JP2004283165A - Hlaタイピング法 - Google Patents
Hlaタイピング法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004283165A JP2004283165A JP2004054126A JP2004054126A JP2004283165A JP 2004283165 A JP2004283165 A JP 2004283165A JP 2004054126 A JP2004054126 A JP 2004054126A JP 2004054126 A JP2004054126 A JP 2004054126A JP 2004283165 A JP2004283165 A JP 2004283165A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- hla
- sample
- blood
- typing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたHLAタイピング技術を提供する。
【解決手段】生体試料から直接DNA増幅反応を行って、生体試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いてHLAの型を決定するHLAタイピング法。好ましくは、DNA増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を用い、生体試料として、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血を用いる。
【選択図】図1
【解決手段】生体試料から直接DNA増幅反応を行って、生体試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いてHLAの型を決定するHLAタイピング法。好ましくは、DNA増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を用い、生体試料として、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血を用いる。
【選択図】図1
Description
本発明は、医療診断のためのHLAタイピング技術に関する。
HLA(human leukocyte antigen;ヒト白血球抗原)は、ヒトのMHC(major histocompatibility complex;主要組織適合遺伝子複合体)であり、全ての細胞表面上に存在する。HLA分子は個体間でタイプが異なり、それに結合できる抗原ペプチドの差異が免疫応答の個体差となって現れる。従って、HLA分子をコードするHLA領域に存在する遺伝子のタイプを決定すること(HLAタイピング)は、臓器移植におけるドナーとレシピエントとの適合性やある種の病気に対する個人の素質などを判定する場合に用いられる、大変重要な技術である。
HLAタイピングには血清学的タイピングとDNAタイピングとがある。従来から、HLAタイピングとしては血清学的タイピングが行われてきた。血清学的HLAタイピングにおいては、抗HLAモノクローナル抗体とリンパ球との抗原抗体反応によってHLAを同定する。しかしこの方法は、解析精度が低いことや、判定可能なHLAのタイプが限られるという欠点がある。
一方、DNAタイピングは、HLAをコードしている第6染色体上の遺伝子を直接タイピングする技術である(RFLP法など)。例えば、特表2002−503497号公報によると、DNAタイピングを行うためには、予め生体試料からDNAを分離・精製し、それを鋳型に遺伝子座特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などを行い、シーケンス反応鋳型を作成していた。
しかしこのような方法では、生体試料の保管時における保存性の問題及び生体試料の輸送時における簡便性の問題がある。特に生体試料が血液試料である場合は、病原微生物などの感染の可能性があるため検査などで血液試料を取り扱う人間に対して危険があり、安全性に問題がある。また、血液試料などの液体試料は、試料間のクロスコンタミネーションなど、試料自体のコンタミネーションの可能性という問題がある。さらに、生体試料からDNAを分離・精製する時には、手間やコストがかかるという問題がある。近年、DNAの分離・精製は様々なキットを利用することで簡略化されてきているが、それでも多段階の操作が必要である。このため、多検体解析を行う場合には、試料の安全性が低下するうえに、解析にコストがかかるという問題がある。
そこで本発明の目的は、試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたHLAタイピング技術を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討した結果、生体試料から直接DNA増幅反応を行い、増幅されたDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列の情報を用いてHLAのタイピングを行うことによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
(1) 生体試料から直接DNA増幅反応を行って、前記血液試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された前記塩基配列を用いてHLAの型を決定する、HLAタイピング法。
(2) 前記DNA増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、(1)に記載のHLAタイピング法。
(3) 前記生体試料が血液試料又は口腔粘膜試料である、(1)又は(2)に記載のHLAタイピング法。
(4) 前記血液試料が、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血である、(3)に記載のHLAタイピング法。
