KR100608278B1 - Ｈｌａ 타이핑법 - Google Patents

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KR100608278B1
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Abstract

본 발명은 시료의 보존 및 수송이 간편하고 안전성이 높아 해석에 드는 비용이 적고, 해석 정밀도 및 처리 효율이 우수한 HLA 타이핑 기술을 제공한다. 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하여 생체 시료 중에 포함되는 DNA의 염기서열을 결정하고, 결정된 염기서열을 사용하여 HLA의 형을 결정하는 HLA 타이핑법이다. 바람직하게는 DNA 증폭 반응으로서 폴리머라아제 연쇄 반응을 사용하고, 생체 시료로서 여과지에 혈액을 포함시킨 후에 건조시킨 여지혈을 사용한다.
HLA 타이핑법, DNA 증폭 반응, 폴리머라아제 연쇄 반응, 여지혈, 생체 시료, 혈액 시료

Description

ＨＬＡ 타이핑법{Method for HLA-typing}
도 1은 여지혈(濾紙血)로부터 직접 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 2는 구강 점막으로부터 직접 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
본 발명은 의료 진단을 위한 HLA 타이핑 기술에 관한 것이다.
HLA(human leukocyte antigen; 인간 백혈구 항원)는 인간의 MHC(major histocompatibility complex; 주요 조직적합 유전자 복합체)로, 모든 세포 표면 상에 존재한다. HLA 분자는 개체간에 타입이 상이하여 그에 결합할 수 있는 항원 펩티드의 차이가 면역응답의 개체 차가 되어 나타난다. 따라서, HLA 분자를 코드하는 HLA 영역에 존재하는 유전자의 타입을 결정하는 것(HLA 타이핑)은 장기이식에 있어서의 도너(donor)와 레시피언트(recipient)와의 적합성이나 어떤 종류의 병에 대한 개인의 소질 등을 판정하는 경우에 사용되는 매우 중요한 기술이다.
HLA 타이핑에는 혈청학적 타이핑과 DNA 타이핑이 있다. 종래부터 HLA 타이핑 으로서는 혈청학적 타이핑이 행해져 왔다. 혈청학적 HLA 타이핑에 있어서는 항HLA 단일클론항체와 림프구와의 항원 항체 반응에 의해 HLA를 동정한다. 그러나 이 방법은 해석 정밀도가 낮거나 판정 가능한 HLA의 타입이 한정된다는 결점이 있다.
한편, DNA 타이핑은 HLA를 코드하고 있는 제6 염색체 상의 유전자를 직접 타이핑하는 기술이다(RFLP법 등). 예를 들면 일본국 특허공표 제2002-503497호 공보(Japanese National Publication No.2002-503497)에 의하면, DNA 타이핑을 행하기 위해서는 미리 생체 시료로부터 DNA를 분리·정제하고, 그것을 주형(鑄型)에 유전자좌(遺傳子座) 특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 등을 행하여 시퀀스 반응 주형을 작성하고 있었다.
종래의 방법에서는 생체 시료의 보관시에 있어서의 보존성의 문제 및 생체 시료의 수송시에 있어서의 간편성의 문제가 있다. 특히 생체 시료가 혈액 시료인 경우는 항원 미생물 등의 감염 가능성이 있기 때문에 검사 등으로 혈액 시료를 취급하는 인간에 대해서 위험이 있어 안전성에 문제가 있다. 또한, 혈액 시료 등의 액체 시료는 시료간의 교차오염(cross-contamination) 등 시료 자체의 오염의 가능성이라는 문제가 있다. 더욱이, 생체 시료로부터 DNA를 분리·정제할 때에는 수고나 비용이 든다는 문제가 있다. 최근 DNA의 분리·정제는 여러가지 키트(kit)를 이용함으로써 간략화되어 오고 있지만, 그러하더라도 다단계의 조작이 필요하다. 이 때문에 다검체 해석을 행하는 경우에는 시료의 안전성이 저하할 뿐만 아니라 해석에 비용이 든다는 문제가 있다.
