CN111893212A - 猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 - Google Patents
猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111893212A CN111893212A CN202010570548.5A CN202010570548A CN111893212A CN 111893212 A CN111893212 A CN 111893212A CN 202010570548 A CN202010570548 A CN 202010570548A CN 111893212 A CN111893212 A CN 111893212A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- infectious peritonitis
- feline infectious
- quantitative pcr
- virus
- real
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 208000005098 feline infectious peritonitis Diseases 0.000 description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 2
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明通过建立一种猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR引物组及试剂盒，该发明属于病毒分子生物学检测领域。该方法可快速检测猫传染性腹膜炎病毒。该方法简单快速，对单个样本检测时间为90分钟，其灵敏度可达10拷贝数/ul，针对较大的样本量可做到同时检测，具有良好的灵敏性、重复性、特异性以及稳定性，可实现对猫传染性腹膜炎病毒快速准确检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒检测引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用，特别涉及一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用。本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)主要是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)引起的家猫和野生猫科动物的渐近线、致死性疾病，主要表现为腹膜炎、大量渗出型腹水聚集或各种脏器出现肉芽肿病变的临床特征，危害及其严重，是影响养猫业及其相关产业发展的主要病毒性传染病之一。
目前国内主要通过临床诊断来对猫传染性腹膜炎进行诊断，临床诊断方法主要包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等。但是仅仅通过临床症状进行诊断的方法需要依赖于临床症状的表现以及诊断者的经验，而患猫传染性腹膜炎的猫初期症状不明显，病程进展有较大差异，导致获得的结果容易不准确，往往因误诊而贻误治疗最终导致病猫死亡。现有的常规方法是抽取腹腔液提取后进行检测，这种方法本身的敏感性极低，而同时由于FIPV在腹腔液中含量极少，非常容易导致漏检，从而不能准确检测出FIPV。
因此，急需建立一种诊断猫传染性腹膜炎病毒的高特异性的检测方法。
发明内容
本发明旨在提供一种实时荧光定量PCR检测猫传染性腹膜炎病毒的引物组。
本发明采取的技术方案是：
一种猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR引物组，包括FIPV Fwd：5’-ATTGATGGAGTCTTCTGGGTTGC-3’(SEQ ID No.1)和FIPV Rev：5’-TGAGTTGTTCCTAGATCGGTTCG-3’(SEQ ID No.2)。所述引物是根据GenBank上公布的FIPV的N基因全基因组序列(登录号：DQ010921)的保守区序列所设计的。
本发明的引物组可以用于制备猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对猫传染性腹膜炎病毒进行病毒含量的检测。该试剂盒包括阳性对照标准品、PCR反应液和阴性对照；所述阳性对照标准品为含有猫传染性腹膜炎病毒N基因序列的重组质粒FIPV-N-pET-28a；所述PCR反应液包括提取的模板cDNA，如前所述的引物组，SYBR-Green荧光染料，ddH2O。
用本发明的引物组制备的猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，检测方法简便快捷，重复性好，敏感性高，特异性强，可以对猫传染性腹膜炎病毒进行快速的、高敏感的实时荧光定量PCR检测。
附图说明
图1是荧光定量PCR标准曲线；
图2是荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线；
图3是荧光定量PCR特异性实验图，其中标号1为阳性标准品，2-8分别为阴性对照，猪流行性腹泻病毒，猪圆环病毒2型，猪细小病毒7型，猪传染性胃肠炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒；
图4是连续10个稀释度标准样品的灵敏性实验扩增曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明做进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
1、实时荧光定量PCR引物组的设计
针对猫传染性腹膜炎病毒N基因设计特异性引物序列：
上游引物：5’-ATTGATGGAGTCTTCTGGGTTGC-3’
下游引物：5’-TGAGTTGTTCCTAGATCGGTTCG-3’
上下游引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。
2、毒株
实验中所使用猫传染性腹膜炎病毒样本收集于安徽合肥和上海某宠物医院。
3、病毒核酸的提取
将采取的样本按照天根基因组试剂盒(天根生物技术有限公司)说明书提取病毒基因组。
实施例2
实时荧光定量PCR反应及标准曲线绘制
利用核酸浓度测定仪测定重组质粒FIPV-N-pET-28a的浓度，并计算得重组质粒拷贝数为1.15×109copies/uL，将重组质粒10倍浓度梯度稀释建立标准曲线，横坐标代表质粒拷贝数的对数(X)，纵坐标为Ct值(Y)；在此基础上得到的相应的回归方程为y＝-4.6226x+40.403，回归方程与标准曲线的相关系数R2为0.9953，结果如图1所示。且在扩增过程当中无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，所建立PCR方法的引物特异性好。
实施例3
