KR20080072017A - Ｐｃｒ에 의한 증폭 산물의 제조 방법 및 그 용도 - Google Patents

Ｐｃｒ에 의한 증폭 산물의 제조 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

광학적 수단에 의한 증폭 핵산의 검출에 있어서, 전혈 시료 유래의 침전물이나 탁함 등에 의한 상기 검출에 대한 영향을 억제할 수 있는 PCR 증폭 산물의 제조 방법을 제공한다. PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 0.1 체적%∼0.9 체적% 또는 헤모글로빈량으로 환산하여 0.01 g/L∼1.8 g/L로 하고, PCR에 의해 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물의 제조를 행한다. 이러한 조건으로 PCR을 행하면, 미처리의 전혈 시료라도 침전물이나 탁함의 영향을 억제하여 광학적 수단에 의해 증폭 산물의 모니터링을 행할 수 있다.

Description

ＰＣＲ에 의한 증폭 산물의 제조 방법 및 그 용도{METHOD FOR PRODUCTION OF PCR AMPLIFICATION PRODUCT AND USE THEREOF}
본 발명은 PCR에 의한 증폭 산물의 제조 방법, 및 그것을 이용한 증폭 산물과 표적 핵산의 분석 방법에 관한 것이다.
임상이나 병리학 등의 여러 가지 분야에 있어서, 유전자의 발현 분석, 기능 분석, 진단 등을 목적으로 하여, PCR(polymerase chain reaction)법이 널리 이용되고 있다. PCR법은 일반적으로 (1) 열처리에 의한 DNA 변성(이중 가닥 DNA로부터 단일 가닥 DNA로 해리), (2) 주형 단일 가닥 DNA에 프라이머의 어닐링, (3) DNA 폴리머라제를 이용한 상기 프라이머의 신장이라는 3 단계를 1 사이클로 하고, 이 사이클을 반복하는 것에 의해 시료중의 표적 핵산에 상보적인 DNA를 증폭하는 방법이다.
그러나, 생체 시료, 그 중에서도 전혈 시료를 PCR에 제공한 경우, DNA 변성을 위한 열처리에 의해서, 상기 시료에 포함되는 당이나 단백질 등이 변성되고, 불용화의 침전물이나 탁함 등이 발생한다. 이러한 침전물 등의 발생은, 예컨대 증폭 산물의 유무를 전기영동으로 확인하는 경우에는 큰 문제가 되지는 않는다. 그러나 증폭 산물의 유무를 광학적 수단에 의해서 확인하는 경우에는 침전물이나 탁함이 조사광을 차단하기 때문에 정확한 측정 결과를 얻을 수 없다고 하는 문제가 있다. 특히 PCR에 있어서 증폭 산물의 생성 과정을 시간의 경과에 따라 모니터링하는 방법(소위, 실시간 PCR법)에 의하면, 예컨대 1사이클마다의 증폭 산물의 정량이나, 증폭 산물이 소정량(임계값)에 달할 때의 사이클 수를 카운트하는 것이 가능하고, 또한 이들 정보에 기초하면, 생체 시료중의 표적 핵산의 정량도 가능하다. 이 때문에 광학적 수단에 의한 정확한 측정의 실현이 매우 중요시되고 있다.
그래서, 이러한 문제를 해결하기 위해, 종래에는 미리 생체 시료를 정제(전처리)한 후 PCR용 시료로서 사용하는 방법이나, 반응 후에 PCR 반응액을 정제(후처리)하는 방법이 취해지고 있다. 상기 생체 시료의 전처리란, 예컨대 미리 생체 시료를 열처리하고, 발생한 침전물 등을 제거하여, 얻어진 상청을 PCR 시료로서 사용하는 방법이나, 미리 침전물이나 탁함의 원인 물질을 생체 시료로부터 제거하는 방법이다. 또한 PCR 반응액의 후처리란, 예컨대 PCR 반응 후, 발생한 침전물 등을 제거한 후 검출을 행하는 방법이다.
한편, 생체 시료를 이용한 PCR에 대해서는, 조작의 간편성이나 신속성의 관점으로부터, 정제 처리 등의 전처리를 행하지 않고, 상기 생체 시료를 그대로 사용하는 것이 요구되고 있다. 또한 이 때, PCR 반응액중의 전혈 시료의 첨가 비율은 1 체적%∼10 체적% 정도라고 보고되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).
그러나, 전술한 바와 같이, 광학적 수단에 의해 증폭 산물의 검출을 행하는 경우, 전자의 방법으로는 생체 시료의 전처리(정제 처리)가 필수가 되어 버린다. 또한 후자의 방법으로는 전처리하지 않는 생체 시료를 그대로 사용할 수 있지만, 반응 종료 후의 침전물 제거가 필수이기 때문에, 전자와 마찬가지로 조작이 번잡해지고, 또한 반응 종료 후가 아니면 분석을 행할 수 없다고 하는 문제가 있다. 즉 최종적으로 얻어지는 증폭 산물의 분석은 가능해도, 광학적 수단에 의해 증폭 산물의 생성 과정을 시간의 경과에 따라 모니터링하는 것은 어렵다. 또한 전혈 시료를 비롯한 생체 시료는 전처리를 행하지 않으면, 그것에 포함되는 성분에 의해서 PCR 반응이 저해된다고 하는 문제도 있다(비특허문헌 3 및 비특허 문헌 4).
특허문헌 1: 일본 특허 제3727667호 공보
비특허문헌 1: Nucleic Acids Research, Vol.18, N0.19, 5908(1990)
비특허문헌 2: Nucleic Acids Research, Vol.19, N0.5, 1151(1991)
비특허 문헌 3: Nucleic Acids Research, Vol.16, N0.20, 9775-9787(1998)
비특허문헌 4: Journal of Clinical Microbiology, Vol.39 N0.2, p485-493(2001)
그래서, 본 발명은 광학적 수단에 의한 증폭 핵산의 검출에 있어서, 전혈 시료 유래의 침전물이나 탁함 등에 의한 상기 검출에의 영향을 억제할 수 있는 PCR에 의한 증폭 산물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 예컨대 PCR 반응에 앞서는 전혈 시료의 정제 처리(전처리)나, PCR 반응 후에 있어서의 PCR 반응액의 정제 처리(후처리)를 필수로 하지 않고, 검출시에 있어서의 탁함이나 침전물 등에 의한 검출에 대한 영향을 억제할 수 있는 PCR 증폭 산물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 탁함이나 침전물 등의 영향을 억제하여, 광학적 수단에 의해 증폭 산물의 정성이나 정량을 행하는 증폭 산물의 분석 방법, 및 전혈 시료에 있어서의 표적 핵산의 분석을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은 PCR에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, PCR의 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율이 0.01 체적%∼0.9체적%이다. 또한 상기 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율은 헤모글로빈량으로 환산하여 0.01 g/L∼1.8 g/L의 범위라도 좋다.
본 발명의 증폭 산물의 분석 방법은 PCR에 의해서 생성된 증폭 산물의 정성 또는 정량을 행하는 증폭 산물의 분석 방법으로서, 하기 (A)∼(B) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(A) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해서, 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정, 및
(B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단에 의해 검출하는 공정.
본 발명의 표적 핵산의 분석 방법은 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 표적 핵산의 분석 방법으로서, 상기 시료가 전혈 시료이고, 하기 (A)∼(C) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(A) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해서, 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정,
(B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단에 의해 검출하고, 상기 증폭 산물을 정량하는 공정, 및
(C) 상기 증폭 산물이 소정량이 된 PCR 사이클 수를 카운트하는 것에 의해, 상기 전혈 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 공정.
