CN101443457B - 利用pcr的扩增产物的制造方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供PCR扩增产物的制造方法，其在通过光学手段对扩增核酸进行的检测中，可以抑制来自全血样品的沉淀物、混浊等对上述检测的影响。使PCR反应液中的全血样品的添加比例为0.1～0.9体积％或换算成血红蛋白量为0.01～1.8g/L，并通过PCR制造与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物。若在这样的条件下进行PCR，即使是未处理的全血样品，也可以抑制沉淀物、混浊的影响，通过光学手段对扩增产物进行监测。

Description

利用PCR的扩增产物的制造方法及其用途
技术领域
本发明涉及利用PCR的扩增产物的制造方法，及对于使用该方法获得的扩增产物和目标核酸的分析方法。
背景技术
在临床、病理学等各种领域中，以基因的表达解析、功能解析、诊断等为目的，广泛使用PCR(聚合酶链反应，polymerasechain reaction)法。一般来说，PCR法是如下的方法：以下述3个步骤为一个循环，(1)通过热处理进行DNA变性(由双链DNA解离为单链DNA)、(2)模板单链DNA和引物的退火、(3)使用DNA聚合酶的上述引物的延伸，通过重复上述循环来扩增与样品中的目标核酸互补的DNA。
但是，在PCR中使用生物样品中的全血样品的情况下，以使DNA变性为目的的热处理，将导致上述样品中含有的糖、蛋白质等变性，产生不溶的沉淀物、混浊等。这样的沉淀物等的产生在例如通过电泳确认有无扩增产物的情况下，不会成为大问题。但是，在通过光学手段确认有无扩增产物的情况下，由于沉淀物、混浊遮住入射光，会产生无法得到正确的测定结果的问题。特别是通过在PCR中随时间监测扩增产物的生成过程的方法(即，实时定量PCR法)，例如可以对每1循环的扩增产物进行定量或对扩增产物到达设定量(阈值)时的循环次数进行计数，另外基于这些信息，还可对生物样品中的目标核酸进行定量。因此，通过光学手段实现准确测定受到极度的重视。
因此，为了解决这样的问题，目前采用预先纯化(前处理)生物样品后再作为PCR用样品的方法或采用在反应后纯化(后处理)PCR反应液的方法。上述生物样品的前处理是指例如预先将生物样品进行热处理，除去产生的沉淀物等，使用得到的上清作为PCR样品的方法，或预先从生物样品中去除引起沉淀物、混浊的物质的方法。另外，PCR反应液的后处理是指例如在PCR反应后，除去产生的沉淀物等再进行检测的方法。
另一方面，对于使用生物样品的PCR，从工序的简便性和快捷性的观点出发，追求不进行纯化处理等前处理而直接使用上述生物样品。而且，有报道说此种情况下，PCR反应液中的全血样品的添加比例为1～10体积％左右(专利文献1、非专利文献1及非专利文献2)。
然而，如上所述，通过光学手段检测扩增产物的情况下，在前者的方法中，必须进行生物样品的前处理(纯化处理)。另外，在后者的方法中，虽然可以直接使用未进行前处理的生物样品，但必须在反应结束后除去沉淀物，因此和前者一样工序繁复，而且存在不待反应结束就不能进行分析的问题。因此，虽然能够对最终获得的扩增产物进行分析，但难以使用光学手段对扩增产物的生成过程进行随时间监测。另外，如对以全血样品为代表的生物样品不进行前处理，还存在其中含有的成分干扰PCR反应的问题(非专利文献3及非专利文献4)。
专利文献1：日本专利第3727667号公报
非专利文献1：Nucleic Acids Research，Vol.18，No.19，5908(1990)
非专利文献2：Nucleic Acids Research，Vol.19，No.5，1151(1991)
非专利文献3：Nucleic Acids Research，Vol.16，No.20，9775-9787(1988)
非专利文献4：Journal of Clinical Microbiology，Vol.39，No.2，p485-493(2001)
发明内容
因此，本发明的目的在于提供在通过光学手段对扩增核酸进行的检测中，使用PCR制造扩增产物的方法，该方法可以抑制全血样品来源的沉淀物、混浊等对上述检测产生的影响。进一步详细而言，例如，本发明涉及无需在PCR反应前对全血样品进行纯化处理(前处理)或在PCR反应后对PCR反应液进行纯化处理(后处理)，可以抑制在检测时沉淀物、混浊等对检测的影响的PCR扩增产物的制造方法。而且，本发明的目的在于提供抑制沉淀物、混浊等的影响，使用光学手段对扩增产物进行定性或定量的扩增产物的分析方法和全血样品中的目标核酸的分析。
为了达成上述目的，本发明的扩增产物的制造方法是通过PCR制造与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的方法，PCR的反应液中全血样品的添加比例是0.01～0.9体积％。而且，上述PCR反应液中全血样品的添加比例换算成血红蛋白(hemoglobin)量可以在0.01～1.8g/L的范围。
本发明的扩增产物的分析方法，其特征在于，是对通过PCR生成的扩增产物进行定性或定量的扩增产物的分析方法，含有以下(A)～(B)的工序。
(A)通过本发明的扩增产物的制造方法生成与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的工序。
(B)使用光学手段检测上述扩增产物的工序。
本发明的目标核酸的分析方法，其特征在于，是对样品中所含的目标核酸进行定量的目标核酸的分析方法，上述样品是全血样品，上述方法包括下述(A)～(C)的工序。
(A)通过本发明的扩增产物的制造方法生成与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的工序。
(B)通过光学手段检测上述扩增产物，对上述扩增产物进行定量的工序。
(C)通过对上述扩增产物到达设定量时的PCR循环次数进行计数，对上述全血样品中所含的目标核酸进行定量的工序。
若使用本发明的扩增产物的制造方法，只要将PCR反应液中的全血样品的添加比例设定在上述范围，就可以无需进行如现有技术中的全血样品的前处理或PCR反应液的后处理等，可以得到抑制混浊、沉淀等对检测的影响的扩增产物。另外，已经确认若为上述添加比例的话，只要全血样品中存在目标核酸，就可以使用PCR进行扩增，可以确保充分的扩增效率。因此，由于通过本发明可以抑制混浊、沉淀等的影响，不使用传统的电泳而使用光学手段也可以检测扩增产物。而且，由于可以使用光学手段进行检测，可以实现使用电泳不能进行的扩增产物生成过程中的随时间监测。因此，使用本发明，即使在使用未经纯化处理的未处理的全血样品的情况下，例如，不仅可以进行扩增产物的定性、定量，也可以进行全血样品中的目标核酸的定性、定量。而且，在扩增产物的检测中，上述的混浊、沉淀等成为问题的情况下(即，使用光学手段检测的情况)，如下所述，由于使用未处理的全血样品本身从未进行过尝试，本发明的技术理所当然是新颖的，本发明的课题也是新颖的。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中，PCR反应液中的全血添加比例和对应于PCR扩增物的荧光值的关系的图。
图2是表示本发明的实施例2中，含有BSA的PCR反应液中的全血添加比例和对应于PCR扩增物的荧光值的关系的图。
图3是表示本发明的实施例3中，反应液中BSA的浓度和反应液的荧光值的关系的图。
图4是表示本发明的实施例4中，对于各样品，实时定量PCR的循环次数和荧光值的关系的图。
图5是表示本发明的实施例5中，对于各样品，实时定量PCR的循环次数和荧光值的关系的图。
具体实施方式
扩增产物的制造方法
本发明的扩增产物的制造方法，如前所述，是通过PCR制造与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的方法，PCR的反应液中全血样品的添加比例是约0.01～约0.9体积％。在本发明中，全血样品的添加比例是指上述PCR反应液中的终浓度(体积％)。
如果全血样品的添加比例超过0.9体积％，可能会产生例如不能充分抑制PCR中的热处理导致的上述样品中蛋白质等变性、不能充分抑制上述反应液中沉淀物等的产生对检测的影响。而且，如果全血样品的添加比例超过0.9体积％，可能会产生例如不能充分抑制上述样品中的成分对PCR反应的干扰，扩增效率不充分。在此情况下，本发明还可以称为抑制沉淀物、混浊产生的方法。而且，由于这些沉淀物等是如同上述的在使用光学手段检测扩增产物时干扰检测的物质，本发明也可以称为抑制上述干扰检测物质产生的方法。
而且，全血的添加比例相对于上述的专利文献或非专利文献中的1～10体积％左右，在本发明中减少至0.01～0.9体积％。因此，例如因为可以降低源于全血样品中含有的成分对PCR反应的干扰，可以提高扩增效率。
上述反应液中的全血样品的添加比例的下限是上述的0.01体积％以上，优选0.02体积％以上，更优选0.05体积％以上，最优选0.1体积％以上。又，上述添加比例的上限是上述的0.9体积％以下，优选0.8体积％以下，更优选0.7体积％以下，最优选0.6体积％以下。
又，在本发明中，上述反应液中的全血样品的比例可以不是上述的体积比例，而以血红蛋白(以下，简称“Hb”)的重量比例来表示。在此情况下，上述反应液中的全血样品的比例换算为Hb的量是约0.01～约1.8g/L的范围。Hb量的下限优选0.05g/L以上，更优选0.1g/L以上；Hb量的上限优选1.5g/L以下，更优选1g/L以下。优选的范围是，例如0.05～1.5g/L，更优选0.1～1g/L。另外，上述反应中，全血样品的添加比例可以同时满足上述体积比例和Hb重量比例两方，也可以只满足任一方。
通常，全血是由包含血小板、白细胞(粒细胞、单核细胞、淋巴细胞)及红细胞的血细胞(固体成分)和血浆(液体成分)构成的，例如，红细胞中含有Hb等，血浆中含有白蛋白、球蛋白、凝血因子等。如前所述，根据本发明，不需要在PCR反应前进行例如对全血样品进行热处理并除去产生的沉淀物以及回收上清的前处理或除去会产生沉淀物等的糖类、蛋白质等的前处理。因此，本发明中的“全血样品”是指通常未进行以除去会产生沉淀物的成分或已产生的沉淀物等为目的的前处理的样品(以下，称为“未处理的全血样品”)。提供给PCR的全血样品的形态没有特别限制，可以是例如直接使用从患者采集的全血，也可以使用解冻的冷冻保存的全血。又，也可以是例如溶血后的全血、未溶血的全血、抗凝全血、含有凝固成分的全血等的任意一种。
通过PCR扩增的目标核酸可以列举例如全血来源的DNA、RNA(mRNA、总RNA)，以及通过细菌或病毒等引入全血的外来核酸(DNA、RNA)等。又，可以根据上述目标核酸的存在，决定例如是否进行全血样品的溶血等。
作为本发明更优选的形态，进一步在PCR反应开始前在上述PCR反应液中加入白蛋白。如此，若加入白蛋白，可以进一步抑制沉淀物、混浊等的影响，而且可以进一步提高扩增效率。
如上所述，已知以全血样品为代表的生物样品中含有的成分会干扰PCR反应，作为减轻这种反应干扰的方法，已报道了在PCR反应液中添加白蛋白的技术(非专利文献3和非专利文献4)。但是，之前并不了解如本发明更优选的形态所示的通过在上述PCR反应液中添加白蛋白，可以进一步抑制沉淀物等对检测造成的影响，如上事实是本发明者在深入研究的结果中得出的结论。特别是在本发明中，在上述PCR反应液中添加白蛋白的前提是在上述PCR反应液中全血样品的添加比例必须设定在上述范围内，仅仅添加白蛋白并不能抑制沉淀物等对检测造成的影响。即，仅在PCR反应液中添加白蛋白不能抑制沉淀物等对检测造成的影响，通过将全血样品的添加比例设定在上述范围内可以抑制影响，进一步在反应液中添加白蛋白，使其共存，可以进一步抑制上述影响。
对此，记载了添加白蛋白的非专利文献3和4中，当然未公开全血样品的添加比例，而对于使用未处理的全血样品、光学检测等中的沉淀物等问题也未公开。而且，在公开了全血样品的专利文献1和非专利文献2中，因为使用所记载的全血添加比例(1体积％以上)，即使添加白蛋白也会使PCR反应液变为胶状，从而得到难以进行光学检测的结果。更重要的是，正是因为本发明以使用光学手段检测扩增产物为目的，所以期望抑制混浊等造成的影响，如上所述，使用未处理的全血样品且进行光学检测从来未被尝试。
上述PCR反应液中白蛋白的添加比例没有限制，下限是例如0.01重量％以上，优选0.1重量％以上，更优选0.2重量％以上；上限是例如5重量％以下，优选2重量％以下，更优选1重量％以下，进一步优选0.8重量％以下。优选的范围是0.01～5重量％，更优选0.1～2重量％，进一步优选0.2～0.8重量％。作为上述的白蛋白没有特别限制，可以列举例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、马血清白蛋白等。可以使用这些的任一种也可以同时使用两种以上。本发明中，白蛋白的添加比例是指例如上述PCR反应液中的终浓度(重量％)。
又，作为本发明的更优选的形态，进一步含有在PCR反应开始前对全血样品进行加热处理的工序。若如此，在PCR反应开始前对全血样品进行加热处理，可以例如进一步增加初始模板量，因此可以进一步提高扩增效率。另外，通过全血样品的加热处理，例如即使产生混浊、沉淀等的情况下，通过在PCR反应时，使PCR反应液中的全血样品的比例为上述添加比例，可以抑制上述混浊等的影响，因此，可以通过光学手段检测扩增产物，而且，可以进一步提高扩增效率。又，如上所述添加白蛋白的情况下，可以进行加热处理，例如，在添加白蛋白的前后均可以进行。
上述加热处理工序中，上述全血样品优选为稀释后的样品。通过使用稀释样品，可以抑制例如为了提高扩增效率而进行的加热处理所产生的沉淀或混浊等。上述稀释样品中全血样品的比例没有特别限制，例如是0.01～90体积％的范围，优选0.05～50体积％，更优选0.5～5体积％。进行加热处理的情况可以是例如在加热处理上述稀释样品后，在PCR反应液中按照上述范围添加全血样品，也可以是在PCR反应液中按照上述范围添加全血样品后，在PCR反应前对其进行加热处理。
上述加热处理工序的加热温度没有限制，例如是80℃以上，优选80～99℃，更优选90～99℃，特别优选95～99℃。又，处理时间没有限制，可以是例如30秒以上，优选30秒～15分钟，更优选1分钟～15分钟，特别优选3分钟～15分钟。
接下来，举出全血样品中的模板核酸是DNA，使用上述DNA作为PCR的模板的例子，来说明本发明的扩增产物的制造方法。另外，本发明的特征在于将PCR反应液中的全血样品的添加比例设定在上述范围，对其它的技术和条件无任何限制。
首先，调制PCR反应液，使全血样品在上述范围内。只要全血样品在PCR反应液中的添加比例在上述范围内即可，其添加方法无限制。例如，可以在PCR反应液中直接添加全血样品，也可以预先用水或者缓冲液等溶剂将全血样品稀释后再添加入PCR反应液中。在预先稀释全血样品的情况下，其稀释率只要使PCR反应液中的全血样品的最终的添加比例在上述范围内即可，例如是100～2000倍，优选200～1000倍。又，PCR反应液的总体积没有特别限制，例如可以根据使用的仪器(例如，热循环仪(Thermal cycler))等适当决定，通常是1～500μl，优选10～100μl。
上述PCR反应液中全血样品以外的组成成分没有特别限制，可以列举现有的公知成分，其比例没有特别限制。作为上述组成成分，可以列举DNA聚合酶、核苷三磷酸、引物及溶剂等。又，如上所述，优选在上述PCR反应液中添加白蛋白。另外，上述PCR反应液中，各组成成分的添加顺序没有任何限制。
作为上述DNA聚合酶，没有特别限制，例如可以使用现有公知的来自耐热菌的聚合酶。作为具体例子，可以从市面得到来自栖热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美国专利第4,889,818号以及美国专利第5,079,352号)(商品名Taq聚合酶)、来自极端嗜热菌Tthermus thermophilus)的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTth DNA polymerase)、来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(WO92/9689)(Pfu DNApolymerase：Stratagenes公司产)、来自嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)的DNA聚合酶(EP-A455430)(商标Vent：New EnglandBiolabs公司产)等，其中，优选来自栖热水生菌(thermusaquaticus)的耐热性DNA聚合酶。
上述反应液中的DNA聚合酶的添加比例没有特别限制，例如是5～50U/ml，优选1～100U/ml，更优选20～30U/ml。DNA聚合酶的活性单位(U)一般定义如下，使用活化鲑鱼精子DNA作为模板引物，在活性测定用反应液(25mM TAPS buffer(pH9.3、25℃)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM巯基乙醇、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-32P”dCTP、0.25mg/ml活化鲑鱼精子DNA)中，74℃下、30分钟内，将10nmol的全核苷酸掺入不溶性沉淀物的活性定义为1U。
作为上述核苷三磷酸，通常可以列举dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反应液中的dNTP的添加比例没有特别限制，例如0.01～1mmol/L，优选0.05～0.5mmol/L，更优选0.1～0.3mmol/L。
上述引物可以根据目标核酸的序列、长度适宜地决定。引物的长度一般为10～50bp左右。上述反应液中的引物的添加比例没有特别限制，例如0.01～5μmol/L，优选0.1～3μmol/L，更优选0.1～1μmol/L。
作为上述溶剂，可以列举例如三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等缓冲液，可以使用市售的PCR用缓冲液或市售的PCR试剂盒的缓冲液等。
又，上述PCR反应液可以进一步含有甘油、肝素、三甲铵乙内酯等，例如其添加比例只要设定为不干扰PCR反应的范围即可。
PCR的循环条件没有特别限制，例如，(1)解离为单链DNA，(2)引物的退火，(3)引物的延伸(聚合酶反应)都依照以下的设定。又，虽然循环次数也没有特别限制，以以下(1)～(3)的3步为1循环时，例如优选30循环以上。虽然上限没有特别限制，为例如合计100循环以下，优选70循环以下，更优选50循环以下。各步的温度变化例如可以使用热循环仪等自动控制。
[表1]
如上所述制造与目标核酸互补的扩增产物，可以得到通过光学手段检测时不易受混浊、沉淀物等影响的扩增产物。
又，在全血样品中的目标核酸是RNA(mRNA、总RNA)的情况下，除例如通过逆转录反应由上述RNA产生cDNA，使用上述cDNA作为PCR的模板以外，可以与上述一样进行PCR(即，逆转录PCR(REVERSE TRANSCRIPTION PCR))。
逆转录反应可以例如在含有现有公知的逆转录酶、对应于上述RNA的引物和核苷三磷酸(dNTP)的逆转录反应液中添加上述全血样品而进行。上述反应液中的全血样品的添加比例可以例如设定为与上述PCR反应液中的添加比例一致。
此逆转录反应通常在上述PCR反应之前进行。虽然可以例如在逆转录反应后，在其反应液中进一步添加PCR反应液的组成成分，但是，为了简便而且可以减少污染的危险性，优选在1个反应体系内连续进行逆转录反应和PCR反应(即，一步PCR(One-Step RT-PCR)法)。
逆转录反应的反应条件虽没有特别限制，但反应温度为例如30～70℃，反应时间为1～120分钟；优选反应温度40～60℃，反应时间10～60分钟；更优选反应温度45～50℃，反应时间20～40分钟。
扩增产物的分析方法
如上所述，本发明的扩增产物的分析方法，其特征在于，其是对通过PCR生成的扩增产物进行定性或定量的扩增产物的分析方法，含有以下(A)～(B)的工序。
(A)使用本发明的扩增产物的制造方法生成与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的工序。
(B)使用光学手段检测上述扩增产物的工序。
本发明的分析方法的特征在于，在生成扩增产物的工序中，如上所述，将PCR反应液中的全血样品设定为上述添加比例。由此，可以抑制沉淀物、混浊等的影响，可以使用光学手段高精度进行扩增产物的检测。所以，本发明的分析方法中，只要PCR反应液中的全血样品的比例在上述范围内即可，对于其它的条件或工序等没有任何限制。
实时定量PCR法一般是指在PCR中随时间监测扩增产物的产生过程的方法。以下，在本发明中，将上述(B)工序“通过光学手段检测扩增产物的工序”称为实时定量PCR。另外，上述(B)工序中的扩增产物的检测例如可以在上述(A)工序完成时或完成后、即PCR反应完成时或完成后进行，也可以与上述(A)工序同时进行。与上述(A)工序同时进行的情况下，上述(B)工序中的扩增产物的检测例如可以随时间进行。随时间检测(监测)可以是例如连续的，也可以是非连续(间断)的。又，也可以仅在上述(A)工序中PCR反应过程中监测。
通过上述方法生成的扩增产物的检测可以通过测定上述扩增产物产生的荧光强度来进行。作为荧光检测没有特别限制，有现有公知的嵌入法、Taq Man(商标)探针法、杂交法(hybri dization)、环状探针法(cycling probe)等。
嵌入法是使用能嵌入双链DNA、照射激发光后可产生荧光的嵌入剂的方法。利用此方法的情况下，可以例如预先在上述PCR反应液中添加上述嵌入剂，用激发光照射上述反应液(上述反应液中的嵌入剂)，测定通过上述嵌入剂产生的荧光。
Taq Man(商标)探针法是使用与PCR的模板互补的部分序列且其上含有荧光物质和猝灭剂的探针的方法。作为上述探针，可以列举在与模板的目标序列特异性退火的寡核苷酸的末端分别标记有荧光物质(5’末端)和猝灭剂(3’末端)的探针。上述探针虽没有特别限制，但是优选例如20～30mer左右的寡核苷酸。利用此方法的情况下，可以例如预先在PCR反应液中添加上述探针，用激发光照射上述反应液(上述反应液中的荧光物质)，测定上述荧光物质产生的荧光。此方法是基于如下原理：在PCR反应液中，上述探针仅与模板退火，虽使用激发光照射，但上述猝灭剂会抑制荧光物质的荧光，但是如果延伸工序中DNA发生了延伸，上述探针由于DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性而被分解，荧光物质与猝灭剂分离从而产生荧光。
杂交法是使用2种与PCR的模板互补的部分序列、且相互邻近的探针的方法。作为上述两种探针，可以列举例如与模板的3’端退火且3’末端用受体荧光物质标记的寡核苷酸探针和与模板的5’端退火且5’末端用供体荧光物质标记的寡核苷酸探针的组合。利用此方法的情况下，可以例如预先在PCR反应液中添加上述两种探针，用激发光照射上述反应液(上述反应液中的受体荧光物质)，测定上述受体荧光物质产生的荧光。此方法是基于如下原理：在PCR反应液中，若上述两种探针与模板退火，各受体荧光物质和供体荧光物质接近而产生荧光，如果延伸工序中DNA发生了延伸，由于被受体荧光物质标记的探针分解，由于受体荧光物质与供体荧光物质分离从而荧光消失。
环状探针法是使用与PCR的模板互补的序列、末端分别被荧光物质(5’末端)和猝灭剂(3’末端)标记且仅仅中央部分是RNA序列(核糖核苷酸序列)的探针的方法。利用此方法的情况下，可以例如预先在PCR反应液中添加上述探针和RNaseH，用激发光照射上述反应液(上述反应液中的荧光物质)，测定上述荧光物质产生的荧光。此方法是基于如下原理：在PCR反应液中，上述探针仅与模板退火，虽使用激发光照射，但上述猝灭剂会抑制荧光物质的荧光，但是如果RNaseH切断了形成嵌合体双链的RNA部分，由于两端的荧光物质和猝灭剂分离从而产生荧光，若RNA部位中存在错配则不发生由RNaseH进行的切断。
荧光强度的检测可以使用例如荧光光度计进行。又，一般使用同时具备PCR反应单元(例如热循环仪)和光学系统单元(例如荧光光度计)的装置。作为具体例，可以列举市售的SmartCycler(商品名，takara-bio公司产)、Light Cycler(商品名，roche-diagnostics公司产)、ABI PRISM7000(商品名，AppliedBiosystems公司产)。
若使用这样的光学手段进行检测，可以例如对扩增产物定性(有无扩增或有无模板核酸)以及定量(扩增产物的量)。实时定量PCR中，通常对每个循环的荧光强度作图来制作扩增曲线，分析扩增产物达到设定值(阈值：例如，扩增停止的量)的循环次数(Ct值：Threshold Cycle)。根据此分析内容，可以对扩增产物定性或定量，同时也可以对全血样品中所含的目标核酸进行定性和定量。另外，阈值的设定或定量方法可以应用现有已知的方法。又，若在PCR反应完成后，应用上述光学手段检测(分析)反应液的温度上升时扩增产物的熔解温度(Tm值)，例如可以确认所得扩增产物是一种还是一种以上。
目标核酸的分析方法
接下来，本发明的目标核酸的分析方法是如上所述的对样品中所含的目标核酸进行定量的目标核酸的分析方法，其特征在于，上述样品是全血样品，上述方法包括下述(A)～(C)的工序。
(A)通过本发明的扩增产物的制造方法生成与全血样品中的目标核酸互补的扩增产物的工序。
(B)通过光学手段检测上述扩增产物，对上述扩增产物进行定量的工序。
(C)通过对上述扩增产物到达设定量时的PCR循环次数进行计数，对上述全血样品中所含的目标核酸进行定量的工序。