따라서 본 발명의 목적은 시료의 보존 및 수송이 간편하고 안전성이 높아 해석에 드는 비용이 적고, 해석 정밀도 및 처리 효율이 우수한 HLA 타이핑 기술을 제공하는 데 있다.
본 발명자 등은 예의 검토한 결과 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하여 증폭된 DNA의 염기서열을 결정하고, 결정된 염기서열의 정보를 사용하여 HLA의 타이핑을 행함으로써 상기 목적이 달성되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하여 상기 혈액 시료 중에 포함되는 DNA의 염기서열을 결정하고, 결정된 상기 염기서열을 사용하여 HLA의 형을 결정하는 HLA 타이핑법.
(2) (1)에 있어서, 상기 DNA 증폭 반응이 폴리머라아제 연쇄 반응인 HLA 타이핑법.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 생체 시료가 혈액 시료 또는 구강 점막 시료인 HLA 타이핑법.
(4) (3)에 있어서, 상기 혈액 시료가 전혈(全血)인 HLA 타이핑법.
(5) (3) 또는 (4)에 있어서, 상기 혈액 시료가 건조혈액인 HLA 타이핑법.
(6) (3) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 혈액 시료가 여과지에 혈액을 포함시킨 후에 건조시킨 여지혈(濾紙血)인 HLA 타이핑법.
본 발명에 의하면, 시료의 보존 및 수송이 간편하고 안전성이 높아 해석에 드는 비용이 적고, 해석 정밀도 및 처리 효율이 우수한 HLA 타이핑 기술이 제공된다. 또한 본 발명에 의하면, 직접 PCR에 있어서 적절한 버퍼를 선택함으로써 전체 로커스(locus)의 HLA 타이핑을 행하는 것이 가능해진다.
본 발명은 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하는 것을 특징으로 하는 HLA 타이핑법이다. 본 발명에서 직접이란, DNA 증폭에 앞서 생체 시료에 포함되는 DNA의 분리·정제를 행하는 과정이 불필요하다는 의미이다. 본 발명의 HLA 타이핑법에 있어서는, 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하여 증폭된 DNA의 염기서열로부터 생체 시료 중에 포함되는 DNA의 염기서열을 결정하고, 결정된 염기서열을 사용하여 HLA의 형을 결정한다. 또한, HLA 타이핑은 통상 A, B, DR의 각 로커스에 대해서 행한다.
본 발명에 있어서 HLA 타이핑해야 할 생체 시료로서는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 혈액 시료나 구강 점막 시료 등은 시료 채취가 간편하여 바람직하다.
혈액 시료로서는 전혈을 사용할 수 있다. DNA를 정제한 것이나 EDTA 등으로 처리를 행한 것을 사용해도 된다. 시료의 형태로서는 DNA가 잔존하고 있다면 신선혈, 보존혈액 및 건조혈액 중 어느 것이어도 된다. 보존혈액으로서는 냉장보존, 냉동보존을 불문한다. 본 발명에 있어서는, 빈번하게 동결·융해를 반복한 냉동혈액 이더라도 안정하게 핵산증폭 산물이 얻어진다. 건조혈액으로서는 여과지에 혈액을 포함시킨 후에 건조시킨 것(여지혈)을 사용해도 된다. 본 발명에 있어서 여지혈을 사용하는 것은 시료의 보존성이나 수송시의 간편성 및 안전성의 관점에서 바람직하다. 여과지에 혈액 시료를 포함시킴으로써 시료가 액체 상태이지 않게 되기 때문에 시료를 엎지르거나 비산시킬 위험성이 적어진다. 따라서, 시료의 안전성이 높고 오염의 가능성이 적어진다.
본 발명에 있어서는 상기 혈액 시료 중에 존재하는 DNA를 분리·정제하지 않고 DNA 증폭 반응을 행한다. 본 발명에 있어서는, 증폭 반응에 있어서의 반응용액에 후술하는 것을 사용함으로써 시료의 전처리를 행하지 않고 직접 DNA 증폭 반응을 행할 수 있다. 이것으로 전처리의 수고나 비용을 줄일 수 있다. 예를 들면, 여지혈을 사용하는 경우는, 소량의 혈액을 여과지에 포함시켜 건조시킨 후 혈액 부착부분의 일부를 뚫어낸(punched out) 것을 그대로 증폭 반응에 사용할 수 있다.
