WO2021167058A1 - 乾燥濾紙血片を用いた標的核酸の検出方法 - Google Patents

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海老沼　宏幸
郁美 鈴木
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid by real-time PCR. More specifically, the present invention is included in dry filter paper blood by delaying the timing of fluorescence detection from the start of the PCR cycle in a method of detecting a target nucleic acid in dry filter paper blood by real-time PCR using a fluorescent dye. The present invention relates to a method for specifically detecting a target nucleic acid.
  • filter paper blood (hereinafter sometimes referred to as dried filter paper blood or simply filter paper blood) that has been dried after soaking blood in the filter paper is used as a sample.
  • Primary Immunodeficiency Disease (PID) and Spinal Muscular Atrophy (SMA) can be mentioned. Since the dried filter paper blood used for the test contains a large amount of substances (hemoglobin, etc.) that inhibit the PCR amplification reaction, a method of extracting and purifying nucleic acid from the filter paper blood is generally used as a sample. ..
  • reagents that reduce the effects of PCR reaction inhibitors due to impurities in the sample are also commercially available (manufactured by Shimadzu Corporation; Ampdirect (registered trademark)). Using this reagent, it is possible to carry out a PCR reaction directly from dried filter paper blood, and a technique for confirming the presence or absence of a target gene in dried filter paper blood by detecting the PCR amplification product by electrophoresis has been disclosed. (Patent Document 1).
  • the dried filter paper blood is soaked in blood in the filter paper, dried, and taken out as punch hole-shaped sections (sometimes referred to as dry filter paper blood punch pieces in the present specification) by a punching tool, and then the target nucleic acid. Used to detect.
  • the present inventors set the size of the punch piece, the total blood volume contained in the punch piece, and the amount of the PCR reaction reagent within a predetermined range, and by attaching a cap to the PCR reaction tube at the time of the PCR reaction.
  • a patent application has been filed for finding a method capable of amplifying a target nucleic acid directly from dried filter paper blood by real-time PCR and optically detecting and quantifying the amplified product without performing complicated pretreatment as in the past (Japanese Patent Application No. 2019-166510).
  • An object of the present invention is to provide a method for reducing the influence of baseline disturbance by a simple method in a method of detecting a target nucleic acid in a dried filter paper blood punch piece by real-time PCR using a fluorescent dye. ..
  • the present invention in a method of detecting a target nucleic acid in a dry filter paper blood punch piece by real-time PCR using a fluorescently labeled probe, a baseline disorder caused by impurities contained in the dry filter paper blood is caused.
  • a baseline disorder caused by impurities contained in the dry filter paper blood is caused.
  • the baseline is disturbed for convenience.
  • Method for detecting target nucleic acid in dry filter paper blood by real-time PCR including the following steps; (1) A step of amplifying a target nucleic acid in dry filter paper blood by subjecting a sample solution containing a dry filter paper blood punch piece and a PCR reagent to a thermal cycle, wherein the PCR reagent contains a fluorescently labeled probe (1). 2) Step of optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle (3) Step of quantitatively analyzing the target nucleic acid using the data after a predetermined number of cycles among the optically detected data ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the predetermined number of cycles in (3) is 10 cycles or more and 25 cycles or less.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the data after the predetermined number of cycles in (3) is the data obtained by optical detection started later than the start of the thermal cycle.
  • the PCR reagent contains at least a primer, a polymerase and dNTP in addition to a fluorescently labeled probe.
  • the fluorescently labeled probe had a fluorescent substance and a quencher and contained a partial sequence complementary to a template for a nucleic acid amplification reaction, and was amplified by detecting fluorescence generated by irradiation of the fluorescent substance with excitation light.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the fluorescent label has a fluorescence detection wavelength in the range of 500 nm to 600 nm.
  • the target nucleic acid is a nucleic acid of one or more genes selected from the group consisting of TREC, KREC and SMN1.
  • the step (2) of optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle is a step based on the photometric parameters set in the thermal cycler, and unphotometric parameters are set for a predetermined number of cycles from the start of the thermal cycle.
  • a method for reducing baseline disturbance in a method for detecting a target nucleic acid in dry filter paper blood by real-time PCR which comprises the following steps.
  • Step of optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle (3) Step of quantitatively analyzing the target nucleic acid using the data after a predetermined number of cycles among the optically detected data ⁇ 10>
  • ⁇ 11> The method according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, wherein the data after the predetermined number of cycles in (3) is the data obtained by optical detection started later than the start of the thermal cycle.
  • ⁇ 12> The method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, wherein the PCR reagent contains at least a primer, a polymerase and dNTP in addition to the fluorescently labeled probe.
  • the fluorescently labeled probe had a fluorescent substance and a quencher and contained a partial sequence complementary to a template for a nucleic acid amplification reaction, and was amplified by detecting fluorescence generated by irradiation of the fluorescent substance with excitation light.
  • the fluorescent label has a fluorescence detection wavelength in the range of 500 nm to 600 nm.
  • the target nucleic acid is a nucleic acid of one or more genes selected from the group consisting of TREC, KREC and SMN1.
  • the step of optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle in (2) is a step based on the photometric parameters set in the thermal cycler, and the unphotometric parameters are set for a predetermined number of cycles from the start of the thermal cycle.
  • the dried filter paper blood is directly subjected to real-time PCR without pretreatment, and the target nucleic acid in the dried filter paper blood punch piece is amplified by real-time PCR using a fluorescently labeled probe to detect the amplified product.
  • this method it has become possible to detect and quantify while preventing erroneous judgment due to defective baseline.
  • the dried filter paper blood used in the present invention is blood (whole blood) in a filter paper that has been dried after containing whole blood in the filter paper (filter paper), and may be simply referred to as dried filter paper blood.