(1) 生体試料から直接DNA増幅反応を行って、前記血液試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された前記塩基配列を用いてHLAの型を決定する、HLAタイピング法。
(2) 前記DNA増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、(1)に記載のHLAタイピング法。
(3) 前記生体試料が血液試料又は口腔粘膜試料である、(1)又は(2)に記載のHLAタイピング法。
(4) 前記血液試料が、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血である、(3)に記載のHLAタイピング法。
本発明によれば、試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたHLAタイピング技術が提供される。また本発明によれば、直接PCRにおいて適切なバッファーを選択することにより、全ローカスのHLAタイピングを行うことが可能になる。
本発明は、生体試料から直接DNA増幅反応を行うことを特徴とする、HLAタイピング法である。本発明で直接とは、DNA増幅に先立って、生体試料に含まれるDNAの分離・精製を行う過程が不要という意味である。本発明のHLAタイピング法においては、生体試料から直接DNA増幅反応を行い、増幅されたDNAの塩基配列から生体試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いてHLAの型を決定する。なお、HLAタイピングは、通常A、B、DRの各ローカスについて行う。
本発明においてHLAタイピングすべき生体試料としては特に限定されない。例えば、血液試料や口腔粘膜試料などは試料採取が簡便であり好ましい。
血液試料としては、全血を用いることができる。DNAを精製したものやEDTAなどで処理を行ったものを用いてもよい。試料の形態としては、DNAが残存していれば、新鮮血、保存血液及び乾燥血液のいずれであっても良い。保存血液としては、冷蔵保存、冷凍保存を問わない。本発明においては、頻繁に凍結・融解を繰り返した冷凍血液であっても安定して核酸増幅産物が得られる。乾燥血液としては、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させたもの(濾紙血)を用いても良い。本発明において濾紙血を用いることは、試料の保存性や輸送時の簡便性、及び安全性の観点から好ましい。濾紙に血液試料を含ませることで試料が液体状態でなくなるため、試料をこぼしたり、飛散させたりする危険性が少なくなる。従って、試料の安全性が高く、コンタミネーションの可能性が少なくなる。
本発明においては、前記血液試料中に存在するDNAを分離・精製することなくDNA増幅反応を行う。本発明においては、増幅反応における反応溶液に後述するものを用いることによって、試料の前処理を行うことなく直接DNA増幅反応を行うことができる。このことによって、前処理の手間やコストを省くことができる。例えば、濾紙血を用いる場合は、少量の血液を濾紙に含ませ、乾燥させた後、血液付着部分の一部を打ち抜いたものをそのまま増幅反応に用いることができる。
DNA増幅には、PCRを用いると良い。PCRに用いるPCR反応溶液は、バッファー、プライマーのセット、dNTP(デオキシヌクレオシド三リン酸)各種、及びDNAポリメラーゼを含む。
分離・精製などの前処理を行わない試料には、DNA増幅反応を阻害する物質が含まれている。DNA増幅反応を阻害する物質とは、生物の体液中に存在する正電荷物質(ある種のタンパク質など)や負電荷物質(ある種の糖、色素など)などである。タンパク質などの正電荷物質はDNAに吸着することで増幅反応を阻害する。一方、糖や色素などの負電荷物質はDNAポリメラーゼに吸着することで増幅反応を阻害する。本発明においては、DNA増幅反応阻害物質の作用を抑制する働きを持つものをバッファーに用いる。
このようなバッファーとしては、例えば、AmpdirectR-A、AmpdirectR-G/C(ともに(株)島津製作所製)が挙げられる。また、必要に応じ増幅効率向上のためのAmp Addition-1又はAmp Addition-4(ともに(株)島津製作所製、以下、Amp Additionと総称する。)をAmpdirectR-A又はAmpdirectR-G/Cに加えたものをバッファーとして使用しても良い。本発明においては、AmpdirectR-G/Cを用いることが好ましい。また、AmpdirectR-G/CにはAmp Addition-4を加えて用いることがより好ましい。AmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cは、DNA増幅反応溶液中に存在する上記の阻害物質を中和する作用があるため、未精製の試料であってもPCRを可能にする。このことにより、生体試料から直接核酸増幅することが可能となる。その他、上記作用を有するバッファーとしては、例えばAmpdirectR-B、AmpdirectR-Dが挙げられ、バッファー中に必要に応じ含まれるAmp Additionとしては、例えばAmp Addition-2、Amp Addition-3が挙げられる。
本発明においては、上記したバッファーに限定されることなく、タイピングするローカスに応じて適した組成を有するバッファーを適宜選択することができる。
本発明においては、上記したバッファーに限定されることなく、タイピングするローカスに応じて適した組成を有するバッファーを適宜選択することができる。
プライマーとしては、HLA領域に特異的な増幅プライマーセットを用いる。DNAポリメラーゼとしては、TaqDNAが好ましく、TaKaRaZ-TaqTM、ExTaq(それぞれ宝酒造(株)製)がより好ましい。