特异性、灵敏性以及重复性试验
1、特异性实验
采用建立的实时荧光定量PCR方法对猫传染性腹膜炎病毒阳性标准品、猪流行性腹泻病毒，猪圆环病毒2型，猪细小病毒7型，猪传染性胃肠炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸进行扩增，同时设立阴性对照，结果如图2所示，其溶解曲线单一，表明该方法具有良好的特异性。
2、灵敏性实验
将已计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，每个梯度浓度的重组质粒分别作为模板，在最佳反应条件下进行荧光定量PCR扩增，结果见图3。由图3可知，能检测出来最低的拷贝数为1×101copies/uL。
3、重复性实验
以107-103copies/uL 5个浓度的重组治理样品作为模板，以最佳反应条件进行实时荧光定量PCR的重复性实验，结果见表1。由表1可知，在重复性实验中变异系数均小于5％，表明建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的重复性。
表1荧光定量PCR重复性实验
| 重组质粒拷贝数 | Ct值 | 变异系数CV(％) |
| 1×107 | 8.62±0.41 | 4.76 |
| 1×106 | 12.32±0.36 | 2.92 |
| 1×105 | 16.66±0.29 | 1.74 |
| 1×104 | 21.92±0.44 | 2.01 |
| 1×103 | 26.93±0.24 | 0.89 |
荧光定量PCR是在PCR反应过程中连续监测荧光型号的强弱来实时测定特异性产物的量，并据此推断监测病料的初始含毒量，不仅具有常规PCR技术的扩增高效率的特点，还具有高度特异性、光谱技术的高敏感性和精确性等特点，同时避免了后续电泳等步骤，减少了污染和人为操作带来的误差。并且在该实验过程中，证明了该方法具有高度的灵敏性和特异性，同时还要良好的重复性。同时可以根据标准曲线来进行准确的定量，即检测样品中所含有的初始病毒量。
Claims (5)
1.一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的SYBR-Green I荧光定量PCR引物组，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物和下游引物的核苷酸序列所示在可读序列表中。
2.权利要求1所述的荧光定量PCR引物组在制备检测猫传染性腹膜炎病毒试剂中的用途。
3.一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的引物组以及SYBR-Green荧光染料反应液。
4.标准曲线的制作
利用一系列不同浓度梯度的阳性标准器作为模板，并以标准品拷贝数的对数作为X轴，Ct值作为Y轴绘制标准曲线。
5.样本中病毒含量的计算
根据建立的标准曲线分别计算样本中的病毒拷贝数。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010570548.5A CN111893212A (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010570548.5A CN111893212A (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111893212A true CN111893212A (zh) | 2020-11-06 |
Family
ID=73206385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010570548.5A Pending CN111893212A (zh) | 2020-06-17 | 2020-06-17 | 猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111893212A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113736923A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-03 | 安徽农业大学 | 一种用于猫Chapparvovirus实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒 |
| CN114592092A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-06-07 | 昆明海关技术中心 | 猫传染性腹膜炎病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒 |
| CN115852043A (zh) * | 2022-07-19 | 2023-03-28 | 安徽农业大学 | 一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004004760A1 (ja) * | 2002-07-04 | 2004-01-15 | The Kitasato Institute | ネコ伝染性腹膜炎ワクチン |
| AU2005202233A1 (en) * | 1999-06-10 | 2005-06-16 | Merial | DNA vaccines for pets and sport animals |
| CN1802440A (zh) * | 2003-07-14 | 2006-07-12 | 北京博奥生物芯片有限责任公司 | 用于检测sars病毒和其它感染性物质的方法和组合物 |
| CN107586884A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-01-16 | 东北农业大学 | 一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt‑pcr引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用 |
| CN109641043A (zh) * | 2016-06-16 | 2019-04-16 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 针对感染性支气管炎病毒的疫苗 |
-
2020
- 2020-06-17 CN CN202010570548.5A patent/CN111893212A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2005202233A1 (en) * | 1999-06-10 | 2005-06-16 | Merial | DNA vaccines for pets and sport animals |
| WO2004004760A1 (ja) * | 2002-07-04 | 2004-01-15 | The Kitasato Institute | ネコ伝染性腹膜炎ワクチン |