  • Dried filter paper Blood is usually cut from dried filter paper soaked with blood and used as a piece of paper. Typically, it is taken out as a punched hole-shaped section (punch piece) by a punching tool.
  • a section of the filter paper in the shape of a punch piece containing blood is particularly referred to as a dry filter paper blood punch piece.
  • the size of the punch piece used in the present invention preferably has a predetermined range of the amount of blood contained in the reaction solution, preferably 1.2 to 2.0 mm in diameter, and 1.5 mm to 1.8 mm. Even more desirable.
  • the total blood volume contained in the punch piece is preferably 0.95 v / v% to 6.6 v / v% with respect to the total amount of the PCR reaction solution when converted from the size of the punch piece, and is 1.4 v / v. % To 5.2 v / v% is even more desirable.
  • the dry filter paper blood used in the present invention includes, for example, filter paper blood collected from the heel of a newborn baby such as newborn mass screening, and filter paper blood collected at the same time as optional screening, but is not limited thereto.
  • the target nucleic acid in the present invention is not particularly limited, and includes DNA and RNA derived from whole blood, as well as foreign nucleic acids introduced into whole blood by a virus or the like.
  • nucleic acids derived from whole blood of newborns are preferable, and more specifically, nucleic acids derived from genes such as TREC, KREC, SMN1 and SMN2 can be mentioned.
  • the PCR method involves repeating a thermal cycle in the presence of a target nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), a pair of primer sets, and a polymerase, with a temperature change consisting of denaturation, annealing, and extension steps as one cycle. Therefore, it is widely used as a method for exponentially amplifying the region of the target nucleic acid sandwiched between the primer sets.
  • the number of thermal cycles varies depending on various reagents, samples, and reaction time, but is usually about 25 to 40.
  • the real-time PCR method means a method of monitoring the production process of an amplification product of a target nucleic acid by the PCR method over time by optical means or the like.
  • optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle means optically detecting the fluorescence intensity produced in the sample solution at the end of each thermal cycle.
  • the "step of quantitatively analyzing the target nucleic acid using the data after a predetermined number of cycles among the optically detected data" is roughly described in the following two ways.
  • Optical detection is started later than the start of the thermal cycle, and analysis is performed using the data obtained by this delayed optical detection.
  • Fluorescence intensity is detected from the start of the thermal cycle.
  • the detection data from the start of the thermal cycle to the predetermined number of cycles is not intentionally used, and the "optical detection is the thermal cycle" in the step (1) of quantitatively analyzing the target nucleic acid using the detection data after the predetermined number of cycles.
  • Starts later than the start of means that, conventionally, optical detection is started at the same time as the start of the thermal cycle, and fluorescence intensity is detected from the end of the first cycle. This means that the fluorescence intensity is not intentionally detected from the start of the thermal cycle to the predetermined number of cycles, and the fluorescence intensity is detected from the time when the predetermined number of cycles is exceeded.
  • the predetermined number of cycles may be any number of cycles until the baseline stabilizes, and may be appropriately set depending on the type of fluorescent dye used, the amount of hemoglobin in the sample, and the like.
  • the detection data from the start of the thermal cycle to the predetermined number of cycles is not intentionally used, and the detection data after the predetermined number of cycles is used to quantify the target nucleic acid.
  • the “step of performing analysis” is usually performed by arbitrarily setting the cycle width and correcting the baseline after the measurement is completed.
  • the predetermined number of cycles a maximum of 25 cycles is desirable, and in some cases, 20 cycles or less is desirable.
  • the predetermined number of cycles is preferably at least 5 cycles or more, and may be preferably 10 cycles or more. From the above, the predetermined number of cycles in the present invention is preferably 5 cycles or more and 25 cycles or less, and 10 cycles or more and 25 cycles or less may be preferable.
  • the thermal cycle conditions (temperature and time) in the PCR reaction of the present invention can be arbitrarily set using a thermal cycler or the like, and the detection of fluorescence intensity is arbitrary based on the photometric parameters set for each thermal cycle. It is possible to control.
  • the optical detection can be started later than the start of the thermal cycle. .. Therefore, the optical detection step of setting the unphotometric parameter and the subsequent photometric parameter after the elapse of a predetermined cycle is also included in the step of "optical detection is started later than the start of the thermal cycle" of the present invention.
  • the amplification product of the target nucleic acid produced by the PCR reaction can be detected by optically detecting the fluorescence intensity generated from the amplification product.
  • fluorescence detection of the present invention fluorescence is generated by irradiating the fluorescent substance of the fluorescently labeled probe with excitation light, and the amplified target nucleic acid can be detected or quantified by optically detecting this.
  • the fluorescently labeled probe include a TaqMan (registered trademark) probe, a cycling probe, a FRET probe and the like.
  • Fluorescence intensity can be detected by, for example, a fluorometer.
  • devices generally include both a PCR reaction unit (eg, a thermal cycler) and an optical system unit (eg, a fluorometer) are used.
  • a PCR reaction unit eg, a thermal cycler
  • an optical system unit eg, a fluorometer
  • Specific examples include commercially available SmartCycler (trade name, manufactured by Takara Bio Inc.), light cycler (trade name, manufactured by Roche Diagnostics), ABI PRISM7000 (trade name, manufactured by Applied Biosystems), and the like. ..
  • the PCR reagents used in the present invention include fluorescently labeled probes, and at least include primer sets, polymerases, and various dNTPs (deoxynucleoside triphosphates). It is desirable that the fluorescently labeled probe of the present invention has a fluorescent substance and a quencher and contains a partial sequence complementary to a template for a nucleic acid amplification reaction.
  • the fluorescent dye for the fluorescent labeling probe may be any known fluorescent dye, for example, Alexa Fluor series, CAL Fluor series, Cy series, ATTO series, DY series, DyLight series, Quasar series, FAM, TAMRA, TET, JOE.
