sinal do PCR foi positivo. O ARn foi a diferença na fluorescência detectada entre a fluorescência medida do ruído de fundo e a fluorescência detectada da amostra a ser analisada. b) Resultados O primeiro grupo de iniciadores (1F e 1R; SEQ ID Nos: 1 e 2, respectivamente) identificou especificamente e sensivelmente o gene psaA de Streptococcus pneumoniae, sob os testes de temperatura de fusão em gradiente usando SYBR verde em um formato iCycler (BIO-RAD).

Depois da otimização dos iniciadores, a sonda foi testada em um sistema de PCR quantitativo usando o formato MX3000P (Stratagene). 2. Exemplo 2. Especificidade do método O diagnóstico de doença pneumocócica exato foi freqüentemen-te dificultado não somente pelas dificuldades na obtenção de isolados do organismo a partir de amostras de pacientes, mas também pela falta de identificação de espécies de estreptococos viridans semelhantes a pneumococos (P-LVS) como Streptococcus pneumoniae (Spn). Isso é especialmente crítico quando a amostra considerada vem do sítio respiratório.

Aqui, os ensaios de PCR em tempo real projetados para a detecção de regiões de seqüência específicas dos genes psaA, lytA e ply não similares aos procedimentos de PCR publicados foram desenvolvidos; dois outros ensaios para o lytA e o ply anteriormente desenvolvidos {McAlvin et al. e Corless et al., respectivamente) também foram avaliados. a) Métodos fh Iniciadores e sondas Os iniciadores e sondas específicos para o psaA foram identificados conforme descrito no Exemplo 1.

Os iniciadores usados na reação de PCR em tempo real para detectar o gene psaA de Streptococcus pneumoniae continham as seguintes seqüências: 1F: 5'GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA3' (SEQ ID NO: 1) 1R: ÕOACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCGS1 (SEQ ID NO: 2). A sonda usada na reação de PCR em tempo real para detectar o gene psaA de Streptococcus pneumoniae tinha a seqüência: Sonda 2: 5' (X)CTAGCACATGC "T" ACA AG A ATG ATTGCAG AAAG AAA-( Y)3', onde X é um ΗΧΕ, Y é um grupo fosfato e ROX está ligado ao "T".

Além das seqüências do iniciador e da sonda para o ply e o lytA gerados para esse estudo, os iniciadores e as sondas para esses dois genes também foram gerados para emparelhar as seqüências dos iniciadores e sondas para o lytA e o ply conforme descrito anteriormente (McAlvin et al. e Corless et al., respectivamente) e são por meio desta incorporadas por referência. (2) Isolados de Streptococcus pneumoniae (Sonl e de espécies de estrepto-cocos viridans semelhantes aos pneumococos (P-LVS1 Isolados foram obtidos a partir do laboratório de Referência de Estreptococos. Os isolados testados consistiam em: 40 Spn (28 diferentes sorotipos); 4 Spn não-encapsulados (representativos da deflagração de con-juntivite), 51 P-LVS (S. pseudopneumoniae, S. mitis, S. oralis, S. sanguinis, S. parasanguinis, S. peroris, S. infantis, S. gordonii, S. cristatus, S. salivari-us, S. vestibularis, S. austraiis, S. sinensis, S. oiigofermentans, S. intestina-lisy, outros organismos respiratórios superiores tais como S. pyogenes, S. agaiactiae, Staphylococcus aureus, Dolosigranuium pigrum, Enterococcus faecalis, e Escheríchia coii.

As cepas foram identificadas e caracterizadas por susceptibilidade à optoquina, solubilidade em bile e testes de Accuprobe [GENE-PROBE], e estocadas em sangue de ovelha desfibrinado a -70 °C.

Todos os isolados de P-LVS foram confirmados como não-Spn por reassociação de DNA/DNA.

(31 Extração do DNA DNA bacteriano foi extraído a partir dos isolados usando o kit de tecido DNeasy (QIAGEN).