本発明のPCR反応溶液の上記成分は、例えば以下の配合量(PCR反応溶液全体を基準とする。)で用いることができる。すなわち、バッファーは10〜40体積%、例えば20体積%、プライマーは各々0.1〜2μM、例えば0.5μM、dNTPは各々100〜300μM、例えば200μM、DNAポリメラーゼは0.5〜1.25U/μl、例えば1.25U/μl用いることができる。また、Amp AdditionをAmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cなどに加えたものをバッファーとして用いる場合、Amp Additionの量の上限は特に限定されないが、例えばAmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cなどの量に対して150体積%程度まで、例えば100体積%使用することができる。例えば試料となる血液は0.5μl〜2μl用いることができ、血液試料1μlに対し上記PCR反応溶液は10〜200μl、好ましくは20〜100μl用いることができる。これら諸条件は、当業者が適宜決めることができる。また、PCR反応の条件についても、当業者が適宜定めることができる。
増幅されたDNAは、精製を行うことが好ましい。精製には、例えばエキソヌクレアーゼとアルカリホスファターゼとを用いると良い。これらは、未反応プライマーヌクレオチドを不活性化する作用があり、従って増幅されたDNAが精製される。
精製されたDNAはその塩基配列が決定される。すなわち本発明はDNAタイピング法であって、HLA領域の塩基配列を決定することで従来の血清学的タイピングに比べて高精度のタイピングが可能となる。
塩基配列の決定には、サンガー法、マクサム・ギルバート法などを用いることができる。例えばサンガー法においては、通常の操作に従って反応を行うことによって鎖長の異なる部分複製DNAの混合物を得る。得られた部分複製DNA混合物の配列は電気泳動法を用いたキャピラリー型又は平板(スラブゲル)型DNAシーケンサーによって解析を行うと良い。本発明においては、キャピラリー型DNAシーケンサー(RISA−384((株)島津製作所製)、ABI−3730xl(アプライド・バイオシステムズ社製))を用いることが好ましい。シーケンスデータはコンピュータプログラムにより解析し、ヘテロ接合体由来の二重ピークを自動検出し、コンセンサス配列を決定する。決定された塩基配列は、HLA型データベースからの検索を行うことによってHLA型を自動判定する。
以上のように本発明によると、DNAタイピングの高い解析精度を保ちながら従来に比べてDNA解析の手間やコストを大幅に削減することによって、より多くの試料をより効率よく処理することが可能である。
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
[実施例1]
40人の被験者から指先に針を突き刺して採取したそれぞれの少量の血液(およそ1μl)を、濾紙に吸着させた。濾紙の血液付着部分の一部分をパンチャーで打ち抜きし(直径2mm)、96穴PCRプレートに挿入した。下記に示すPCR反応溶液20μlをプレートのそれぞれの血液濾紙に加え、蒸発防止シールをプレートに貼った。
40人の被験者から指先に針を突き刺して採取したそれぞれの少量の血液(およそ1μl)を、濾紙に吸着させた。濾紙の血液付着部分の一部分をパンチャーで打ち抜きし(直径2mm)、96穴PCRプレートに挿入した。下記に示すPCR反応溶液20μlをプレートのそれぞれの血液濾紙に加え、蒸発防止シールをプレートに貼った。
(PCR反応溶液(20μl中))
プライマー
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC(配列表の配列番号1) 0.5μM
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC (配列表の配列番号2) 0.5μM
AmpdirectR-G/C((株)島津製作所製) 4μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
ExTaq(宝酒造(株)製) 0.5U
プライマー
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC(配列表の配列番号1) 0.5μM
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC (配列表の配列番号2) 0.5μM
AmpdirectR-G/C((株)島津製作所製) 4μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
ExTaq(宝酒造(株)製) 0.5U
PCR反応は、サーマルサイクラー(アプライド・バイオシステムズ社製、GeneAmp9700)を用い、96℃−3分間のプレヒーティングの後、96℃−30秒間、63℃−1分間、72℃−3分間の条件で40サイクルを行った。最後に、72℃−5分間のポリメライゼーションを行った。
それぞれの反応溶液10μlを回収し、エキソヌクレアーゼ及びアルカリフォスファターゼの混合物(アマルシャム社製、ExoSAP-IT)1μlを加えることにより精製を行った。
下記に示すシーケンス反応液5μlを用いて、上記精製によって得られたPCR産物を下記の4つのプライマ−を用いてそれぞれシーケンスを行った。
(シーケンス反応液(5μl中))
上記精製によって得られたPCR産物 0.25μl
プライマ− 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(アプライド・バイオシステムズ社製)1μl
(プライマ−)
CACTCCATGAGGTATTTC(配列表の配列番号3)
TCTGGTTGTAGTAGC (配列表の配列番号4)
GGCCAGGGTCTCACA (配列表の配列番号5)
CAATTGTCTCCCCTC (配列表の配列番号6)
上記精製によって得られたPCR産物 0.25μl
プライマ− 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(アプライド・バイオシステムズ社製)1μl
(プライマ−)
CACTCCATGAGGTATTTC(配列表の配列番号3)
TCTGGTTGTAGTAGC (配列表の配列番号4)
GGCCAGGGTCTCACA (配列表の配列番号5)
CAATTGTCTCCCCTC (配列表の配列番号6)