  • the PCR reagent also usually contains a buffer.
  • a buffer acts to suppress the action of substances that inhibit the DNA amplification reaction, such as positively charged substances (certain proteins, etc.) and negatively charged substances (certain sugars, pigments, etc.) that exist in the body fluids of living organisms. It is not particularly limited as long as it has a buffer. Examples of commercially available products include Ampdirect and Ampdirect plus (both manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the method for quantifying the target nucleic acid of the present invention is a method in which an amplification product complementary to the target nucleic acid in dried filter paper blood is generated by real-time PCR, the amplification product is detected by optical means, and the amplification product is quantified. be.
  • the target nucleic acid contained in the dried filter paper blood can be quantified. Further, as in the examples described later, the number of copies of 1 ⁇ L of whole blood in the dried filter paper blood can be converted and quantified from the calibration curve of the Cq value calculated from the standard product.
  • the method for detecting the target nucleic acid of the dried filter paper blood of the target nucleic acid of the present invention by real-time PCR includes the following steps (1) and (2).
  • Step of optically detecting the fluorescence intensity of the sample solution for each thermal cycle (3) Step of quantitative analysis of the target nucleic acid using the data after a predetermined number of cycles among the optically detected data
  • the step (1) is preferably a step including the following steps (A) to (C).
  • (A) Step of adding dried filter paper blood to a tube for PCR reaction (B) A step of adding a PCR reagent to a tube for PCR reaction, wherein the PCR reagent contains a fluorescently labeled probe (C).
  • a step of amplifying a target nucleic acid in dry filter paper blood by subjecting a sample solution containing a dry filter paper blood punch piece and a PCR reagent to a plurality of thermal cycles.
  • the steps (A) and (B) may be performed first or at the same time, but it is desirable to perform the step (B) after the step (A). This is because by performing (A) first, even if the filter paper adheres to the wall surface of the tube or the like, it is more certain that the filter paper is contained in the bottom of the tube by the reagent solution. It is also desirable to perform centrifugation or the like to ensure that the punch pieces are contained in the bottom of the tube before the start of the PCR reaction. Further, in the present invention, it is preferable to start the thermal cycle after sealing the reaction tube with a cap in the PCR reaction, thereby suppressing the generation of bubbles due to the thermal cycle and suppressing the vibration without raising the punch piece. be able to. In the present invention, "performing a thermal cycle” means repeatedly changing the temperature and also performing thermal cycling. Further, specifically, a device called a thermal cycler is used to repeatedly apply a temperature change to the PCR reaction solution.
  • the baseline disturbance can be reduced by the step of quantitatively analyzing the target nucleic acid using the data after a predetermined number of cycles.
  • the present invention can be said to be, in other words, a method for reducing baseline disturbance in a method for detecting a target nucleic acid in dried filter paper blood by real-time PCR.
  • the reason for the reduction in baseline turbulence is unclear, but the extent to which the hemoglobin protein absorbs noise, probably due to contaminants in dried filter paper blood, and the fluorescence produced by the fluorescently labeled probe in the PCR reaction. Is increasing or decreasing with the number of thermal cycles, and it is speculated that it is causing some fluctuation in the baseline.
  • the target nucleic acid contained in the dried filter paper blood punch piece can be accurately and optically detected and quantified by direct real-time PCR without complicated pretreatment.
  • the tube used in the present invention is a tube for PCR reaction, and may have a structure in which a dried filter paper blood punch piece can be smoothly inserted and can be sealed by a cap. Further, it is preferable that the opening at the upper part of the tube is circular (for example, about 2.5 mm to 10 mm in inner diameter) and the bottom is narrower than the opening at the upper part, and an inverted conical shape or the like is preferable.
  • the volume of the tube may be as long as it can sufficiently accommodate the reaction solution even when the PCR reaction reagent is added and the temperature changes due to the PCR reaction, preferably 0.1 mL to 0.3 mL, and more preferably 0.15 mL.
  • the PCR reaction tube used in the present invention is preferably a 96-hole tube for PCR reaction in which 96 tubes are continuous or an 8-series tube in which 8 tubes are continuous, and commercially available products include a 96-well PCR plate and a PCR 8-series tube. Those sold under such names can be used. Commercially available products include LightCycler480 Multiwell Plate 96 (Roche), 96-Well PCR Plate, Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux (Scientific Specialties, Inc.), Eppendorf PCR Plate 96, Skirtless, 150 ⁇ L.
  • the material of these reaction tubes has less contamination of the reaction solution and has a rigidity that does not change the shape even if the internal pressure changes due to the temperature change of the PCR reaction, and examples thereof include polypropylene.
  • the amount of the PCR reagent used in the present invention added to the reaction tube is preferably 20 to 50 ⁇ L.
  • A-2 Probe for RNase P Gene Detection
  • FAM fluorescence
  • the probe was created by requesting Prime Tech to synthesize it.
  • RNase P gene partial sequence (SEQ ID NO: 4) CAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGA
  • PCR Reagent The composition of the PCR reagent is shown below.
  • PCR buffer Analog Plus; Shimadzu Corporation 0.125 ⁇ M (final concentration)
  • Forward primer for RNaseP gene amplification 0.125 ⁇ M (final concentration)
  • Reverse primer for RNaseP gene amplification 0.125 ⁇ M (final concentration)
  • Probe for RNaseP gene detection 0.025 U / ⁇ L BIOTAQ HSDNA polymerase
  • Control dry filter paper blood A plasmid containing a partial sequence of the RNaseP gene was added to blood obtained by mixing a human erythrocyte fraction from which leukocytes had been removed and 1% BSA (PBS base) at a ratio of 6: 4, 10,000 copies / It was added so as to be ⁇ L, soaked in 40 ⁇ L of blood collection filter paper (Advantech), and dried as it was, which was used as control dry filter paper blood.