As amostras foram preparadas pela coleta das células (máximo de 2 x 109 células) em um tubo de microcentrífuga por centrifugação por 10 min a 5000 x g (7500 rpm) e, a seguir, pelo descarte do sobrenadante. O pélete bacteriano foi, a seguir, ressuspenso em 180 μί de tampão de lise contendo 0,02 g/mL de lisozima (Sigma) e 5 U/mL de mutanolisina (Sigma) por 1 hora a 37 °C. 25 pL de proteinase K e 200 μΙ_ de tampão AL foram adicionados às amostras e as amostras foram misturadas por submissão ao vórtex. As amostras foram, a seguir, incubadas a 70 °C por 30 min. A seguir, 200 pL de etanol (96 - 100%) foram adicionados às amostras. As amostras foram, a seguir, misturadas completamente por submissão ao vórtex. A mistura foi, a seguir, transferida na coluna de DNeasy Mini Spin colocada em um tubo de coleta de 2 mL. A amostra foi, a seguir, centrifugada a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. O fluxo contínuo e o tubo de coleta foram, então, descartados e a coluna DNeasy Mini Spin foi colocada em um novo tubo de coleta de 2 mL e foi adicionado 500 pL de tampão AW1. A nova mistura foi centrifugada por 1 min a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min. Novamente fluxo contínuo e o tubo de coleta foram então descartados e a coluna DNeasy Mini spin foi colocada em um novo tubo de coleta de 2 mL. 500 pL de tampão AW2 foi adicionado à amostra e centrifugado por 3 min a 20.000 x g (14.000 rpm) para secar a membrana DNeasy. Depois da centrifugação, o fluxo contínuo e o tubo de coleta foram, então, descartados. A coluna DNeasy Mini spin foi colocada em um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL e 200 pL de tampão AE foi adicionado diretamente na membrana DNeasy e a amostra foi incubada em temperatura ambiente por 1 min e, a seguir, centrifugada por 1 min a > 6000 x g (8000 rpm) por 1 min para eluir a amostra. O passo de eluição foi, a seguir, repetido.

Os ácidos nucléicos foram conservados a 4 °C até o passo de PCR, conforme descrito no exemplo acima.

(41 Reação de PCR

As condições de PCR usadas foram as seguintes: 500 nM de iniciadores, 100 nM de sonda, tampão de mistura principal universal Taq-Man® 1x e 2,5 pL de DNA em um volume total de 25 pL. Controles sem moldes foram preparados adicionando 2,5 pL de volume de água estérila ao invés de DNA. Controle sem moldes foram preparados adicionando 2,5 pL de volume de água estérila ao invés de DNA. As condições de ciclização usadas foram as seguintes: um ciclo de desnaturação a 95 °C por 10 min, se- guido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e pela extensão do amplicon a 60 °C por 60 segundos. {Ver Figura 3). (5) Máauina e quantificação Todas as reações de PCR em tempo real foram executadas com a ajuda da máquina MX3000P (Stratagene), cuja máquina detectou o sinal com a ajuda de uma sonda fluorescente {sonda TaqMan®) durante os ciclos de PCR. O sistema MX3000P é um termociclizador, no qual cada cavidade {n * 96) foi conectada a uma fibra ótica, essa fibra ótica foi conectada a um laser. Uma câmera CCD coletou as emissões fluorescentes cerca de cada 6 segundos para cada cavidade. O programa de computador MX3000P analisou os dados de fluorescência e determinou a quantidade de cópias alvo em uma amostra. A quantificação foi baseada no princípio do PCR em tempo real. Especificamente, o produto de PCR foi caracterizado durante o ciclo de PCR no momento no qual a amplificação foi detectável pela degradação da sonda a qual foi ligada ao acúmulo dos produtos de PCR. {Ver Figuras 4 e 5). Quanto maior o número de cópias alvo iniciais, menos ciclos de PCR foram requeridos para detectar um aumento significativo na fluorescência.