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의하면, PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 전술의 범위로 설정하는 것만으로, 종래와 같은 전혈 시료의 전처리나 PCR 반응액의 후처리 등을 행하지 않고, 탁함이나 침전 등의 검출에 대한 영향을 억제할 수 있는 증폭 산물을 얻을 수 있다. 또한, 상기 첨가 비율이면, 전혈 시료중에 표적 핵산이 존재하면 PCR에 의해 증폭이 가능하고, 충분한 증폭 효율이 확보되는 것을 확인하였다. 그리고 본 발명에 의하면, 이와 같이 탁함이나 침전 등의 영향을 억제할 수 있기 때문에, 종래와 같은 전기영동이 아니라, 광학적 수단이어도, 증폭 산물을 검출하는 것이 가능하다. 또한 광학적 수단으로의 검출이 가능하기 때문에, 전기영동으로는 불가능한 증폭 산물의 생성 과정에 있어서의 시간 경과에 따른 모니터링도 실현할 수 있다. 이 때문에 본 발명에 의하면 정제 처리 등을 행하지 않은 미처리 전혈 시료를 사용하는 경우라도, 예컨대 증폭 산물의 정성·정량뿐만 아니라, 전혈 시료에 있어서의 표적 핵산의 정성·정량이 가능해진다. 또한 증폭 산물의 검출에 있어서, 전술과 같은 탁함이나 침전 등이 문제가 되는 경우(즉, 광학적 수단에 의한 검출의 경우), 후술하는 바와 같이, 미처리의 전혈 시료를 사용하는 것 자체가 종래 시도되고 있지 않기 때문에, 본 발명의 구성은 물론 본 발명의 과제도 신규라고 할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서, PCR 반응액중의 전혈 첨가 비율과, PCR 증폭물에 대응하는 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 있어서, BSA를 포함하는 PCR 반응액중의 전혈 첨가 비율과, PCR 증폭물에 대응하는 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에 있어서, 반응액중에 있어서의 BSA 농도와 반응액의 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 4에 있어서, 각 시료에 대해서 실시간 PCR의 사이클 수와 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에 있어서, 각 시료에 대해서 실시간 PCR의 사이클 수와 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
<증폭 산물의 제조 방법>
본 발명의 증폭 산물의 제조 방법은 전술과 같이, PCR에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 방법으로서, PCR의 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율이 약 0.01 체적%∼약 0.9 체적%이다. 본 발명에 있어서, 전혈 시료의 첨가 비율은, 상기 PCR 반응액에 있어서의 최종 농도(체적%)를 의미한다.
전혈 시료의 첨가 비율이 0.9 체적%를 초과하면, 예컨대 PCR에 있어서의 열처리에 의해 상기 시료중의 단백질 등이 변성되고, 상기 반응액에 있어서의 침전물 등의 발생이 검출에 미치는 영향을 충분히 억제할 수 없을 우려가 있다. 또한 전혈 시료의 첨가 비율이 0.9 체적%를 초과하면, 예컨대 상기 시료중의 성분에 의한 PCR 반응의 저해를 충분히 억제할 수 없고, 증폭 효율이 불충분해질 우려가 있다. 또한 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의하면, 전혈 시료의 첨가 비율을 상기 범위로 설정하는 것에 의해, 예컨대 PCR 반응시에 있어서의 침전 등의 발생을 억제할 수도 있다. 이 경우, 본 발명은 침전물이나 탁함 등의 발생 억제 방법이라고 할 수도 있다. 또한 이들의 침전물 등은 전술한 바와 같이, 증폭 산물을 광학 수단에 의해 검출할 때의 검출 저해 물질이기 때문에도, 본 발명은, 상기 검출 저해 물질의 발생 억제 방법이라고도 할 수 있다.
또한, 전혈의 첨가 비율이 전술의 특허문헌이나 비특허문헌에서는 1 체적%∼10 체적% 정도인 데 대하여, 본 발명에서는 0.01 체적%∼0.9 체적%로 경감되어 있다. 이 때문에, 예컨대 전혈 시료에 포함되는 성분에 의한 PCR 반응의 저해도 저감할 수 있기 때문에, 증폭 효율의 향상도 가능하다.
상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율의 하한은 전술한 바와 같이 0.01 체적% 이상, 바람직하게는 0.02 체적% 이상이고, 보다 바람직하게는 0.05 체적% 이상, 더 바람직하게는 0.1 체적% 이상이다. 또한, 상기 첨가 비율의 상한은 전술한 바와 같이 0.9 체적% 이하, 바람직하게는 0.8 체적% 이하이며, 보다 바람직하게는 0.7 체적%이하, 더 바람직하게는 0.6 체적% 이하이다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 반응액중의 전혈 시료의 비율은 전술과 같은 체적 비율이 아니고, 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 한다)의 중량 비율로 나타낼 수도 있다. 이 경우, 상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율은 Hb량으로 환산하여 약 0.01 g/L∼약 1.8 g/L의 범위이다. Hb량의 하한은 바람직하게는 0.05 g/L 이상이고, 보다 바람직하게는 0.1 g/L 이상이며, Hb량의 상한은 바람직하게는 1.5 g/L 이하이고, 보다 바람직하게는 1 g/L 이하이다. 바람직한 범위는 예컨대 0.05 g/L∼1.5 g/L이고, 보다 바람직한 범위는 0.1 g/L∼1 g/L이다. 또한, 상기 반응중에 있어서, 전혈 시료의 첨가 비율은 상기 체적 비율과 Hb 중량 비율 양쪽 모두를 만족시켜도 좋지만, 어느 하나만을 만족시키는 것이어도 좋다.
전혈은 일반적으로 혈소판, 백혈구(과립구, 단핵구, 림프구) 및 적혈구로 이루어지는 혈액 세포(고체 성분)와, 혈장(액체 성분)으로 구성되어 있고, 예컨대 적혈구중에는 Hb 등이 혈장중에는 알부민, 글로불린, 혈액 응고 인자 등이 포함되어 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 PCR의 반응 시작에 앞서서, 예컨대 전혈 시료에 열처리를 실시하고, 발생한 침전물을 제거하여 상청을 회수하는 전처리나, 침전물 등의 발생 원인이 되는 당류나 단백질 등을 제거하는 전처리 등이 요구되지 않는다. 이 때문에 본 발명에 있어서의 「전혈 시료」란, 통상 침전물 등의 원인이 되는 성분이나 발생한 침전물 등의 제거를 목적으로 하는 전처리를 실시하고 있지 않는 것(이하, 「미처리의 전혈 시료」라고도 한다)을 의미한다. PCR에 제공하는 전혈 시료의 형태는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 환자로부터 채취한 전혈을 그대로 사용하여도 좋으며, 동결 보존한 전혈을 해동하여 사용할 수도 있다. 또한 예컨대 용혈한 전혈, 미용혈의 전혈, 항응고 전혈, 응고 분획을 포함하는 전혈 등 중 어느 것이어도 좋다.
PCR에 의해서 증폭시키는 표적 핵산은 예컨대 전혈 유래의 DNA, RNA(mRNA, 전체 RNA) 외에, 세균이나 바이러스 등에 의해서 전혈에 도입된 외래 핵산(DNA, RNA) 등을 들 수 있다. 또한 이들의 표적 핵산의 소재에 따라서, 예컨대 전혈 시료의 용혈의 필요 여부 등을 결정할 수도 있다.
본 발명은 보다 바람직한 형태로서, 또한 PCR의 반응 시작에 앞서서, 상기 PCR 반응액에 알부민을 첨가한다. 이와 같이, 알부민을 첨가하면 침전물이나 탁함 등에 의한 영향을 한층 더 억제할 수 있고, 증폭 효율도 더 향상할 수 있다.
전술한 바와 같이, 전혈 시료를 비롯한 생체 시료에 포함되는 성분이 PCR 반응을 저해하는 것이 알려져 있고, 이 반응 저해를 경감하는 방법으로서, PCR 반응액에 알부민을 첨가하는 기술이 보고되어 있다(비특허문헌 3 및 비특허문헌 4). 그러나 본 발명의 보다 바람직한 형태로 나타내는 바와 같이, 상기 PCR 반응액에 대한 알부민의 첨가에 의해서, 침전물 등에 의한 검출에 대한 영향을 더 억제할 수 있는 것은 전혀 알려져 있지 않고, 이 사실은 본 발명자들이 예의 연구한 결과 발견한 것이다. 특히 본 발명에 있어서는, 상기 PCR 반응액에 대한 알부민 첨가의 전제 조건으로서, 상기 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 상기 범위로 설정하는 것이 필수이며, 단순히 알부민을 첨가하여도, 침전물 등에 의한 검출에 대한 영향을 억제할 수는 없다. 즉 PCR 반응액에 알부민을 첨가하는 것만으로 침전물 등에 의한 검출에 대한 영향이 억제되는 것이 아니라, 전혈 시료의 첨가 비율을 상기 범위로 설정함으로써 침전물 등에 의한 영향이 억제되고, 또한 이 반응액에 알부민을 첨가하여 공존시킴으로써, 상기 영향을 더 억제할 수 있다.
이것에 대하여, 알부민의 첨가가 기재되어 있는 비특허문헌 3 및 4에는 전혈 시료의 첨가 비율은 물론, 미처리의 전혈 시료를 사용하는 것, 광학적 검출 등에 있어서의 침전물 등의 문제에 대해서도 전혀 개시되어 있지 않다. 또한 전혈 시료가 개시되어 있는 특허문헌 1 및 비특허문헌 2의 경우, 기재되어 있는 전혈 첨가 비율(1 체적% 이상)에서는, 알부민을 더 첨가하여도 PCR 반응액이 젤리상으로 변화되기 때문에, 광학적인 검출은 어렵다는 결과도 얻어지고 있다. 더 중요한 것은, 본 발명은 광학적 수단에 의한 증폭 산물의 검출을 목적으로 하기 때문에, 탁함 등에 의한 영향의 억제를 도모하고 있는 것이고, 전술한 바와 같이, 미처리의 전혈 시료를 사용하며 광학적 검출하는 것 자체가 종래에는 시도되고 있지 않다.
상기 PCR 반응액에 있어서의 알부민의 첨가 비율은 제한되지 않고, 하한이 예컨대 0.01 중량% 이상, 바람직하게는 0.1 중량% 이상, 보다 바람직하게는 0.2 중량% 이상이며, 상한이 예컨대 5 중량% 이하, 바람직하게는 2 중량% 이하, 보다 바람직하게는 1 중량% 이하, 더 바람직하게는 0.8 중량% 이하이다. 바람직한 범위는 0.01 중량%∼5중량%, 보다 바람직하게는 0.1 중량%∼2 중량%, 더 바람직하게는 0.2 중량%∼0.8 중량%이다. 상기 알부민으로서는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 소혈청 알부민(BSA), 사람 혈청 알부민, 래트 혈청 알부민, 말혈청 알부민 등을 들 수 있다. 이들은 어느 1 종류라도 좋고 2 종류 이상을 병용하여도 좋다. 본 발명에 있어서, 알부민의 첨가 비율은 예컨대 상기 PCR 반응액에 있어서의 최종 농도(중량%)를 의미한다.
또한, 본 발명은 보다 바람직한 형태로서, 또한 PCR의 반응 시작에 앞서서, 전혈 시료에 가열 처리를 실시하는 공정을 포함한다. 이와 같이, PCR 반응에 앞서서, 전혈 시료에 가열 처리를 실시하면, 예컨대 초기 주형량을 더 증가할 수 있고, 그것에 의해 증폭 효율을 한층 더 향상할 수 있다. 또한 전혈 시료의 가열 처리에 의해서, 예컨대 탁함이나 침전 등이 발생한 경우라도, PCR 반응시에 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율을 전술의 첨가 비율로 하는 것에 의해, 상기 탁함 등의 영향이 억제되기 때문에, 광학적 수단에 의한 증폭 산물의 검출이 가능하고, 증폭 효율의 더 나은 향상도 가능하다. 또한 전술한 바와 같이 알부민을 첨가하는 경우에도 가열 처리를 실시하여도 좋고, 예컨대 알부민 첨가의 전후, 어느 것으로 행해도 좋다.
상기 가열 처리 공정에 있어서, 상기 전혈 시료는 희석한 시료인 것이 바람직하다. 희석 시료를 사용하는 것에 의해, 예컨대 증폭 효율 향상을 위한 가열 처리에 의해서, 침전이나 탁함 등이 발생하는 것을 억제할 수 있다. 상기 희석 시료에 있어서의 전혈 시료의 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 0.01 체적%∼90 체적%의 범위이고, 바람직하게는 0.05 체적%∼50 체적%이며, 보다 바람직하게는 0.5 체적%∼5 체적%이다. 가열 처리를 행하는 경우, 예컨대 상기 희석 시료를 가열 처리한 후, 전혈 시료가 상기 범위가 되도록 PCR 반응액에 첨가하여도 좋고, 전혈 시료가 상기 범위가 되도록 PCR 반응액에 첨가한 후, PCR 반응에 앞서서, 이것에 가열 처리를 실시하여도 좋다.
상기 가열 처리 공정에 있어서의 가열 온도는 제한되지 않지만, 예컨대 80℃ 이상이고, 바람직하게는 80℃∼99℃, 보다 바람직하게는 90℃∼99℃, 특히 바람직하게는 95℃∼99℃이다. 또한 처리 시간은 제한되지 않지만, 예컨대 30초 이상이며, 바람직하게는 30초∼15분, 보다 바람직하게는 1분∼15분, 특히 바람직하게는 3분∼15분이다.
이어서, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 대해서, 전혈 시료중의 표적 핵산이 DNA이고, 상기 DNA를 PCR의 주형으로서 사용하는 예를 들어 설명한다. 또한 본 발명은 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 전술의 범위로 설정하는 것이 특징이며, 다른 구성 및 조건은 전혀 제한되지 않는다.
우선, 전혈 시료가 전술의 범위가 되도록, PCR 반응액을 조제한다. 전혈 시료는 그 첨가 비율이 PCR 반응액에 있어서 상기 범위가 되면 좋고, 그 첨가 방법은 제한되지 않는다. 예컨대 전혈 시료를 그대로 PCR 반응액에 첨가하여도 좋고, 전혈 시료를, 미리 물이나 완충액 등의 용매로 희석한 후 PCR 반응액에 첨가하여도 좋다. 전혈 시료를 미리 희석하는 경우, 그 희석율은 PCR 반응액에서의 최종적인 전혈 첨가 비율이 상기 범위이면 좋지만, 예컨대 100∼2000배이고, 바람직하게는 200∼1000배이다. 또한 PCR 반응액의 전체 체적은 특별히 제한되지 않고, 예컨대 사용하는 기기(예컨대 써멀 사이클러) 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있지만, 통상 1 ㎕∼500 ㎕이며, 바람직하게는 10 ㎕∼100 ㎕이다.
상기 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료 이외의 조성 성분은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 성분을 들 수 있으며, 그 비율도 특별히 제한되지 않는다. 상기 조성 성분으로서는 예컨대 DNA 폴리머라제, 뉴클레오시드 3인산, 프라이머 및 용매 등을 들 수 있다. 또한 전술한 바와 같이, 상기 PCR 반응액에는 알부민을 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 PCR 반응액에 있어서, 각 조성 성분의 첨가 순서는 전혀 제한되지 않는다.
상기 DNA 폴리머라제로서는 특별히 제한되지 않고, 예컨대 종래 공지의 내열성 세균 유래의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 구체예로서는 써머스·아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라제(미국 특허 제4,889,818호 및 동 제5,079,352호)(상품명 Taq 폴리머라제), 써머스·써머필러스(Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라제(WO 91/09950)(rTth DNA polymerase), 파이로코크스·퓨리오수스(Pyrococcus furiosus)」 유래 DNA 폴리머라제(WO 92/9688)(Pfu DNA polymerase: Stratagenes사제), 써모코커스·리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리머라제(EP-A 455 430)(상표 Vent: Biolab New England사제) 등이 상업적으로 입수 가능하고, 그 중에서도 써머스·아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 내열성 DNA 폴리머라제가 바람직하다.