  • the punch piece was put into a tube for PCR reaction (manufactured by Roche: Light Cycler (R) 8-Tube Strips, manufactured by polypropylene).
  • (Iv) Real-time PCR measurement (excitation; 470 nm / detection; 514 nm) of the RNase P gene was performed with the above parameters using a thermal cycler device (Light Cycler 96; Roche).
  • the fluorescence value rises transiently, and the arithmetic unit of the device processes it as if the amplification reaction occurred at the time point (number of cycles) of the arrow part of the growth curve, and the Cq value is calculated to be very small. It was decided to be done. Therefore, when fitting to the calibration curve is performed based on the Cp value, the target nucleic acid concentration in the sample is erroneously calculated to be a concentration much higher than the actual concentration.
  • the timing of fluorescence detection is delayed from the start of the thermal cycle of PCR, and the optically detected data
  • the method of the present invention can be applied to the quantification of specific genes, for example, the TREC / KREC gene fragment quantification method which is a newborn screening test for PID and the SMN1 gene quantification method which is a newborn screening test for SMA.

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Abstract

本発明は、乾燥濾紙血中の標的核酸を、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲにより検出する方法において、簡易な方法によりベースラインの乱れの影響を軽減する方法を提供することを目的とする。　本発明は以下の工程を含む乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲに より検出する方法を提供する。 （１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程 （２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程 （３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程

Description

乾燥濾紙血片を用いた標的核酸の検出方法
　本発明は、標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法に関する。より詳しくは、本発明は、乾燥濾紙血中の標的核酸を、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲにより検出する方法において、蛍光検出するタイミングをＰＣＲのサイクル開始から遅らせることにより、乾燥濾紙血に含まれる標的核酸を特異的に検出する方法に関する。
　濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血（以下、乾燥濾紙血あるいは単に濾紙血ということがある）が検体となる新生児スクリーニング検査において、近年遺伝子検査として注目されている先天性疾患として、原発性免疫不全症(Primary Immunodeficiency Disease；ＰＩＤ)や脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy；ＳＭＡ）が挙げられる。
　その検査に用いられる乾燥濾紙血には、ＰＣＲ増幅反応を阻害する物質（ヘモグロビンなど）が多く含まれるため、一般には濾紙血から核酸を抽出し精製したものを試料とする方法が用いられている。一方、検体中の夾雑物によるＰＣＲ反応阻害物質の影響を低減している試薬も商業利用されている（株式会社島津製作所製; Ampdirect（登録商標））。
　この試薬を使用すると、乾燥濾紙血から直接ＰＣＲ反応を行うことが可能であり、そのＰＣＲ増幅産物を電気泳動で検出することにより乾燥濾紙血中の目的遺伝子の有無を確認するという技術が開示されている（特許文献１）。
　しかしながら、このような試薬を用いても、光学的手段を用いてＰＣＲ増幅産物を検出する場合には、血中に含まれるヘモグロビンやＰＣＲ反応時の熱変性により発生する血液成分の沈殿が光学的経路を阻害することにより、正確な結果を得ることができない。その為、ＰＣＲ増幅反応の際に、反応液に対して全血試料の添加割合を規定する方法が開示されている（特許文献２）。
　しかしながら、全血成分由来の影響に加えて、ＰＣＲ反応液中に存在する乾燥濾紙血由来の濾紙切片自体が光学検出の光路を妨害することもあり、影響を十分に軽減できない恐れもある。
　乾燥濾紙血は、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させ、穴あけパンチ工具によりパンチ穴形状の切片（本明細書中、乾燥濾紙血パンチ片）ということがある）として取り出された後、標的核酸の検出に使われる。本発明者らは、このようなパンチ片の大きさやパンチ片に含まれる全血量、ＰＣＲ反応試薬の量を所定の範囲とし、ＰＣＲ反応時にＰＣＲ反応チューブにキャップを装着すること等の工夫により従来のような煩雑な前処理をすることなく、乾燥濾紙血から直接標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより増幅し、当該増幅産物を光学的に検出及び定量できる方法を見出し特許出願を行っている（特願2019-166510号）。
　ところで、上記工夫によってもなお、乾燥濾紙血から直接、標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより増幅し、増幅産物を光学的に検出及び定量する方法において、乾燥濾紙血中に含まれている夾雑物が要因でベースラインの乱れが生じる場合がある。この傾向は、全血に含まれるヘモグロビンの影響を受け易いと思われる蛍光色素を適用する測定系で特に高い傾向にあった。
　ここで、リアルタイムＰＣＲにおいてノイズの多いデータに起因するベースラインの質の低下を防ぐために増幅曲線のベースラインの終点（終止サイクル）を決定する方法が提案されている（特許文献３）。本方法は、増幅曲線の導関数を算出し、得られた一次導関数のピーク解析により増幅曲線を処理することでベースラインの終点を推定する方法である。しかしながら、本方法は複雑なアルゴリズムを実行するための新たなソフトウエアを必要とする。
特開2004-283165号公報 特許第5144518号公報 特表2008-545380号公報