DNA 증폭에는 PCR를 사용하면 된다. PCR에 사용하는 PCR 반응용액은 버퍼, 프라이머의 세트, dNTP(데옥시뉴클레오시드 삼인산) 각종 및 DNA 폴리머라아제를 포함한다.
분리·정제 등의 전처리를 행하지 않는 시료에는 DNA 증폭 반응을 저해하는 물질이 포함되어 있다. DNA 증폭 반응을 저해하는 물질이란, 생물의 체액 중에 존재하는 양전하 물질(어떤 종의 단백질 등)이나 음전하 물질(어떤 종의 당, 색소 등) 등이다. 단백질 등의 양전하 물질은 DNA에 흡착하여 증폭 반응을 저해한다. 한편, 당이나 색소 등의 음전하 물질은 DNA 폴리머라아제에 흡착하여 증폭 반응을 저 해한다. 본 발명에 있어서는 DNA 증폭 반응 저해물질의 작용을 억제하는 작용을 갖는 것을 버퍼로 사용한다.
이러한 버퍼로서는 예를 들면, AmpdirectR-A, AmpdirectR-G/C(모두 Shimadzu Corporation제)를 들 수 있다. 또한, 필요에 따라 증폭효율 향상을 위한 Amp Addition-1 또는 Amp Addition-4(모두 Shimadzu Corporation제, 이하, Amp Addition이라고 총칭한다.)를 AmpdirectR-A 또는 AmpdirectR-G/C에 가한 것을 버퍼로서 사용해도 된다. 본 발명에 있어서는 AmpdirectR-G/C를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 AmpdirectR-G/C에는 Amp Addition-4를 가하여 사용하는 것이 보다 바람직하다. AmpdirectR-A나 AmpdirectR-G/C는 DNA 증폭 반응용액 중에 존재하는 상기의 저해물질을 중화하는 작용이 있기 때문에 미정제 시료이더라도 PCR을 가능하게 한다. 이것으로, 생체 시료로부터 직접 핵산증폭하는 것이 가능해진다. 그 밖에 상기 작용을 갖는 버퍼로서는 예를 들면 AmpdirectR-B, AmpdirectR-D를 들 수 있고, 버퍼 중에 필요에 따라 포함되는 Amp Addition으로서는 예를 들면 Amp Addition-2, Amp Addition-3을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는 상기한 버퍼에 한정되지 않고 타이핑하는 로커스에 따라 적합한 조성을 갖는 버퍼를 적절히 선택할 수 있다.
프라이머로서는 HLA 영역에 특이적인 증폭 프라이머 세트를 사용한다. DNA 폴리머라아제로서는 TaqDNA가 바람직하고, TaKaRaZ-TaqTM, ExTaq(각각 Takara Shuzo Co., Ltd.제)가 보다 바람직하다.
본 발명의 PCR 반응용액의 상기 성분은 예를 들면 이하의 배합량(PCR 반응용액 전체의 체적을 기준으로 한다.)으로 사용할 수 있다. 즉, 버퍼는 10~40 체적%, 예를 들면 20 체적%, 프라이머는 각각 0.1~2 μM, 예를 들면 0.5 μM, dNTP는 각각 100~300 μM, 예를 들면 200 μM, DNA 폴리머라아제는 0.5~1.25 U/㎕, 예를 들면 1.25 U/㎕를 사용할 수 있다. 또한, Amp Addition을 AmpdirectR-A나 AmpdirectR-G/C 등에 가한 것을 버퍼로서 사용하는 경우 Amp Addition의 양의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 AmpdirectR-A나 AmpdirectR-G/C 등의 양에 대해서 150 체적% 정도까지, 예를 들면 100 체적% 사용할 수 있다. 예를 들면 시료가 되는 혈액은 0.5 ㎕~2 ㎕를 사용할 수 있고, 혈액 시료 1 ㎕에 대해서 상기 PCR 반응용액은 10~200 ㎕, 바람직하게는 20~100 ㎕를 사용할 수 있다. 이들 모든 조건은 당업자가 적절히 결정할 수 있다. 또한, PCR 반응의 조건에 대해서도 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
증폭된 DNA는 정제를 행하는 것이 바람직하다. 정제에는 예를 들면 엑소뉴클레아제(exonuclease)와 알칼리포스파타아제를 사용하면 된다. 이들은 미반응 프라이머 뉴클레오티드를 불활성화하는 작용이 있어 증폭된 DNA가 정제된다.
정제된 DNA는 그 염기서열이 결정된다. 즉 본 발명은 DNA 타이핑법으로서, HLA 영역의 염기서열을 결정함으로써 종래의 혈청학적 타이핑에 비해 고정밀도의 타이핑이 가능해진다.
염기서열의 결정에는 생거법(Sanger method), 맥섬 길버트법(Maxam-Gilbert method) 등을 사용할 수 있다. 예를 들면 생거법에 있어서는, 통상의 조작에 따라 반응을 행함으로써 사슬길이가 다른 부분복제 DNA의 혼합물을 얻는다. 얻어진 부분복제 DNA의 서열은 전기영동법을 사용한 모세관형(capillary-type) 또는 평판[(슬랩겔(slab gel)]형 DNA 시퀀서에 의해 해석을 행하면 된다. 본 발명에 있어서는 모세관형 DNA 시퀀서(RISA-384(Shimadzu Corporation제), ABI-3730xl(Applied Biosystems사제))을 사용하는 것이 바람직하다. 시퀀스 데이터는 컴퓨터 프로그램에 의해 해석하고, 헤테로 접합체 유래의 이중 피크를 자동 검출하여 콘센서스 서열(consensus sequence)을 결정한다. 결정된 염기서열은 HLA형 데이터베이스로부터 검색을 행함으로써 HLA형을 자동 판정한다.
이상과 같이 본 발명에 의하면, DNA 타이핑이 높은 해석 정밀도를 유지하면서 종래에 비해 DNA 해석의 수고나 비용을 큰 폭으로 삭감함으로써 보다 많은 시료를 보다 효율적으로 처리하는 것이 가능하다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되지는 않는다.
[실시예 1]
40인의 피실험자로부터 손끝을 바늘로 찔러 채취한 각각의 소량의 혈액(약 1 ㎕)을 여과지에 흡착시켰다. 여과지의 혈액 부착부분의 일부분을 펀치로 뚫어내어(직경 2 mm) 96웰(96-well) PCR 플레이트에 삽입하였다. 하기에 나타내는 PCR 반응용액 20 ㎕를 플레이트의 각각의 혈액 여과지에 가하여 증발방지 실(seal)을 플레이트에 붙였다.
(PCR 반응용액(20 ㎕ 중))
프라이머
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC (서열표의 서열번호 1) 0.5 μM
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC (서열표의 서열번호 2) 0.5 μM
AmpdirectR-G/C(Shimadzu Corporation제) 4 ㎕
dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 μM
ExTaq(Takara Shuzo Co., Ltd.제) 0.5 U
PCR 반응은 써멀 사이클러(thermal cycler)(Applied Biosystems사제, GeneAmp9700)를 사용하여 96℃-3분간 예열한 후, 96℃-30초간, 63℃-1분간, 72℃-3분간의 조건으로 40 사이클을 행하였다. 마지막으로 72℃-5분간의 중합을 행하였다.
각각의 반응용액 10 ㎕를 회수하고 엑소뉴클레아제와 알칼리포스파타아제의 혼합물(Amersham제, ExoSAP-IT) 1 ㎕를 가함으로써 정제를 행하였다.
하기에 나타내는 시퀀스 반응액 5 ㎕를 사용하여 상기 정제에 의해 얻어진 PCR 산물을 하기 4종류의 프라이머를 사용하여 각각 시퀀스를 행하였다.
(시퀀스 반응액(5 ㎕ 중))
상기 정제에 의해 얻어진 PCR 산물 0.25 ㎕
프라이머 1 μM
BigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems사제) 1 ㎕
(프라이머)
1. CACTCCATGAGGTATTTC (서열표의 서열번호 3)
2. TCTGGTTGTAGTAGC (서열표의 서열번호 4)
3. GGCCAGGGTCTCACA (서열표의 서열번호 5)
4. CAATTGTCTCCCCTC (서열표의 서열번호 6)
상기 시퀀스 반응에 의해 얻어진 부분복제 DNA를 에탄올 침전법으로 정제하고, 물에 재용해시켜 모세관 DNA 시퀀서(RISA-384, Shimadzu Corporation제)에 의해 부분복제 DNA의 서열 데이터를 해석하였다. 헤테로 접합체 유래의 이중 피크를 검출하여 콘센서스 서열을 결정하고, 결정된 콘센서스 서열 데이터는 http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html에 있어서 공개되어 있는 HLA형 데이터로부터의 검색을 행하여 히트(hit)한 형을 열거하였다.
상술한 타이핑 방법에 의해 얻어진 HLA의 형과 혈청학적 타이핑 방법에 의해 얻어진 HLA의 형을 비교하면 40개의 시료 모두에 대해서 일치를 나타냈다.
또한, 여지혈로부터 직접 PCR이 행해졌는지의 여부는 얻어진 증폭 산물의 일부를 전기영동함으로써 확인하였다. 전기영동 도면을 도 1에 나타낸다. 도 1 중, 레인 1은 실시예 1에서 행해진 PCR에서 사용한 버퍼 AmpdirectR-G/C 4 ㎕를 ExTaq(Takara Shuzo Co., Ltd.제) 첨부 PCR 버퍼 2 ㎕로 치환한 결과이다. 레인 2는 실시예 1에서 행해진 PCR의 결과이다. 레인 3은 실시예 1에서 행해진 PCR에서 사용한 버퍼 AmpdirectR-G/C 4 ㎕를, AmpdirectR-G/C:Amp Addition-4=1:1(체적비)의 혼합용액 8 ㎕로 치환한 결과이다. 도 1이 나타내는 바와 같이, 종래형 PCR 버퍼로는 DNA의 증폭은 확인할 수 없지만(레인 1), AmpdirectR-G/C나 AmpdirectR-G/C와 Amp Addition-4와의 혼합물을 버퍼로 사용하면 명확하게 DNA의 증폭을 확인할 수 있었다(레인 2 및 3).
[실시예 2]
5명의 피실험자는 입에 소량의 물을 포함하여 입안을 가볍게 세정하였다. 이어서 시판의 칫솔로 한쪽 뺨 10회씩(양 뺨 합계 20회)의 브러싱을 행한 후 칫솔을 10 ml의 1 중량% NaCl 수용액이 들어간 원침관(centrifuge tube) 안에 넣어 수회 흔들어 채취한 구강 점막을 1 중량% NaCl 수용액에 현탁하여 샘플 현탁액으로 하였다.
하기에 나타내는 PCR 반응용액 45 ㎕를 넣은 튜브에 상기 샘플 현탁액 5 ㎕를 가하였다.
(PCR 반응용액(50 ㎕ 중))
프라이머
포워드 프라이머
ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT (서열표의 서열번호 7) 0.5 μM
리버스 프라이머(하기 2종류 프라이머의 혼합 프라이머로서 사용하였다.)
GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT (서열표의 서열번호 8) 0.25 μM
GGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT (서열표의 서열번호 9) 0.25 μM
AmpdirectR-G/C(Shimadzu Corporation제) 10 ㎕
AmpAddition-4(Shimadzu Corporation제) 10 ㎕
dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각 200 μM
Z-Taq(Takara Shuzo Co., Ltd.제) 1.25 U
PCR 반응은 써멀 사이클러(Applied Biosystems사제, GeneAmp9700)를 사용하여 80℃-15분의 전처리, 이어서 96℃-3분간의 예열 후, 96℃-30초간, 63℃-1분간, 72℃-3분간의 조건으로 40 사이클을 행하였다. 마지막으로 72℃-5분간의 중합을 행하였다.
각각의 반응용액 10 ㎕를 회수하고 엑소뉴클레아제 및 알칼리포스파타아제의 혼합물(Amersham제, ExoSAP-IT) 1 ㎕를 가함으로써 정제를 행하였다.
하기에 나타내는 시퀀스 반응액 5 ㎕를 사용하여 상기 정제에 의해 얻어진 PCR 산물을 하기 4종류의 프라이머를 사용하여 시퀀스를 행하였다.
(시퀀스 반응액(5 ㎕ 중))
상기 정제에 의해 얻어진 PCR 산물 0.25 ㎕
프라이머 1 μM
BigDye Terminator Ver3.1(Applied Biosystems사제) 1 ㎕
(프라이머)
1. CACTCCATGAGGTATTTC (서열표의 서열번호 3)
2. TCTGGTTGTAGTAGC (서열표의 서열번호 4)
3. GGCCAGGGTCTCACA (서열표의 서열번호 5)
4. 하기 2종류 프라이머의 혼합 프라이머
CCCCGGCGACCTAT (서열표의 서열번호 10)
GGAAGGCTCCCCACT (서열표의 서열번호 11)
상기 시퀀스 반응에 의해 얻어진 부분복제 DNA를 에탄올 침전법으로 정제하고, 물에 재용해시켜 모세관 DNA 시퀀서(RISA-384, Shimadzu Corporation제)에 의해 부분복제 DNA의 서열 데이터를 해석하였다. 헤테로 접합체 유래의 이중 피크를 검출하여 콘센서스 서열을 결정하고, 결정된 콘센서스 서열 데이터는 http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.html에 있어서 공개되어 있는 HLA형 데이터로부터의 검색을 행하여 히트한 형을 열거하였다.
상술한 타이핑 방법에 의해 얻어진 HLA의 형과 혈청학적 타이핑 방법에 의해 얻어진 HLA의 형을 비교하면 5개 시료 모두에 대해서 일치를 나타냈다.
또한, 구강 점막으로부터 직접 PCR이 행해졌는지의 여부는 얻어진 증폭 산물의 일부를 전기영동함으로써 확인하였다. 전기영동 도면을 도 2에 나타낸다. 도 2 중, 레인 1은 실시예 2에서 행해진 PCR에서 사용한 버퍼 AmpdirectR-G/C 4 ㎕를 ExTaq(Takara Shuzo Co., Ltd.제) 첨부 PCR 버퍼 2 ㎕로 치환한 결과이다. 레인 3은 실시예 2에서 행해진 PCR의 결과이다. 도 2가 나타내는 바와 같이, 종래형 PCR 버퍼로는 DNA의 증폭은 확인할 수 없지만(레인 1), AmpdirectR-G/C와 Amp Addition-4와의 혼합물을 버퍼로 사용하면 명확하게 DNA의 증폭을 확인할 수 있었다(레인 3).
상기 실시예에서는 본 발명의 범위에 있어서의 구체적인 2개의 형태에 대해서 나타냈지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않고 다른 여러가지 형태로 실시할 수 있다. 그 때문에, 상기 실시예는 모든 점에서 단순한 예시에 지나지 않아 한정적으로 해석해서는 안된다. 더욱이, 청구항의 균등 범위에 속하는 변경은 모두 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 의하면, 시료의 보존 및 수송이 간편하고 안전성이 높아 해석에 드는 비용이 적고, 해석 정밀도 및 처리 효율이 우수한 HLA 타이핑 기술이 제공된다. 또한 본 발명에 의하면, 직접 PCR에 있어서 적절한 버퍼를 선택함으로써 전체 로커스의 HLA 타이핑을 행하는 것이 가능해진다.
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Claims (6)

  1. 생체 시료로부터 직접 DNA 증폭 반응을 행하여 상기 생체 시료 중에 포함되는 HLA 영역의 DNA의 염기서열을 결정하고, 결정된 상기 염기서열을 사용하여 HLA의 형을 결정하는 HLA 타이핑법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 증폭 반응이 폴리머라아제 연쇄 반응인 HLA 타이핑법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료가 혈액 시료 또는 구강 점막 시료인 HLA 타이핑법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 혈액 시료가 전혈인 HLA 타이핑법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 혈액 시료가 건조혈액인 HLA 타이핑법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 혈액 시료가 여과지에 혈액을 포함시킨 후에 건조시킨 여지혈인 HLA 타이핑법.
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