CN117143979A - 一种质粒残留dna检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及IPC C12N15，更具体地涉及，一种质粒残留DNA检测试剂盒及其使用方法。本发明中的质粒残留DNA检测试剂盒，包括2×qPCR Reaction MIX、质粒Primer⪻MIX、定量参考品1～6、DNA稀释液、ROX Low、ROX High，其标准曲线的线性范围为4×106copies/μL～4×101copies/μL，R2≥0.980，扩增效率90％≤Eff(％)≤110％，各浓度检测值CV<15％，准确度，精密度高，稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及IPC C12N15，更具体地涉及，一种质粒残留DNA检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
在慢病毒、腺病毒包装实验中，需要用到各类质粒DNA，但过多的质粒DNA残留可能会与其潜在的致瘤性相关。2022年5月份CDE颁布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》就明确指出AAV等易于将非载体DNA包装入病毒颗粒的病毒载体，在选择包装质粒时应考虑相关外源DNA包装入病毒颗粒的潜在风险。
现有专利CN202280005530.8公开了用于检测细胞制剂或病毒制剂中的宿主DNA残留的质粒靶点、引物探针、试剂盒及方法，通过磁珠法前处理样本，再进行检测，但该试剂盒中未对其准确度、灵敏度进行检测。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种质粒残留DNA检测试剂盒，包括2×qPCR Reaction MIX、质粒Primer&Probe MIX、定量参考品1～6、DNA稀释液、ROXLow、ROX High。
优选的，所述质粒Primer&Probe MIX包括上游引物、下游引物、探针。
优选的，所述的上游引物包括SEQ ID NO.1；下游引物包括SEQ ID NO.2；探针包括SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.3的5’端为FAM基团、SEQ ID NO.3的3’端为BHQ1基团。
优选的，所述质粒Primer&Probe MIX包括10μM浓度的上游引物、10μM浓度的下游引物，10μM浓度的探针。
优选的，所述定量参考品1～6中质粒DNA序列包括SEQ ID NO.4。
本发明中，通过构建质粒特异性的上游引物、下游引物、探针，与慢病毒、腺病毒构建过程中宿主质粒特异性结合，能够灵敏地，准确地检测出残留的质粒DNA。本发明人创造性地发现，本试剂盒中的上游引物、下游引物、探针能特异性结合残留的质粒DNA，提高扩增效率，且更加稳定，从而提高了样本检测结果的可靠性，同时减少其它DNA的影响，能准确定量地检测出残留DNA的量。
优选的，所述定量参考品1中的质粒DNA的浓度包括2～6×106copies(拷贝数)/uL；进一步优选的，为4×106copies/uL。
优选的，所述定量参考品2中的质粒DNA的浓度包括2～6×105copies/uL；进一步优选的，为4×105copies/uL。
优选的，所述定量参考品3中的质粒DNA的浓度包括2～6×104copies/uL；进一步优选的，为4×104copies/uL。
优选的，所述定量参考品4中的质粒DNA的浓度包括2～6×103copies/uL；进一步优选的，为4×103copies/uL。
优选的，所述定量参考品5中的质粒DNA的浓度包括2～6×102copies/uL；进一步优选的，为4×102copies/uL。
优选的，所述定量参考品6中的质粒DNA的浓度包括2～6×101copies/uL；进一步优选的，为4×101copies/uL。
本发明中，通过构建特定的定量参考品，稀释不同浓度，绘制标准曲线，能定量检测残留的DNA量。本发明人创造性地通过慢病毒的四质粒系统，聚焦于四质粒系统共同的DNA碱基序列，设计了定量参考品DNA序列作为定量参考模板，提高了试剂盒的准确度，使试剂盒的测量偏差不超过±5％，回收率在70％-130％之间。
优选的，所述的2×qPCR Reaction MIX购自百奥莱博的2×QuickSYBR PCR Mix，货号为WE0141；
优选的，所述DNA稀释液购自Thermo Fisher的Applied BiosystemsTMDNA稀释缓冲液，货号为4405587C；
优选的，所述ROX Low购自百奥莱博的50×Low ROX，型号为WE0142。
优选的，所述ROX High购自百奥莱博的50×High ROX，货号为WE0143。
优选的，所述质粒Primer&Probe MIX中的上游引物、下游引物、探针，定量参考品1～6中的质粒DNA序列均由金斯瑞生物科技公司合成。
本发明第二方面提供了一种质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：准备试剂、qPCR反应液的制备和加样、qPCR程序参数设置、qPCR结果分析。
优选的，所述质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法的具体步骤为：
S1：准备试剂：将各试剂于冰上融解；
S2：qPCR反应液的制备和加样：将所用试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表1所示的配制质粒qPCR MIX；将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表2所示配制参考品、无模板对照NTC、待测样品；
S3：qPCR程序参数设置：
1)按表3设置反应程序；
2)创建实验反应板；点击Select Fluorophores选择荧光FAM；在反应板图表中，选择样品孔；在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为ZL；输入每个样品的重复次数及Sample Name；
3)在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为ZL；输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一栏赋值为4000000、400000、40000、4000、400、40(单位为copies/uL)；点击Run界面的“Start Run”按钮进行PCR测定。
S4：qPCR结果分析。
优选的，所述S3中的qPCR程序参数设置所用的仪器为BIO-RAD公司的CFX96 qPCR。
表1
| 组分 | 单个反应量 |
| 2×qPCR Reaction MIX | 15μL |
| 质粒Primer&Probe MIX | 5μL |
| 总体积 | 20μL |
表2
表3
有益效果
1、本发明中，通过特异性构建质粒的上游引物、下游引物、探针，与慢病毒、腺病毒构建过程中宿主质粒特异性结合，能够灵敏地，准确地检测出残留的质粒DNA。
2、本发明中，通过构建特定的定量参考品，稀释不同浓度，绘制标准曲线，能定量检测残留的DNA量。
3、本发明中通过2×qPCR Reaction MIX、质粒Primer&Probe MIX、定量参考品1～6、DNA稀释液、ROX Low、ROX High的选择，提高了试剂盒的专属性，生物制品生产中常用的DNA对质粒DNA残留检测试剂盒未见干扰。
4、本发明中，通过配制好的试剂，简化了qPCR配置过程时的操作步骤，减少了操作者的工作量，节约了整个操作时间，且若是用于连续性检测，可使检测结果更具比较性。
5、本发明中的质粒残留DNA检测试剂盒标准曲线的线性范围为4×106copies/μL～4×101copies/μL，R2≥0.980，扩增效率90％≤Eff(％)≤110％，各浓度检测值CV<15％，准确度，精密度高，稳定性高。
附图说明
图1为实施例1中的质粒残留DNA检测试剂盒的检测结果图；左边为6个浓度的扩增图谱；右边为根据扩增图谱绘制的标准曲线图；
图2为生物制品中常用的不同细胞DNA对标准曲线的影响结果；第一行从左至右分别为HEK293 DNA、HELA DNA、CHO DNA；第二行从左至右分别为KQC DNA、KQCH DNA。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种质粒残留DNA检测试剂盒，为2×qPCR ReactionMIX、质粒Primer&Probe MIX、定量参考品1～6、DNA稀释液、ROX Low、ROX High。
所述质粒Primer&Probe MIX为上游引物、下游引物、探针；所述的上游引物为SEQID NO.1；下游引物为SEQ ID NO.2；探针为SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.3的5’端为FAM基团、SEQ ID NO.3的3’端为BHQ1基团。
所述质粒Primer&Probe MIX为10μM浓度的上游引物、10μM浓度的下游引物，10μM浓度的探针。
所述定量参考品1～6中质粒DNA序列为SEQ ID NO.4。
所述定量参考品1中的质粒DNA的浓度为4×106copies/uL。
所述定量参考品2中的质粒DNA的浓度为4×105copies/uL。
所述定量参考品3中的质粒DNA的浓度为4×104copies/uL。
所述定量参考品4中的质粒DNA的浓度为4×103copies/uL。
所述定量参考品5中的质粒DNA的浓度为4×102copies/uL。
所述定量参考品6中的质粒DNA的浓度为4×101copies/uL。
所述的2×qPCR Reaction MIX购自百奥莱博的2×QuickSYBR PCR Mix，货号为WE0141；
所述DNA稀释液购自Thermo Fisher的Applied BiosystemsTMDNA稀释缓冲液，货号为4405587C；
所述ROX Low购自百奥莱博的50×Low ROX，型号为WE0142。
所述ROX High购自百奥莱博的50×High ROX，货号为WE0143。
所述质粒Primer&Probe MIX中的上游引物、下游引物、探针，定量参考品1～6中的质粒DNA序列均由金斯瑞生物科技公司合成，见表4。
所述试剂盒的具体组成成分见表5。
表4
表5
| 组分 | 装量(100反应) |
| 2×qPCR Reaction MIX | 1.6mL×1管 |
| 质粒Primer&Probe MIX | 550uL×1管 |
| 定量参考品1 | 300uL×1管 |
| 定量参考品2 | 300uL×1管 |
| 定量参考品3 | 300uL×1管 |
| 定量参考品4 | 300uL×1管 |
| 定量参考品5 | 300uL×1管 |
| 定量参考品6 | 300uL×1管 |
| DNA稀释液 | 1mL×3管 |
| ROX Low | 50μl×1管 |
| ROX High | 50μl×1管 |
本实施例第二方面提供了一种质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：准备试剂、qPCR反应液的制备和加样、qPCR程序参数设置、qPCR结果分析。
所述质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法的具体步骤为：
S1：准备试剂：将各试剂于冰上融解；
S2：qPCR反应液的制备和加样：将所用试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表1所示的配制质粒qPCR MIX；将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表2所示配制参考品、无模板对照NTC、待测样品；
S3：qPCR程序参数设置：
1)按表3设置反应程序；
2)创建实验反应板；点击Select Fluorophores选择荧光FAM；在反应板图表中，选择样品孔；在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，TargetName命名为ZL；输入每个样品的重复次数及Sample Name；
3)在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为ZL；输入每个稀释梯度的重复次数及SampleName；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一栏赋值为4000000、400000、40000、4000、400、40(单位为copies/uL)；点击Run界面的“Start Run”按钮进行PCR测定。
S4：qPCR结果分析。
所述S3中的qPCR程序参数设置所用的仪器为BIO-RAD公司的CFX96qPCR。
性能测试
1、标准曲线的线性
通过qPCR测定实施例1中试剂盒的线性范围；
结果：试剂盒线性范围为4×106copies/μL～4×101copies/μL，R2≥0.980，扩增效率90％≤Eff(％)≤110％，各浓度检测值CV<15％。结果见表6，图1。
表6
2、准确度--测量偏差
对实施例1中的4×104copies/μL的参考品(质控样品)，重复测定3次，测量偏差不超过±5％。结果见表7。
表7
3、准确度--回收率
测定三个批次的样品回收率和加标回收率；
结果：样品回收率和加标回收率均在70％-130％之间，见表8。
表8
4、阴性参考品符合率
测定NTC值；NTC：无模板的阴性对照是指使用了水代替荧光定量PCR反应中的核酸，其他的试剂按比例正常加入，用于监测反应体系中的污染。
结果：NTC值为大于定量限2-3个CT。
5、重复测定实施例1中浓度为4×101copies/μL参考物质10次后，计算其结果测量偏差及变异系数CV。CV值<20％。结果见表9。
表9
6、精密度
检测线性范围内高、中、低(4×106copies/μL、4×104copies/μL和4×101copies/μL)三个浓度参考物质各10次，高浓度和中浓度CV值<15％，低浓度CV值<20％。结果见10。
表10
7、空白限
用实施例1中的质粒DNA残留检测试剂盒空白限；空白限的检测均值为2.115copies/μL，空白限确定为不大于8.986copies/μL。结果见表11。
表11
8、专属性
考察生物制品生产中常用的DNA对实施例1中质粒DNA残留检测试剂盒的干扰，干扰组应与对照组重合，未见干扰。结果见图2。
9、稳定性验证
9.1冻融稳定性实验
将实施例1中的试剂盒中各组分冻融6次，试剂盒性能不受影响。
9.2长期稳定性
将实施例1中的试剂盒在-20度或以下稳定保存12个月，性能不受影响。
Claims (10)
1.一种质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，包括2×qPCR Reaction MIX、质粒Primer&Probe MIX、定量参考品1～6、DNA稀释液、ROX Low、ROX High。
2.根据权利要求1所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述质粒Primer&Probe MIX包括上游引物、下游引物、探针。
3.根据权利要求2所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述的上游引物包括SEQ ID NO.1；下游引物包括SEQ ID NO.2；探针包括SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.3的5’端为FAM基团、SEQ ID NO.3的3’端为BHQ1基团。
4.根据权利要求2所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述质粒Primer&Probe MIX包括10μM浓度的上游引物、10μM浓度的下游引物，10μM浓度的探针。
5.根据权利要求1所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述定量参考品1～6中质粒DNA序列包括SEQ ID NO.4。
6.根据权利要求5所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述定量参考品1中的质粒DNA的浓度包括2～6×106copies/uL；所述定量参考品2中的质粒DNA的浓度包括2～6×105copies/uL。
7.根据权利要求5所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述定量参考品3中的质粒DNA的浓度包括2～6×104copies/uL；所述定量参考品4中的质粒DNA的浓度包括2～6×103copies/uL。
8.根据权利要求5所述的质粒残留DNA检测试剂盒，其特征在于，所述定量参考品5中的质粒DNA的浓度包括2～6×102copies/uL；所述定量参考品6中的质粒DNA的浓度包括2～6×101copies/uL。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：准备试剂、qPCR反应液的制备和加样、qPCR程序参数设置、qPCR结果分析。
10.根据权利要求9所述的质粒残留DNA检测试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤为：
S1：准备试剂：将各试剂于冰上融解；
S2：qPCR反应液的制备和加样：将所用试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表1所示的配制质粒qPCR MIX；将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表2所示配制参考品、无模板对照NTC、待测样品；
S3：qPCR程序参数设置：
1)按表3设置反应程序；
2)创建实验反应板；点击Select Fluorophores选择荧光FAM；在反应板图表中，选择样品孔；在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为ZL；输入每个样品的重复次数及Sample Name；
3)在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为ZL；输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name；并且分别在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一栏赋值为4000000、400000、40000、4000、400、40，单位为copies/uL；点击Run界面的“Start Run”按钮进行PCR测定；
S4：qPCR结果分析。
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