　本発明は、乾燥濾紙血パンチ片中の標的核酸を、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲにより検出する方法において、簡易な方法によりベースラインの乱れの影響を軽減する方法を提供することを目的とする。
　本発明では、乾燥濾紙血パンチ片中の標的核酸を、蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより検出する方法において、乾燥濾紙血中に含まれている夾雑物が要因で引き起こされる、ベースラインの乱れに対して、蛍光検出するタイミングをＰＣＲサイクル開始よりも遅らせるなど、光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行うことにより、便宜上ベースラインの乱れを検出することなく、乾燥濾紙血中の標的核酸を正確に検出及び定量する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
以下の工程を含む乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法；
（１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
（２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程
（３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程
＜２＞
前記（３）の所定サイクル数が１０サイクル以上２５サイクル以下である＜１＞に記載の方法。
＜３＞
前記（３）の所定サイクル数以降のデータが、サーマルサイクルの開始より遅れて開始される光学的検出により得られるデータである、＜1＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞
ＰＣＲ試薬は蛍光標識プローブのほかに、少なくともプライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞
前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞
蛍光標識が、５００ｎｍ～６００ｎｍの範囲の蛍光検出波長を有するものである＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞
標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子の核酸である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞
（２）のサーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程が、サーマルサイクラーに設定された測光パラメーターにもとづく工程であり、サーマルサイクル開始から所定サイクル数は未測光パラメーターが設定され、所定サイクル数以降は測光パラメーターが設定されていることにより、光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される工程である、＜３＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞
以下の工程を含む乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法におけるベースラインの乱れを低減する方法。
（１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
（２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程
（３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程
＜１０＞
前記（３）の所定サイクル数が１０サイクル以上２５サイクル以下である＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
前記（３）の所定サイクル数以降のデータが、サーマルサイクルの開始より遅れて開始される光学的検出により得られるデータである、＜９＞又は＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞
ＰＣＲ試薬は蛍光標識プローブのほかに、少なくともプライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載の方法。
＜１３＞
前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、＜９＞～＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞
蛍光標識が、５００ｎｍ～６００ｎｍの範囲の蛍光検出波長を有するものである＜９＞～＜１３＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞
標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子の核酸である、＜９＞～＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞
前記（２）のサーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程が、サーマルサイクラーに設定された測光パラメーターにもとづく工程であり、サーマルサイクル開始から所定サイクル数は未測光パラメーターが設定され、所定サイクル数以降は測光パラメーターが設定されていることにより、光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される工程である、＜１１＞～＜１５＞のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、乾燥濾紙血を前処理することなく直接リアルタイムＰＣＲに供して、乾燥濾紙血パンチ片中の標的核酸を、蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲで増幅し、当該増幅産物を検出する方法において、ベースライン不良による誤判断を防いで検出及び定量することが可能となった。
本発明のリアルタイムＰＣＲによりＲＮａｓｅＰ遺伝子を増幅したときの増幅曲線を示す図である（実施例１）。 従来のリアルタイムＰＣＲによりＲＮａｓｅＰ遺伝子を増幅したときの増幅曲線を示す図である（比較例１）。
（乾燥濾紙血）
　本発明に用いられる乾燥濾紙血は、濾紙（フィルターペーパー）に全血を含ませた後に乾燥させた濾紙中の血液（全血）であり、単に乾燥濾紙血ということがある。乾燥濾紙血は通常、血液を含ませ乾燥した濾紙から切り出されて紙の切片として使用される。典型的には、穴あけパンチ工具によりパンチ穴形状の切片（パンチ片）として取り出される。血液を含む当該パンチ片形状の濾紙の切片を特に乾燥濾紙血パンチ片という。本発明に用いられる当該パンチ片の大きさは、反応溶液に含まれる血液の量を所定の範囲とすることが望ましく、直径１．２～２．０ｍｍが望ましく、１．５ｍｍ～１．８ｍｍがよりいっそう望ましい。また、前記パンチ片に含まれる全血量としては、パンチ片の大きさより換算するとＰＣＲ全反応溶液量に対して０．９５ｖ／ｖ％～６．６ｖ／ｖ％が望ましく、１．４ｖ／ｖ％～５．２ｖ／ｖ％がよりいっそう望ましい。
　本発明に用いられる乾燥濾紙血としては、例えば、新生児マス・スクリーニングなど新生児のかかとから採血した濾紙血、同時にオプショナルスクリーニングとして採血された濾紙血などが用いられるがこれらに限定されない。
（標的核酸）
　本発明における標的核酸は、特に制限はなく、全血由来のＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ウイルス等によって全血に導入された外来核酸等いずれも含まれる。
　このうちでも、例えば新生児の全血由来の核酸が好ましく、より具体的には、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２などの遺伝子由来の核酸が挙げられる。