上記シーケンス反応によって得られた部分複製DNAをエタノール沈殿法で精製し、水に再溶解させ、キャピラリーDNAシーケンサー(RISA−384、(株)島津製作所製)によって部分複製DNAの配列データを解析した。ヘテロ接合体由来の二重ピークを検出してコンセンサス配列を決定し、決定されたコンセンサス配列データは、http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.htmlにおいて公開されているHLA型データからの検索を行い、ヒットした型を列挙した。
上述のタイピング方法によって得られたHLAの型と、血清学的タイピング方法によって得られたHLAの型とを比較すると、40試料全てについて一致を示した。
なお、濾紙血から直接PCRが行われたかどうかは、得られた増幅産物の一部を電気泳動することによって確認した。電気泳動の図を図1に示す。図1中、レーン1は、実施例1で行われたPCRで用いたバッファーAmpdirectR-G/C4μlを、ExTaq(宝酒造(株)製)添付PCRバッファー2μlに置き換えた結果である。レーン2は、実施例1で行われたPCRの結果である。レーン3は、実施例1で行われたPCRで用いたバッファーAmpdirectR-G/C4μlを、AmpdirectR-G/C:Amp Addition-4=1:1(体積比)の混合溶液8μlに置き換えた結果である。図1が示すように、従来型のPCRバッファーではDNAの増幅は確認できない(レーン1)が、AmpdirectR-G/Cや、AmpdirectR-G/CとAmp Addition-4との混合物をバッファーに用いると明確にDNAの増幅が確認できた(レーン2及び3)。
[実施例2]
5人の被験者は口に少量の水を含み、口の中を軽く洗浄した。次に市販の歯ブラシで、片頬10回ずつ(両頬計20回)のブラッシングを行った後、歯ブラシを10mlの1重量%NaCl水溶液が入った遠沈管の中に入れ、数回振ることにより、採取した口腔粘膜を1重量%NaCl水溶液に懸濁し、サンプル懸濁液とした。
5人の被験者は口に少量の水を含み、口の中を軽く洗浄した。次に市販の歯ブラシで、片頬10回ずつ(両頬計20回)のブラッシングを行った後、歯ブラシを10mlの1重量%NaCl水溶液が入った遠沈管の中に入れ、数回振ることにより、採取した口腔粘膜を1重量%NaCl水溶液に懸濁し、サンプル懸濁液とした。
下記に示すPCR反応溶液45μlを入れたチューブに、上記サンプル懸濁液の5μlを加えた。
(PCR反応溶液(50μl中))
プライマー
フォワードプライマー
ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT(配列表の配列番号7) 0.5μM
リバースプライマー(下記2種のプライマーの混合プライマーとして用いた。)
GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT (配列表の配列番号8) 0.25μM
GGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT (配列表の配列番号9) 0.25μM
AmpdirectR-G/C((株)島津製作所製) 10μl
AmpAddition-4((株)島津製作所製) 10μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
Z-Taq(宝酒造(株)製) 1.25U
プライマー
フォワードプライマー
ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT(配列表の配列番号7) 0.5μM
リバースプライマー(下記2種のプライマーの混合プライマーとして用いた。)
GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT (配列表の配列番号8) 0.25μM
GGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT (配列表の配列番号9) 0.25μM
AmpdirectR-G/C((株)島津製作所製) 10μl
AmpAddition-4((株)島津製作所製) 10μl
dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各200μM
Z-Taq(宝酒造(株)製) 1.25U
PCR反応は、サーマルサイクラー(アプライド・バイオシステムズ社製、GeneAmp9700)を用い、80℃ー15分の前処理、続いて96℃−3分間のプレヒーティングの後、96℃−30秒間、63℃−1分間、72℃−3分間の条件で40サイクルを行った。最後に、72℃−5分間のポリメライゼーションを行った。
それぞれの反応溶液10μlを回収し、エキソヌクレアーゼ及びアルカリフォスファターゼの混合物(アマルシャム社製、ExoSAP-IT)1μlを加えることにより精製を行った。
下記に示すシーケンス反応液5μlを用いて、上記精製によって得られたPCR産物を、下記の4種のプライマーを用いてシーケンスを行った。
(シーケンス反応液(5μl中))
上記精製によって得られたPCR産物 0.25μl
プライマ− 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(アプライド・バイオシステムズ社製) 1μl
(プライマ−)
1. CACTCCATGAGGTATTTC(配列表の配列番号3)
2. TCTGGTTGTAGTAGC (配列表の配列番号4)
3. GGCCAGGGTCTCACA (配列表の配列番号5)
4. 下記2種のプライマーの混合プライマー
CCCCGGCGACCTAT (配列表の配列番号10)
GGAAGGCTCCCCACT (配列表の配列番号11)
上記精製によって得られたPCR産物 0.25μl
プライマ− 1μM
BigDye Terminator Ver3.1(アプライド・バイオシステムズ社製) 1μl
(プライマ−)
1. CACTCCATGAGGTATTTC(配列表の配列番号3)
2. TCTGGTTGTAGTAGC (配列表の配列番号4)
3. GGCCAGGGTCTCACA (配列表の配列番号5)
4. 下記2種のプライマーの混合プライマー
CCCCGGCGACCTAT (配列表の配列番号10)