| CN1802440A (zh) * | 2003-07-14 | 2006-07-12 | 北京博奥生物芯片有限责任公司 | 用于检测sars病毒和其它感染性物质的方法和组合物 |
| CN109641043A (zh) * | 2016-06-16 | 2019-04-16 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 针对感染性支气管炎病毒的疫苗 |
| CN107586884A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-01-16 | 东北农业大学 | 一种用于猫传染性腹膜炎病毒检测的rt‑pcr引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YUANHONG WANG等: "Development and evaluation of a SYBR Green I RTqPCR assay for Feline Infection Peritonitis virus detection", RESEARCH SQUARE, 28 January 2020 (2020-01-28), pages 1 - 13 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113736923A (zh) * | 2021-10-15 | 2021-12-03 | 安徽农业大学 | 一种用于猫Chapparvovirus实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒 |
| CN114592092A (zh) * | 2022-03-23 | 2022-06-07 | 昆明海关技术中心 | 猫传染性腹膜炎病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒 |
| CN115852043A (zh) * | 2022-07-19 | 2023-03-28 | 安徽农业大学 | 一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用 |
| CN115852043B (zh) * | 2022-07-19 | 2023-07-21 | 安徽农业大学 | 一种检测四种猫腹泻相关病毒的多重荧光pcr引物探针组、试剂盒及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111893212A (zh) | 猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量pcr引物组及试剂盒 | |
| CN111500776A (zh) | 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法 | |
| CN110760620A (zh) | 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法 | |
| CN108866243B (zh) | 一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN111621602B (zh) | 猪圆环病毒3型快速检测荧光定量pcr试剂盒及其应用 | |
| CN112094944A (zh) | 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 | |
| CN114015815B (zh) | 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法 | |
| CN114634996A (zh) | 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN113913559A (zh) | 一种荧光定量检测prrsv的试剂、其应用于prrsv分型的检测方法 | |
| CN109234464A (zh) | 用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 | |
| CN112126716A (zh) | 一种坦布苏病毒的qRT-PCR检测用引物对及其应用 | |
| CN116814859A (zh) | 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN114480725A (zh) | 犬圆环病毒实时荧光定量pcr引物组、探针及试剂盒 | |
| CN109234465A (zh) | 用于检测a型猪轮状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 | |
| CN116064942A (zh) | Ndrv和mdrv的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法 | |
| CN116064957A (zh) | 一种用于检测引起牛腹泻病病毒性病原的多重实时荧光pcr检测试剂盒及其应用 | |
| CN108842001A (zh) | 用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 | |
| CN107974516A (zh) | 用于检测猪圆环病毒2型的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 | |
| CN108315480B (zh) | 一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量pcr引物、探针和试剂盒 | |
| CN116200546B (zh) | PRCV、PRRSV、SIV和PRV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 | |
| CN117210615B (zh) | 猪曼那角病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法与应用 | |
| CN109234463A (zh) | 用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 | |
| CN110607404B (zh) | 猪肠病毒g型的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 | |
| CN110684862A (zh) | 用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN114107569B (zh) | 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |