CN116926217A - 一种E.coli残留总RNA检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种E.coli残留总RNA检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括E.coli RNA定量标准品、One Step Enzyme Mix、E.coli RNA Primer⪻Mix。本发明提供的E.coli残留总RNA检测试剂盒的扩增效率在90‑110％，稳定性好，样本的检测结果更加可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种E.coli残留总RNA检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
在细胞药生产过程中，需要用到大肠杆菌来扩增质粒，因此大肠杆菌总RNA残留的含量是细胞药的重要质控标准。细胞药中宿主残留RNA不仅是生产带来的杂质，还存在一定安全隐患，进入人体后可造成多种多样的后果，例如残留RNA引入了显性致癌基因，使得部分细胞分化为瘤性细胞；残留RNA因为细胞RNA中可能存在感染性病毒基因组而具有感染性，能通过复制和转录扩增并产生感染性病毒粒子，因此，RNA感染性风险可能比致癌性风险更高。
检测总RNA残留的含量通常是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料，即实时荧光定量PCR(qPCR)，其原理为：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
中国专利CN115216550A公开了E.coli残留RNA检测试剂盒及其使用方法，试剂盒至少包括E.coliRNA定量参考品、E.coliPrimer□MIX、qPCRReactionBuffer、RNA稀释液，采用qPCR-荧光探针法，在qPCR技术的基础上利用荧光探针原理，定量检测样本中E.coli残留RNA，简化qPCR反应操作的反应液配置时的操作步骤，检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到fg水平。但上述试剂盒无法应用于E.coli残留总RNA的检测。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种E.coli残留总RNA检测试剂盒，所述试剂盒包括E.coli RNA定量标准品、One Step Enzyme Mix、E.coli RNAPrimer&Probe Mix。
在一些实施方式中，所述One Step Enzyme Mix包括逆转录酶、热启动聚合酶、缓冲液。
进一步地，所述逆转录酶、热启动聚合酶、缓冲液的体积比为1:1:10。
在一些实施方式中，所述E.coli RNAPrimer&Probe Mix包括E.coli靶标RNA的上游引物、下游引物和探针。
进一步地，所述E.coli靶标RNA的上游引物、下游引物和探针的体积比为3:3:2。
在一些实施方式中，所述E.coli靶标RNA的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。
上游引物：GGAACCGTGAGACAGGTGCT
下游引物：CTCTCGCGAGGTCGCTTCT
探针：FAM-AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT-BHQ1
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括One Step RT-qPCR buffer、RNA IPCPrimer&Probe Mix、RNA稀释液、ROX Low、ROX High。
在一些实施方式中，所述RNA IPC Primer&Probe Mix包括质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板，体积比为0.6：0.6：0.4：5。
进一步地，所述质控IPC上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，质控IPC下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，质控IPC探针序列如SEQ ID NO.6所示，质控RNA模板序列如SEQ IDNO.7所示。
质控IPC引物探针序列
上游引物：TGACATGCTCCAGGGCCATAC
下游引物：TGGCTTACCAGTGCCCTGAC
探针：Vic-TCGACCCGTACGGAGCGTCATC-BHQ1
质控RNA模板
AACTAGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAAGCGGTGAGTCCTACATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACGTCTAAGGC
本发明的第二个方面提供了一种采用所述试剂盒检测E.coli残留总RNA的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.E.coli RNA定量标准品的稀释；
S2.qPCR反应液的制备和加样；
S3.qPCR程序参数设置；
S4.qPCR结果分析。
在一些实施方式中，所述S1中稀释具体包括：取6支1.5mL离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，在STD0管中用RNA稀释液将E.coli RNA定量标准品稀释10倍，振荡混匀后短时间快速离心10s，在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5管中分别加入5μL稀释后的STD0和45μLRNA稀释液。
在一些实施方式中，所述STD0管中RNA稀释液的浓度为200pg/μL。
在一些实施方式中，所述STD1管中RNA稀释液的浓度为20pg/μL，所述STD2管中RNA稀释液的浓度为2pg/μL，所述STD3管中RNA稀释液的浓度为0.2pg/μL，所述STD4管中RNA稀释液的浓度为0.02pg/μL，所述STD5管中RNA稀释液的浓度为0.002pg/μL。
在一些实施方式中，所述S2中qPCR反应液的制备和加样进一步根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数进行实验用的各试剂需要的量进行制备及加样。
在一些实施方式中，所述S3中qPCR程序参数设置进一步按照说明书对qPCR设备进行程序设定。
所述qPCR程序参数设置具体包括以下步骤：
S1、创建实验反应程序，设置PCR反应程序如下：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环，反应体积20μL；
S2、创建实验反应板，点击SelectFluorophores选择荧光FAM；(a)在反应板图表中，选择样品孔，在SampleType中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，TargetName进行命名，输入每个样品的重复次数及SampleName；(b)在反应板图表中，选择标曲孔，在SampleType中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，TargetName命名E.coli-RNA，输入每个稀释梯度的重复次数及SampleName；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5的Concentration一栏进行赋值，选择单位fg；
S3、点击StartRun，选择保存路径。
在一些实施方式中，所述S4中qPCR结果分析进一步根据设备上的相关数据，进行分析以及报告结果。
进一步地，所述qPCR结果分析具体包括以下步骤：
S1、点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、扩增效率(Effect)、R2；
S2、在视窗QuantitationData中，SQMean一栏可读取无模板对照NTC、待测样本检测值，单位为fg/μL；
S3、无模板对照NTC检测结果应为N/A或Ct值大于标准曲线最低浓度Ct均值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的E.coli残留总RNA检测试剂盒的扩增效率在90-110％，稳定性好，样本的检测结果更加可靠。
2.本发明提供的E.coli残留总RNA检测试剂盒简化了qPCR反应操作时反应液配置时的操作步骤，试剂盒中有配置好的试剂，可直接用于实验，减少操作者的工作量，节约整个操作时间，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。
3.本发明提供的E.coli残留总RNA检测试剂盒使用RT-PCR荧光探针法原理，将反转录和荧光探针qPCR检测技术融合，可实现一步法定量检测。
4.本试剂盒已完成方法学验证，检测快速，专一性强，性能可靠。
5.本发明提供的E.coli残留总RNA检测试剂盒反应原料易得，成本低，使用方法简单，具有广阔的市场推广前景。
附图说明
图1为性能测试中标曲扩增曲线及线性图，左图为标曲扩增曲线，右图为线性图。
具体实施方式
实施例1
一种E.coli残留总RNA检测试剂盒，所述试剂盒包括E.coli RNA定量标准品、OneStep Enzyme Mix、E.coli RNA Primer&Probe Mix、One Step RT-qPCR buffer、RNA IPCPrimer&Probe Mix、RNA稀释液。各组分的来源参见下表。
所述One Step Enzyme Mix包括逆转录酶(购买自赛默飞)、热启动聚合酶(购买自赛默飞)、缓冲液，体积比为1:1:10。
所述E.coli RNA Primer&Probe Mix包括E.coli靶标RNA的上游引物、下游引物和探针，体积比为3:3:2。
所述RNA IPC Primer&Probe Mix包括质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板，体积比为0.6：0.6：0.4：5。
一种采用所述试剂盒检测E.coli残留总RNA的方法，所述方法包括如下步骤：
S1.E.coli RNA定量标准品的稀释；
S2.qPCR反应液的制备和加样；
S3.qPCR程序参数设置；
S4.qPCR结果分析。
所述S1中稀释具体包括：取6支1.5mL离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，在STD0管中用RNA稀释液将E.coli RNA定量标准品稀释10倍，振荡混匀后短时间快速离心10s，在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5管中分别加入5μL稀释后的STD0和45μLRNA稀释液。
所述STD0管中RNA稀释液的浓度为200pg/μL，所述STD1管中RNA稀释液的浓度为20pg/μL，所述STD2管中RNA稀释液的浓度为2pg/μL，所述STD3管中RNA稀释液的浓度为0.2pg/μL，所述STD4管中RNA稀释液的浓度为0.02pg/μL，所述STD5管中RNA稀释液的浓度为0.002pg/μL。
所述S2中qPCR反应液的制备和加样进一步根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数进行实验用的各试剂需要的量进行制备及加样。
所述S3中qPCR程序参数设置进一步按照说明书对qPCR设备进行程序设定。所述qPCR程序参数设置具体包括以下步骤：
S1、创建实验反应程序，设置PCR反应程序如下：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环，反应体积20μL；
S2、创建实验反应板，点击SelectFluorophores选择荧光FAM；(a)在反应板图表中，选择样品孔，在SampleType中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，TargetName进行命名，输入每个样品的重复次数及SampleName；(b)在反应板图表中，选择标曲孔，在SampleType中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，TargetName命名E.coli-RNA，输入每个稀释梯度的重复次数及SampleName；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5的Concentration一栏进行赋值，选择单位fg；
S3、点击StartRun，选择保存路径。
所述S4中qPCR结果分析进一步根据设备上的相关数据，进行分析以及报告结果。所述qPCR结果分析具体包括以下步骤：
S1、点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、扩增效率(Effect)、R2；
S2、在视窗QuantitationData中，SQMean一栏可读取无模板对照NTC、待测样本检测值，单位为fg/μL；
S3、无模板对照NTC检测结果应为N/A或Ct值大于标准曲线最低浓度Ct均值。
性能测试
将实施例1的E.coli残留总RNA检测试剂盒做如下检测：
1.线性范围：如图1所示，试剂盒线性范围为：2.00×102～2.00×10-3pg/μL，R2＝1，扩增效率为97.892％。各浓度点CV值见表1。
表1各浓度点CV值
2.定量限：检测2.00×10-3pg/μL、1.00×10-3pg/μL及0.50×10-3pg/μL3个浓度各10个复孔，计算CV值和偏差。根据检测结果，定量限可设置为2.00×10-3pg/μL。定量限确认见表2。
表2定量限确认
3.重复性：重复检测中间浓度标准品(2.00×101pg/μL、2.00×10-1pg/μL，2.00×10-2pg/μL)，每个浓度做10个重复，CV值均在20％以内。重复性结果见表3。
表3重复性
4.专属性：干扰试验：每个反应分别加入3000pg的毕赤酵母、Vero、CHO、NS1、293T的RNA及293TRNA扩增结果与空白限相当。干扰基因组定量结果见表4。
表4干扰基因组定量结果
| 干扰物种 | 浓度pg/ul |
| Yeast DNA | 4.36E-04 |
| Vero DNA | 5.51E-05 |
| CHO DNA | 2.81E-04 |
| 293T DNA | 3.25E-05 |
| 293T RNA | 5.45E-04 |
| NS1 DNA | 2.81E-04 |
5.中间精密度：3名操作人员分别检测高、中、低浓度(2.00×102pg/μL、2.00×101pg/μL、2.00×10-1pg/μL、2.00×10-3pg/μL)标准品，每个浓度做10个重复，重复检测高、中间浓度标准品(CV值均在20％以内，检测低浓度标准品CV值均在30％以内，符合中间精密度要求。中间精密度结果分析见表5。
表5中间精密度结果分析
6.稳定性：试剂盒冻融4次，进行标准曲线测定，并测度低浓度样本(0.002pg/μL)，各片段的标曲参数均符合要求，测试样本CV值符合要求，
即试剂盒冻融四次不影响性能。测试结果见表6。
表6试剂盒稳定性测试结果
Claims (10)
1.一种E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括E.coli RNA定量标准品、One Step Enzyme Mix、E.coli RNA Primer&Probe Mix。
2.根据权利要求1所述的E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述One StepEnzyme Mix包括逆转录酶、热启动聚合酶、缓冲液。
3.根据权利要求1所述的E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述E.coli RNAPrimer&Probe Mix包括E.coli靶标RNA的上游引物、下游引物和探针。
4.根据权利要求3所述的E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述E.coli靶标RNA的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括One Step RT-qPCR buffer、RNAIPC Primer&Probe Mix、RNA稀释液、ROX Low、ROX High。
6.根据权利要求5所述的E.coli残留总RNA检测试剂盒，其特征在于，所述RNAIPCPrimer&Probe Mix包括质控IPC上游引物、质控IPC下游引物、质控IPC探针和质控RNA模板，质控IPC上游引物序列如SEQ ID NO.4所示，质控IPC下游引物序列如SEQ ID NO.5所示，质控IPC探针序列如SEQ ID NO.6所示，质控RNA模板序列如SEQ ID NO.7所示。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述的试剂盒检测E.coli残留总RNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1.E.coli RNA定量标准品的稀释；
S2.qPCR反应液的制备和加样；
S3.qPCR程序参数设置；
S4.qPCR结果分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述S1中稀释具体包括：取6支1.5mL离心管，分别标记为STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，在STD0管中用RNA稀释液将E.coli RNA定量标准品稀释，振荡混匀后短时间快速离心10s，在STD1、STD2、STD3、STD4、STD5管中分别加入5μL稀释后的STD0和45μLRNA稀释液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述STD0管中RNA稀释液的浓度为200pg/μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述STD1管中RNA稀释液的浓度为20pg/μL，所述STD2管中RNA稀释液的浓度为2pg/μL，所述STD3管中RNA稀释液的浓度为0.2pg/μL，所述STD4管中RNA稀释液的浓度为0.02pg/μL，所述STD5管中RNA稀释液的浓度为0.002pg/μL。
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