本发明中，上述(A)工序和(B)工序相当于上述本发明的扩增产物的分析方法。本发明的特征在于，在生成扩增产物的工序中，如上所述，将PCR反应液中的全血样品设定为上述添加比例。由此，可以抑制沉淀物、混浊等的影响，可以使用光学手段高精度进行扩增产物的检测，结果可以高精度分析目的核酸。所以，本发明的分析方法中，PCR反应液中的全血样品的比例只要在上述范围内即可，对于其它的条件、工序等没有任何限制。
通常PCR中，若扩增产物达到一定的量(阈值)，则不会产生超过此量的扩增。因此，若仅仅测定最终产生的扩增产物的量，则难以对全血样品中的目标核酸的量进行定量。但是，如果如上所述通过实时定量PCR，由于监测每循环的扩增产物的产生，对达到设定的阈值时的循环次数(Ct值)进行计数，可以例如基于阈值和Ct值对全血样品中所含的目标核酸进行定量。
实施例
以下，对本发明的实施例、比较例一并进行说明。但是，本发明并受下述实施例和比较例的限定。
[实施例1]
本实施例是将PCR反应液中全血样品的添加比例设定为各种值来进行PCR，对得到的扩增产物的Tm进行分析的例子。作为引物，使用由序列号1和2表示的forward primer GH20(商品名，Takara公司产)、reverse primer GH21(商品名，Takara公司产)，扩增β-球蛋白(人)中的408bp的区域。又，作为用于确认PCR的扩增的荧光物质，使用商品名为SYBER GreenI的嵌入剂。
序列号1(forward primer GH20)
5’—gaagagccaaggacaggtac—3’
序列号2(reverse primer GH21)
5’—ggaaaatagaccaataggcag—3’
将健康人的全血以设定的添加比例(0.02、0.025、0.033、0.036、0.038、0.042、0.045、0.05、0.056、0.0625、0.071、0.083、0.1、0.125、0.17、0.25、0.29、0.33、0.4、0.5、0.67、1、2、2.5、3.3、5、10体积％)添加入下述PCR反应液中。使用扩增装置根据下述条件对上述PCR反应液进行PCR反应。此后，对于PCR反应后的反应液，使用波长515～555nm测定荧光值(％)，进行Tm分析。Tm分析的条件如下。另外，作为上述扩增装置，使用由热循环仪(商品名Eppendorf Master Cycler epS：Eppendorf公司产)和下述光学系统(商品名Arkray systemVer.4)组合的装置(其它的实施例也同样)，进行PCR和Tm的分析(参考WO2005/118772)。
[表2]
(PCR反应液)
[表3]
发光元件LED(Epitex Inc产)
受光元件PD(型号：6931：Hamamatsu Photonics K.K.产)
[表4]
其结果由图1表示。图1是表示PCR反应液中的全血样品添加比例和荧光值的关系的图。该图中，纵轴为荧光值(％)，横轴为PCR反应液中全血样品的添加比例(终浓度：体积％)。
其结果如图1所示，PCR反应液中的全血的添加比例为高浓度(特别是2体积％以上)的情况下，不能使用荧光测定确认PCR的扩增。推测这是因为PCR反应中，上升反应液中产生沉淀物、混浊等，所以照射光被遮住。相对的，如图1所示，将PCR反应液中全血添加比例设定为0.5体积％以下，则PCR扩增产物的荧光测定完全可以进行。推测这是因为充分保持了PCR的扩增效率且抑制了混浊等的产生。其结果可以说：通过将全血添加比例设定在上述范围内，可以例如不对全血样品进行前处理而对目标核酸进行定性或定量。
[实施例2]
本实施例是在PCR反应液中进一步添加BSA，对得到的扩增产物进行Tm分析的例子。又，除了添加0.4重量％的BSA之外，与上述实施例1一样，与未添加BSA的系统一样的进行测定。其结果由图2表示。图2是表示PCR反应液中的全血样品添加比例和荧光值的关系的图。该图中，■表示添加BSA的结果，◆表示未添加BSA的结果。
如该图所示，通过在PCR反应液中添加BSA，与未添加的结果比较，发现荧光值进一步增加。特别是对于在PCR反应液中血液添加比例(体积％)为0.5体积％以下的样品，与未添加BSA的结果相比，可以看到更进一步增加。根据此结果，通过将PCR反应液中的血液添加比例设定为0.5体积％以下，并进一步添加BSA，能够更加可靠地测定PCR扩增物的荧光。
[实施例3]
确认了添加BSA对加热产生的沉淀物等的生成的影响。又，由于上述影响是通过荧光测定中对光的阻挡来确认的，因此仅仅进行热处理，没有使用PCR进行扩增反应。具体而言，向下述组成的反应液中，使全血的添加比例为0.4体积％，而BSA以设定的添加比例(0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32、0.36、0.4、0.44、0.48、0.52、0.56、0.6、0.64、0.68、0.72、0.76、0.8％)分别添加。此后，使用与上述实施例1同样的装置，将上述反应液在95℃下处理5分钟后，进行Tm分析(测定波长515～555nm)。其结果以图3表示。图3是表示反应液中BSA的浓度和荧光值的关系的图。
[表5]
如该图所示，确认通过添加BSA可增加荧光值。特别确认通过将BSA添加比例设定为0.2体积％以上时，荧光值的增加显著。推测这是因为通过添加BSA抑制了沉淀物等的产生。由此结果可知，确认通过将PCR反应液中血液添加比例设定为0.5体积％以下，进一步添加BSA(特别是0.2体积％以上)，可更加准确地测定PCR扩增物的荧光。
[实施例4]
本实施例是在PCR反应前加热全血的稀释样品的基础上，将PCR反应液中全血的添加比例设定为特定的比例，进行PCR和Tm分析。
使用由序列号3和4表示的正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)作为引物，扩增胰淀素(amylin)基因上的105bp的区域。又，为了确认PCR的扩增，使用由序列号5表示的下述探针。
序列号3(正向引物)
5’—cacatgtgcaacgcagcg—3’
序列号4(反向引物)
5’—ctcttgccatatgtattggatccc—3’
序列号5(检测用探针)
5’—(FAM)-ttcattccagcaacaactttggtgccattctctc-(DABCYL)—3’
将使用肝素采血管采集的健康人的全血10μl添加入90μl的下述分析物稀释液1，混合。将此混合液10μl添加入90μl的下述分析物稀释液2，混合。以此作为稀释样品。进一步，在95℃对10μl上述稀释样品加热处理5分钟。此后，使用非加热的稀释样品10μl或加热后的稀释样品10μl，使用下述组成的PCR反应液进行实时定量PCR。同时，对每份样品进行3次分析(n＝3)。
(分析物稀释液1：以下同样)
10mM Tris-HCl(pH8)
0.1mM EDTA
0.05％NaN3
0.3％SDS
(分析物稀释液2：以下同样)
10mM Tris-HCl(pH8)
0.1mM EDTA
0.05％NaN3
[表6]
(PCR反应液：单位μl)
*商品名Gene Taq NT(nippongene公司产)
**尿嘧啶-N-糖苷酶(uracil-N-glycosylase)
上述实时定量PCR的条件如下。使用i-Cycler(商品名，BIO-RAD公司产)，50℃下2分钟，95℃下2分钟处理后，以95℃、15秒和56℃、45秒作为一个循环，重复50个循环。并且，在各循环中56℃、45秒的步骤中，使用波长530nm监测上述检测用探针中FAM的荧光。
在下表中显示使用上述i-Cycler计算的Ct(ThresholdCycle)的值。如上所述，Ct表示与扩增产物的量相关的荧光值达到设定值(阈值)时的循环次数。上述阈值也使用i-Cycler算出，本实施例中荧光值的阈值是184.2。同时，根据实时定量PCR的原理，可以判断Ct值相对越小，初始模板量相对越多。
[表7]
又，图4的图中分别显示对非加热的稀释样品和加热的稀释样品的测定值(n＝3)的平均值。图4是表示各样品的循环次数和荧光值的关系的图，粗线表示加热处理的稀释样品的结果，细线表示非加热处理的稀释样品的结果。
如上述表7所示，通过预先对稀释样品进行加热处理，与非加热的稀释样品相比，Ct值平均减少了1.7个循环。这意味着通过加热处理，初始模板量多了约3.2倍。又，如图4所示，以图表表示的情况下，与非加热的稀释样品比较，明显发现加热处理的稀释样品的荧光值从30个循环附近开始增加。通过上述的实施例可知，通过将PCR反应液中的全血样品的比例设定在特定范围内，可以充分保持PCR的扩增效率且可以抑制混浊等的影响。进而，通过本实施例也发现在PCR反应前加热稀释样品可以进一步提高PCR的扩增效率。
[实施例5]
除使用采用EDTA采血管代替肝素采血管采集到的健康人的全血10μl以外，与上述实施例4一样进行实时定量PCR。
在下表8中显示使用上述i-Cycler计算的Ct值。又，图5中分别显示对非加热的稀释样品和加热的稀释样品的测定值(n＝3)的平均值。图5是表示各样品循环次数和荧光值的关系的图，粗线表示加热处理的稀释样品的结果，细线表示非加热处理的稀释样品的结果。
[表8]
如上述表8所示，通过预先对稀释样品进行加热处理，与非加热的稀释样品相比，Ct值平均减少了2.4个循环。这意味着通过加热处理，初始模板量多了约5.3倍。又，如图5所示，以图表表示的情况下，与非加热的稀释样品比较，明显发现加热处理的稀释样品的荧光值从30个循环附近开始增加。通过上述的实施例可知，通过将PCR反应液中的全血样品的比例设定在特定范围内，可以充分保持PCR的扩增效率且可以抑制混浊等的产生。进而，通过本实施例也发现在PCR反应前加热全血样品可以进一步提高PCR的扩增效率。
[实施例6]
本实施例是在PCR反应前在设定的温度下加热全血的稀释样品的基础上，将PCR反应液中全血的添加比例设定为特定的比例，进行PCR和Tm分析。
使用与上述实施例4相同的正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)作为引物。又，为了确认PCR的扩增，使用由序列号6表示的下述探针。
序列号6(检测用探针)
5’—(FAM)—ttggtagatgagagaatggcaccaaagttgttgc—(DABCYL)—3’
将使用EDTA采血管采集的健康人的全血10μl添加入90μl的前述分析物稀释液1，混合。将此混合液10μl添加入90μl的前述分析物稀释液2，混合。以此作为稀释样品。进一步，在特定的温度下(99℃、95℃、90℃、85℃、80℃)对10μl上述稀释样品加热处理5分钟。此后，使用非加热的稀释样品10μl或加热后的稀释样品10μl，通过下述组成的PCR反应液进行实时定量PCR。实时定量PCR的条件与上述实施例4相同。
[表9]
(PCR反应液：单位μl)
*商品名Gene Taq NT(nippongene公司产)
下表中显示使用上述i-Cycler计算的Ct值。本实施例中荧光值的阈值是335.2。
[表10]
如上述表所示，预先在80℃～99℃对稀释样品进行加热处理的情况下，与非加热的稀释样品的Ct的差在0.6个循环以上。0.6个循环以上意味初始模板量为约1.5倍以上。因此，发现在80℃以上加热处理稀释样品可以进一步提高P CR的扩增效率。同时也发现加热温度相对越高，扩增效率相对提高越多。
[实施例7]
本实施例是在PCR反应前在80℃或99℃下对全血的稀释样品加热特定的时间的基础上，将PCR反应液中全血的添加比例设定为特定的比例，进行PCR和Tm分析。
除以80℃或99℃作为加热温度，将加热处理的时间设定为特定的时间(30秒、1分钟、3分钟、10分钟、15分钟)之外，与上述实施例6一样，进行实时定量PCR。
下表中显示使用上述i-Cycler计算的Ct的值。本实施例中荧光值的阈值是165.4。
[表11]
如上述表所示，预先在80℃或99℃对稀释样品加热处理30秒以上的情况下，与非加热的稀释样品的Ct值的差在0.6个循环以上。如前所述，0.6个循环以上意味初始模板量为约1.5倍以上。因此，发现在80℃以上加热处理30秒以上稀释样品，可以进一步提高PCR的扩增效率。
产业上的利用可能性
如上所述，若使用本发明的扩增产物的制造方法，只要将PCR反应液中的全血样品的添加比例设定在上述范围，就可以无需进行如现有技术中的全血样品的前处理或PCR反应液的后处理等而抑制混浊、沉淀等对检测的影响。因此，由于这样可以抑制混浊、沉淀等的影响，不使用传统的电泳而使用光学手段也可以检测扩增产物。而且，由于可以使用光学手段检测，可以实现使用电泳不能进行的扩增产物生成过程中的随时间监测。因此，根据本发明，即使在使用全血样品的情况下，例如，不仅可以进行扩增产物的定性、定量，也可以进行全血样品中的目标核酸的定性、定量。

Claims (12)

1.扩增产物的分析方法，其对通过PCR生成的扩增产物进行定性或定量，其特征在于，含有以下(A)～(B)的工序，
(A)通过PCR生成与全血样品中的全血来源的目标核酸互补的扩增产物的工序，其中在PCR反应液中，所述全血样品的添加比例是0.01～0.9体积％，
(B)通过光学手段检测PCR反应液中的所述扩增产物的工序。
2.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，在所述(B)工序中，随时间检测所述扩增产物。
3.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，通过测定所述扩增产物产生的荧光来检测所述扩增产物。
4.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，所述光学手段是荧光光度计。
5.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，PCR反应液中还含有能嵌入双链DNA的嵌入剂，
在所述(B)工序中，通过测定向所述嵌入剂照射激发光而产生的荧光来检测所述扩增产物。
6.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，PCR反应液中还含有探针，所述探针带有荧光物质和猝灭剂且作为与PCR的模板互补的部分序列，
在所述(B)工序中，通过测定向所述荧光物质照射激发光而产生的荧光来检测所述扩增产物。
7.根据权利要求1所述的扩增产物的分析方法，在所述(B)工序中，所述扩增产物的检测方法是Tm分析。
8.目标核酸的分析方法，其是对样品中所含的目标核酸进行定量的目标核酸的分析方法，其特征在于，所述样品是全血样品，所述方法包括下述(A)～(C)的工序，
(A)通过PCR生成与全血样品中的全血来源的目标核酸互补的扩增产物的工序，其中在PCR反应液中，所述全血样品的添加比例是0.01～0.9体积％，
(B)通过光学手段检测PCR反应液中的所述扩增产物，对所述扩增产物进行定量的工序，
(C)通过对所述扩增产物到达设定量时的PCR循环次数进行计数，对所述全血样品中所含的全血来源的目标核酸进行定量的工序。
9.根据权利要求8所述的目标核酸的分析方法，在所述(B)工序中，随时间检测所述扩增产物。
10.根据权利要求8所述的目标核酸的分析方法，通过测定所述扩增产物产生的荧光来检测所述扩增产物。
11.根据权利要求8所述的目标核酸的分析方法，所述光学手段是荧光光度计。
12.根据权利要求8所述的目标核酸的分析方法，在所述(B)工序中，所述扩增产物的检测方法是Tm分析。
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