Dados de PCR-RT em tempo real foram quantificados em termos dos valores de limiar de ciclo {Ct). Os valores de Ct são inversamente relacionados com a quantidade de molde inicial; altos valores de Ct se correlacionam com baixos níveis de expressão de genes, enquanto que baixos valores de Ct se correlacionam com altos níveis de expressão de genes. A quantidade de cópias alvo em uma amostra foi quantificada medindo o valor Ct, e usando uma curva padrão (Figuras 4 e 5). Na teoria, se o PCR funcionar em 100%, 3,32 ciclos foram requeridos para cada aumento de 10 vezes dos alvos. O segundo parâmetro (Delta Rn) foi usado para confirmar que o sinal do PCR foi positivo. O delta Rn foi a diferença na fluorescência detectada entre a fluorescência medida do ruído de fundo e a fluorescência detectada da amostra a ser analisada. bl Resultados Todos os cinco ensaios testados foram positivos para todos os isolados de Spn, e foram capazes de detectar menos do que 15 cópias de DNA. Os ensaios recentemente desenvolvidos alvejando psaA e lytA foram negativos para todos os isolados não-Spn, exceto para um isolado de S. pseudopneumoniae que foi positivo para o ensaio de psaA. O mesmo isolado foi indefinido para o ensaio de PCR de lytA anteriormente desenvolvido por McAlvin. Ambos os PCRs de ply foram positivos para todos os isolados de S. pseudopneumoniae juntamente com 12 outros isolados de P-LVS. Conseqüentemente, o uso do gene ply para a detecção pneumocócica pode levar à identificação incorreta de P-LVS. Os novos ensaios para o psaA e para o lytA foram mais específicos para a detecção de Spn verdadeiro do que os ensaios desenvolvidos por McAlvin et al e Corless et ai. F. Referências.

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ATTTTCTATA ACGGTATCAA CCTTGAAACA GGTGGCAATG CTTGGTT-TAC AAAATTGGTA GAAAATGCCA AGAAAACTGA AAACAAAGAC TACTTCGCAG TCAGCGACGG CGTTGATGTT ATCTACCTTG AAGGT-CAAAA TGAAAAAGGA AAAGAAGACC

CACACGCTTG GCTTAACCTT GAAAACGGTA TTATTTTTGC TAAAAA-TATC GCCAAACAAT TGAGCGCCAA AGACCCTAAC AATAAAGAAT TC-TATGAAAA AAATCTCAAA GAATATACTG ATAAGTTAGA CAAACTTGAT AAAGAAAGTA AGGATAAATT TAATAAGATC CCTGCTGAAA AGAAACT-CAT TGTAACCAGC GAAGGAGCAT TCAAATACTT CTCTAAAGCC TATGGTGTCC CAAGTGCCTA CATCTGGGAA ATCAATACTG AAGAAGA-AGG AACTCCTGAA CAAATCAAGA

CCTTGGTTGA AAAACTTCGC CAAACAAAAG TTCCATCACT CTTTGTA-GAA TCAAGTGTGG ATGACCGTCC AATGAAAAGT GTTTCTCAAG ACA-CAAACAT CCCAATCTAC GCACAAATCT TTACTGACTC TATCGCAGAA CAAGGTAAAG AAGGCGACAG CTACTACAGC ATGATGAAAT ACA-ACCTTGA CAAGATTGCT GAAGGATTGG CAAAATAAGC CTCTGAAAAA CGTCATTCTC ATGTGAGCTG GCGTTTTTTC TATGCCCACA TTTCCGGTCA AATCATTGGA AAATTCTGAC

TGTTTCAGAT ACAATGGAAG AAAAAAGATT GGAGTATCCT ATGGTA-ACTT TTCTCGGAAA TCCTGTGAGC TTTACAGGTA AACAACTACA AGTCGGCGAC AAGGCGCTTG ATTTTTCTCT TACTACAACA SEQ ID NO: 5 (complemento do iniciador psaA para frente) T CATTAG AT CCTCCAATTTATTAG GGC

SEQ ID NO: 6 (complemento do iniciador psaA reverso) CGGAAAAAAAGAT ACAACTT CTGGTC

SEQ ID NO: 7 (complemento da sonda psaA) TTTCTTTCTGCAATCATTCTTGTAGCATGTGCTAG

SEQ ID NO: 8 (iniciador não-funcionante fwd 2F) GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA SEQ ID NO: 9 (iniciador não-funcionante fwd 2R) TTG ACCAGAAGTTGTATCm ΓΤΤΤΟΟ SEQ ID NO: 10 (iniciador não-funcionante fwd 3F) CCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGAAA

SEQID NO: 11 (iniciador não-funcionante fwd 3R) CAACTTTT AGTTTTG ACCAG AAGTT GT A

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Método para detectar ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: a produção de um produto de amplificação pela amplificação de uma seqüência de nucleotídeos de Streptococcus pneumoniae por PCR em tempo real, usando: um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 1, e um iniciador consistindo em SEQ ID NO: 2, e sob condições adequadas para uma reação em cadeia da poli- merase; e a detecção do referido produto de amplificação pelo uso: de uma sonda consistindo da SEQ ID NO: 3, por meio da qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae seja detectada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção do ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae diagnostica a infecção por Streptococcus pneumoniae.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sonda compreende uma molécula reveladora ou um sistema revelador de moléculas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida sonda consiste em: 5-X-CT AGCACATGC"T"ACAAGAAT GATTGCAGAAAG AAA-Y-3, em que X é um fluoróforo, em que Y é um grupo fosfato ou grupos fosfato, em que "T" é uma timina com um supressor escuro ou corante aceptor ligado a ela.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a quantificação do referido produto de amplificação na referida amostra biológica pela medição de um sinal de detecção a partir da referida sonda e pela comparação do referido sinal de detecção com um sinal de detecção de uma segunda sonda a partir do padrão de quantificação, em que o referido padrão de quantificação compreende uma sonda de sentido e um padrão de ácido nucléico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido padrão de quantificação é extraído em paralelo com a referida amostra biológica.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido padrão de ácido nucléico compreende uma solução de Streptococcus pneumoniae purificada e titulada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido sinal de detecção da referida sonda é ainda comparado com um terceiro sinal de detecção de sonda a partir de um calibrador de ácido nucléico extraído em paralelo com a referida amostra biológica, em que o referido calibrador de ácido nucléico compreende uma sonda de sentido e um calibrador de ácido nucléico.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido calibrador de ácido nucléico compreende uma quantidade conhecida de Streptococcus pneumoniae e de uma quantidade conhecida de um meio similar à amostra biológica.

10. Sonda de oligonucleotídeo, caracterizada pelo fato de que consiste em: 5-X-CT AGCACATGC"T"ACAAGAAT GATTGCAGAAAG AAA-Y-3 (SEQ ID NO: 3), em que X é um fluoróforo, em que Y é um grupo fosfato ou grupos fosfato, em que "T" é uma timina com um supressor escuro ou corante aceptor ligado a ela.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o oligonucleotídeo como definido na reivindicação 10.

12. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende reagentes para uma reação de amplificação do tipo PCR em tempo real para detectar Streptococcus pneumoniae, compreendendo iniciadores de sentido, iniciado-res anti-sentido e uma sonda não-degenerada, em que: a sonda não-degenerada é uma sonda de oligonucleotídeo como definida na reivindicação 10; o iniciador de sentido tem comprimento de 27 a 30 e compreende a sequência de ácidos nucleico de SEQ ID NO:1; e o iniciador anti-sentido tem comprimento de 15 a 30 e pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2.

13. Kit de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o iniciador de sentido consiste na SEQ ID NO: 1, e o iniciador anti-sentido consiste na SEQ ID NO: 2, e a sonda consiste em: 5-X-CT AGCACATGC"T"ACAAGAAT GATTGCAGAAAG AAA-Y-3' (SEQ ID NO: 3), em que X é um fluoróforo, em que Y é um grupo fosfato ou grupos fosfato, em que "T" é uma timina com um supressor escuro ou corante aceptor ligado a ela, por meio do qual a presença de ácido nucléico de Streptococcus pneumoniae é detectada.