（リアルタイムＰＣＲ）
　ＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、一対のプライマーセット及びポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、および伸長工程からなる温度変化を１サイクルとしてサーマルサイクルを繰り返すことにより、上記プライマーセットで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法として広く用いられている。サーマルサイクルの回数は、各種試薬や試料、反応時間により適宜変更されるが通常２５～４０回程度である。
　本発明においてリアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅産物の生成過程を経時的に光学的手段等によりモニタリングする方法を意味する。
　本発明において、サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出するとは、各サーマルサイクルの終了時点の試料溶液中から産生される蛍光強度を光学的に検出することを意味する。
　本発明の特徴である「光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程」としては、大きく以下の2通りが挙げられる。
（１）光学的な検出が、サーマルサイクルの開始より遅れて開始され、この遅れた光学的検出により得られるデータを用いて解析を行う工程
（２）サーマルサイクルの開始から蛍光強度の検出を行うものの、サーマルサイクルの開始から所定サイクル数までの検出データはあえて使用せず、所定サイクル数以降の検出データを使って標的核酸の定量解析を行う工程
（１）の「光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される」とは、従来はサーマルサイクルの開始と同時に光学的な検出も開始し、1サイクル目の終了時点から蛍光強度の検出が行われていたところ、本発明においてはサーマルサイクルの開始から所定サイクル数まではあえて蛍光強度の検出を行わず、所定サイクル数を超えた時点から蛍光強度の検出を行うことを意味する。所定サイクル数としては、ベースラインが安定化するまでのサイクル数であればよく、使用する蛍光色素の種類や試料中のヘモグロビン量などにより適宜設定すればよい。
　（２）の「サーマルサイクルの開始から蛍光強度の検出を行うものの、サーマルサイクルの開始から所定サイクル数までの検出データはあえて使用せず、所定サイクル数以降の検出データを使って標的核酸の定量解析を行う工程」は通常測定終了後に任意にサイクル幅を設定し、ベースラインを補正することによって行われる。
　所定サイクル数としては、最大でも２５サイクルが望ましく、２０サイクル以下が望ましい場合もある。また、前記所定サイクル数は少なくとも５サイクル以上が好ましく、１０サイクル以上が好ましい場合もある。以上より、本発明における所定サイクル数としては、５サイクル以上２５サイクル以下が好ましく、１０サイクル以上２５サイクル以下が好ましい場合がある。
　本発明のＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの条件（温度や時間）は、サーマルサイクラー等を用いて任意に設定することができ、蛍光強度の検出は、サーマルサイクル毎に設定された測光パラメーターにもとづいて任意に制御することが可能である。本発明においては、サーマルサイクル開始から所定サイクル数に未測光パラメーターを設定し、所定サイクル数以降に測光パラメーターを設定することで、光学的な検出をサーマルサイクルの開始より遅れて開始することができる。従って、未測光パラメータとそれに続く所定サイクル経過後の測光パラメータの設定による光学的な検出工程も、本発明の「光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される」工程に含まれる。
　本発明において、ＰＣＲ反応により生成した標的核酸の増幅産物は、前記増幅産物から発生する蛍光強度を光学的に検出することにより検出できる。本発明の蛍光検出は、蛍光標識プローブの蛍光物質へ励起光照射をすることによって蛍光が発生し、これを光学的に検出することで増幅された標的核酸を検出又は定量することができる。蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、サイクリングプローブ、ＦＲＥＴプローブ等が挙げられる。
　蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用される。具体例としては、市販のSmartCycler（商品名、タカラバイオ社製）、ライトサイクラー（商品名、ロシュ・ダイアグノスティック社製）、ABI PRISM7000（商品名、アプライド・バイオシステム社製）等があげられる。
（ＰＣＲ試薬）
　本発明に用いられるＰＣＲ試薬は、蛍光標識プローブを含み、さらに少なくとも、プライマーのセット、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）各種を含む。
　本発明の蛍光標識プローブは、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含むことが望ましい。
　蛍光標識プローブ用の蛍光色素としては、公知のいずれの蛍光色素でもよく、例えばＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒシリーズ、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒシリーズ、Ｃｙシリーズ、ＡＴＴＯシリーズ、ＤＹシリーズ、ＤｙＬｉｇｈｔシリーズ、Ｑｕａｓａｒシリーズ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＨＥＸなどが挙げられるが、特にヘモグロビンが５００～６００ｎｍの波長を良く吸収することから、蛍光検出波長がこの範囲にある蛍光色素を使用した場合は、より本発明の効果が発揮されるため好ましい。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ５４０、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｏｒａｎｇｅ５６０、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）、ＣｙＴＭ３、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＣＡＬ　Ｆｌｕｏｒ　Ｒｅｄ５９０、Ｃｙ３．５が挙げられる。
　また、当該ＰＣＲ試薬には通常バッファーも含まれている。バッファーとしては、生物の体液中に存在する正電荷物質（ある種のタンパク質など）や負電荷物質（ある種の糖、色素など）などのＤＮＡ増幅反応を阻害する物質の作用を抑制する働きを持つバッファーであれば特に限定されない。市販されているものとして、例えば、Ampdirect、Ampdirect plus（ともに（株）島津製作所製）等が挙げられる。
（標的核酸の定量方法）
　本発明の標的核酸の定量方法は、リアルタイムＰＣＲにより乾燥濾紙血中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させ、前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する方法である。前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記乾燥濾紙血中に含まれる標的核酸を定量することができる。また、後述する実施例のように、標準品から算出されたＣｑ値の検量線から乾燥濾紙血中の全血１μＬのコピー数を換算して定量することもできる。
　本発明の標的核酸の乾燥濾紙血の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法は、以下の（１）及び（２）の工程を含む。
（１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
（２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程
（３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程
　上記（１）の工程は、より具体的には、下記（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む工程であることが望ましい。
　（Ａ）ＰＣＲ反応用のチューブに乾燥濾紙血を添加する工程
　（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブにＰＣＲ試薬を添加する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
　（Ｃ）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液に複数のサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程
　ここで、（Ａ）工程と（Ｂ）工程は、いずれを先に行っても、また同時に行ってもよいが、（Ａ）の工程の後、（Ｂ）の工程を行うことが望ましい。（Ａ）を先に行うことで、濾紙が仮にチューブ壁面などに付着した場合でも、試薬溶液によりチューブ底部に収容することがより確実になるからである。また、ＰＣＲ反応開始前にパンチ片を確実にチューブの底に収めるために、遠心分離などを行うことも望ましい。
　また、本発明は、ＰＣＲ反応において反応チューブをキャップで密閉してからサーマルサイクルを開始することが好ましく、これにより、サーマルサイクルによる気泡の発生を抑え、パンチ片を浮き上がらせることなく、振動を抑えることができる。
　本発明において「サーマルサイクルを施す」とは、温度変化を繰り返し行うことであり、サーマルサイクリングを行うことでもある。また、具体的にはサーマルサイクラーという機器を用いてＰＣＲ反応溶液に繰り返し温度変化を付与することである。
　上記（３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程によりベースラインの乱れを低減することができる。この点において、本発明は、換言すれば乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法におけるベースラインの乱れを低減する方法ともいえる。
　ベースラインの乱れが低減される理由は定かではないが、おそらく乾燥濾紙血に含まれる夾雑物質が原因となるノイズや、ＰＣＲ反応で蛍光標識プローブから産生される蛍光がヘモグロビン蛋白に吸収される程度がサーマルサイクル数に伴い増減し、ベースラインに何らかの変動を引き起こしているものと推察している。本発明によれば、所定サーマルサイクル数の蛍光検出を行わないことにより、前記変動の影響を受けずに正確なベースラインを引くことが可能になったと思われる。
　したがって、本発明によれば、乾燥濾紙血パンチ片中に含まれる標的核酸を、煩雑な前処理をすることなく直接リアルタイムＰＣＲにより正確に光学的に検出及び定量することが可能となった。
（反応チューブ）
　本発明に用いられるチューブは、ＰＣＲ反応用のチューブであり、乾燥濾紙血パンチ片がスムーズに挿入でき、キャップにより密閉できる構造であればよい。また、チューブ上部の開口部が円形（例えば、内径２．５ｍｍ～１０ｍｍ程度）で底部が上部の開口部よりも狭くなっている形状が良く、逆円錐形などが好ましい。
　上記チューブの容量は、ＰＣＲ反応試薬を添加し、ＰＣＲ反応による温度変化によっても反応溶液を十分に収容できる容量であればよく、０．１ｍＬ～０．３ｍＬ容量が好ましく、さらに好ましくは０．１５ｍＬ～０．２５ｍＬ容量、最も好ましくは０．２ｍＬ容量である。
　本発明に用いるＰＣＲ反応用チューブは、チューブが９６個連続しているＰＣＲ反応用９６穴チューブ又は８個連続している８連チューブが好ましく、市販品としては、９６ウェルＰＣＲプレート、ＰＣＲ８連チューブなどの名称で販売されているものを用いることができる。市販品としては、LightCycler480 Multiwell Plate 96（ロッシュ社）、96-Well PCR Plate, Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux（Scientific Specialties, Inc.社）、エッペンドルフ PCR プレート 96、スカートレス, 150 μL,カラーレス（エッペンドルフ社）、PCRプレート 96well シンプレート0.1ml ナチュラル（BM機器社）、LightCycler(R) 8-Tube Strips（ロッシュ社）などが挙げられる。
　これらの反応用チューブの材質は、反応溶液のコンタミが少なく、また、ＰＣＲ反応の温度変化による内部圧力変動によっても形状が変化しない剛性を有することが望ましく、例えばポリプロピレン製が挙げられる。
　ここで、本発明に用いられるＰＣＲ試薬の反応用チューブへの添加量は、２０～５０μＬが望ましい。
　以下、本発明を実施例にもとづき説明するが、これに限定されるものではない。
〔実施例１〕蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ
（ａ）試験材料
（ａ－１）ＲＮａｓｅＰ遺伝子増幅用プライマー
ＲＮａｓｅＰ増幅用のプライマーとして、下記のプライマーをシグマ-アルドリッチ社に合成依頼したものを用いた。
フォワードプライマー；　５’－GCGGAGGGAAGCTCATCA－３’（配列番号１）
リバースプライマー；　５’－GTCTGACCTCGCGCGGA－３’（配列番号２）
（ａ－２）ＲＮａｓｅＰ遺伝子検出用プローブ
　ＲＮａｓｅＰのＰＣＲ増幅を確認するためのプローブとして、蛍光標識（ＦＡＭ）を施した以下の検出プローブを用いた。当該プローブはプライムテック社に合成依頼して作成した。
ＲＮａｓｅＰ遺伝子検出用プローブ；
５’－(ＦＡＭ)－CCACGAGCTGAGTGCGTCCTG－(ＢＨＱ１)－３’（塩基配列部分は配列番号３）
（ａ－３）
　ＰＣＲ反応の鋳型として、下記に示すＲＮａｓｅＰ遺伝子の部分配列をベクターに組み込んだプラスミドを、ユーロフィン社に合成依頼したものを用いた。
ＲＮａｓｅＰ遺伝子部分配列（配列番号４）
CAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACATTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTC
（ｂ）ＰＣＲ試薬
　ＰＣＲ試薬の組成を以下に示す。
ＰＣＲバッファー（Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ　Ｐｌｕｓ；島津製作所）
０．１２５μＭ （終濃度）ＲＮａｓｅＰ遺伝子増幅用フォワードプライマー
０．１２５μＭ （終濃度）ＲＮａｓｅＰ遺伝子増幅用リバースプライマー
０．１２５μＭ （終濃度）ＲＮａｓｅＰ遺伝子検出用プローブ
０．０２５Ｕ/μＬ　ＢＩＯＴＡＱ　ＨＳＤＮＡポリメラーゼ
（ｃ）コントロール乾燥濾紙血
　白血球を除去したヒト赤血球画分と１％ＢＳＡ（ＰＢＳベース）を、６：４の割合で混合した血液に、ＲＮａｓｅＰ遺伝子部分配列を含んだプラスミドを、１０，０００ｃｏｐｙ／μＬとなるように添加して、採血用濾紙（アドバンテック社）に４０μＬ染み込ませ、そのまま乾燥させたものを、コントロール乾燥濾紙血とした。
（ｄ）ＰＣＲ反応の条件
　以下に示す本発明の未測光パラメーターを組み合わせた条件でＰＣＲ反応を行った。
(i）９５℃：１５分
(ii）９５℃：１５秒、６３℃：６０秒（１０サイクル）未測光設定
(iii）９５℃：１５秒、６３℃：６０秒（３０サイクル）測光設定
(iv）３７℃：５分
（ｅ）リアルタイムＰＣＲ測定
（ｅ－１）測定方法
　以下の手順で測定した。
（i）コントロール乾燥濾紙血から、パンチャーを用いて直径１．５ｍｍの円形のパンチ片を採取した。
（ii）ＰＣＲ反応用のチューブ(ロッシュ社製：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(R) ８－Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐｓ、ポリプロピレン製）に上記パンチ片を投入した。
（iii）そのチューブに４０μＬの上記ＰＣＲ試薬をそれぞれ加えた後、キャップ（前記チューブとセットになっているもの）をして密閉した。
（iv）サーマルサイクラー装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６；ロッシュ社）を用いて、上記パラメーターにて、ＲＮａｓｅＰ遺伝子のリアルタイムＰＣＲ測定（励起；４７０ｎｍ／検出；５１４ｎｍ）を行った。
（ｅ－２）測定結果
　本発明のＰＣＲ反応条件で測定したＰＣＲ反応の増幅曲線の結果を図１に示す。２０個のパンチ片それぞれを、未測光パラメーターを組み合わせたパラメーターにて測定した結果、後述する比較例１で発生したような乱れを実質的に含まないベースライン補正が良好に行われることが確認された。
　このように、乾燥濾紙血中に含まれている夾雑物が要因で引き起こされる、ベースラインの乱れに対して、蛍光検出しないパラメーターを組み込むことで、便宜上ベースラインの乱れが検出されないように設定することが出来た。したがって、本発明方法によれば、乾燥濾紙血中の特定遺伝子を測定する際に、ベースライン不良による再検査の発生頻度を抑え、正確で効率的な定量方法を提供することが可能となった。
〔比較例１〕従来のパラメーターによる蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ
（ａ）リアルタイムＰＣＲ測定
　上記実施例１の（ｄ）ＰＣＲ反応の条件のパラメータを以下に変更した以外は同じ方法でＦＡＭ標識蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行い、４４個のパンチ片についてＲＮａｓｅＰ遺伝子の測定を行った。
＜ＰＣＲ反応条件：従来のパラメータ＞
(i）９５℃：１５分
(ii）９５℃：１５秒、６３℃：６０秒（４０サイクル）測光設定
(iii）３７℃：５分
（ｂ）測定結果
　４４個のパンチ片について測定したＰＣＲ反応の増幅曲線を図２に示す。
　４４個中６個分の増幅曲線で、装置に組み込まれているベースライン補正機能処理後でもなおベースラインの乱れが見られた。この理由は定かではないが、検体である乾燥濾紙血パンチ片からのヘモグロビン蛋白質の溶出量にも関わっている可能性がある。すなわち、反応初期に蛍光物質であるＦＡＭの蛍光がタンパク質に吸収されたために、蛍光値が一時的に相対的に低くなってしまい、サ－マルサイクル数が進むにつれて、ヘモグロビン蛋白質の影響が弱まった場合などが考えられる。このような場合、一過性の蛍光値上昇となり、増殖曲線の矢印部分の時点（サイクル数）で増幅反応が起こったかのように装置の演算部が処理してしまい、Ｃｑ値が非常に小さく算出されることになった。
　したがって、当該Ｃｐ値にもとづき検量線へのあてはめが行われた場合には、検体中の標的核酸濃度は実際の濃度よりも非常に高い濃度であると誤って算出されることになる。
　本発明は、乾燥濾紙血パンチ片中の標的核酸を、蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲで検出する方法において、蛍光検出のタイミングをＰＣＲのサーマルサイクル開始より遅らせるなど、光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行うことによりベースライン不良による誤判断を防いで、正確な定量をすることが可能となった。
　本発明方法は、特定遺伝子の定量、例えば、ＰＩＤの新生児スクリーニング検査であるＴＲＥＣ／ＫＲＥＣ遺伝子断片定量方法及びＳＭＡの新生児スクリーニング検査であるＳＭＮ１遺伝子定量方法に応用することができる。 

Claims (16)

  1. 以下の工程を含む乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法；
    （１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
    （２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程
    （３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程
  2. 前記（３）の所定サイクル数が１０サイクル以上２５サイクル以下である請求項１に記載の方法。
  3. 前記（３）の所定サイクル数以降のデータが、サーマルサイクルの開始より遅れて開始される光学的検出により得られるデータである、請求項1又は２に記載の方法。
  4. ＰＣＲ試薬は蛍光標識プローブのほかに、少なくともプライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 蛍光標識が、５００ｎｍ～６００ｎｍの範囲の蛍光検出波長を有するものである請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子の核酸である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. （２）のサーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程が、サーマルサイクラーに設定された測光パラメーターにもとづく工程であり、サーマルサイクル開始から所定サイクル数は未測光パラメーターが設定され、所定サイクル数以降は測光パラメーターが設定されていることにより、光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される工程である、請求項３～６のいずれかに記載の方法。
  9. 以下の工程を含む乾燥濾紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法におけるベースラインの乱れを低減する方法。
    （１）乾燥濾紙血パンチ片及びＰＣＲ試薬を含む試料溶液にサーマルサイクルを施すことにより乾燥濾紙血中の標的核酸を増幅する工程であって、ＰＣＲ試薬が蛍光標識プローブを含むものである、前記工程
    （２）サーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程
    （３）光学的に検出したデータのうち、所定サイクル数以降のデータを用いて標的核酸の定量解析を行う工程
  10. 前記（３）の所定サイクル数が１０サイクル以上２５サイクル以下である請求項９に記載の方法。
  11. 前記（３）の所定サイクル数以降のデータが、サーマルサイクルの開始より遅れて開始される光学的検出により得られるデータである、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. ＰＣＲ試薬は蛍光標識プローブのほかに、少なくともプライマー、ポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含む請求項９～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、請求項９～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 蛍光標識が、５００ｎｍ～６００ｎｍの範囲の蛍光検出波長を有するものである請求項９～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子の核酸である、請求項９～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記（２）のサーマルサイクル毎の試料溶液の蛍光強度を光学的に検出する工程が、サーマルサイクラーに設定された測光パラメーターにもとづく工程であり、サーマルサイクル開始から所定サイクル数は未測光パラメーターが設定され、所定サイクル数以降は測光パラメーターが設定されていることにより、光学的な検出がサーマルサイクルの開始より遅れて開始される工程である、請求項１１～１５のいずれかに記載の方法。 
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