상기 반응액중의 DNA 폴리머라제의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 5 U/㎖∼50 U/㎖이고, 바람직하게는 1 U/㎖∼100 U/㎖이며, 보다 바람직하게는 20 U/㎖∼30 U/㎖이다. DNA 폴리머라제의 활성 단위(U)는 일반적으로 활성화 연어 정자 DNA를 주형 프라이머로서, 활성 측정용 반응액(25 mM TAPS 완충액(pH9.3, 25℃), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM 메르캅토에탄올, 200 μM dATP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 100 μM「α-32P」dCTP, 0.25 mg/㎖ 활성화 연어 정자 DNA) 중, 74℃로 30분간 10 nmol의 전체 뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 취입하는 활성이 1U이다.
상기 뉴클레오시드 3인산으로서는 통상, dNTP(dATP, dCTP, dTTP)를 들 수 있다. 상기 반응액중의 dNTP의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 0.01 mmol/L∼1 mmol/L이고, 바람직하게는 0.05 mmol/L∼0.5 mmol/L이며, 보다 바람직하게는 0.1 mmol/L∼0.3 mmol/L이다.
상기 프라이머는 표적 핵산의 서열이나 길이에 따라서 적절하게 결정하면 좋다. 프라이머의 길이는 일반적으로 10 bp∼50 bp 정도이다. 상기 반응액중의 프라이머의 첨가 비율은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 0.01 μmol/L∼5 μmol/L이고, 바람직하게는 0.1 μmol/L∼3 μmol/L이며, 보다 바람직하게는 0.1 μmol/L∼1 μmol/L이다.
상기 용매로서는, 예컨대 Tricine, MES, MOPS, HEPES, CAPS 등의 완충액을 들 수 있고, 시판의 PCR용 완충액이나 시판의 PCR 키트의 완충액 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 PCR 반응액은 또한 글리세롤, 헤파린, 베타인 등을 포함하여도 좋고, 이들의 첨가 비율은, 예컨대 PCR 반응을 저해하지 않는 범위로 설정하면 좋다.
PCR의 사이클 조건은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 (1) 단일 가닥 DNA의 해리, (2) 프라이머의 어닐링, (3) 프라이머의 신장(폴리머라제 반응)은 각각 이하와 같다. 또한 사이클 수도 특별히 제한되지 않지만, 하기 (1)∼(3)의 3 단계를 1 사이클로 하여, 예컨대 30 사이클 이상이 바람직하다. 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 합계 100 사이클 이하, 바람직하게는 70 사이클 이하, 더 바람직하게는 50 사이클 이하이다. 각 단계의 온도 변화는, 예컨대 써멀 사이클러 등을 이용하여 자동적으로 제어하면 좋다.
[표 1]
온도(℃) 및 시간(초)
(1) 단일 가닥 DNA의 해리 예를 들어, 90∼99℃, 1∼120초
바람직하게는, 92∼95℃, 30∼60초
(2) 프라이머의 어닐링 예를 들어, 40∼70℃, 1∼300초
바람직하게는, 50∼60℃, 30∼60초
(3) 신장 반응 예를 들어, 50∼80℃, 1∼300초
바람직하게는, 60∼75℃, 30∼60초
이상과 같이 하여, 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 제조하면, 광학적 수단에 의해 검출할 때에 탁함이나 침전물 등의 영향을 잘 받지 않는 증폭 산물을 얻을 수 있다.
또한, 전혈 시료중의 표적 핵산이 RNA(mRNA, 전체 RNA)의 경우는, 예컨대 상기 RNA로부터 역전사 반응에 의해 cDNA를 생성시키고, 이 cDNA를 PCR의 주형으로서 사용하는 것 이외는 전술과 마찬가지로 하여 PCR을 행하면 좋다(소위, REVERSE TRANSCRIPTION PCR).
역전사 반응은, 예컨대 종래 공지의 역전사 효소, 상기 RNA에 대한 프라이머 및 뉴클레오시드 3인산(dNTP)을 포함하는 역전사 반응액에, 상기 전혈 시료를 첨가하여 행할 수 있다. 상기 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율은, 예컨대 전술의 PCR 반응액에 있어서의 첨가 비율과 동일하게 설정할 수 있다.
이 역전사 반응은, 통상 전술의 PCR 반응에 앞서서 행해진다. 예컨대 역전사 반응 후, 그 반응액에 PCR 반응액의 조성 성분을 더 첨가하여도 좋지만, 간편하고 오염의 위험성도 경감할 수 있기 때문에, 하나의 반응계 내에서, 역전사 반응과 PCR 반응을 연속적으로 행하는 것이 바람직하다(소위, One-Step RT-PCR법).
역전사 반응의 반응 조건은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 반응 온도 30℃∼70℃, 반응 시간 1분∼120분이고, 바람직하게는 반응 온도 40℃∼60℃, 반응 시간 10분∼60 분이며, 보다 바람직하게는 반응 온도 45℃∼50℃, 반응 시간 20분∼40분이다.
<증폭 산물의 분석 방법>
이어서, 본 발명의 증폭 산물의 분석 방법은 전술한 바와 같이, PCR에 의해서 생성시킨 증폭 산물의 정성 또는 정량을 행하는 증폭 산물의 분석 방법으로서, 하기 (A)∼(B) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(A) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해서, 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정,
(B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단에 의해 검출하는 공정.
본 발명의 분석 방법은 증폭 산물의 생성 공정에 있어서, 전술한 바와 같이, PCR 반응액중의 전혈 시료를 상기 첨가 비율로 설정하는 것이 특징이다. 이것에 의해서, 침전물이나 탁함 등에 의한 영향이 억제되고, 광학적 수단에 의한 증폭 산물의 검출의 정밀도가 좋게 행할 수 있다. 따라서 본 발명의 분석 방법에 있어서는 PCR 반응액중의 전혈 시료의 비율이 상기 범위이면 좋고, 그 외의 조건이나 공정 등에 대해서는 전혀 제한되지 않는다.
실시간 PCR법은 일반적으로 PCR에 있어서 증폭 산물의 생성 과정을 시간의 경과에 따라 모니터링하는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 (B) 공정 「증폭 산물을 광학적 수단에 의해 검출하는 공정」을, 이하 실시간 PCR이라고 한다. 또한, 상기 (B) 공정에 있어서의 증폭 산물의 검출은, 예컨대 상기 (A) 공정의 종료시 또는 종료 후, 즉 PCR 반응 종료시 또는 종료 후에 행하여도 좋고, 상기 (A) 공정과 병행하여 행하여도 좋다. 상기 (A) 공정과 병행하여 행하는 경우, 상기 (B) 공정에 있어서의 증폭 산물의 검출은, 예컨대 시간의 경과에 따라 행할 수 있다. 시간의 경과에 따른 검출(모니터링)은, 예컨대 연속적이어도 비연속적(단속적)이어도 좋다. 또한, 상기 (A) 공정에 있어서의 PCR의 반응 도중만의 모니터링이어도 좋다.
전술의 방법에 의해 생성한 증폭 산물은, 예컨대 상기 증폭 산물로부터 발생하는 형광 강도의 측정에 의해 검출할 수 있다. 형광 검출로서는 특별히 제한되지 않지만, 종래 공지한 인터컬레이터법, Taq Man(상표) 프로브법, 하이브리드화법, 사이클링 프로브법 등이 있다.
인터컬레이터법은 이중 가닥 DNA에 인터컬레이팅하고, 여기광을 조사하면 형광을 발하는 인터컬레이터를 사용하는 방법이다. 이 방법을 이용하는 경우는, 예컨대 상기 PCR 반응액에 미리 상기 인터컬레이터를 첨가해 두고, 상기 반응액(상기 반응액중의 인터컬레이터)에 여기광을 조사하며, 상기 인터컬레이터로부터 발생하는 형광을 측정하면 좋다.
Taq Man(상표) 프로브법은 PCR의 주형에 상보적인 부분 서열이고 형광 물질과 억제제를 갖는 프로브를 사용하는 방법이다. 상기 프로브로서는 주형의 표적 서열에 특이적으로 어닐링하는 올리고 뉴클레오티드의 말단을, 형광 물질(5'말단)과 켄칭제(3'말단)로 각각 표지화한 것을 예시할 수 있다. 상기 프로브는 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 20 mer∼30 mer 정도의 올리고 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 이 방법을 이용하는 경우, 예컨대 PCR 반응액에 미리 상기 프로브를 첨가해 두고, 상기 반응액(상기 반응액중의 형광 물질)에 여기광을 조사하며, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 측정하면 좋다. 이 방법은 PCR 반응액에 있어서, 상기 프로브가 주형에 어닐링한 것만으로는 여기광을 조사하여도 상기 켄칭제에 의해 형광 물질의 형광은 억제되지만, 신장 공정에 있어서 DNA 신장이 발생하면, DNA 폴리머라제의 5'→3'엑소뉴클레아제 활성에 의해 상기 프로브가 분해되고, 형광 물질이 켄칭제로부터 떨어짐으로써 형광을 발한다고 하는 원리에 기초한다.
하이브리드화법은 PCR의 주형에 상보적인 부분 서열인 인접하는 2 종류의 프로브를 사용하는 방법이다. 상기 2 종류의 프로브로서는, 예컨대 주형의 3'측에 어닐링하고 3'말단이 억셉터 형광 물질로 표지된 올리고 뉴클레오티드 프로브와, 주형의 5'측에 어닐링하며 5'말단이 도너 형광 물질로 표지된 올리고 뉴클레오티드 프로브와의 조합을 예시할 수 있다. 이 방법을 이용하는 경우는, 예컨대 PCR 반응액에 미리 상기 2 종류의 프로브를 첨가해 두고, 상기 반응액(상기 반응액중의 억셉터 형광 물질)에 여기광을 조사하여, 상기 억셉터 형광 물질로부터 발생하는 형광을 측정하면 좋다. 이 방법은 PCR 반응액에 있어서, 2 종류의 프로브가 주형에 어닐링하여, 각각의 억셉터 형광 물질과 도너 형광 물질이 인접하면 형광이 발생하지만, 신장 공정에 있어서 DNA 신장이 발생하면, 억셉터 형광 물질로 표지된 프로브가 분해되고, 억셉터 형광 물질이 도너 형광 물질로부터 떨어짐으로써 형광을 발생하지 않는다고 하는 원리에 기초한다.
사이클링 프로브법은 PCR의 주형에 대하여 상보적인 서열이고, 말단이 형광 물질(5'말단)과 켄칭제(3'말단)로 각각 표지되며, 중앙만이 RNA 서열(리보뉴클레오티드 서열)이 된 프로브를 사용하는 방법이다. 이 방법을 이용하는 경우는, 예컨대 상기 PCR 반응액에 미리 상기 프로브 및 RNaseH를 첨가해 두고, 상기 반응액(상기 반응액중의 형광 물질)에 여기광을 조사하며, 상기 형광 물질로부터 발생하는 형광을 측정하면 좋다. 이 방법은, 상기 PCR 반응액에 있어서, 상기 프로브가 주형에 어닐링한 것만으로는 여기광을 조사하여도 상기 억제제에 의해 형광 물질의 형광은 억제되지만, 키메라 이중 가닥을 형성한 RNA 부분이 RNase에 의해서 절단되면, 양단의 형광 물질과 억제제가 떨어지기 때문에 형광을 발하고, RNA 영역에 미스매치가 존재하면 RNaseH에 의한 절단은 생기지 않는다고 하는 원리에 기초한다.
형광 강도의 검출은, 예컨대 형광 광도계로 행할 수 있다. 또한 일반적으로 PCR 반응 유닛(예컨대 써멀 사이클러)과 광학계 유닛(예컨대 형광 광도계) 양쪽 모두를 구비하는 장치가 사용된다. 구체예로서는 시판의 Smart Cycler(상품명, 다카라바이오사 제조), 라이트 사이클러(상품명, 로슈·다이아그노스틱사 제조), ABI PRISM 7000(상품명, 어프라이드·바이오시스템사 제조) 등을 들 수 있다.
이와 같이 광학적 수단에 의한 검출을 행하면, 예컨대 증폭 산물의 정성(증폭의 유무 또는 표적 핵산의 유무) 및 정량(증폭 산물의 양)이 가능하다. 실시간 PCR에 있어서는 통상, 사이클마다의 형광 강도를 플롯한 증폭 곡선을 작성하고, 증폭 산물이 설정한 값(임계값: 예컨대 증폭이 정지하는 양)이 된 사이클 수(Ct값: Threshold Cycle)를 분석한다. 이 분석 내용에 기초하면 증폭 산물의 정성이나 정량, 및 전혈 시료에 포함되는 표적 핵산의 정성이나 정량 등도 가능해진다. 또한 임계값의 설정이나 정량 방법은 종래 공지의 방법을 적용할 수 있다. 또한 PCR 반응의 종료 후, 반응액의 온도를 상승시켜 증폭 산물의 융해 온도(Tm값)를 상기 광학적 방법에 의해 검출(분석)하면, 예컨대 얻어진 증폭 산물이 1 종류인지 그 이상인지를 확인할 수도 있다.
<표적 핵산의 분석 방법>
이어서, 본 발명의 표적 핵산의 분석 방법은 전술한 바와 같이, 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 표적 핵산의 분석 방법으로서, 상기 시료가 전혈 시료이고, 하기 (A)∼(C) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(A) 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의해서, 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정,
(B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단에 의해 검출하고, 상기 증폭 산물을 정량하는 공정, 및
(C) 상기 증폭 산물이 소정량이 된 PCR 사이클 수를 계측하는 것에 의해, 상기 전혈 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 공정.
본 발명에 있어서, 상기 (A) 공정 및 (B) 공정은 전술한 본 발명의 증폭 산물의 분석 방법에 해당한다. 본 발명은 증폭 산물의 생성 공정에 있어서, 전술한 바와 같이, PCR 반응액중의 전혈 시료를 전술한 첨가 비율로 설정하는 것이 특징이다. 이것에 의해서 침전물이나 탁함 등에 의한 영향이 억제되고, 광학적 수단에 의한 증폭 산물의 검출 정밀도가 좋게 행할 수 있으며, 결과적으로 표적 핵산의 정밀도가 좋게 분석할 수 있다. 따라서 본 발명의 분석 방법에 있어서는 PCR 반응액중의 전혈 시료의 비율이 상기 범위이면 좋고, 그 외의 조건이나 공정 등에 대해서는 전혀 제한되지 않는다.
PCR에서는, 통상 증폭 산물이 있는 일정한 양(임계값)에 달하면, 그 이상의 증폭은 발생하지 않는다. 이 때문에 최종적으로 생성한 증폭 산물의 양을 측정하는 것만으로는 전혈 시료에 포함되는 표적 핵산의 양을 정량하는 것은 어렵다. 그러나 전술과 같은 실시간 PCR에 의하면, 사이클마다의 증폭 산물의 생성을 모니터링하고, 설정한 임계값에 달하는 사이클 수(Ct값)를 카운트하기 때문에, 예컨대 임계값과 Ct값에 기초하여, 전혈 시료에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 것도 가능하다.
이어서, 본 발명의 실시예에 대해서, 비교예와 더불어 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예 및 비교예에 의해 제한되지 않는다.
[실시예 1]
본 실시예는 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 여러 가지 값으로 설정하여 PCR을 행하고, 얻어진 증폭 산물의 Tm 분석을 행한 예이다. 프라이머로서, 서열 번호 1 및 2로 나타내는 전방향 프라이머 GH20(상품명, Takara사 제조), 역방향 프라이머 GH21(상품명, Takara사 제조)을 이용하고, β-글로불린(사람) 중 408 bp의 영역을 증폭시켰다. 또한 PCR의 증폭을 확인하기 위한 형광 물질로서는 인터컬레이터인 상품명 SYBER GreenI를 사용하였다.
서열 번호 1(전방향 프라이머 GH20)
5'-gaagagccaaggacaggtac-3'
서열 번호 2(역방향 프라이머 GH21)
5'-ggaaaatagaccaataggcag-3'
보통 사람의 전혈을 소정의 첨가 비율(0.02, 0.025, 0.033, 0.036, 0.038, 0.042, 0.045, 0.05, 0.0056, 0.0625, 0.071, 0.083, 0.1, 0.125, 0.17, 0.25, 0.29, 0.33, 0.4, 0.5, 0.67, 1, 2, 2.5, 3.3, 5, 10체적%)이 되도록 하기 PCR 반응액에 첨가하였다. 상기 PCR 반응액에 대해서, 증폭 장치를 이용하고, 하기 조건에 의해 PCR 반응을 행하였다. 그리고 PCR 반응 후의 반응액에 대해서, 파장 515 nm∼555 nm의 형광값(%)의 측정에 의해 Tm 분석을 행하였다. Tm 분석의 조건은 이하와 같다. 또한, 상기 증폭 장치로서는 써멀 사이클러(상품명 Eppendorf Master Cycler epS: Eppendorf사 제조)와 하기 광학계(상품명 Arkray system Ver. 4)를 조합한 것을 사용하고(다른 실시예도 같음), PCR 및 Tm 분석을 행하였다(WO 2005/118772 참조).
[표 2」
Taq buffer (상품명, Takara 제조)
0.2 mM dNTP (Takara 제조) 0.5 uM 전방향 프라이머 0.5 uM 역방향 프라이머 25 U/㎖ Lr-Taq (Takara 제조) 1/500배 희석 SYBER GREEN I 전혈 시료
합계 50 ㎕
[표 3]
필터 범위
LED 발광측 수광측
ch1 405 nm 370∼415 nm 450∼480 nm
ch2 470 nm 420∼485 nm 515∼555 nm
ch3 525 nm 490∼555 nm 585∼700 nm
발광 소자 LED (에피텍스사 제조)
수광 소자 LED(형번 6931: 하마마츠 포토닉스사 제조)
[표 4]
94℃, 4.5분 PCR
94℃, 30초 ×40 사이클
55℃, 1분
72℃, 1분
72℃, 7분
↓
95℃, 1초 Tm 분석
40℃, 1분
↓ 1℃/3초씩 상승
95℃ (종료)
이들의 결과를 도 1에 도시한다. 도 1은 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율과 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다. 동 도면에 있어서, 종축은 형광값(%)이고, 횡축은 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율(종농도: 체적%)이다.
이 결과, 도 1에 도시하는 바와 같이, PCR 반응액에 있어서의 전혈 첨가 비율이 고농도(특히 2 체적% 이상)인 경우, PCR의 증폭을 형광 측정에 의해서 확인할 수 없었다. 이것은 PCR 반응에 있어서, 상기 반응액중에 침전물이나 탁함 등이 발생하고, 이것에 의해서 조사광이 차단되었기 때문이라고 추측된다. 이것에 대하여, 도 1에 도시하는 바와 같이, PCR 반응액에 있어서의 전혈 첨가 비율을 0.5 체적% 이하로 설정하는 것에 의해 PCR 증폭 산물의 형광 측정이 충분히 가능해졌다. 이것은 PCR의 증폭 효율을 충분히 유지하고 탁함 등의 발생도 억제할 수 있기 때문이라고 추측된다. 이 결과, 전혈 첨가 비율을 전술과 같은 범위로 설정하는 것에 의해, 예컨대 전혈 시료를 전처리하지 않고 표적 핵산의 정성이나 정량이 가능하게 된다 고 할 수 있다.
[실시예 2]
본 실시예는 PCR 반응액에 BSA를 더 첨가하고, 얻어진 증폭 산물의 Tm 분석을 행한 예이다. 또한 BSA를 0.4 중량%가 되도록 첨가한 것 이외는, 상기 실시예 1과 동일하고, 아울러 BSA 무첨가의 계에 대해서도 마찬가지로 측정을 행하였다. 이들의 결과를 도 2에 도시한다. 도 2는 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 첨가 비율과 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다. 동 도면에 있어서, ■는 BSA 첨가의 결과, ◆는 BSA 무첨가의 결과를 나타낸다.
동 도면에 도시하는 바와 같이, PCR 반응액에 BSA를 첨가하는 것에 의해, 무첨가의 결과와 비교하여, 형광값의 한층 더한 증가를 볼 수 있었다. 특히 PCR 반응액에 있어서의 혈액 첨가 비율(체적%)이 0.5 체적% 이하의 시료에 대해서는 BSA 무첨가의 결과에 비해 한층 더한 증가를 볼 수 있었다. 이 결과로부터, PCR 반응액에 있어서, 혈액 첨가 비율을 0.5 체적% 이하로 설정하는 것에 추가로, 또한 BSA를 첨가하는 것에 의해, 한층 더 확실하게 PCR 증폭물의 형광 측정이 가능하게 된다고 할 수 있다.
[실시예 3]
가열에 의한 침전물 등의 생성에 대한 BSA 첨가의 영향을 확인하였다. 또한 이 영향은 형광 측정에 있어서의 빛의 저해에 의해 확인하기 때문에, 열처리를 실시하는 것만으로 PCR에 의한 증폭 반응은 행하지 않았다. 구체적으로는 하기 조성의 반응액에 전혈을 첨가 비율이 0.4 체적%가 되도록, 또한 BSA를 소정의 첨가 비 율(0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2, 0.24, 0.28, 0.32, 0.36, 0.4, 0.44, 0.48, 0.52, 0.56, 0.6, 0.64, 0.68, 0.72, 0.76, 0.8)이 되도록 각각 첨가하였다. 그리고 이 반응액을, 상기 실시예 1과 동일 장치를 이용하여, 95℃로 5분 처리한 후, Tm 분석을 행하였다(측정 파장 515 nm∼555 nm). 이들의 결과를 도 3에 도시한다. 도 3은 PCR 반응액에 있어서의 BSA의 첨가 비율과 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이다.
[표 5]
Taq buffer (상품명, Takara 제조)
형광 물질 (상품명: BODIPY FL, Invitrogen 제조) 전혈 시료
합계 50 ㎕
동 도면에 도시하는 바와 같이, BSA를 첨가하는 것에 의해, 형광값의 증가가 확인되었다. 특히, BSA 첨가 비율을 0.2 체적% 이상으로 설정함으로써, 형광값의 현저한 증가가 확인되었다. 이것은 BSA의 첨가에 의해서 침전물 등의 생성이 억제되었기 때문이라고 추측된다. 이 결과로부터, PCR 반응액에 있어서, 혈액 첨가 비율을 0.5 체적% 이하로 설정하는 것에 추가로, BSA를 더 첨가하는 것에 의해(특히 0.2 체적% 이상), 한층 더 확실하게 PCR 증폭물의 형광 측정이 가능하게 된다고 할 수 있다.
[실시예 4]
본 실시예는 PCR 반응 전에, 전혈의 희석 시료를 가열한 후에, PCR 반응액에 있어서의 전혈의 첨가 비율을 소정의 비율로 설정하여, PCR 및 Tm 분석을 행한 예이다.
프라이머로서, 서열 번호 3 및 4로 나타내는 전방향 프라이머, 역방향 프라이머를 이용하고, 아미린 유전자 중 105 bp의 영역을 증폭시켰다. 또한 PCR의 증폭을 확인하기 위해, 서열 번호 5로 나타내는 하기 프로브를 사용하였다.
서열 번호 3(전방향 프라이머)
5'-cacatgtgcaacgcagcg-3'
서열 번호 4(역방향 프라이머)
5'-ctcttgccatatgtattggatccc-3'
서열 번호 5(검출용 프로브)
5'-(FAM)-ttcattccagcaacaactttggtgccattctctc-(DABCYL)-3'
헤파린 채혈관을 이용하여 채혈한 보통 사람의 전혈 10 ㎕를, 90 ㎕의 하기 검체 희석액 1에 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액 10 ㎕를, 90 ㎕의 하기 검체 희석액 2에 첨가하여 혼합하였다. 이것을 희석 시료로 하였다. 또한 상기 희석 시료 10 ㎕를 95℃로 5분간 가열 처리하였다. 그리고 비가열의 희석 시료 10 ㎕ 또는 가열한 희석 시료 10 ㎕를 이용하고, 하기 조성의 PCR 반응액에 의해, 실시간 PCR을 행하였다. 또한, 동일 시료에 대해서 3회씩 분석을 행하였다.(n=3).
(검체 희석액 1: 이하 같음)
10 mM Tris-HCl(pH8)
0.1 mM EDTA
0.05% NaN3
0.3% SDS
(검체 희석액 2: 이하 같음)
10 mM Tris-HCl(pH8)
0.1 mM EDTA
0.05% NaN3
[표 6]
(PCR 반응액 : 단위 ㎕)
증류수 30.4 20% BSA 1 10×Gene Taq buffer* 5 10 mM dAUGC 1 100 mM MgCl2 0.75 5 uM 검출용 프로브 1 100 uM 전방향 프라이머 0.25 100 uM 역방향 프라이머 0.25 2 U/㎕ UNG** 0.1 5 U/㎕ Gene Taq NT* 0.25 희석 시료 10
합계 50 ㎕
* 상품명 Gene Taq NT(닛폰진사 제조) ** 우라실-N-글리코실라제
상기 실시간 PCR의 조건은 다음과 같다. i-Cycler(상품명, BIO-RAD사제)에 의해, 50℃로 2분간, 95℃로 2분간 처리한 후, 95℃ 15초 및 56℃ 45초를 1 사이클로 하여 50 사이클 반복하였다. 그리고 각 사이클에 있어서의 56℃ 45초의 단계로, 상기 검출용 프로브에 있어서의 FAM의 형광을, 파장 530 nm에서 모니터링하였다.
상기 i-Cycler에 의해 산출된 Ct(Threshold Cycle)의 값을 하기 표에 나타낸다. Ct는 전술한 바와 같이, 증폭 산물의 양과 상관있는 형광값이 설정값(임계값)에 달하는 사이클 수를 나타낸다. 상기 임계값도 i-Cycler에 의해서 산출되고, 본 실시예에 있어서의 형광값의 임계값은 184.2이다. 또한 실시간 PCR의 원리로부터, Ct값이 상대적으로 작을수록 초기 주형량이 상대적으로 많다고 판단할 수 있다.
[표 7]
Ct 평균값 Ct
비가열 33.9 34.7 33.7 33.3
가열 32.2 32.1 31.9 32.7
또한, 비가열의 희석 시료 및 가열한 희석 시료의 각각 대해서, 측정값(n=3)의 평균값을, 도 4의 그래프로 도시한다. 도 4는 각 시료에 대해서, 사이클 수와 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이며, 굵은 선이 가열 처리한 희석 시료의 결과, 가는 선이 미처리의 희석 시료의 결과를 도시한다.
상기 표 7에 도시하는 바와 같이, 희석 시료를 미리 가열 처리하는 것에 의해, 비가열의 희석 시료와 비교해서, Ct값이 평균 1.7 사이클 감소하였다. 이것은 가열 처리하는 것에 의해, 초기 주형량이 약 3.2배 많은 것을 의미한다. 또한 도 4에 도시하는 바와 같이, 그래프로 나타낸 경우, 비가열의 희석 시료와 비교하여, 분명히 가열 처리한 희석 시료의 형광값이 30 사이클 부근보다 증가되어 있는 것을 알 수 있다. 전술의 실시예에 의해 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율을 소정의 범위로 함으로써, PCR의 증폭 효율을 충분히 유지하고 탁함 등의 영향을 억제할 수 있는 것을 알고 있다. 그리고 본 실시예에 의해 PCR 반응 전에 희석 시료를 가열함으로써, PCR의 증폭 효율을 더 향상할 수 있는 것도 알았다.
[실시예 5]
헤파린 채혈관 대신에, EDTA 채혈관을 이용하여 채혈한 보통 사람의 전혈 10 ㎕를 사용한 것 이외는, 상기 실시예 4와 마찬가지로 하여 실시간 PCR을 행하였다.
하기 표 8에, 상기 i-Cycler에 의해 산출된 Ct의 값을 나타낸다. 또한 비가열의 희석 시료 및 가열한 희석 시료의 각각 대해서, 측정값(n=3)의 평균값을, 도 5의 그래프로 도시한다. 도 5는 각 시료에 대해서, 사이클 수와 형광값과의 관계를 도시하는 그래프이고, 굵은 선이 가열 처리한 희석 시료의 결과, 가는 선이 미처리의 희석 시료의 결과를 도시한다.
[표 8]
Ct 평균값 Ct
비가열 35.4 35.8 35.4 35.1
가열 33.0 33.6 32.9 32.6
상기 표 8에 나타내는 바와 같이, 희석 시료를 미리 가열 처리하는 것에 의해, 비가열의 희석 시료와 비교해서, Ct값이 평균 2.4 사이클 감소하였다. 이것은 가열 처리하는 것에 의해, 초기 주형량이 약 5.3배 많은 것을 의미한다. 또한 도 5에 도시하는 바와 같이, 그래프에 나타낸 경우, 비가열의 희석 시료와 비교하여, 분명히 가열 처리한 희석 시료의 형광값이 30 사이클 부근보다 증가하고 있는 것을 알 수 있다. 전술의 실시예에 의해 PCR 반응액에 있어서의 전혈 시료의 비율을 소정의 범위로 함으로써 PCR의 증폭 효율을 충분히 유지하고 탁함 등의 발생을 억제할 수 있는 것을 알고 있다. 그리고 본 실시예에 의해 PCR 반응 전에 전혈 시료를 가열함으로써, PCR의 증폭 효율을 더 향상할 수 있는 것도 알았다.
[실시예 6]
본 실시예는 PCR 반응 전에, 전혈의 희석 시료를 소정의 온도로 가열한 후에, PCR 반응액에 있어서의 전혈의 첨가 비율을 소정의 비율로 설정하여, PCR 및 Tm 분석을 행한 예이다.
프라이머로서, 상기 실시예 4와 동일 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하였다. 또한 PCR의 증폭을 확인하기 위해 서열 번호 6으로 나타내는 하기 프로브를 사용하였다.
서열 번호 6(검출용 프로브)
5'-(FAM)-ttggtagatgagagaatggcaccaaagttgttgc-(DABCYL)-3'
EDTA 채혈관을 이용하여 채혈한 보통 사람의 전혈 10 ㎕를, 90 ㎕의 상기 검체 희석액 1에 첨가하여 혼합하였다. 이 혼합액 10 ㎕를, 90 ㎕의 상기 검체 희석액 2에 첨가하여 혼합하였다. 이것을 희석 시료로 하였다. 또한 상기 희석 시료 10 ㎕를 소정의 온도(99℃, 95℃, 90℃, 85℃, 80℃)에서 5분간 가열 처리하였다. 그리고 비가열의 희석 시료 10 ㎕ 또는 가열한 희석 시료 10 ㎕를 이용하고, 하기 조성의 PCR 반응액에 의해 실시간 PCR을 행하였다. 실시간 PCR의 조건은, 상기 실시예 4와 같다.
[표 9]
(PCR 반응액 : 단위 ㎕)
증류수 26.25 20% BSA 0.5 10×Gene Taq buffer* 5 10 mM dNTP 4 100 mM MgCl2 0.75 5 uM 검출용 프로브 2 100 uM 전방향 프라이머 0.25 100 uM 역방향 프라이머 0.25 5 U/㎕ Gene Taq NT* 0.25 희석 시료 10
합계 50 ㎕
* 상품명 Gene Taq NT(닛폰진사 제조)
하기 표에, 상기 i-Cycler에 의해 산출된 Ct의 값을 나타낸다. 본 실시예에 있어서의 형광값의 임계값은 335.2이다.
[표 10]
Ct
비가열 34.2
가열 80℃ 85℃ 90℃ 95℃ 99℃ 32.7 32.8 32.8 32.6 31.7
상기 표에 도시하는 바와 같이, 희석 시료를 미리 80℃∼99℃로 가열 처리한 경우, 비가열의 희석 시료와의 Ct값의 차는 0.6 사이클 이상이었다. 0.6 사이클 이상이란, 초기 주형량이 약 1.5배 이상인 것을 의미한다. 따라서 희석 시료를 80℃ 이상으로 가열 처리하는 것에 의해, PCR의 증폭 효율을 더 향상할 수 있는 것을 알았다. 또한 가열 온도가 상대적으로 높을수록, 상대적으로 증폭 효율이 향상하는 것을 알았다.
[실시예 7]
본 실시예는 PCR 반응 전에 전혈의 희석 시료를 80℃ 또는 99℃에서 소정 시 간 가열한 후에, PCR 반응액에 있어서의 전혈의 첨가 비율을 소정의 비율로 설정하여, PCR 및 Tm 분석을 행한 예이다.
가열 온도를 80℃ 또는 99℃로 하고, 가열 처리의 시간을 소정 시간(30초, 1분, 3분, 10분, 15분)으로 한 것 이외는, 상기 실시예 6과 마찬가지로 하여, 실시간 PCR을 행하였다.
하기 표에, 상기 i-Cycler에 의해 산출된 Ct의 값을 나타낸다. 본 실시예에 있어서의 형광값의 임계값은 165.4이다.
[표 11]
Ct
비가열 35.7
가열 80℃ 80℃ 80℃ 80℃ 80℃ 30초 1분 3분 10분 15분 35 35 34.7 33.5 33.2
가열 99℃ 99℃ 99℃ 99℃ 99℃ 30초 1분 3분 10분 15분 34.1 32.2 31.9 31.5 31.6
상기 표에 나타내는 바와 같이, 희석 시료를 미리 80℃ 또는 99℃에서 30초 이상 가열 처리한 경우, 비가열의 희석 시료와의 Ct값의 차는 0.6 사이클 이상이었다. 0.6 사이클 이상이란, 전술과 같이, 초기 주형량이 약 1.5배 이상인 것을 의미한다. 따라서 희석 시료를, 80℃ 이상 30초 이상 가열 처리한는 것에 의해 PCR의 증폭 효율을 더 향상할 수 있는 것을 알았다.
이상과 같이, 본 발명의 증폭 산물의 제조 방법에 의하면, PCR 반응액에 있 어서의 전혈 시료의 첨가 비율을 전술의 범위로 설정하는 것만으로, 종래와 같이 전혈 시료의 전처리나 PCR 반응액의 후처리 등을 행하지 않고, 탁함이나 침전 등의 검출에 대한 영향을 억제할 수 있다. 그리고 이와 같이 탁함이나 침전 등의 영향을 억제할 수 있기 때문에, 종래와 같은 전기영동이 아니라, 광학적 수단에 의해서도 증폭 산물을 검출하는 것이 가능해진다. 또한, 광학적 수단에 의한 검출이 가능하게 되었기 때문에, 예컨대 전기영동으로는 불가능한, 증폭 산물의 생성 과정에 있어서의 시간의 경과에 따른 모니터링도 실현할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의하면 전혈 시료를 사용하는 경우라도, 예컨대 증폭 산물의 정성·정량뿐만 아니라, 전혈 시료에 있어서의 표적 핵산의 정성·정량이 가능해진다.

Claims (24)

  1. PCR에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 방법으로서,
    PCR 반응액에서 전혈 시료의 첨가 비율이 0.01 체적%∼0.9 체적%인 증폭 산물의 제조 방법.
  2. PCR에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 제조하는 방법으로서,
    PCR 반응액에서 전혈 시료의 첨가 비율이 헤모글로빈량으로 환산하여 0.01 g/L∼1.8 g/L의 범위인 증폭 산물의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCR 반응의 시작에 앞서서 상기 PCR 반응액에 알부민을 첨가하는 증폭 산물의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 PCR 반응액에서 상기 알부민의 첨가 비율이 0.1 중량%∼1 중량%의 범위인 증폭 산물의 제조 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 알부민이 소혈청 알부민, 사람 혈청 알부민, 래트 혈청 알부민 및 말혈청 알부민으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나인 증 폭 산물의 제조 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCR 반응의 시작에 앞서서 전혈 시료에 가열 처리를 실시하는 공정을 포함하는 증폭 산물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 가열 처리 공정에서 전혈 시료를 희석한 희석 시료에 가열 처리를 실시하며, 상기 희석 시료에서 전혈 시료의 비율이 0.01 체적%∼90 체적%의 범위인 증폭 산물의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 가열 처리 공정에서 가열 온도가 80℃∼99℃의 범위인 증폭 산물의 제조 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 가열 처리 공정에서 처리 시간이 30초 이상인 증폭 산물의 제조 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전혈 시료중의 표적 핵산이 DNA이고, 상기 DNA를 PCR의 주형으로 하는 증폭 산물의 제조 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전혈 시료중의 표적 핵산이 RNA이고, 상기 RNA로부터 역전사 반응에 의해 생성시킨 cDNA를 PCR의 주형으로 하는 증폭 산물의 제조 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, PCR의 증폭 횟수가 30 사이클 이상인 증폭 산물의 제조 방법.
  13. PCR에 의해서 생성된 증폭 산물의 정성 또는 정량을 행하는 증폭 산물의 분석 방법으로서,
    (A) 제1항 또는 제2항에 기재된 증폭 산물의 제조 방법에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정, 및
    (B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단을 통해 검출하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 증폭 산물의 분석 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 (B) 공정에서 상기 증폭 산물을 시간 경과에 따라 검출하는 증폭 산물의 분석 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 증폭 산물로부터 발생하는 형광을 측정하여 상기 증폭 산물을 검출하는 증폭 산물의 분석 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 광학적 수단이 형광 광도계인 증폭 산물의 분석 방법.
  17. 제13항에 있어서, PCR 반응액이 추가로 이중 가닥 DNA에 인터컬레이팅하는 인터컬레이터를 포함하고,
    상기 (B) 공정에서 상기 인터컬레이터에 대한 여기광을 조사하여 발생하는 형광을 측정하여서 상기 증폭 산물을 검출하는 증폭 산물의 분석 방법.
  18. 제13항에 있어서, PCR 반응액이 추가로 형광 물질 및 켄칭제를 가지며 또한 PCR의 주형에 상보적인 부분 서열인 프로브를 포함하고,
    상기 (B) 공정에서 상기 형광 물질에 대한 여기광을 조사하여 발생하는 형광을 측정하여서 상기 증폭 산물을 검출하는 증폭 산물의 분석 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 (B) 공정에서 상기 증폭 산물의 검출 방법이 Tm 분석인 증폭 산물의 분석 방법.
  20. 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 표적 핵산의 분석 방법으로서,
    상기 시료가 전혈 시료이고,
    (A) 제1항 또는 제2항에 기재된 증폭 산물의 제조 방법에 의해서 전혈 시료중의 표적 핵산에 상보적인 증폭 산물을 생성시키는 공정,
    (B) 상기 증폭 산물을 광학적 수단을 통해 검출하고, 상기 증폭 산물을 정량하는 공정, 및
    (C) 상기 증폭 산물이 소정량이 되는 PCR 사이클 수를 계측하여 상기 전혈 시료중에 포함되는 표적 핵산을 정량하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 분석 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 (B) 공정에서 상기 증폭 산물을 시간 경과에 따라 검출하는 표적 핵산의 분석 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 증폭 산물로부터 발생하는 형광을 측정하여 상기 증폭 산물을 검출하는 표적 핵산의 분석 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 광학적 수단이 형광 광도계인 표적 핵산의 분석 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 (B) 공정에서 상기 증폭 산물의 검출 방법이 Tm 분석인 표적 핵산의 분석 방법.
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