GGAAGGCTCCCCACT (配列表の配列番号11)
上記シーケンス反応によって得られた部分複製DNAをエタノール沈殿法で精製し、水に再溶解させ、キャピラリーDNAシーケンサー(RISA−384、(株)島津製作所製)によって部分複製DNAの配列データを解析した。ヘテロ接合体由来の二重ピークを検出してコンセンサス配列を決定し、決定されたコンセンサス配列データは、http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.htmlにおいて公開されているHLA型データからの検索を行い、ヒットした型を列挙した。
上述のタイピング方法によって得られたHLAの型と、血清学的タイピング方法によって得られたHLAの型とを比較すると、5試料全てについて一致を示した。
なお、口腔粘膜から直接PCRが行われたかどうかは、得られた増幅産物の一部を電気泳動することによって確認した。電気泳動の図を図2に示す。図2中、レーン1は、実施例2で行われたPCRで用いたバッファーAmpdirectR-G/C4μlを、ExTaq(宝酒造(株)製)添付PCRバッファー2μlに置き換えた結果である。レーン3は、実施例2で行われたPCRの結果である。図2が示すように、従来型のPCRバッファーではDNAの増幅は確認できない(レーン1)が、AmpdirectR-G/CとAmp Addition-4との混合物をバッファーに用いると明確にDNAの増幅が確認できた(レーン3)。
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な2つの形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
配列番号1〜11は、合成プライマーである。
Claims (4)
- 生体試料から直接DNA増幅反応を行って、前記生体試料中に含まれるDNAの塩基配列を決定し、決定された前記塩基配列を用いてHLAの型を決定する、HLAタイピング法。
- 前記DNA増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項1に記載のHLAタイピング法。
- 前記生体試料が血液試料又は口腔粘膜細胞試料である、請求項1又は2に記載のHLAタイピング法。
- 前記血液試料が、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血である、請求項3に記載のHLAタイピング法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004054126A JP2004283165A (ja) | 2003-03-04 | 2004-02-27 | Hlaタイピング法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003057287 | 2003-03-04 | ||
JP2004054126A JP2004283165A (ja) | 2003-03-04 | 2004-02-27 | Hlaタイピング法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004283165A true JP2004283165A (ja) | 2004-10-14 |
Family
ID=33302044
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004054126A Pending JP2004283165A (ja) | 2003-03-04 | 2004-02-27 | Hlaタイピング法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2004283165A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012157295A (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Mukogawa Gakuin | 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法 |
WO2015019658A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
WO2015019952A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
WO2021049601A1 (ja) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | 積水メディカル株式会社 | リアルタイムpcrによる核酸検出方法 |
WO2021167058A1 (ja) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | 積水メディカル株式会社 | 乾燥濾紙血片を用いた標的核酸の検出方法 |
-
2004
- 2004-02-27 JP JP2004054126A patent/JP2004283165A/ja active Pending
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012157295A (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Mukogawa Gakuin | 遺伝子の増幅方法、特定遺伝子の検出方法 |
WO2015019658A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
WO2015019952A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
JP2015050994A (ja) * | 2013-08-06 | 2015-03-19 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
JPWO2015019952A1 (ja) * | 2013-08-06 | 2017-03-02 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
JP2018042567A (ja) * | 2013-08-06 | 2018-03-22 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
JP2019068815A (ja) * | 2013-08-06 | 2019-05-09 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
JP2020036614A (ja) * | 2013-08-06 | 2020-03-12 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
WO2021049601A1 (ja) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | 積水メディカル株式会社 | リアルタイムpcrによる核酸検出方法 |
WO2021167058A1 (ja) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | 積水メディカル株式会社 | 乾燥濾紙血片を用いた標的核酸の検出方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5834189A (en) | Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of HLA types | |
JP5811483B2 (ja) | 多数の標的の増幅のためのアンプリコンレスキューマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応 | |
JP3117083B2 (ja) | Hla dpタイプ分け方法 | |
US20150056621A1 (en) | Primers, methods and kits for detecting killer-cell immunoglobulin-like receptor alleles | |
US20080020386A1 (en) | Methods and apparatus for genotyping | |
JP2012523824A (ja) | Hla変異体の検出のためのシステムおよび方法 | |
US20140141436A1 (en) | Methods and Compositions for Very High Resolution Genotyping of HLA | |
CN105463116A (zh) | 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法 | |
US6103465A (en) | Methods and reagents for typing HLA class I genes | |
Holland | Molecular analysis of the human mitochondrial DNA control region for forensic identity testing | |
EP1179091B2 (fr) | Procede d'analyse de la predisposition genetique d'un patient a au moins une maladie et amplification adaptee a un tel procede | |
JP2004283165A (ja) | Hlaタイピング法 | |
KR100608278B1 (ko) | Hla 타이핑법 | |
Fujiwara et al. | Large‐scale DNA typing for human platelet alloantigens by PCR‐PHFA (preferential homoduplex formation assay) | |
US9863009B2 (en) | Sequence specific primer pool for multiplex PCR and method of detecting microbial infections in thalassemia patients | |
Zhang et al. | High‐throughput polymerase chain reaction analysis of clinical samples by capillary electrophoresis with UV detection | |
CA2213731C (en) | Methods and reagents for typing hla class i genes | |
JP5143450B2 (ja) | Hla−bローカスにおける新規アリル | |
JP2009539355A (ja) | 核酸分子の同定 | |
JP4186270B2 (ja) | 核酸合成法 | |
US20190226017A1 (en) | Methods and kits for typing kir2dl alleles | |
Lu et al. | Multiplex HLA-typing by pyrosequencing | |
JP4629167B2 (ja) | 核酸合成法 | |
Barral et al. | Sequence variation of two hypervariable short tandem repeats at the D22S683 and D6S477 loci | |
RU2818323C2 (ru) | Способ получения полноразмерной последовательности митохондриальной ДНК человека с использованием набора олигонуклеотидов методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК |