CN109641043A - 针对感染性支气管炎病毒的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其分别涉及IBV(感染性支气管炎病毒)和包含IBV的免疫原性组合物，其中ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b被失活。此外，本发明涉及用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用本发明的免疫原性组合物。此外，本发明涉及治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的免疫原性组合物。

Description

针对感染性支气管炎病毒的疫苗
序列表
本申请根据37 C.F.R.1.821–1.825含有序列表。伴随本申请的序列表以其整体通过引用并入本文。
背景技术
禽冠状病毒感染性支气管炎病毒(IBV)是网巢病毒目、冠状病毒科的原型γ冠状病毒。感染性支气管炎病毒主要感染鸡的上呼吸道上皮，引起呼吸系统疾病，通常并发继发性细菌病原体(Cook等人2012.Avian Pathol.41:239-250)。一些IBV毒株额外影响肾小管、输卵管和胃肠道的部分，导致这些器官系统中的病理损伤和临床症状。该病毒在商业和后院鸡中都具有全球存在。由于其高基因组变异性，IBV在各种各样的基因型、血清型和保护型方面区分。IBV目前被认为是家禽业中经济上最相关的病毒病原体之一。
感染性支气管炎病毒是一种包膜病毒，其具有27.6kb的正义单链RNA基因组(Cavanagh 2007.Vet.Res.38:281-297)。病毒基因组的前三分之二包含大编码区(也称为基因1)，分为两个开放阅读框1a和1b，其编码参与RNA复制、编辑和转录的15种非结构蛋白。病毒基因组的最后三分之一编码结构蛋白：刺突蛋白(S，由基因2编码)，包膜蛋白(E，由基因3c编码)，膜蛋白(M，由基因4编码)，和核衣壳蛋白(N，由基因6编码)。蛋白S、E和M是病毒包膜的一部分，而蛋白N与病毒RNA一起形成核糖核蛋白核心。刺突蛋白是二聚体或三聚体跨膜蛋白，其被蛋白水解切割成两个亚基，S1和S2。高度糖基化的S1结构域形成刺突蛋白的‘头部’，并含有与宿主细胞表面上的2,3-连接的唾液酸相互作用的受体结合结构域(Promkuntod等人2014.Virology.448:26-32)。S2结构域含有胞外域的剩余部分('茎')、跨膜结构域和位于细胞质的胞内域。冠状病毒刺突蛋白主要决定宿主物种向性(Kuo等人2000.J.Virol.74:1393-1406)。
散布在冠状病毒结构基因之间的是可变数目的群特异性辅助基因(Liu等人2014.Antiviral Res.109:97-109)。这些基因中的大多数是非结构性的，并且它们的表达对于含胚鸡蛋或细胞培养中的病毒复制不是必需的。IBV基因组含有辅助基因3和5，分别编码蛋白3a和3b以及5a和5b(Britton等人2006；Adv Exp Med Biol.；581:363-8)。此外，存在位于基因4和5之间的基因间区域(IR)中的开放阅读框(Bentley等人2013；J.Virol.87:2128-2136)。
基因3在功能上是三顺反子的，编码三种蛋白，3a、3b和3c。后者是IBV的结构E蛋白。基因5在功能上是双顺反子的并且编码两种蛋白，5a和5b(Britton等人2006；Adv ExpMed Biol.；581:363-8)。最近发现辅助IBV蛋白3a和3b在体外诱导I型干扰素反应的延迟活化，其中蛋白3a额外参与IBV对IFN诱导诱导的细胞抗病毒状态的抗性(Kint等人2015:J.Virol.89:1156-1167；Kint等人2015:J.Virol.doi:JVI.01057-15.)。辅助蛋白5b有助于宿主关闭，由此尤其抑制I型IFN的翻译(Kint,PhD论文2015)。
Britton等人2006(Adv Exp Med Biol.；581:363-8)已经缺失了IBV 3a、3b、5a和5b蛋白的表达，并且已经显示基因产物无一对于复制本身是必需的，并且它们可以被认为是辅助蛋白。进一步，Bentley等人2013(PLOS One.8(6):e67875)公开了用hRluc替代ORF3a和3b以及用hRluc的IBV密码子优化的版本替代基因5。然而，尚未显示或暗示基因3a和3b或基因5的替代将导致任何与野生型IBV不同的表型(诸如减毒)。相反，Bently等人关注是否可以将标记基因引入IBV基因组中。在这方面，Bentley等人公开了重组IBV稳定性根据所替代的基因组区域而变化。
迄今为止最广泛使用的减毒活IBV疫苗毒株是在1960年代在荷兰通过连续传代Massachusetts样IBV毒株开发的(Bijlenga et al 2004；Avian Pathol.33:550-557)。在传代期间，病毒变得适应于含胚卵，其中观察胚胎矮化，直至第30代，并且在较高传代时胚胎死亡。在51次传代后，病毒在48hpi内引起胚胎死亡，但第52次传代(称为H52)对雏鸡来说仍然过于毒性。在另外68次传代后，病毒(称为HI 20)被充分减毒以安全地用于幼鸡中，同时仍然诱导保护性免疫反应。然而，1970年代新的IBV血清型的出现(传统的Massachusetts样疫苗对其没有得到足够保护)促进新的活减毒疫苗的开发，并对可能针对多种血清型诱导保护性免疫力的其他疫苗类型进行研究(Cook等人2012.Avian Pathol.41:239-250)。如今，最广泛使用的IBV疫苗仍然通过在含胚卵中连续传代而减毒，这是费力且耗时的。此外，这种类型的减毒是随机的，并且结果是相当不可预测的。
因此，开发IBV疫苗需要除了连续传代以外的其他方法。一些研究组已经独立地开发系统以通过重组技术操纵IBV基因组(Youn,等人2005.Virology.332:206-215；Zhou等人2013.Vet.Microbiol.162:53-61)。然而，所有这些反向遗传学系统都基于非致病性细胞培养适应的IBV毒株Beaudette，或高度减毒的IBV疫苗毒株HI20。由于这些IBV毒株是非毒性的(Bijlenga等人2004.Avian Pathol.33:550-557)，保护性免疫可能只能通过引入来自致病性IBV毒株的毒力因子来诱导。该方法可能引起安全问题，并且尚未导致重组IBV疫苗的登记。
因此，分别需要新且高效的IBV疫苗和用于减毒IBV的替代策略。
发明详述
在描述本发明的方面之前，必须注意，如本文中且如在随附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数个指示物。因此，例如，提及“抗原”包括复数个抗原，提及“病毒”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种病毒及其等效物，等等。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管任何类似或等效于本文所述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的方法、装置和材料。出于描述和公开如结合本发明使用的出版物中所报告的细胞系、载体和方法的目的，本文所提及的所有出版物通过引用并入本文。本文中没有什么内容应解释为承认本发明没有资格早于根据先前发明的此类公开内容。
内容的组成
本发明解决了现有技术中固有的问题且提供了现有技术的显著进步。
通常，本发明提供了IBV(感染性支气管炎病毒)，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
因此，本发明还提供了IBV(感染性支气管炎病毒)，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
因此，本发明提供了IBV(感染性支气管炎病毒)，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。
因此，本发明提供了IBV(感染性支气管炎病毒)，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。
因此，本发明提供了IBV(感染性支气管炎病毒)，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
进一步，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
因此，本发明还提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF3a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF3b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF5a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 5a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a和ORF 3b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 5a和ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 5a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a或ORF 5a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a或ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3b和ORF 5a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3b或ORF 5a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3b和ORF 5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3b或ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b和ORF 5a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a或ORF 3b或ORF 5a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b和ORF 5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a或ORF 3b或ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b和ORF 3a被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 5a或ORF 5b或ORF 3a被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b和ORF 3b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 5a或ORF 5b或ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
因此，本发明提供了包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。如实施例中所示，已经证明包含IBV(感染性支气管炎病毒)(其中ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活)的免疫原性组合物是安全和有效的。
现有技术IBV疫苗具有几个缺点。灭活疫苗通常仅产生体液免疫反应(但有限的细胞免疫反应)，并且当使用灭活IBV疫苗时，加强免疫接种通常是必要的。由于该原因，通常修饰的活IBV疫苗(诱导体液和细胞免疫反应)将是优选的选择。然而，迄今为止开发的修饰的活IBV疫苗具有不同的缺点。Beaudette IBV毒株(非致病性细胞培养物适应的IBV毒株)是过于减毒的。其他毒株诸如H52可能没有充分减毒，导致疫苗接种后呼吸道受损。进一步，最广泛使用的修饰的活IBV疫苗通过在含胚卵中连续传代而减毒，这是费力且耗时的。此外，这种类型的减毒是随机的，并且结果是相当不可预测的。在鸡中传代的同时存在恢复毒力的风险。因此，需要安全且有效的新的重组修饰的活IBV疫苗。
进一步，不预期双突变体(ORF 3a和ORF 3b的失活；ORF 5a和ORF 5b的失活)仍然没有过度减毒，因为如果引入许多缺失/失活，病毒会变得过度减毒，其导致在接种疫苗的宿主中诱导保护性免疫反应的能力不足。也被称为“过度减毒”的这种现象已在Rennick等人2015的示例性文献(J Virol.2015Feb；89(4):2192-200)中描述，其中一种麻疹病毒突变体诱导低免疫反应。Chen等人2016(Arch Virol.2016,161:77-86)给出了另一个实例，其中猪繁殖和呼吸综合征病毒在细胞培养中太频繁传代，其已导致过度减毒，如猪中的免疫力过低所示。Manservigi等人2010(Open Virol J.2010；4:123–156)提出如下担忧：单纯疱疹病毒1的基因组中的许多缺失可能导致过度减毒，其否定其价值。因此，令人惊讶的是，与单突变体(ORF 3a的失活；ORF 3b的失活；ORF 5a的失活；ORF 5b的失活)相比，双突变体(ORF3a和ORF 3b的失活；ORF 5a和ORF 5b的失活)仍然能够诱导保护性免疫反应。甚至更令人惊讶的是，在所有四个ORF中具有失活的缺失突变体(ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b的失活)未显示过度减毒的表型。
术语“免疫原性组合物”是指包含至少一种在向其施用免疫原性组合物的宿主中诱导免疫反应的抗原的组合物。这种免疫反应可以是对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫反应。优选地，免疫原性组合物诱导免疫反应且更优选地赋予针对IBV感染的一种或多种临床体征的保护免疫力。宿主还被描述为“受试者”。优选地，本文所描述或提及的任何宿主或受试者是禽类或家禽。
通常，“免疫反应”包括但不限于以下效果中的一种或多种：产生或活化特异性地针对本发明的免疫原性组合物中所包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主显示保护免疫反应或治疗反应。
“保护免疫反应”或“保护免疫力”将显示为减少或缺乏通常由受感染宿主展现的临床体征、较快恢复时间和/或较低感染性持续时间或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的较低病原体滴度。
在宿主展现保护免疫反应、使得对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重程度会减小的情况下，则将免疫原性组合物描述为“疫苗”。
术语“IBV”是指感染性支气管炎病毒，其为本领域技术人员所众所周知。术语“IBV”涵盖感染性支气管炎病毒的所有毒株、基因型、保护型和血清型。
术语“ORF 3a”和“ORF 3b”是指由IBV的基因3编码的开放阅读框(ORF)3a和3b。IBV的基因3在功能上是三顺反子的并编码三种蛋白3a、3b和3c。蛋白3c也被称为E蛋白。ORF 3a具有从起始密码子(AUG)至终止密码子(UAA)的174个核苷酸的长度，如SEQ ID NO:29中所示。然而，ORF 3a的AUG的第一个核苷酸(A)是ORF S(刺突)的终止密码子(A)的最后一个核苷酸，且因此，ORF 3a在一个核苷酸中与ORF S重叠。进一步，ORF 3a的终止密码子的最后一个核苷酸(A)是ORF 3b的AUG的第一个核苷酸(A)，且因此，ORF 3a在一个核苷酸中与ORF 3b重叠。ORF 3b具有从起始密码子(AUG)至终止密码子(UAA)的195个核苷酸的长度，如SEQ IDNO:30中所示。然而，ORF 3b在20个核苷酸中与ORF 3c重叠。
术语“ORF 5a”和“ORF 5b”是指由IBV的基因5编码的开放阅读框(ORF)5a和5b。基因5在功能上是双顺反子的，且编码两种蛋白5a和5b。ORF 5a具有从起始密码子(AUG)至终止密码子(UGA)的198个核苷酸的长度，如SEQ ID NO:31中所示。然而，ORF 5a在4个核苷酸中与ORF 5b重叠。ORF 5b具有从起始密码子(AUG)至终止密码子(UGA)的249个核苷酸的长度，如SEQ ID NO:32中所示。然而，ORF 5b在58个核苷酸中与ORF N重叠。
术语“失活”是指ORF 3a、ORF 3b、ORF 5a和ORF 5b内的突变。术语突变包括编码所述蛋白的病毒RNA中的修饰，导致所述编码蛋白的改变。术语突变涉及但不限于取代(一个或几个核苷酸/碱基对的替代)、缺失(一个、几个或所有核苷酸/碱基对的去除)和/或插入(一个或几个核苷酸/碱基对的添加)。因此，术语突变包括突变，包括但不限于点突变(单核苷酸突变)或更大的突变，其中例如编码(和/或非编码)核苷酸/碱基对的部分被缺失(部分缺失)或所有编码(和/或非编码)核苷酸/碱基对被缺失(完全缺失)、取代和/或额外编码(和/或非编码)核苷酸/碱基对被插入。应当理解，术语突变包括编码核苷酸/碱基对内的突变，非编码核苷酸/碱基对内的突变，诸如调节核苷酸/碱基对内的突变和编码核苷酸/碱基对和非编码核苷酸/碱基对内的突变。进一步，术语突变还包括核苷酸/碱基对(编码和/或非编码)的倒置，诸如部分或全部编码核苷酸/碱基对的倒置或部分或全部非编码核苷酸/碱基对的倒置，或其组合。此外，术语突变还包括核苷酸/碱基对(编码和/或非编码)的重新定位，诸如部分或全部编码核苷酸/碱基对的重新定位或部分或全部非编码核苷酸/碱基对的重新定位，或其组合。如本文所用，突变可以是单个突变或几个突变，因此，通常使用术语“突变”并且涉及单个突变和几个突变。由于编码序列中的改变，所述突变可以导致修饰的表达蛋白。然而，术语突变是本领域技术人员众所周知的，并且本领域技术人员可以没有再费周折地生成突变。
优选地，ORF 3b或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或不影响E蛋白(由ORF 3c编码)的活性。因此，ORF 3b或ORF 3a和ORF 3b表达(3b RNA或3a和3b RNA和/或3b蛋白或3a蛋白和3b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF 3c的表达和/或E蛋白的活性不受影响。因此，应当理解，涵盖ORF 3c的起始密码子(AUG)和ORF 3b的终止密码子(UAA)的重叠区域内的缺失、截短、取代、插入、倒置或重新定位，只要ORF 3c的表达和/或E蛋白的活性不受影响。
在本发明的一个方面，所述ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或不影响E蛋白的活性。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中所述ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或其不影响E蛋白的活性。
优选地，ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性，如基于IBV的S蛋白的保护性免疫反应所示。因此，ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b表达(3a RNA或3a和3b RNA和/或3a蛋白或3a蛋白和3b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF S的表达和/或S蛋白的活性不受影响。优选地，ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活使刺突(S)蛋白的终止密码子(UAA)保持完整，其与ORF 3a的起始密码子(AUG)重叠。这可以通过不使ORF 3a的起始密码子的AUG的A失活或通过以ORF S的最后两个核苷酸(UA)3’的第一个核苷酸是A或G以具有终止密码子(UAA或UAG)的方式使ORF3a和ORF3b失活来进行。或者，可以通过缺失、截短、取代、插入、倒置或重新定位以读取UAA、UAG或UGA(终止密码子)来生成ORF S中的新终止密码子。因此，应当理解，涵盖ORF 3a的起始密码子(AUG)和ORF S的终止密码子(UAA)的重叠区域内的缺失、截短、取代、插入、倒置或重新定位，只要ORF S的表达和/或活性不受影响。
在本发明的一个方面，所述ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF S的表达和/或不影响S蛋白的活性。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中所述ORF 3a或ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性。
优选地，ORF 5b或ORF 5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白(由ORF N编码)的活性。因此，ORF 5b或ORF 5a和ORF 5b表达(5b RNA或5a和5b RNA和/或5b蛋白或5a蛋白和5b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF N的表达和/或N蛋白的活性不受影响。优选地，ORF 5b或ORF 5a和ORF 5b的失活使N蛋白的起始密码子(AUG)保持完整，且因此也使ORF N保持完整。然而，应当理解，涵盖ORF N的起始密码子(AUG)和ORF 5b的终止密码子(UAG)的重叠区域内的缺失、截短、取代、插入、倒置或重新定位，只要ORF N的表达和/或N蛋白的活性不受影响。
在本发明的一个方面，所述ORF 5b或ORF 5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中所述ORF 5b或ORF 5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或其不影响N蛋白的活性。
在本发明的一个方面，所述失活是ORF 3a的完全或部分缺失和ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分缺失和ORF 5b的部分缺失，ORF 3a的完全或部分截短和ORF 3b的部分截短和/或ORF 5a的完全或部分截短和ORF 5b的部分截短，ORF 3a的完全或部分倒置和ORF 3b的部分倒置和/或ORF 5a的完全或部分倒置和ORF 5b的部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位和ORF 3b的部分重新定位和/或ORF 5a的完全或部分重新定位和ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的插入，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的取代。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中所述失活是ORF 3a的完全或部分缺失和ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分缺失和ORF 5b的部分缺失，ORF 3a的完全或部分截短和ORF 3b的部分截短和/或ORF 5a的完全或部分截短和ORF 5b的部分截短，ORF 3a的完全或部分倒置和ORF 3b的部分倒置和/或ORF 5a的完全或部分倒置和ORF 5b的部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位和ORF 3b的部分重新定位和/或ORF 5a的完全或部分重新定位和ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的插入，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的取代。
术语“失活”是指蛋白(和/或RNA)的表达降低或消除和/或蛋白的活性降低。
术语“失活”涵盖ORF 3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF 5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的表达降低(或消除)。应当理解，表达降低涵盖RNA转录降低以及蛋白表达降低两者。优选地，当与野生型IBV病毒的表达相比时，ORF 3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF 5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的表达在本发明的IBV中通过RNA和/或蛋白降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％或更多。更优选地，当与野生型IBV病毒的表达相比时，ORF3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF 5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的表达在本发明的IBV中通过RNA和/或蛋白降低50-100％、60-100％、70-100％、80-100％或90-100％。甚至更优选地，当与野生型IBV病毒的表达相比时，ORF 3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的表达在本发明的IBV中通过RNA和/或蛋白降低80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
优选地，当与野生型IBV病毒的表达相比时，ORF 3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF 5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的表达在本发明的IBV中通过RNA和/或蛋白降低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍、约1至约10倍、或约1至约5倍、或约40至约80倍、或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
术语“RNA”指任何核糖核酸。该术语涵盖单链和双链RNA。本发明的RNA涵盖分离的RNA(即从其天然背景分离)和遗传修饰形式。此外，还包括化学修饰的RNA，包括天然存在的修饰的RNA，诸如甲基化的RNA或人工修饰的RNA，诸如生物素化的RNA。术语“RNA”还特别包括由除了四种生物学存在的核苷酸/碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基构成的RNA。本发明的RNA的特征在于其应当编码如上所提及的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)。
术语“核酸”或“核酸序列”是指包括DNA分子、RNA分子、cDNA分子或衍生物的多核苷酸。该术语涵盖单链以及双链多核苷酸。本发明的核酸涵盖分离的多核苷酸(即，从其天然背景分离)和基因修饰形式。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，包括天然修饰的多核苷酸(例如糖基化或甲基化多核苷酸)或人工修饰的多核苷酸(诸如生物素化多核苷酸)。此外，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”还具体地包括由除了5种生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外的碱基构成的核酸。
术语“蛋白”、“氨基酸”和“多肽”可互换使用。术语“蛋白”是指由天然氨基酸以及其衍生物构成的氨基酸序列。天然氨基酸是本领域众所周知的且描述于生物化学的标准教科书中。在氨基酸序列内，氨基酸由肽键连接。此外，氨基酸序列的两端被称为羧基末端(C-末端)及氨基末端(N-末端)。术语“蛋白”涵盖基本上纯化的蛋白或额外包含其他蛋白的蛋白制备物。进一步，该术语还涉及蛋白片段。此外，其包括化学修饰的蛋白。此类修饰可以是人工修饰或天然存在的修饰，诸如磷酸化、糖基化、肉豆蔻酰化等。
用于测量ORF 3a和/或ORF 3b(3a和/或3b RNA和/或3a蛋白和/或3b蛋白)和/或ORF 5a和/或ORF 5b(5a和/或5b RNA和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的降低表达的方法是本领域技术人员众所周知的。此类方法包括但不限于RT-PCR、实时RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、放射免疫测定、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、原位杂交。
然而，术语“失活”还涵盖蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性降低(或消除)。优选地，当与野生型IBV病毒的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性相比时，本发明的IBV的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-99％。更优选地，当与野生型IBV病毒的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或50b蛋白)的活性相比时，本发明的IBV的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性降低50-100％、60-100％、70-100％、80-100％或90-100％。甚至更优选地，当与野生型IBV病毒的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性相比时，本发明的IBV的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性降低80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
优选地，当与野生型IBV病毒的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性相比时，本发明的IBV的蛋白(3a蛋白和/或3b蛋白和/或5a蛋白和/或5b蛋白)的活性降低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约80倍、约1至约10倍、或约1至约5倍、或约40至约80倍、或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
最近发现辅助IBV蛋白3a和3b在体外引起I型干扰素反应的延迟活化，其中蛋白3a额外参与IBV对IFN诱导的细胞抗病毒状态的抗性(Kint等人2015:J.Virol.89:1156-1167；Kint等人2015:J.Virol.doi:JVI.01057-15.)。辅助蛋白5b有助于宿主细胞关闭，因此尤其抑制I型IFN的翻译(Kint,PhD thesis 2015)。
术语“失活”涵盖具有降低或抑制的细胞干扰素免疫反应的重组IBV(不能完全干扰细胞干扰素免疫反应的IBV)。优选地，重组IBV具有降低或抑制的对干扰素表达和/或活性的干扰。优选地，降低或抑制一种或两种类型的干扰素(IFN)的表达和/或活性。在本发明的一个方面，重组IBV引起对IFN-α的表达和/或活性的影响。在另一个方面，IFN-β的表达和/或活性受影响。在另一个方面，IFN-γ的表达和/或活性受影响。优选地，当与IFN-有活性(competent)系统(例如，在相同条件下的野生型细胞或动物)中的对照(例如PBS或没有干扰素拮抗剂活性的蛋白)相比时，具有干扰素拮抗剂活性的蛋白、多肽等使IFN-α和/或IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更多。更优选地，当与在相同条件下的IFN-有活性系统中的对照(例如，PBS或没有干扰素拮抗剂活性的蛋白)相比时，具有干扰素拮抗剂活性的蛋白、多肽等使IFN-α和/或IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性降低约1至约100倍、约5至约80倍、约20至约约80倍、约1至约10倍或约1至约5倍或约40至约80倍或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。用于测量降低或抑制的干扰素表达和/或活性的方法是本领域技术人员众所周知的。
在本发明的一个方面，ORF 3a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b被部分缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
其中ORF 3a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b被部分缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b和ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b和ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
术语“完全或部分缺失、取代或倒置”涵盖完全或部分缺失、完全或部分取代以及完全或部分倒置。术语“完全”意味着从ORF的起始密码子至终止密码子的整个ORF受影响。优选地，ORF 3a和/或ORF 5a被完全缺失、取代或倒置。然而，术语“部分”意味着仅整个ORF的一部分受影响。优选地，ORF 3a、ORF 3b、ORF 5a、ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。更优选地，ORF 3b和/或ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。最优选地，ORF 3b和/或ORF 5b被部分缺失，不影响ORF 3c(编码E蛋白)和ORF N(编码N蛋白)的表达和/或E蛋白和N蛋白的活性。
在本发明的一个方面，ORF 3a被完全或部分缺失，且ORF 3b被部分缺失。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a被完全或部分缺失，且ORF 3b被部分缺失。
在本发明的一个方面，ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 5b被部分缺失。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 5b被部分缺失。
在本发明的一个方面，ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 3b和ORF 5b被部分缺失。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 3b和ORF 5b被部分缺失。
在本发明的一个方面，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的起始密码子被失活。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被活化，
其中ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的起始密码子被失活。
在本发明的一个方面，ORF 3a的起始密码子和ORF 3b的起始密码子被失活。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a的起始密码子和ORF 3b的起始密码子被失活。
在本发明的一个方面，ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。因此，必须理解AUG的失活涵盖AUG内1、2或3个核苷酸的失活/突变。因此，起始密码子AUG的失活涵盖A的突变和/或U的突变和/或G的突变。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。
在本发明的一个方面，所述ORF 3a和ORF 3b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)通过缺失、取代或倒置而失活。
在本发明的一个方面，ORF 5a的起始密码子和ORF 5b的起始密码子被失活。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a的起始密码子和ORF 5b的起始密码子被失活。
在本发明的一个方面，ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。因此，必须理解AUG的失活涵盖AUG内1、2或3个核苷酸的失活/突变。因此，起始密码子AUG的失活涵盖A的突变和/或U的突变和/或G的突变。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。
在本发明的一个方面，所述ORF 5a和ORF 5b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，Seq ID NO:2的核苷酸195-197)通过缺失、取代或倒置而失活。
在本发明的一个方面，ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。
术语“从起始密码子的5’-末端截短”是指ORF在5’-末端截短。术语“5’-末端”已经在别处描述。术语“截短的或截短”是指ORF内的一个或多个核苷酸/碱基的缺失。因此，保留ORF的3’-末端的部分，而缺失ORF的5’-末端区域的部分。然而，5’-末端的截短可以导致相应蛋白内的一个或多个氨基酸的缺失，或ORF中的移框，其导致不同于野生型蛋白的编码区域。然而，由于起始密码子被截短，5’-末端的截短可以导致完全不表达蛋白。
如本文所用的术语“起始密码子的5’-末端”应当被理解为所述截短影响(包括)ORF的起始密码子。起始密码子(AUG)的5’-末端是A，其中AUG的3’末端是G。然而，术语“5’-”和“3-”是本领域技术人员所众所周知的。
在本发明的一个方面，ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。
如本文所用的术语“从起始密码子的A、U或G截短”应当理解为所述截短可以以A或U或G开始。在截短以A开始的情况下，A被截短。然而，如果来自A的截短包含两个或更多个核苷酸的缺失，则U同样被缺失。进一步，如果来自A的截短包含三个或更多个核苷酸的缺失，则A、U和G被缺失。然而，应当理解，如果截短以U开始，则U被缺失，而AUG的A仍然存在。此外，如果截短以G开始，则G被缺失，而AUG的A和U仍然存在。
在本发明的一个方面，ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
在本发明的一个方面，ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。
在本发明的一个方面，ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG)(AUG，SEQ IDNO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短，且其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG)(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短，且其中ORF5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ IDNO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ IDNO:2的核苷酸195-197)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，Seq ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
术语“从ORF 3a的起始密码子的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置”是指ORF 3a从5’-末端起的核苷酸的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A；SEQID NO:1的核苷酸1-3)是编号1。因此，所述术语涵盖从5’-末端起核苷酸1至173、1至172、1至171、1至170、1至169等等直至1至5、1至4、1至3、1至2和1至1的缺失、取代或倒置。因此，应当理解术语“从ORF 3a的起始密码子的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置”涵盖173种变体，其中在所有173种变体中，5’-末端核苷酸(AUG的A定义为编号1)被缺失、取代或倒置。
术语“从ORF 3b的起始密码子的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置”是指ORF 3b从5’-末端起的核苷酸的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A；SEQID NO:1的核苷酸174-176)是编号1。因此，所述术语涵盖从5’-末端起核苷酸1至175、1至174、1至173、1至172、1至170等等直至1至5、1至4、1至3、1至2和1至1的缺失、取代或倒置。因此，应当理解术语“从ORF 3b的起始密码子的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置”涵盖175种变体，其中在所有175种变体中，5’-末端核苷酸(AUG的A定义为编号1)被缺失、取代或倒置。
优选地，本发明的IBV包含从ORF 3a的5’-末端起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170、核苷酸1-173的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A；SEQ IDNO:1的核苷酸1)是编号1，且优选地，本发明的IBV包含从ORF 3b的5’-末端起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170、核苷酸1-175的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A；SEQ ID NO:1的核苷酸174)是编号1。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ IDNO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
术语“1至171个核苷酸”、“1至172个核苷酸”、“1至173个核苷酸”、“1至174个核苷酸”和“1至175个核苷酸”必须根据如上所述的其他定义理解。因此，所述术语涵盖171种变体、172种变体、173种变体、174种变体或175种变体。术语“从起始密码子的A起”、“从起始密码子的U起”或“从起始密码子的G起”定义缺失、取代或倒置的起始点。术语“从起始密码子的A起”示例性定义所述缺失、取代或倒置从起始密码子(AUG)的A开始并影响A。
优选地，本发明的IBV包含从ORF 3a和ORF 3b的起始密码子(AUG)的A、U或G起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170的缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SeqID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
术语“从ORF 5a的起始密码子的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置”是指ORF 5a从5’-末端起的核苷酸的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A；SEQID NO:1的核苷酸1-3)是编号1。因此，所述术语涵盖从5’-末端起核苷酸1至194、1至193、1至192、1至191、1至190等等直至1至5、1至4、1至3、1至2和1至1的缺失、取代或倒置。因此，应当理解术语“从ORF 5a的起始密码子的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置”涵盖194种变体，其中在所有194种变体中，5’-末端核苷酸(AUG的A定义为编号1)被缺失、取代或倒置。
术语“从ORF 5b的起始密码子的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置”是指ORF 5b从5’-末端起的核苷酸的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A，SEQID NO:2的核苷酸195-197)是编号1。因此，所述术语涵盖从5’-末端起核苷酸1至191、1至190、1至189、1至188、1至187等等直至1至5、1至4、1至3、1至2和1至1的缺失、取代或倒置。因此，应当理解术语“从ORF 5b的起始密码子的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置”涵盖191种变体，其中在所有191种变体中，5’-末端核苷酸(AUG的A定义为编号1)被缺失、取代或倒置。
优选地，本发明的IBV包含从ORF 5a的5’-末端起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170、核苷酸1-180、核苷酸1-190、核苷酸1-194的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A，SEQ ID NO:,2的核苷酸1)是编号1，且，优选地，本发明的IBV包含从ORF 5b的5’-末端起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170、核苷酸1-180、核苷酸1-190、核苷酸1-191的缺失、取代或倒置，其中5’-末端核苷酸(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)是编号1。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ IDNO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。
术语“1至189个核苷酸”、“1至190个核苷酸”、“1至191个核苷酸之间”、“1至192个核苷酸”、“1至193个核苷酸”、“1至194个核苷酸”必须根据如上所述的其他定义理解。所述术语涵盖189种变体、190种变体、191种变体、192种变体、193种变体或194种变体。术语“从起始密码子的A起”、“从起始密码子的U起”或“从起始密码子的G起”定义缺失、取代或倒置的起始点。术语“从起始密码子的A起”示例性定义所述缺失、取代或倒置从起始密码子(AUG)的A开始并影响A。
优选地，本发明的IBV包含从ORF 5a和ORF 5b的起始密码子(AUG)的A、U或G起核苷酸1-10、核苷酸1-20、核苷酸1-30、核苷酸1-40、核苷酸1-50、核苷酸1-60、核苷酸1-70、核苷酸1-80、核苷酸1-90、核苷酸1-100、核苷酸1-110、核苷酸1-120、核苷酸1-130、核苷酸1-140、核苷酸1-150、核苷酸1-160、核苷酸1-170、核苷酸1-180、核苷酸1-190的缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的5’-末端起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起174至200个核苷酸或174至300个核苷酸或174至348个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起174至200个核苷酸或174至300个核苷酸或174至348个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起174至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ IDNO:1的核苷酸2)起173至347个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起172至346个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起174至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起173至347个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起172至346个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起195至250个核苷酸或195至300个核苷酸或195至350或195至385个核苷酸在ORF5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起195至250个核苷酸或195至300个核苷酸或195至350或195至385个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起195至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ IDNO:2的核苷酸2)起194至384个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起193至383个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起195至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起194至384个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起193至383个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
通常，术语“ORF 3a/3b/5a/5b的核苷酸被缺失、取代或倒置”是指可以在所述ORF内的任何地方发生的核苷酸的缺失、取代或倒置。因此，所述核苷酸的缺失、取代或倒置可以仅影响所述ORF的5’-末端，仅影响所述ORF的3’-末端或所述ORF的剩余核苷酸(不包括5’-末端和3’-末端)或其任何组合(诸如示例性地，所述ORF的5’-末端和另外的核苷酸或所述ORF的3’-末端和另外的核苷酸)。因此，示例性的措辞“ORF3a/3b/5a/5b的至少25个核苷酸被缺失、取代或倒置”意味着所述25个核苷酸可以在所述ORF内的任何地方缺失、取代或倒置，而不限制所述ORF内核苷酸的缺失、取代或倒置的定位。进一步，示例性的措辞“ORF3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置”意味着所述核苷酸可以在所述ORF内的任何地方缺失、取代或倒置，而不限制所述ORF内核苷酸的缺失、取代或倒置的定位。此外，如上所述，应当理解术语“1至173个核苷酸”涵盖173种变体(1、2、3,、4等等直至171、172或173个核苷酸的缺失、取代或倒置)。因此，应当理解，术语“1至175个核苷酸”涵盖175种变体(1、2、3、4等等直至173、174或175个核苷酸的缺失、取代或倒置)，术语“1至194个核苷酸”涵盖194种变体(1、2、3、4等等直至192、193或194个核苷酸的缺失、取代或倒置)，术语“1至90个核苷酸”涵盖90种变体(1、2、3、4等等直至88、89或90个核苷酸的缺失、取代或倒置)，术语“1至191个核苷酸”涵盖191种变体(1、2、3、4等等直至189、190或191个核苷酸的缺失、取代或倒置)，术语“1至348个核苷酸”涵盖348种变体(1、2、3、4等等直至346、347或348个核苷酸的缺失、取代或倒置)，且术语“1至385个核苷酸”涵盖385种变体(1、2、3、4等等直至383、384或385个核苷酸的缺失、取代或倒置)。
在本发明的一个方面，ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF 3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且，其中ORF 5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
如本文所用，术语“在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间”应当理解为所述核苷酸的缺失、取代或倒置可以影响(可以包括)ORF 3a的起始密码子，其中ORF 3c的起始密码子不受影响(排除)。因此，ORF 3c的表达和/或E蛋白的活性不受影响。因此，术语“在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间”是指可以在所述ORF的任何地方发生的核苷酸的缺失、取代或倒置，只要ORF 3c的起始密码子不受影响。因此，所述核苷酸的缺失、取代或倒置可以仅影响ORF 3a的5’-末端，仅影响ORF 3b的3’-末端(不影响ORF 3c的起始密码子)或所述ORF的剩余核苷酸(不包括所述ORF的5’-末端和3’-末端)或其任何组合。此外，应当从上文理解术语“176至348个核苷酸”涵盖176、177、178等等直至346、347或348个核苷酸的缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQIDNO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF3c的表达和/或不影响E蛋白的活性。因此，ORF 3a和ORF 3b表达(3a和3b RNA和/或3a蛋白和3b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF 3c的表达和/或E蛋白的活性不受影响。
在本发明的一个方面，在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQIDNO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF3c的表达和/或不影响E蛋白的活性。因此，ORF 3a和ORF 3b表达(3a和3b RNA和/或3a蛋白和3b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF3c的表达和/或E蛋白的活性不受影响。
在本发明的一个方面，在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
如本文所用，术语“在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间”应当理解为所述核苷酸的缺失、取代或倒置可以影响(可以包括)ORF 5a的起始密码子，其中ORF N的起始密码子不受影响(排除)。因此，ORF N的表达和/或N蛋白的活性不受影响。因此，术语“在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间”是指可以在所述ORF的任何地方发生的核苷酸的缺失、取代或倒置，只要ORF N的密码子不受影响。因此，所述核苷酸的缺失、取代或倒置可以仅影响ORF5a的5’-末端，仅影响ORF 5b的3’-末端(不影响ORF N的起始密码子)或所述ORF的剩余核苷酸(不包括所述ORF的5’-末端和3’-末端)或其任何组合。此外，应当从上文理解术语“195至385个核苷酸”涵盖195、196、197等等直至383、384或385个核苷酸的缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ IDNO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，ORF5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。因此，ORF 5a和ORF 5b表达(5a和5b RNA和/或5a蛋白和5b蛋白)和/或所述蛋白的活性被降低(或消除)，而ORF N的表达和/或N蛋白的活性不受影响。
在本发明的一个方面，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ IDNO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348的ORF 3a和ORF 3b被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ IDNO:1的核苷酸348的ORF 3a和ORF 3b被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
术语“同一性”或“序列同一性”是本领域已知的且是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、即参考序列与待与参考序列进行比较的给定序列之间的关系。通过在将序列最佳地比对以产生最高序列相似性程度之后比较给定序列与参考序列来测定序列同一性，如通过此类序列串之间的匹配所测定。在这种比对后，基于逐个位置来确定序列同一性，例如，如果在一个位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则所述序列在具体位置处“相同”。然后将此类位置同一性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到％序列同一性。序列同一性可易于通过已知方法来计算，所述方法包括但不限于描述于以下文献中的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.,编辑,Oxford UniversityPress,New York(1988),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,部分I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑,Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M.Stockton Press,NewYork(1991)；以及Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)，其教导通过引用并入本文。设计用于测定序列同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列同一性的方法编成测定给定序列之间的序列同一性的公开获得的计算机程序。此类程序的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic AcidsResearch,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)，其教导通过引用并入本文)。这些程序使用默认空位权重最佳地比对序列以在给定序列和参考序列之间产生最高水平的序列同一性。作为说明，对于多核苷酸与参考核苷酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％“序列同一性”的核苷酸序列而言，意欲给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，除了给定多核苷酸序列可以包括最高达15、优选地最高达10、甚至更优选地最高达5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中最高达15％、优选地10％、甚至更优选地5％的核苷酸可被缺失或被另一核苷酸取代，或参考序列中全部核苷酸中最高达15％、优选地10％、甚至更优选地5％数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地，对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列同一性的给定氨基酸序列而言，意欲多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同，除了给定多肽序列可包括最高达15、优选地最高达10、甚至更优选地最高达5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言之，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选地90％、甚至更优选地95％序列同一性的给定多肽序列，参考序列中最高达15％、优选地最高达10％、甚至更优选地最高达5％的氨基酸残基可被缺失或被另一氨基酸取代，或参考序列中全部数量氨基酸残基的最高达15％、优选地最高达10％、甚至更优选地最高达5％数量的氨基酸可插入参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在那些末端位置之间的任何位置，其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地，不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在测定序列同一性时，并不包括保守取代作为匹配。
术语“同一性”、“序列同一性”和“百分比同一性”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，这里定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的比对序列(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸或核酸的序列中引入空位)。然后比较在相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数(即重叠位置)x 100)。优选地，两个序列是相同的长度。
可以在所比较的两个序列的整个长度上或在两个序列的片段上进行序列比较。通常，比较将在所比较的两个序列的全长上进行。然而，序列同一性可以在例如二十、五十、一百或更多个连续氨基酸残基的区域上进行。
技术人员将意识到不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性。例如，两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。在一个优选实施方案中，使用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法(其已被并入Accelrys GCG软件包(可得自http://www.accelrys.com/products/gcg/)中的GAP程序)，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，确定两个氨基酸或核酸序列之间的百分比同一性。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但当使用不同的算法时，两个序列的总体百分比同一性不会显著改变。
本发明的蛋白序列或核酸序列可以进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTP程序(版本2.0)进行此类检索。可以用BLASTP程序、得分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402所述利用空位BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，BLASTP和BLASTN)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
在本发明的一个方面，从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385的ORF 5a和ORF 5b被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ IDNO:2的核苷酸385的ORF 5a和ORF 5b被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％同一性的RNA在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％同一性的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。因此，本发明提供了IBV或包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活，
其中与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
在本发明的一个方面，E蛋白具有基因型QX、Beaudette、H120或H52的氨基酸序列或与上面提及的基因型中的至少一种具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，E蛋白具有如对于KM586818(QX)、AJ311317(Beaudette)、FJ807652(H120)或SEQ ID NO:38(H52)所示的氨基酸序列或与上面提及的序列中的至少一种具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在本发明的一个方面，所述IBV是减毒的。
术语“减毒”是指病原体与野生型分离株相比具有减小的毒力。在本发明中，减毒IBV是其中毒力已降低、使得不会引起IBV感染的临床体征、但能够在靶动物中诱导免疫反应的IBV，但也可意指与感染未减毒IBV且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒IBV的动物中临床体征的发生率或严重程度降低。在此上下文中，术语“降低(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的被未减毒IBV感染的对照组相比降低至少10％、优选地25％、甚至更优选地50％、仍更优选地60％、甚至更优选地70％、仍更优选地80％、仍更优选地90％、甚至更优选地95％和最优选地100％。因此，减毒IBV毒株是适于并入包含修饰的活IBV的免疫原性组合物中的毒株。
因此，本发明提供了减毒的IBV或包含减毒的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
因此，本发明提供了减毒的IBV或包含减毒的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。
因此，本发明提供了减毒的IBV或包含减毒的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。
因此，本发明提供了减毒的IBV或包含减毒的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
灭活的病毒
在本发明的一个方面，本发明的IBV已经被灭活，产生整个灭活的病毒。因此，本发明还涉及包含灭活的IBV的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
在本发明的另一个方面，本发明的IBV已经被灭活，产生整个灭活的病毒。因此，本发明还涉及免疫原性组合物，包含：
-灭活的IBV，其中ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-灭活的IBV，其中ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-灭活的IBV，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
任一常规灭活方法都可用于本发明的目的。因此，可通过本领域技术人员已知的化学和/或物理处理来进行灭活。优选的灭活方法包括添加环化二乙烯亚胺(BEI)，包括添加2-溴乙烯胺氢溴酸盐(BEA)(其已环化成二乙烯亚胺(BEI))的溶液。优选的其他化学灭活剂包括但不限于TritonX-100、去氧胆酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、苯酚和甲醛(福尔马林)。然而，灭活也可包括中和步骤。优选的中和剂包括但不限于硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠等。
优选的福尔马林灭活条件包括浓度在约0.02％(v/v)-2.0％(v/v)、更优选地约0.1％(v/v)-1.0％(v/v)、仍更优选地约0.15％(v/v)-0.8％(v/v)、甚至更优选地约0.16％(v/v)-0.6％(v/v)且最优选地约0.2％(v/v)-0.4％(v/v)之间的福尔马林。孵育时间取决于IBV的抗性。通常，进行灭活过程，直至可在合适的培养系统中检测不到IBV生长。
优选地，本发明的灭活IBV是福尔马林灭活的，优选地使用如上文所述的浓度。
可使用已知技术(诸如描述于Nature,1974,252,252-254or Journal ofImmunology,1978,120,1109-13中的技术)将本发明的灭活IBV并入脂质体中。在本发明的另一个实施方案中，本发明的灭活IBV可缀合至合适的生物化合物(诸如多糖、肽、蛋白质或诸如此类或其组合)。
在本发明的一个方面，所述IBV是基因工程改造的。
术语“基因工程改造”是指已通过使用“反向遗传学”方法突变的IBV。优选地，本发明的IBV已进行基因工程改造。反向遗传学技术涉及制备合成重组病毒RNA。然而，“反向遗传学”技术是本领域技术人员众所周知的。
在本发明的一个方面，所述IBV是重组IBV。
如本文所用的术语“重组”涉及RNA基因组(或RNA序列或蛋白)，其具有对于对应的RNA基因组(或RNA序列或蛋白)不天然存在的任何修饰。例如，如果RNA基因组(或RNA序列或蛋白)含有人工引入(例如，通过人为干预)的插入、缺失、倒置、重新定位或点突变，则认为它是“重组的”。因此，RNA基因组序列(或RNA序列或蛋白)与其天然相关的序列(RNA序列或蛋白的氨基酸序列)的全部或部分不相关。如关于病毒使用的术语“重组”意指通过人工操作病毒基因组产生的病毒。术语“重组病毒”涵盖遗传修饰的病毒。
IBV毒株
IBV毒株可以通过血清型和基因型分类。血清型分类涉及用中和抗体处理病毒，而基因型分类涉及检查S1(刺突)蛋白的序列。然而，不同的IBV毒株是本领域技术人员众所周知的。感染性支气管炎病毒最早在1930年代在美国发现。鉴定的第一种IBV血清型是Massachusetts，但在美国，除了最初确定的Massachusetts型之外，还鉴定了几种血清型，包括Arkansas和Delaware。
IBV毒株Beaudette是Massachusetts型的毒株，并且在鸡胚中至少传代150次后得到。IBV毒株Beaudette最初由Beaudette和Hudson(J.Am.Vet.Med.A.90,51-60,1937)分离并且在鸡胚中传代数百次，其通常被称为“鸡胚适应”或“蛋适应”毒株。除了Beaudette以外的其他Massachusetts型IBV毒株是H120、H52和M41。
IB QX已被描述为IBV的毒性野外分离株，其最初在中国分离。然而，该病毒已经向欧洲蔓延，并且已经在部分西欧地区，主要在荷兰鉴定，但也在德国、法国、比利时、丹麦和英国鉴定。QX血清型已经在亚洲和非洲的几个国家得到描述。
另一种IBV毒株是4/91基因型，其通常也称为793B。
命名为“Italien-02”或“Italy-02”的毒株已经在1990年代末在意大利被分离。这些分离株之一的序列分析发表于2002年(NCBI-BLAST，编号AJ457137)。然而，研究已显示，这种Italian-02毒株在欧洲很普遍，并且除了IBV变体毒株4/91以外，其已成为英国、西班牙、法国和荷兰最主要的基因型之一。
此外，毒株D274、B1648/D8880、D1466、V1397和Arkansas也已在欧洲鉴定。
在本发明的一个方面，所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California 1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine 209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
在本发明的一个方面，所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
在本发明的一个方面，所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05,FR-L1450L-05,NL-L1449T-04,NL-L1449K-04,IBV/Ck/SP/170/09,IBV/Ck/SP/79/08,IBV/Ck/SP/248/09,HBN,IBVQX,LX4,BJQ,CK/CH/LGD/03,GB341/96。
在本发明的一个方面，所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120,H52,Spain/98/308,IBMA5-1,SD/97/01,Beaudette,Spain/96/334,M41-M21883。
在本发明的一个方面，所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328,Spain/92/35,IR-3654-VM,FR-CR88061-88,FR-85131-85,UK-1233-95,UK/3/91,Spain/00/336,UK/7/91,4/91-致病的,4/91减毒的,IB4-91。
在本发明的一个方面，所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I,CK/CH/LSD/08-10,J2,Q1,AR08ER22,AR08BA21,Chile-295-10。
在本发明的一个方面，所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316,Italy-02,UK-L633-04,It-497-02,Spain/05/866,Spain/04/221,Spain/00/337,Spain/155/09,Spain/03/08。
在本发明的一个方面，所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
在本发明的一个方面，所述H52是H52U。
在本发明的一个方面，所述H52具有如对于EU817497所示的核苷酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在本发明的一个方面，所述H52毒株具有刺突(S1)蛋白，其具有如对于AF352315所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在本发明的一个方面，所述H52毒株具有核衣壳(N)蛋白，其具有如对于AY044185或AF352310所示的氨基酸序列或与上面提及的序列中的至少一种具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在本发明的一个方面，所述H52毒株具有包膜(E)蛋白，其具有如对于AF317210所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在本发明的一个方面，所述H52毒株具有膜糖蛋白(M)蛋白，其具有如对于AF286185所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
在何处获得任何IBV毒株在本领域技术人员的一般知识之内。IBV毒株可以商业购买，从科学研究所获得，或者基因组可以作为互补DNA合成合成，因为IBV毒株已经被测序并且序列已经公开并因此可获得。此外，IBV毒株可以从野外分离。分离IBV毒株和表征IBV毒株的方法是本领域技术人员众所周知的。Valter Leonardo de Quadros2011(Dissertation,DasBronchitis Virus(IBV):MolekularbiologischeUntersuchungen zur Diagnostik und zum Vorkommen sowie zurdesGenotyps IBV QX in spezifisch pathogenfreien(SPF)Broilern,FreieBerlin),Worthington等人2009(Avian Pathology 37(3),247-257),Liu等人2009(VirusGenes 38:56-65),Dolz等人2006(Avian Pathology 35(2):77-85),Farsang等人2002(Avian Pathology 31:229-236)和Feng等人2014(Virus Genes 49:292-303)描述了如何分离和区分不同的IBV毒株。
示例性地，在何处获得IBV H52在本领域技术人员的一般知识之内。IBV H52毒株可以商业购买，诸如示例性Nobilis IB H52(MSD Animal Health)、AviPro IB H52(Lohmann Animal Health GmbH&Co.KG)、Bronchovac(Ceva)等。此外，McDonald等人1980(Avain Pathology 9:245-259)公开了IBV H52可以通过Central Veterinary LaboratoryRotterdam获得，Kusters(J.gen Virol 68:343-352)公开了IBV H52可以通过荷兰的Poultry Health Institute Dorn(现在是Deventer Institute；IBV H52可以在Deventer获得)获得，并且Chen等人2007(Avian Pathology 36(4):269-274)公开了IBV H52可以通过China Institute of Veterinary Drug Control获得。此外，IBV H52用作疫苗毒株数十年(Bijlenga等人2004,Avian Pathology 33(6):550-557)，且因此可以从野外发现和分离。分离IBV H52毒株和表征IBV H52毒株的方法是本领域技术人员众所周知的。
示例性地，IBV H52毒株可以如Zwaagstra等人1992(J.Clin.Microbiol.30(1):79-84)、Handberg等人1999(Avian Pathology 28:327-335)或Callison等人2006(Journalof Virological Methods 138:60-65)中所述表征。例如，Zwaagstra等人1992和Handberg等人1999公开了用于RT-PCR和测序的Massachusetts特异性引物(分别用于S和N蛋白)和用于比较的参考序列。
进一步，术语“IBV”意在涵盖已经分离和表征的许多IBV的血清型，包括(但不限于)：B/D207/84；B/D274/84；B/UK 167/84；B/UK142/86；E D3S96/84；E/UK 123/82；Brazil/BRl/USP-73/09；793B/4-91/91；FR/CR88121 88；China/Q1/98；Chka/LDL971 97aaz09202；CAV/CAV9437/95；CAV/CAV1 86/95；CAV/CAV56b 91；PA/Wolgemnth/98；PA/i 71/99；C/557/03SI；JAA/04SI vaccine；HN99SI；N1/62/SI；GAGS SI GU301925；Ark/ArkDPI 81SI；Ark/Ark99/73；CAL99/CAL99/99SI；CAL99/NE15172/95SI；Holte/Holte/54；JMK/JMK/64；Gray/Gray/60；lowa/lowa609/56；Ca 1737/04SI；DMA/5642/06SI；GA07/GA07/07Si；QX/QXIBV/99；Mass/H52/SI；Mass/Hi 20/SI；Mass/Mass41/4l SI；Cofln/Corm46/51SI疫苗:FL/FL i8288/71；DE DE072/92SI疫苗；GA98/Q470/98SI；和Dutch/D 1466/81。
典型参考毒株的另外的实例和其刺突基因序列的核苷酸序列数据库登录号是M41(Massachusetts血清型；X04722)、NUD274/78(D274血清型；X15832)、USA/Arkansas 99(Ark99血清型；L10384)、Belgium/B1648(B1648血清型；X87238)、USA(DE)/072/92(DE072血清型；U77298)、US(GA)/0470/98(Georgia 98血清型；AF274437)、Ut14/91(793B1血清型；AF093794)、USA/Connecticut(Connecticut血清型；L18990)和NL/D1466(D1466血清型；M21971)。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物是疫苗。术语“疫苗”已经在本文别处描述。然而，在宿主展现保护性免疫反应、使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低的情况下，免疫原性组合物被描述为“疫苗”。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的载体”包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫攻击剂及其组合。
“稀释剂”可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。
在本发明的一个方面，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
优选地，免疫原性组合物进一步包括蔗糖明胶稳定剂。
在本发明的一个方面，药学上可接受的载体是壳聚醣。
壳聚醣是天然去乙酰化多糖，其来自甲壳类动物(例如虾、螃蟹)、昆虫及其他无脊椎动物中的几丁质。最近，Rauw等人，2009(Vet Immunol Immuno p134:249-258)证明，壳聚醣增强活新城鸡瘟疫苗的细胞免疫反应且促进其保护效应。此外，Wang等人，2012(ArchVirol(2012)157:1451–1461)显示的结果揭示壳聚醣作为用于活减毒流感疫苗中佐剂的潜能。
优选地，免疫原性组合物可进一步包括一种或多种其他免疫调节剂，诸如例如介白素、干扰素或其他细胞因子。可用于本发明背景中的佐剂和添加剂的量和浓度可容易地由本领域技术人员测定。
在一些方面，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝；皂苷，例如QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。该乳液可尤其基于轻质液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(尤其为异丁烯或癸烯)的寡聚化产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体地植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其为异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，具体而言为山梨糖醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的任选地乙氧基化的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，具体而言为Pluronic产品，尤其为L121。参见Hunter等人，The Theory and PracticalApplication of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY,pp51-94(1995)和Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是描述于M.Powell和M.Newman编辑(PlenumPress,1995)的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上的SPT乳液和描述于该同一本书第183页上的乳液MF59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚化合物。优选的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物被称为术语卡波姆(carbomer)(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利号2,909,462，其描述与聚羟基化化合物交联的此类丙烯酸系聚合物，所述聚羟基化化合物具有至少3个(优选不多于8个)羟基，至少3个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团替代。优选基团是含有2至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他烯属不饱和基团。不饱和基团自身可含有其他取代基诸如甲基。以名称卡波普(Carbopol)(BF Goodrich,Ohio,USA)销售的产品尤其适合。其可与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中可提及的是卡波普974P、934P和971P。最优选使用卡波普971P。共聚物EMA(Monsanto)属马来酸酐与烯基衍生物的共聚物，其为马来酸酐与乙烯的共聚物。将这些聚合物溶于水中会产生酸性溶液，将其中和，优选中和至生理pH以得到佐剂溶液，将免疫原性的、免疫的或疫苗组合物本身并入该佐剂溶液中。
其他合适的佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组的或其他性质的)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽或天然或重组的细胞因子或其类似物或内源细胞因子释放的攻击物。
预期佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量、优选以约100μg至约10mg/剂量、更优选以约500μg至约5mg/剂量、甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量且最优选地以约1mg/剂量的量添加。或者，以最终产物的体积计，佐剂的浓度可为约0.01至50％，优选为约2％至30％，更优选为约5％至25％，仍更优选为约7％至22％，且最优选地为10％至20％。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。术语“治疗和/或预防”、“临床体征”和“有需要”已在别处定义。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。术语“保护”和“预防(prophylaxis)”和“预防(preventing)”在本申请中可互换使用。然而，这些术语已在别处定义。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
单剂量的体积已在本文别处定义。
此外已经显示，在施用这种单剂量的这种免疫原性组合物之后，一个剂量的本发明的免疫原性组合物是有效的。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50/ml/剂量的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50/ml/剂量的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50/ml/剂量的IBV。
试剂盒
如果期望，所述组合物可以在包装或分配器装置中呈现，所述包装或分配器装置可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。所述包装或分配器装置可以附有施用说明，优选用于施用于受试者，尤其是家禽。与此类容器相关的是由管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构规定形式的告知书，该告知书反映了该机构批准制造、使用或销售用于人类施用。
因此，本发明提供了试剂盒，其包含如本文所述的IBV或免疫原性组合物。
在本发明的一个方面，所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
在本发明的一个方面，所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
在本发明的一个方面，所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB(感染性支气管炎)的说明书。
治疗方法
进一步，本发明提供了用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用如本文所述的免疫原性组合物。
术语“免疫”是指通过向待免疫的受试者施用免疫原性组合物进行的主动免疫，由此引起针对这种免疫原性组合物中所包括的抗原的免疫反应。
优选地，免疫导致畜群中特定IBV感染的发病率的减少或由特定IBV感染引起或与其有关的临床体征的严重程度的减少。
此外，使用如本文所提供的免疫原性组合物对有需要的受试者进行免疫导致预防由IBV感染的受试者的感染。甚至更优选地，免疫导致针对IBV感染的有效、持久的免疫反应。应理解，所述时间段将持续大于1个月、优选大于2个月、优选地大于3个月、更优选地大于4个月、更优选地大于5个月、更优选地大于6个月。必须理解，免疫不能在所免疫的所有受试者中都有效。然而，该术语需要有效免疫畜群的大部分受试者。
优选地，在此上下文中设想通常(即，没有免疫的情况下)发生通常由IBV感染引起或与其有关的临床体征的受试者畜群。本领域技术人员可不再费周折地测定畜群受试者是否被有效免疫。优选地，如果与未免疫或使用可在本发明之前获得的免疫原性组合物免疫、但随后感染特定IBV的受试者相比，给定畜群中至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％受试者的临床体征的发病率或严重程度减小至少10％、更优选地至少20％、仍更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、仍更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、仍更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、仍更优选地至少90％、仍更优选地至少95％及最优选地100％，则免疫应是有效的。
进一步，本发明提供了治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
术语“治疗和/或预防”是指畜群中特定IBV感染的发生率的减少或由特定IBV感染引起或与特定IBV感染相关的临床体征的严重程度的降低。因此，术语“治疗和/或预防”还指与受试者未接受此类免疫原性组合物的受试者组相比，在受试者已经接受有效量的如本文提供的免疫原性组合物的受试者组中，被特定IBV感染的畜群中的受试者数量的减少(＝特定IBV感染的发生率的减少)或通常与IBV感染相关或由其引起的临床体征的严重程度的降低或被特定IBV感染后病毒脱落的减少或预防或减少被特定IBV感染后产蛋母鸡中的减蛋。
“治疗和/或预防”通常涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用于需要这种治疗/预防或可能受益于这种治疗/预防的受试者或一群受试者。术语“治疗”是指一旦受试者或畜群的至少一些受试者已经感染这种IBV并且其中此类受试者已经显示由这种IBV感染引起或与之相关的一些临床体征，则施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”是指在受试者感染IBV之前向这种受试者施用，或者至少在这种受试者或受试者群中的无一受试者没有显示由这种IBV感染引起或与之相关的任何临床体征的情况下向受试者施用。术语“预防(prophylaxis)”和“预防(preventing)”在本申请中可互换使用。
如本文所用的术语“有效量”是指但不限于在受试者中引发或能够引发免疫反应的抗原的量。这种有效量能够减少畜群中特定IBV感染的发生率或降低特定IBV感染的临床体征的严重程度。
优选地，与用在本发明之前可得的免疫原性组合物非治疗或治疗、但随后被特定IBV感染的受试者相比，临床体征的发病率或严重程度减少至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，还更优选至少95％，且最优选100％。
如本文所用的术语“临床体征”是指受试者感染IBV的体征。感染的临床体征取决于所选择的病原体。此类临床体征的实例包括但不限于呼吸窘迫、肾炎、咽鼓管炎、产蛋异常、羽毛褶皱、抑郁、生长速度降低和食欲降低。呼吸窘迫的体征涵盖呼吸道体征，涵盖喘气、咳嗽、打喷嚏、气管罗音、鼻腔和眼部分泌物、气管损伤和气管中的纤毛停滞。肾炎的体征涵盖肾损伤和水样腹泻。产蛋异常的体征涵盖减蛋、较小尺寸的蛋、较差的蛋壳、内部蛋品质降低、蛋白的蛋清薄和输卵管中的纤毛停滞。然而，临床体征还包括但不限于可从活动物直接观察到的临床体征。可直接从活动物观察到的临床症状的实例涵盖鼻和眼分泌物、咳嗽、喘气、打喷嚏、气管罗音、羽毛褶皱、结膜炎、体重减轻、生长速度降低、食欲减退、脱水、水样腹泻、跛行、嗜睡、消瘦和体重不增等。
优选地，与用在本发明之前可得的免疫原性组合物非治疗或治疗、但随后被特定IBV感染的受试者相比所治疗受试者的发病率或严重程度减少的临床体征是指纤毛停滞的减少、罗音的减少、减蛋的减少、肾损伤的减少、水样腹泻的减少、体重减轻的减少、病毒载量的降低、病毒脱落的减少或其组合。
如本文所用的术语“有需要(in need)”或“有需要(of need)”意味着施用/治疗与根据本发明接受免疫原性组合物的受试者的健康或临床体征的加强或改善或对其健康的任何其他积极药效相关。
术语“减少(reducing)”或“减少(reduced)”或“减少(reduction)”或“降低”在本申请中可互换使用。术语“减少”意味着，与非治疗(未免疫)、但随后被特定IBV感染的受试者相比，临床体征减少至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，还更优选至少95％，最优选100％。
进一步，本发明提供了与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
如实施例中所示，已经证明如本文提供的免疫原性组合物在减少纤毛停滞方面是有效的。
术语“纤毛停滞”是指纤毛在气管中的运动减少。因此，可以通过检查气管环的内层的纤毛的运动来确定纤毛停滞。如何确定气管中纤毛的运动在本领域技术人员的一般知识之内。
优选地，与相同物种的非免疫对照组的受试者相比，纤毛的运动在攻击或感染后第10天起，更优选在攻击或感染后第5天起，更优选在攻击或感染后第4天起，更优选在攻击或感染后第3天起，最优选在IBV攻击或感染后第1天或第2天起不降低。
术语“纤毛停滞的减少”意味着，与相同物种的非免疫对照组的受试者相比，纤毛停滞减少至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选100％。如何测量纤毛停滞的减少在本领域技术人员的一般知识之内。
在本发明的一个方面，所述受试者是禽类。
术语“禽类”是本领域技术人员众所周知的。术语“禽类”涵盖所有鸟类，包括家禽。
在本发明的一个方面，所述受试者是家禽。
术语“家禽”是本领域技术人员众所周知的。术语“家禽”涵盖鸡、火鸡、鹌鹑、野鸡、珍珠鸡、鹅和鸭。进一步，术语“鸡”包括肉鸡、产蛋母鸡和繁殖种群，后两者也被称为育种鸡。
在本发明的一个方面，所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物施用一次。
应理解，单剂量仅施用一次。如实施例中所示，已经证明如本文提供的免疫原性组合物在向有需要的受试者施用单剂量后是有效的。
每只家禽的剂量体积取决于疫苗接种途径和家禽的周龄。
通常，滴眼疫苗在任何周龄都以每剂量1至100μl的体积施用。优选地，用于滴眼疫苗的单剂量具有约5μl至70μl、更优选约20μl至50μl的总体积，其中优选单个20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl或50μl剂量。最优选地，用于滴眼疫苗的单剂量具有约30μl至50μl的总体积，其中优选单个30μl、35μl、40μl、45μl或50μl剂量。
对于日龄家禽，喷雾疫苗可以含有25至1000μl的体积的剂量。优选地，用于喷雾疫苗的单剂量具有约50μl至5000μl、更优选约75μl至2000μl、更优选约100μl至1000μl、甚至更优选约200μl至900μl、甚至更优选约300μl至800μl且甚至更优选约400μl至700μl的总体积，其中优选单个400μl、425μl、450μl、475μl、500μl、525μl、550μl、575μl、600μl、625μl、650μl、675μl或700μl剂量。最优选地，单剂量具有400μl、450μl 500μl、550μl、600μl、650μl或700μl的总体积。
用于卵内疫苗接种的疫苗可以含有50至100μl、优选50μl的体积的剂量。优选地，用于卵内疫苗的单剂量具有约10μl至250μl、更优选约15μl至200μl、甚至更优选约20μl至150μl、甚至更优选约30μl至100μl、甚至更优选约30μl至75μl的总体积，其中优选单个30μl、35μl、40μl、45μl、50μl、55μl、60μl、65μl、70μl或75μl剂量。最优选地，单剂量具有40μl、45μl、50μl、55μl或60μl的总体积。
用于肌内或皮下疫苗接种的疫苗或一个剂量的饮用水疫苗可以含有30μl至1000μl的体积的剂量。优选地，单剂量具有约30μl至1000μl、更优选约50μl至500μl、更优选约75μl至250μl和甚至更优选约100μl至200μl的总体积，其中最优选单个100μl、110μl、120μl、125μl、130μl、135μl、140μl、145μl、150μl、160μl、170μl、175μl、180μl、190μl、155μl或200μl剂量。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
然而，所述免疫原性组合物可以以两个或更多个剂量施用，其中第一剂量在施用第二(加强剂)剂量前施用。
在两次施用方案的优选方面，第一和第二剂量的免疫原性组合物以相同的量施用。优选地，每个剂量均为上文指定的优选量。除了第一和第二剂量方案以外，一个替代实施方案包括进一步的后续剂量。例如，可以在这些方面施用第三、第四或第五剂量。优选地，随后的第三、第四和第五剂量方案以与第一剂量相同的量施用，其中剂量之间的时间范围与上面提及的第一和第二剂量之间的时机一致。
优选地，疫苗的第一次施用在前三周龄内、更优选地在第一周龄内且最优选地在一日龄时通过如下所述的方法进行。第二次施用可以在前20周龄内、优选地在16-18周龄内、更优选地在6-12周龄之间进行。示例性地，初始(第一)疫苗接种在1-10日龄时进行，并且第二疫苗接种(加强疫苗接种)在6-12或16-18周龄时用活疫苗或灭活疫苗进行。更优选地，初始(第一)疫苗接种在一日龄时进行，并且第二疫苗接种(加强疫苗接种)在6-12或16-18周龄时用活疫苗或灭活疫苗进行。
在卵内疫苗接种的情况下，优选地，当胚胎在15至19日龄之间、优选地在第17、18或19日龄、最优选地在第18日龄时，进行第一次施用。第二次施用可以在前三周龄内、优选地在前10日龄内进行。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
所述免疫原性组合物优选地局部或全身施用。常规使用的合适的施用途径是口服或肠胃外施用，诸如鼻内、静脉内、皮内、经皮、肌内、腹膜内、皮下以及吸入、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼。然而，取决于化合物的性质和作用模式，所述免疫原性组合物同样可以通过其他途径施用。例如，此类其他途径包括皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内(intralobally)、叶内(intralobarly)、髓内、肺内、直肠内和阴道内。然而，最优选的是，所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
活IBV疫苗优选通过滴眼、鼻内、肌内或皮下单独施用。
更优选地，使用大量应用方法，包括饮用水和气溶胶喷雾疫苗接种。还优选的是使用疫苗作为胚胎疫苗(所谓的卵内疫苗)，如下文进一步描述。
例如，肉鸡可以在1日龄或1-3周龄时接种疫苗，特别是对于具有高水平MDA的肉鸡。产蛋种群或繁殖种群可以最初在1-10日龄时接种疫苗，并且在7-12或16-18周龄时用疫苗加强。
卵内施用
如上所概述，本发明还提供了IBV疫苗，其可以经由卵内途径安全地施用，且同时能够诱导保护性免疫反应。卵内施用是本领域技术人员众所周知的，并且本领域技术人员可以没有再费周折地进行卵内施用。疫苗的卵内施用涉及将疫苗施用于鸡胚，同时包含在卵中(对于关于卵内疫苗接种的综述，参见：Ricks等人,Advances in Vet.Med.495-515,1999)。可以将疫苗施用于卵的任何合适的隔室(例如，尿囊液、卵黄囊、羊膜、气室或胚胎中)，如本领域所述(Sharma；Am.J.Vet.Res.45 1619-1623,1984).优选地，所述疫苗在壳(气室)膜和绒毛尿囊膜下施用。
优选地，在胚胎形成的晚期期间，通常在孵育期的最后四分之一期间，优选在孵化前3-4天，将疫苗注射至含胚卵中。优选地，当胚胎在15和19日龄之间、优选地在第17、18或19日龄、最优选地在第18日龄时，进行施用。随后，将接种疫苗的含胚卵转移至孵育器进行孵化。卵内施用的过程可以使用如现有技术中所述的机器人注射方法自动化。
通常用于家禽孵化后疫苗接种的常规疫苗不能用于卵内疫苗接种，因为晚期胚胎对所检查的大多数疫苗病毒高度敏感。然而，国际专利申请WO 01/64244公开了IBV疫苗可以用于卵内施用，条件是其以非常低的剂量施用。进一步，Wakenell等人1986(Am.J.Vet.Res.,47 933-938)公开了在组织培养物中传代IB疫苗病毒使得病毒对胚胎无致病性。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
通常，用于孵化后施用的活疫苗包含每单位剂量101至108EID50(50％蛋感染剂量)的浓度、优选地每单位剂量102至105EID50的浓度且更优选地每单位剂量102至104EID50的浓度且甚至更优选地每单位剂量102至103EID50的浓度的减毒IBV。
用于卵内施用的活疫苗通常在50至100μl、优选地50μl的体积中包含102至107EID50/胚胎、优选地102至103EID50/胚胎的量的减毒IBV。
优选地，本发明的免疫原性组合物包含每剂量约1至约10log10EID(卵感染剂量)50/ml、优选地每剂量约2至约8log10EID50/ml、优选地每剂量约2至约7log10EID50/ml、更优选地每剂量约2至约6log10EID50/ml、甚至更优选地每剂量约2至约5log10EID50/ml、甚至更优选地每剂量约2至约4log10EID50/ml、最优选地每剂量约2至约3log10EID50/ml的量的本发明的IBV。更优选地，本发明的免疫原性组合物包含每剂量约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或log10EID50/ml的量的本发明的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50/ml的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50/ml的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50/ml的IBV。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
优选地，待免疫的受试者是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21日龄。更优选地，所述待免疫的受试者是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14日龄。最优选地，所述待免疫的受试者是1、2、3、4、5、6或7日龄。
然而，必须理解的是，在受试者的疫苗接种为几日龄之后，家禽的免疫系统确实需要几天来建立针对IBV感染的免疫力。因此，优选地，受试者在前24小时龄内免疫。
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。如实施例中所示，已经证明如本文提供的免疫原性组合物当施用于1日龄家禽时是安全且有效的。
在本发明的一个方面，所述方法导致与相同物种的非免疫对照组的受试者相比，选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
术语“治疗和/或预防”已在别处定义，其中术语“预防(prophylaxis)”和“预防(preventing)”或“预防(prevention)”在本申请中可互换使用。进一步，术语“脱落”也已在别处定义。
术语“降低(reducing)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”或“更低”意指，与相同物种的未免疫对照组的受试者相比，效力参数(纤毛停滞、罗音、减蛋、肾损伤、水样腹泻、体重减轻、病毒载量、病毒脱落)减低至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％、甚至更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％和最优选地100％。如何测量效力参数的改善在本领域技术人员的一般知识之内。
术语“病毒载量”是本领域技术人员众所周知的。术语病毒载量在本文中可与术语病毒滴度互换使用。病毒载量或病毒滴度是活动性病毒感染的严重程度的量度，且可通过本领域技术人员已知的方法来测定。该测定可基于诸如通过抗体与病毒蛋白的结合来检测病毒蛋白及另外或者可替代地通过扩增方法(诸如RT-PCR)来检测病毒RNA。通过核酸扩增方法监测血浆中的病毒粒子相关的病毒RNA是广泛用于评价逆转录病毒疾病的状态和进展以及评估预防性和治疗性干预的有效性的参数。示例性地，可通过估计所涉及体液中的活病毒量(诸如RNA拷贝数/毫升血样血浆)来计算病毒载量或病毒滴度。
术语“纤毛停滞”是该领域技术人员众所周知的。气管的表面覆盖有专门的上皮细胞，所述上皮细胞内衬有许多被称为纤毛的运动型毛发样结构。术语“纤毛停滞”涵盖纤毛的减少或丧失和/或纤毛活性的丧失或部分丧失。纤毛停滞可以由本领域技术人员可以没有再费周折地确定。
术语“罗音”是该领域技术人员众所周知的。然而，术语“罗音”涵盖气管罗音并且是指从支气管发出的声音。罗音可以由本领域技术人员可以没有再费周折地确定。
术语“减蛋”是该领域技术人员众所周知的。术语“减蛋”涵盖减少的产蛋量。
在本发明的一个方面，与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
在本发明的一个方面，与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
在本发明的一个方面，与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
本发明进一步提供了如本文所述的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
本发明进一步提供了如本文所述的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
本发明进一步提供了如本文所述的IBV或免疫原性组合物，其用于药物。
本发明进一步提供了如本文所述的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
本发明进一步提供了如本文所述的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
进一步，必须理解，ORF 3a的单一失活或ORF 3b的单一失活或ORF 5a的单一失活或ORF 5b的单一失活同样导致IBV的减毒。因此，具有ORF 3a的单一失活或ORF3b的单一失活或ORF 5a的单一失活或ORF 5b的单一失活的IBV可用于制备免疫原性组合物。此外，这种免疫原性组合物具有如本文所述的效果(诸如针对IBV攻击感染的保护)。
此外，当生成这种单一失活(ORF 3a或ORF 3b或ORF 5a或ORF 5b)时，必须理解包含终止密码子的序列可以被插入ORF的下游以确保所述ORF的翻译停止。当两个ORF重叠并且一个ORF的失活可以使另一个ORF的终止密码子失活时，这可能是必需的。
实施方案
本文还描述以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a和ORF 3b被失活；或
-ORF 5a和ORF 5b被失活；或
-ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
3.条款1的IBV或条款2的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或不影响E蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF S的表达和/或不影响S蛋白的活性。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3a的完全或部分缺失和ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分缺失和ORF 5b的部分缺失，ORF3a的完全或部分截短和ORF 3b的部分截短和/或ORF 5a的完全或部分截短和ORF 5b的部分截短，ORF 3a的完全或部分倒置和ORF 3b的部分倒置和/或ORF 5a的完全或部分倒置和ORF5b的部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位和ORF 3b的部分重新定位和/或ORF 5a的完全或部分重新定位和ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的插入，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的取代。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b被部分缺失、取代或倒置。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b和ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
10.条款1至9中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失，且ORF 3b被部分缺失。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 5b被部分缺失。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 3b和ORF 5b被部分缺失。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子和ORF3b的起始密码子被失活。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。
15.条款13或条款14的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子和ORF5b的起始密码子被失活。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。
18.条款16或条款17的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF 3a的起始密码子(AUG)(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ IDNO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短，且其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
26.条款1至25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
27.条款1至26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
28.条款1至27中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
29.条款1至28中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ IDNO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
30.条款1至29中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
31.条款1至30中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ IDNO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。
32.条款1至31中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF3b内被缺失、取代或倒置。
33.条款1至32中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
34.条款1至33中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
35.条款1至34中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
36.条款1至35中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起174至200个核苷酸或174至300个核苷酸或174至348个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
37.条款1至36中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起174至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起173至347个核苷酸，或从ORF3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起172至346个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
38.条款1至37中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起195至250个核苷酸或195至300个核苷酸或195至350或195至385个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
39.条款1至38中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起195至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起194至384个核苷酸，或从ORF5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起193至383个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
40.条款1至39中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
41.条款1至40中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
42.条款1至41中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
43.条款1至42中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
44.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
45.条款1至44中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
46.条款1至45中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
47.条款1至46中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和ORF3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
48.条款1至47中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
49.条款1至48中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
50.条款1至49中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
51.条款1至50中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
52.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348的ORF 3a和ORF 3b被缺失、取代或倒置。
53.条款1至52中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
54.条款1至53中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
55.条款1至54中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385的ORF 5a和ORF 5b被缺失、取代或倒置。
56.条款1至55中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
57.条款1至56中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
58.条款1至57中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
59.条款1至58中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
60.条款1至59中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
61.条款1至60中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
62.条款1至61中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
63.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
64.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
65.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
66.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
67.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
68.条款1至62中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
69.条款2至68中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
70.条款2至69中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
71.条款70的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
72.条款2至71中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
73.条款2至72中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
74.条款2至73中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
75.条款2至74中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
76.条款2至75中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
77.条款2至76中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
78.条款2至77中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
79.条款2至78中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
80.试剂盒，其包含条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物。
81.根据条款80所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
82.根据条款81所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
83.根据条款82所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
84.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物。
85.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物。
86.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物。
87.根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
88.根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
89.根据条款2至79中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
90.条款84至89中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
91.条款84至90中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
92.条款84至91中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
93.条款84至92中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
94.条款84至92中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
95.条款84至94中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
96.条款84至95中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
97.条款84至96中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
98.条款84至97中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
99.条款84至98中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
100.条款84至99中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
101.条款84至100中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
102.条款84至101中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
103.条款84至102中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
104.条款84至103中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
105.条款84至104中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
106.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
107.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
108.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
109.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
110.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
进一步，本文还描述以下条款：
1.繁殖和基因组修饰IBV的方法，其包括：
a)将IBV的病毒RNA转染至细胞中；
b)用第一部分IBV病毒RNA共转染步骤a)的细胞，其中所述第一部分IBV病毒RNA编码不同冠状病毒的表面蛋白；
c)选择所述部分IBV病毒RNA的不同冠状病毒的所述表面蛋白阳性的嵌合感染性IBV克隆；
d)将第二部分IBV病毒RNA转染至步骤c)的嵌合感染性IBV克隆阳性的细胞系中，其中所述第二部分IBV病毒RNA编码IBV的表面蛋白，且其中所述第二部分IBV病毒RNA携带进一步修饰；
e)将来自步骤d)的细胞接种至含胚禽蛋中；
f)从步骤e)的含胚禽蛋选择基因组修饰的IBV，其中所述基因组修饰的IBV具有IBV的表面蛋白，且其中所述基因组修饰的IBV携带所述进一步修饰。
2.条款1的方法，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
3.条款1或2的方法，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California 1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine 209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120正确？)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
4.条款1至3中任一项的方法，其中转染是显微注射。
5.条款1至3中任一项的方法，其中转染是电穿孔。
6.条款1至5中任一项的方法，其中条款1的步骤a)中的转染和条款1的步骤b)中的共转染同时进行。
7.条款1至6中任一项的方法，其中所述细胞具有哺乳动物、禽类或脊椎动物来源。
8.条款1至7中任一项的方法，其中所述细胞选自：BHK(幼仓鼠肾)-21、Vero(非洲绿猴肾上皮细胞)、Cos-7(非洲绿猴Cercopithecus aethiops成纤维细胞样肾细胞)、CK(鸡肾)、CEF(鸡胚成纤维细胞)、鸡胚肝细胞(CELC)、鸡胚真皮细胞(CED)、Vero细胞和293T细胞。
9.条款1至8中任一项的方法，其中所述细胞与第二类型的细胞共培养，其中第二类型的细胞源自与来自所述不同冠状病毒的物种特异性相同的物种。
10.条款9的方法，其中用于共培养的第二类型的细胞是源自小鼠、猫、猪、人或火鸡的细胞。
11.条款9或10的方法，其中用于共培养的第二类型的细胞是小鼠LR7、小鼠L2R、小鼠L2、小鼠mTAL(小鼠髓袢开支粗段)、猫FCWF(猫全胎)、ST(猪睾丸)或LLC-PK(猪肾上皮细胞)。
12.条款9或10的方法，其中用于共培养的第二类型的细胞是小鼠LR7。
13.条款1至12中任一项的方法，其中条款1的步骤b)中的共转染步骤进一步包括共转染编码冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)的RNA。
14.条款13的方法，其中编码冠状病毒N基因的RNA是编码IBV N蛋白、MHV N蛋白、FIPV N蛋白或SDCV N蛋白的RNA。
15.条款1至14中任一项的方法，其中所述表面蛋白是受体结合蛋白或其部分。
16.条款1至15中任一项的方法，其中所述表面蛋白是刺突蛋白或其部分。
17.条款1至16中任一项的方法，其中所述表面蛋白是刺突蛋白或其部分的胞外域。
18.条款1至17中任一项的方法，其中条款1的步骤b)的不同冠状病毒的表面蛋白是MHV、FIPV、PEDV或SDCV表面蛋白或其部分。
19.条款1至17中任一项的方法，其中条款1的步骤b)的不同冠状病毒的表面蛋白是MHV、FIPV、PEDV或SDCV受体结合蛋白或其部分。
20.条款1至19中任一项的方法，其中条款1的步骤b)的不同冠状病毒的表面蛋白是MHV、FIPV、PEDV或SDCV刺突蛋白或其部分。
21.条款1至19中任一项的方法，其中条款1的步骤b)的不同冠状病毒的表面蛋白是MHV、FIPV、PEDV或SDCV刺突蛋白或其部分的胞外域。
22.条款1至21中任一项的方法，其中所述不同冠状病毒的表面蛋白来自除了IBV以外的冠状病毒。
23.条款1至22中任一项的方法，其中所述不同冠状病毒的表面蛋白是MHV刺突蛋白或其部分。
24.条款1至23中任一项的方法，其中所述不同冠状病毒的表面蛋白是MHV刺突蛋白或其部分的胞外域。
25.条款1至24中任一项的方法，其中所述嵌合感染性IBV克隆包含MHV、FIPV、PEDV或SDCV的刺突蛋白或其部分。
26.条款1至25中任一项的方法，其中所述嵌合感染性IBV克隆包含MHV、FIPV、PEDV或SDCV的刺突蛋白或其部分的胞外域。
27.条款1至26中任一项的方法，其中所述嵌合感染性IBV克隆包含MHV刺突蛋白或其部分。
28.条款1至27中任一项的方法，其中所述嵌合感染性IBV克隆包含MHV刺突蛋白或其部分的胞外域。
29.条款1至28中任一项的方法，其中所述含胚禽蛋来自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
30.条款1至29中任一项的方法，其中所述含胚禽蛋是鸡蛋。
31.条款1至30中任一项的方法，其中选择感染性IBV克隆包括选自以下的方法：RT-PCR、实时RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、放射免疫测定、ELISA测定、免疫荧光、免疫组织化学、原位杂交。
32.条款1至31中任一项的方法，其中所述部分IBV病毒RNA是重组病毒RNA。
33.条款1至32中任一项的方法，其中所述部分IBV病毒RNA是合成病毒RNA。
34.条款1至33中任一项的方法，其中条款1的所述第二部分IBV病毒RNA编码IBV刺突蛋白或其部分。
35.条款1至34中任一项的方法，其中条款1的所述第二部分IBV病毒RNA编码IBV刺突蛋白或其部分的胞外域。
36.条款1至35中任一项的方法，其中所述第二部分IBV病毒RNA中的所述修饰选自：基因、ORF、启动子或任何非编码序列的完全缺失，基因、ORF、启动子或任何非编码序列的部分缺失，基因、ORF、启动子或任何非编码序列的截短，基因、ORF、启动子或任何非编码序列的倒置，基因、ORF、启动子或任何非编码序列的重新定位，基因、ORF、启动子或任何非编码序列内的核酸的插入，基因、ORF、启动子或任何非编码序列内的核酸的取代。
37.条款1至36中任一项的方法，其中所述第二部分IBV病毒RNA中的所述修饰是ORF 3a的完全或部分缺失和ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分缺失和ORF 5b的部分缺失，ORF 3a的完全或部分截短和ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分截短和ORF 5b的部分缺失，ORF 3a的完全或部分倒置和ORF 3b的部分倒置和/或ORF 5a的完全或部分倒置和ORF 5b的部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位和ORF 3b的部分重新定位和/或ORF 5a的完全或部分重新定位和ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF5a和ORF 5b内的核酸的插入，ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b内的核酸的取代。
38.条款1至36中任一项的方法，其中所述第二部分IBV病毒RNA中的所述修饰是ORF 3a的完全或部分缺失、取代或倒置和ORF 3b的部分缺失、取代或倒置和/或ORF5a的完全或部分缺失、取代或倒置和ORF 5b的部分缺失、取代或倒置。
39.条款1至36中任一项的方法，其中所述第二部分IBV病毒RNA中的所述修饰是ORF 3a和ORF 3b和/或ORF 5a和ORF 5b的截短。
40.条款1至39中任一项的方法，其中从含胚鸡蛋选择基因组修饰的IBV包括选自RT-PCR、实时RT-PCR、Northern印迹、Western印迹、放射免疫测定、ELISA测定、免疫荧光免疫组织化学、原位杂交、终点稀释的方法。
41.条款1至40中任一项的方法，其中所述基因组修饰的IBV是重组IBV。
42.条款1至41中任一项的方法，其中所述基因组修饰的IBV是减毒的。
43.条款1至42中任一项的方法，其中通过有限稀释进行在含胚鸡蛋中选择所述基因组修饰的冠状病毒。
44.制备减毒IBV疫苗的方法，其包括根据条款1至43中任一项所述的方法。
45.条款44的方法，其包括将减毒IBV与药学上可接受的载体混合。
46.细胞，其包含根据条款1至43中任一项所述的IBV。
47.含胚禽蛋，其包含根据条款1至43中任一项所述的IBV。
48.含胚鸡蛋，其包含根据条款1至42中任一项所述的IBV。
49.通过根据条款1至42中任一项的方法获得的减毒IBV。
进一步，本文还描述涉及ORF 3a失活的以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中ORF 3a被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 3a被失活。
3.条款1或2的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a的失活不影响ORF S的表达和/或不影响S蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a的失活不影响ORF3b的表达和/或不影响3b蛋白的活性。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3a的完全或部分缺失，ORF 3a的完全或部分截短，ORF 3a的完全或部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位，ORF 3a内的核酸插入，ORF 3a内的核酸取代。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被部分缺失、取代或倒置。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被部分缺失。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子被失活。
9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)被失活。
10.条款8或条款9的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端截短。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G截短。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
18.条款1至17中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸173的ORF 3a被缺失、取代或倒置。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:33中所示的RNA序列在ORF 3a内被缺失、取代或倒置。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:33中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a内被缺失、取代或倒置。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
26.条款1至25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
27.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
28.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
29.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
30.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
31.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
32.条款1至26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
33.条款2至32中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
34.条款2至33中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
35.条款34的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
36.条款2至35中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
37.条款2至36中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
38.条款2至37中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
39.条款2至38中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
40.条款2至39中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
41.条款2至40中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
42.条款2至41中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
43.条款2至42中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
44.试剂盒，其包含条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物。
45.根据条款44所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
46.根据条款45所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
47.根据条款46所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
48.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
49.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
50.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
51.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
52.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
53.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
54.条款48至53中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
55.条款48至54中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
56.条款48至55中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
57.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
58.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
59.条款48至58中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
60.条款48至59中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
61.条款48至60中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
62.条款48至61中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
63.条款48至62中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
64.条款48至63中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
65.条款48至64中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
66.条款48至65中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
67.条款48至66中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
68.条款48至67中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
69.条款48至68中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
70.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
71.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
72.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
73.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
74.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
本文还描述涉及ORF 3b失活的以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中ORF 3b被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 3b被失活。
3.条款1或2的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b的失活不影响ORF 3a的表达和/或不影响3a蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3c的失活不影响ORF3c的表达和/或不影响E蛋白的活性。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3b的部分缺失，ORF 3b的部分截短，ORF 3b的部分倒置，ORF 3b的部分重新定位，ORF 3b内的核酸插入，ORF 3b内的核酸取代。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b被部分缺失、取代或倒置。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b被部分缺失。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的起始密码子被失活。
9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。
10.条款8或条款9的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
18.条款1至17中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348的ORF 3b被缺失、取代或倒置。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:34中所示的RNA序列在ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:34中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
26.条款1至25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
27.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
28.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
29.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
30.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
31.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
32.条款1至26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
33.条款2至32中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
34.条款2至33中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
35.条款34的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
36.条款2至35中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
37.条款2至36中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
38.条款2至37中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
39.条款2至38中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
40.条款2至39中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
41.条款2至40中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
42.条款2至41中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
43.条款2至42中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
44.试剂盒，其包含条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物。
45.根据条款44所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
46.根据条款45所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
47.根据条款46所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
48.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
49.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
50.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
51.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
52.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
53.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
54.条款48至53中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
55.条款48至54中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
56.条款48至55中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
57.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
58.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
59.条款48至58中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
60.条款48至59中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
61.条款48至60中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
62.条款48至61中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
63.条款48至62中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
64.条款48至63中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
65.条款48至64中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
66.条款48至65中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
67.条款48至66中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
68.条款48至67中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
69.条款48至68中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
70.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
71.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
72.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
73.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
74.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
本文还描述涉及ORF 5a失活的以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中ORF 5a被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 5a被失活。
3.条款1或2的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a的失活不影响ORF 5b的表达和/或不影响5b蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 5a的完全或部分缺失，ORF 5a的完全或部分截短，ORF 5a的完全或部分倒置，ORF 5a的完全或部分重新定位，ORF 5a内的核酸插入，ORF 5a内的核酸取代。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被部分缺失、取代或倒置。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被部分缺失。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子被失活。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸2-3)被失活。
9.条款7或条款8的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
10.条款7至9条款8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a的起始密码子(AUG)的失活是缺失。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端截短。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G截短。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
18.条款1至17中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸194的ORF 5a被缺失、取代或倒置。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:35中所示的RNA序列在ORF 5a内被缺失、取代或倒置。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:35中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a内被缺失、取代或倒置。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
26.条款1至25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
27.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
28.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
29.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
30.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
31.条款26的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
32.条款1至26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
33.条款2至32中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
34.条款2至33中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
35.条款34的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
36.条款2至35中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
37.条款2至36中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
38.条款2至37中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
39.条款2至38中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
40.条款2至39中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
41.条款2至40中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
42.条款2至41中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
43.条款2至42中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
44.试剂盒，其包含条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物。
45.根据条款44所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
46.根据条款45所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
47.根据条款46所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
48.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
49.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
50.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物。
51.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
52.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
53.根据条款2至43中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
54.条款48至53中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
55.条款48至54中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
56.条款48至55中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
57.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
58.条款48至56中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
59.条款48至58中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
60.条款48至59中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
61.条款48至60中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
62.条款48至61中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
63.条款48至62中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
64.条款48至63中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
65.条款48至64中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
66.条款48至65中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
67.条款48至66中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
68.条款48至67中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
69.条款48至68中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
70.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
71.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
72.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
73.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
74.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
本文还描述涉及ORF 5b失活的以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中ORF 5b被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 5b被失活。
3.条款1或2的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5b的失活不影响ORF5a的表达和/或不影响5a蛋白的活性。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 5b的部分缺失，ORF 5b的部分截短，ORF 5b的部分倒置，ORF 5b的部分重新定位，ORF 5b内的核酸插入，ORF 5b内的核酸取代。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b被部分缺失。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的起始密码子被失活。
9.条款1至8中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。
10.条款8或条款9的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。
13.条款1至12中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
14.条款1至13中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至90个核苷酸被缺失、取代或倒置。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至90个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至89个核苷酸，或从ORF5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至88个核苷酸被缺失、取代或倒置。
18.条款1至17中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的1至90个核苷酸被缺失、取代或倒置。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸284的ORF 5b被缺失、取代或倒置。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:36中所示的RNA序列在ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:36中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中TRS(转录调节序列)被插入ORF N的5’。
26.条款25的IBV或免疫原性组合物，其中所述TRS具有序列CUUAACAA。
27.条款25或26的IBV或免疫原性组合物，其中插入所述TRS(转录调节序列)，不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。
28.条款1至27中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中包含终止密码子的序列被插入ORF N的TRS的5’。
29.条款28的IBV或免疫原性组合物，其中所述包含终止密码子的序列具有如SEQID NO:37中所示的序列。
30.条款1至29中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
31.条款1至30中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
32.条款1至31中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
33.条款1至32中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
34.条款1至33中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
35.条款34的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
36.条款34的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
37.条款34的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
38.条款34的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
39.条款34的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
40.条款1至39中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
41.条款2至40中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
42.条款2至41中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
43.条款42的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
44.条款2至43中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
45.条款2至44中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
46.条款2至45中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
47.条款2至46中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
48.条款2至47中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
49.条款2至48中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
50.条款2至49中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
51.条款2至50中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
52.试剂盒，其包含条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物。
53.根据条款52所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
54.根据条款53所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
55.根据条款54所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
56.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物。
57.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物。
58.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物。
59.根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
60.根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
61.根据条款2至51中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
62.条款56至61中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
63.条款56至62中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
64.条款56至63中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
65.条款56至64中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
66.条款56至65中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
67.条款56至66中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
68.条款56至67中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
69.条款56至68中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
70.条款56至69中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
71.条款56至70中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
72.条款56至71中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
73.条款56至72中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
74.条款56至73中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
75.条款56至74中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
76.条款56至75中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
77.条款56至76中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
78.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
79.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
80.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
81.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
82.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
本文还描述以下条款：
1.IBV(感染性支气管炎病毒)，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
2.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
3.条款1或2的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性。
4.条款1至3中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b的失活不影响ORF3c的表达和/或其不影响E蛋白的活性。
5.条款1至4中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5b的失活不影响ORFN的表达和/或其不影响N蛋白的活性。
6.条款1至5中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3a的完全或部分缺失和/或ORF 3b的部分缺失和/或ORF 5a的完全或部分缺失和/或ORF 5b的部分缺失，ORF 3a的完全或部分截短和/或ORF 3b的部分截短和/或ORF 5a的完全或部分截短和/或ORF 5b的部分截短，ORF 3a的完全或部分倒置和/或ORF 3b的部分倒置和/或ORF 5a的完全或部分倒置和/或ORF 5b的部分倒置，ORF 3a的完全或部分重新定位和/或ORF 3b的部分重新定位和/或ORF 5a的完全或部分重新定位和/或ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b内的核酸插入，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF5b内的核酸取代。
7.条款1至6中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3a和/或ORF3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分缺失，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分截短，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分倒置，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b内的核酸插入，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF5b内的核酸取代。
8.条款1至7中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF5a和/或ORF 5b的起始密码子被失活。
9.条款8的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
10.条款8的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失、取代或倒置。
11.条款1至10中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失。
12.条款1至11中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)被失活。
13.条款12的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
14.条款12的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失。
15.条款1至14中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性。
16.条款1至15中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端截短。
17.条款1至16中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G截短。
18.条款1至17中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
19.条款1至18中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
20.条款1至19中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
21.条款1至20中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置。
22.条款1至21中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
23.条款1至22中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
24.条款1至23中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸173的ORF 3a被缺失、取代或倒置。
25.条款1至24中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:33中所示的RNA序列在ORF 3a内被缺失、取代或倒置。
26.条款1至25中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:33中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a内被缺失、取代或倒置。
27.条款1至26中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b被完全或部分缺失、取代或倒置。
28.条款1至27中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b被完全或部分缺失。
29.条款1至28中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。
30.条款29的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
31.条款29的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
32.条款1至31中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或其不影响E蛋白的活性。
33.条款1至32中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。
34.条款1至33中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。
35.条款1至34中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
36.条款1至35中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
37.条款1至36中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
38.条款1至37中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
39.条款1至38中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
40.条款1至39中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
41.条款1至40中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348的ORF 3b被缺失、取代或倒置。
42.条款1至41中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:34中所示的RNA序列在ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
43.条款1至42中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:34中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
44.条款1至43中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置。
45.条款1至44中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失。
46.条款1至45中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)被失活。
47.条款46的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
48.条款46的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失。
49.条款1至48中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端截短。
50.条款1至49中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G截短。
51.条款1至50中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
52.条款1至51中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
53.条款1至52中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置。
54.条款1至53中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置。
55.条款1至54中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
56.条款1至55中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置。
57.条款1至56中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸194的ORF 5a被缺失、取代或倒置。
58.条款1至57中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:35中所示的RNA序列在ORF 5a内被缺失、取代或倒置。
59.条款1至58中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:35中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a内被缺失、取代或倒置。
60.条款1至59中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b被完全或部分缺失、取代或倒置。
61.条款1至60中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b被完全或部分缺失。
62.条款1至61中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。
63.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
64.条款62的IBV或免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失。
65.条款1至64中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或其不影响N蛋白的活性。
66.条款1至65中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
67.条款1至66中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。
68.条款1至67中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
69.条款1至68中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
70.条款1至69中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至90个核苷酸被缺失、取代或倒置。
71.条款1至70中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
72.条款1至71中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至90个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至89个核苷酸，或从ORF5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至88个核苷酸被缺失、取代或倒置。
73.条款1至72中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。
74.条款1至73中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少90个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
75.条款1至74中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的1至90个核苷酸被缺失、取代或倒置。
76.条款1至75中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
77.条款1至76中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸284的ORF 5b被缺失、取代或倒置。
78.条款1至77中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:36中所示的RNA序列在ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
79.条款1至78中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与SEQ ID NO:36中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
80.条款1至79中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中TRS(转录调节序列)被插入ORF N的5’。
81.条款80的IBV或免疫原性组合物，其中所述TRS具有序列CUUAACAA。
82.条款80或81的IBV或免疫原性组合物，其中插入所述TRS(转录调节序列)，不影响ORF N的表达和/或不影响N蛋白的活性。
83.条款1至82中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中包含终止密码子的序列被插入ORF N的TRS的5’。
84.条款83的IBV或免疫原性组合物，其中所述包含终止密码子的序列具有如SEQID NO:37中所示的序列。
85.条款1至84中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
86.条款1至85中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
87.条款1至86中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
88.条款1至87中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
89.条款1至88中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
90.条款1至89中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至347个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:1的核苷酸3)起1至346个核苷酸被缺失、取代或倒置。
91.条款1至90中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
92.条款1至91中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至384个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:2的核苷酸3)起1至383个核苷酸被缺失、取代或倒置。
93.条款1至92中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF3a和/或ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
94.条款1至93中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和/或ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
95.条款1至94中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG、SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和/或ORF5b内被缺失、取代或倒置。
96.条款1至95中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和/或ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
97.条款1至96中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至348个核苷酸在ORF 3a和/或ORF3b内被缺失、取代或倒置。
98.条款1至97中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至347个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQID NO:1的核苷酸3)起1至346个核苷酸在ORF 3a和/或ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
99.条款1至98中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至385个核苷酸在ORF 5a和/或ORF5b内被缺失、取代或倒置。
100.条款1至99中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至384个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起1至383个核苷酸在ORF 5a和/或ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
101.条款1至100中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和/或ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
102.条款1至101中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和/或ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
103.条款1至102中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和/或ORF 3b的1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
104.条款1至103中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和/或ORF 5b的1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
105.条款1至104中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和/或ORF 3b的1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
106.条款1至105中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF3a和/或ORF3b的1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
107.条款1至106中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5'-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和/或ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
108.条款1至107中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF3a和/或ORF3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
109.条款1至108中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和/或ORF 5b的1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
110.条款1至109中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF5a和/或ORF5b的1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
111.条款1至110中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和/或ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
112.条款1至111中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF5a和/或ORF5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
113.条款1至112中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或其不影响E蛋白的活性。
114.条款1至113中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性。
115.条款1至114中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或其不影响N蛋白的活性。
116.条款1至115中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b被部分缺失、取代或倒置。
117.条款1至116中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
118.条款1至117中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b和ORF 5b被部分缺失、取代或倒置。
119.条款1至118中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被完全或部分缺失，且ORF 3b被部分缺失。
120.条款1至119中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 5b被部分缺失。
121.条款1至120中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 5a被完全或部分缺失，且ORF 3b和ORF 5b被部分缺失。
122.条款1至121中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子和ORF 3b的起始密码子被失活。
123.条款1至122中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)被失活。
124.条款122或条款123的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
125.条款1至124中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子和ORF 5b的起始密码子被失活。
126.条款1至125中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)被失活。
127.条款125或条款126的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b的起始密码子(AUG)的失活是缺失、取代或倒置。
128.条款1至127中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短。
129.条款1至128中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G截短。
130.条款1至129中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和ORF 5b从ORF5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
131.条款1至130中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a和ORF 5b从ORF5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G截短。
132.条款1至131中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a和ORF 3b从ORF3a的起始密码子(AUG)(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)和ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端截短，且其中ORF 5a和ORF 5b从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)和ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端截短。
133.条款1至132中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
134.条款1至133中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
135.条款1至134中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
136.条款1至135中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的A、U或G起至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
137.条款1至136中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸174-176)的5’-末端起1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
138.条款1至137中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起1至173个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起1至172个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起1至171个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 3b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸174)起1至175个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸175)起1至174个核苷酸，或从ORF 3b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ IDNO:1的核苷酸176)起1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置。
139.条款1至138中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸195-197)的5’-末端起1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
140.条款1至139中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起1至194个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起1至193个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起1至192个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中从ORF 5b的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸195)起1至191个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸196)起1至190个核苷酸，或从ORF 5b的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸197)起1至189个核苷酸被缺失、取代或倒置。
141.条款1至140中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF3b内被缺失、取代或倒置。
142.条款1至141中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的A、U或G起至少174个核苷酸、至少175个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少190个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少340个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
143.条款1至142中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
144.条款1至143中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的A、U或G起至少195个核苷酸、至少196个核苷酸、至少197个核苷酸、至少200个核苷酸、至少210个核苷酸、至少220个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少325个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
145.条款1至144中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端起174至200个核苷酸或174至300个核苷酸或174至348个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
146.条款1至145中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:1的核苷酸1)起174至348个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:1的核苷酸2)起173至347个核苷酸，或从ORF 3a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:1的核苷酸3)起172至346个核苷酸在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
147.条款1至146中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端起195至250个核苷酸或195至300个核苷酸或195至350或195至385个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
148.条款1至147中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子的A(AUG的A，SEQ ID NO:2的核苷酸1)起195至385个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的U(AUG的U，SEQ ID NO:2的核苷酸2)起194至384个核苷酸，或从ORF 5a的起始密码子的G(AUG的G，SEQ ID NO:2的核苷酸3)起193至383个核苷酸在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
149.条款1至148中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸被缺失、取代或倒置。
150.条款1至149中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸被缺失、取代或倒置。
151.条款1至150中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a的1至173个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 3b的1至175个核苷酸被缺失、取代或倒置。
152.条款1至151中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a的1至194个核苷酸被缺失、取代或倒置，且其中ORF 5b的1至191个核苷酸被缺失、取代或倒置。
153.条款1至152中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
154.条款1至153中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF3a和ORF 3b的176至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
155.条款1至154中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
156.条款1至155中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF3a和ORF 3b的至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
157.条款1至156中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
158.条款1至157中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF5a和ORF 5b的195至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
159.条款1至158中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
160.条款1至159中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF5a和ORF 5b的至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
161.条款1至160中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348的ORF 3a和ORF 3b被缺失、取代或倒置。
162.条款1至161中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
163.条款1至162中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与如SEQ ID NO:1中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 3a和ORF 3b内被缺失、取代或倒置。
164.条款1至163中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中从ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385的ORF 5a和ORF 5b被缺失、取代或倒置。
165.条款1至164中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
166.条款1至165中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中与如SEQ ID NO:2中所示的RNA序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的RNA序列在ORF 5a和ORF 5b内被缺失、取代或倒置。
167.条款1至166中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中E蛋白具有基因型QX、Beaudette、H120或H52的氨基酸序列或与上面提及的基因型中的至少一种具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。
168.条款1至167中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中E蛋白具有如对于KM586818(QX)、AJ311317(Beaudette)、FJ807652(H120)或SEQ ID NO:38(H52)所示的氨基酸序列或与上面提及的序列中的至少一种具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
169.条款1至168中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
170.条款1至169中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是基因工程改造的。
171.条款1至170中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是重组IBV。
172.条款1至171中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV具有选自含有以下的毒株列表的基因型：Arkansas(诸如Arkansas 99)、California(诸如California1734/04、California 99)、Connecticut、Delaware(诸如Delaware 98)、Dutch(诸如D207、D212、D274、D3128、D3896、D8880、D1466)、Florida、Georgia(诸如Georgia GA-O8、GA-12、GA-13)、Gray、Holte、Iowa(诸如Iowa 97和Iowa 69)、Italy(诸如Italy 02)、JMK、Maine(诸如Maine209)、Massachusetts(诸如M41、Beaudette、246G、D 580、H52、H120)、Pennsylvania(诸如Pennsylvania 1220/98、Pennsylvania Wolg/98)、Qu、(诸如Qu-mv)、QX(诸如GB341/96)、Q1、SE 17、变体2(诸如IS/1494/06)和4/91(793B)。
173.条款1至172中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是QX、Massachusetts、4/91、Q1或Italy 02基因型的IBV。
174.条款173的IBV或免疫原性组合物，其中所述QX基因型选自含有以下的列表：FR-L1450T-05、FR-L1450L-05、NL-L1449T-04、NL-L1449K-04、IBV/Ck/SP/170/09、IBV/Ck/SP/79/08、IBV/Ck/SP/248/09、HBN、IBVQX、LX4、BJQ、CK/CH/LGD/03、GB341/96。
175.条款173的IBV或免疫原性组合物，其中所述Massachusetts基因型选自含有以下的列表：H120、H52、Spain/98/308、IBMA5-1、SD/97/01、Beaudette、Spain/96/334、M41-M21883。
176.条款173的IBV或免疫原性组合物，其中所述4/91基因型选自含有以下的列表：Spain/98/328、Spain/92/35、IR-3654-VM、FR-CR88061-88、FR-85131-85、UK-1233-95、UK/3/91、Spain/00/336、UK/7/91、4/91-致病的、4/91减毒的、IB4-91。
177.条款173的IBV或免疫原性组合物，其中所述Q1基因型选自含有以下的列表：CK/CH/LDL/98I、CK/CH/LSD/08-10、J2、Q1、AR08ER22、AR08BA21、Chile-295-10。
178.条款173的IBV或免疫原性组合物，其中所述Italy 02基因型选自含有以下的列表：Spain/99/316、Italy-02、UK-L633-04、It-497-02、Spain/05/866、Spain/04/221、Spain/00/337、Spain/155/09、Spain/03/08。
179.条款1至178中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV是Massachusetts基因型毒株H52的IBV。
180.条款1至179中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52基因型是H52U。
181.条款1至180中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52具有如对于EU817497所示的核苷酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
182.条款1至181中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52毒株具有刺突(S1)蛋白，其具有如对于AF352315所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
183.条款1至182中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52毒株具有核衣壳(N)蛋白，其具有如对于AY044185或AF352310所示的氨基酸序列或与上面提及的序列中的至少一种具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
184.条款1至183中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52毒株具有包膜(E)蛋白，其具有如对于AF317210所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
185.条款1至184中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述H52毒株具有膜糖蛋白(M)蛋白，其具有如对于AF286185所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的序列。
186.条款1至185中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述IBV不是N1/88、Q3/88、V18/91或V6/92。
187.条款2至186中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗。
188.条款2至187中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。
189.条款188的免疫原性组合物，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
190.条款2至189中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物在有需要的受试者中有效地治疗和/或预防由IBV引起的临床体征。
191.条款2至190中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对同源攻击进行保护。
192.条款2至191中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物针对用M41攻击进行保护。
193.条款2至192中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
194.条款2至193中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
195.条款2至194中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
196.条款2至195中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
197.条款2至196中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
198.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3a被失活。
199.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 3b被失活。
200.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5a被失活。
201.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中ORF 5b被失活。
202.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。
203.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 5a被失活。
204.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 5b被失活。
205.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b和ORF 5a被失活。
206.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3b和ORF 5b被失活。
207.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。
208.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b和ORF 5a被失活。
209.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b和ORF 5b被失活。
210.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b和ORF 3a被失活。
211.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b和ORF 3b被失活。
212.条款1至197中任一项的IBV或免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b和ORF 5a和ORF 5b被失活。
213.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 3a被失活。
214.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 3b被失活。
215.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 5a被失活。
216.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中ORF 5b被失活。
217.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。
218.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。
219.包含条款1至212中任一项的IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
220.试剂盒，其包含条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物。
221.根据条款220所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类的疾病的说明书。
222.根据条款221所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防家禽的疾病的说明书。
223.根据条款222所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防IB的说明书。
224.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物。
225.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物。
226.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物。
227.根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物，其用于免疫受试者的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
228.根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
229.根据条款2至219中任一项所述的免疫原性组合物，其用于与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述免疫原性组合物。
230.条款224至229中任一项的方法或用途，其中所述受试者是禽类。
231.条款224至230中任一项的方法或用途，其中所述受试者是家禽。
232.条款224至231中任一项的方法或用途，其中所述受试者选自鸡、火鸡、鹌鹑或野鸡。
233.条款224至232中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物施用一次。
234.条款224至232中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物以两个或更多个剂量施用。
235.条款224至234中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
236.条款224至235中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物经由滴眼施用。
237.条款224至236中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含1至10log10EID50的IBV。
238.条款224至237中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至5log10EID50的IBV。
239.条款224至238中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物包含2至4log10EID50的IBV。
240.条款224至239中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一周龄内、在前三日龄内、在前二日龄内或在第一日龄内施用于受试者。
241.条款224至240中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物在第一日龄内施用于受试者。
242.条款224至241中任一项的方法或用途，其中所述方法导致与相同物种的非治疗对照组的受试者相比选自以下的效力参数的改善：纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、减蛋的预防或减少、肾损伤的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
243.条款224至242中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
244.条款224至243中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致肾损伤的预防或减少。
245.条款224至244中任一项的方法或用途，其中与相同物种的非治疗对照组的受试者相比，所述治疗或预防导致减蛋的预防或减少。
246.条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用于治疗用途。
247.条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作免疫原或疫苗。
248.条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物，其用作药物。
249.条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物用于制备药物的用途。
250.条款1至219中任一项的IBV或免疫原性组合物用于治疗和/或预防受试者中的IBV感染的用途。
实施例
下面阐明以下实施例以说明本发明的具体实施方案。这些实施例仅仅是说明性的，并且不应理解为限制本发明的范围或基本原理。
实施例1：质粒的构建
IBV供体质粒的构建
使用毒株IBV-H52(Boehringer Ingelheim,Ingelheim,Germany)。供体质粒的设计主要遵循Kuo等人2000(J.Virol.74:1393-1406)。从随后的5种亚质粒的连接构建供体质粒p-IBV：p-IBV-5、p-IBV-1b、p-IBV-S、p-IBV-SIR和p-IBV-3T(表1)。
表1-亚质粒的概述
质粒 基因 坐标 长度(nt) 3’-末端RES<sup>a</sup>
p-IBV-5 IBV 5’-UTR 1-497 497 BstBI
p-IBV-1b IBV 3’-末端1b,S(ss) 19610-20379 770 XhoI
p-IBV-S IBV S(ec) 20379-23590 3211 StyI
p-IBV-SIR IBV S(tm,en),3a,3b,E,M 23591-25318 1728 EcoRI
p-IBV-3T IBV 5a,5b,N,3’-UTR 25319-27640 2322 MssI,PacI
p-MHV-S MHV S(ec) n.a. 3757 StyI
(ss)＝信号序列；(ec)＝胞外域；(tm)＝跨膜结构域；(en)＝胞内域；n.a.＝不适用；a：BstBI存在于基因1b中，但不完全存在于5’-UTR中；沉默地引入XhoI。
质粒IBV-5包含近全长5’-非翻译区(UTR)。质粒IBV-1b包含pol 1b基因的最后754nt(包括与刺突基因重叠的50nt)，以及刺突基因的前66nt(包括编码刺突蛋白信号序列的核苷酸序列)。质粒IBV-S含有长度为3211nt的刺突基因的近全长胞外域。质粒IBV-SIR包含刺突基因的最后212nt(跨膜和胞内域)、辅助基因3、包膜基因、膜基因和一半基因间区域(IR)。质粒IBV-3T包含IBV基因组的3’-末端区域，包括IR的后半部分、辅助基因5、核衣壳基因、3’-UTR和100nt聚-A序列。
所有质粒连接是天然存在的限制酶切割位点(RES)，除了连接p-IBV-1b和p-IBV-S的XhoI位点，其为沉默地引入的。通过从供体质粒中包括的病毒基因组的其他部分沉默地去除这些RES，使RES是独特的(表2)。
表2-rIBV中引入的沉默突变
此外，通过在辅助基因3和5的上游和下游200nt内的沉默突变引入半独特的RES，其允许它们的操作。最后，在聚-A序列之后包括独特的RES MssI和PacI，其允许通过单一限制酶切割将质粒线性化。所有质粒均由GenScript(Piscataway,NJ,USA)生成，并提供质粒pUC57-simple，一种其中去除多接头的标准克隆质粒。
使用表1中指定的限制酶将所有基因组片段逐步连接至p-IBV-5中，且随后使用HB101感受态细胞转化。最终的质粒由p-IBV-5-1b-S-SIR-3T组成，现在称为p-IBV。在每个步骤通过PCR、限制酶消化和插入物的测序(Macrogen,Seoul,South Korea)检查质粒的组成。
mIBV供体质粒的构建
使用具有XhoI突出端的引物(表3)通过PCR从pTUG/pTUMS扩增来自Vennema等人,1996(EMBO J.15:2020-2028)的编码MHV刺突的胞外域的基因，并将其连接至pJet1.2中，产生p-MHV-S。使用Q5SDM试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,USA)进行定点诱变(SDM)以沉默地去除干扰随后的克隆步骤的EcoRI和XhoI RES(表3)。
表3：用于克隆和SDM的引物序列
A：引物XhoI-t-MHV-S.F01和MHV-S-StyI-XhoI.R01中的XhoI限制酶位点呈斜体；保持MHV刺突基因胞外域序列与IBV刺突基因信号序列同框的额外胸腺嘧啶残基呈粗体。
将MHV刺突的胞外域连接至p-IBV-5-1b中，随后在后续克隆步骤中连接IBV片段SIR和3T，产生p-IBV-5-1b-mhvS-SIR-3T，现在被称为p-mIBV。
具有编码3ab和5ab的基因的双重和四重缺失的Δ质粒的构建
辅助基因3和5被缺失。Δ3ab片段(Δ3ab)的计算机芯片上设计使得刺突基因的终止密码子和3a基因的ATG-密码子之间的1nt重叠区被刺突基因的终止密码子和包膜基因的ATG-密码子之间的重叠区所替代。因此，3b-基因的3’-末端和包膜基因之间的现在非编码20nt重叠区仍然存在。预期位于刺突基因的3’-末端以形成以基因3a开始的亚基因组RNA的TRS(转录调节序列)保持功能，但现在以包膜基因开始。Δ5ab片段(Δ5ab)的设计使得5a基因的ATG-密码子现在是核衣壳基因的ATG-密码子。因此，5b-基因的3’-末端和核衣壳基因之间的现在非编码58nt重叠区仍然存在。位于5b基因3’-末端以形成包含核衣壳基因的亚基因组RNA的TRS与基因5b一起被去除；但预期IR的3’-末端的TRS保持功能，现在用于形成以核衣壳基因开始的亚基因组RNA。
生成从辅助基因3和5周围的半独特RES跨越的DNA片段(其具有如上所述设计的缺失)(Δ3ab和Δ5ab)，并将其通过Genscript连接至pUC57-simple中。在NheI-PmlI双重消化以去除3ab基因之后将Δ3ab连接至p-IBV-5-1b-S-SIR中，随后连接3T区域以形成p-IBV-5-1b-S-SIRΔ3ab-3T，现在被称为p-IBV-Δ3ab。在AfeI-NheI双重消化以去除5ab基因之后将Δ5ab连接至p-IBV-3T中。随后在p-IBV-5-1b-S-SIR或p-IBV-5-1b-S-SIRΔ3ab之后连接片段3TΔ5ab以分别形成p-IBV-5-1b-S-SIR-3TΔ5ab和p-IBV-5-1b-S-SIRΔ3ab-3TΔ5ab，现在被称为p-IBV-Δ5ab和p-IBV-Δ3ab5ab。
N转录物质粒的构建
通过使用引物IBV-H52.N.ATG.FW和IBV-M41.#2.IR.RV(表3)的扩增相应区域的RT-PCR生成包含IBV H52毒株的核衣壳基因和3’-UTR序列的RNA转录质粒。将扩增子连接至pJet1.2中，产生p-IBV-N，其通过测序验证。
实施例2：减毒的IBV的生成
体外转录
使用mMessage mMachine T7试剂盒(Thermo Fisher Scientific的Ambion)从p-IBV、p-mIBV和p-IBV-N合成加帽的跑掉的(run-off)供体转录物。简而言之，p-mIBV是PacI-线性化的，并且p-IBV和p-IBV-N是MssI-线性化的。线性化的质粒DNA用乙醇沉淀。对于p-(m)IBV和p-IBV-N，分别使用1.5和0.5μg线性化的DNA/10ul反应，根据制造商的说明书制备转录反应。在37℃下孵育1小时之后，通过使用凝胶电泳分析1μl反应体积来测试RNA的产生。在孵育总共2小时之后，通过将反应管转移在冰上来终止反应。
靶向RNA重组和mIBV的拯救
通过p-mIBV生成的供体RNA和受体病毒(IBV)RNA之间的靶向RNA重组，IBV刺突基因被IBV基因组中的嵌合MHV-IBV刺突基因取代，基本上如Kuo等人2000(J.Virol.74:1393-1406)之前所述。由于大多数IBV的感染在连续细胞系中是不可能的，所以反而将IBV病毒RNA转染至BHK-21细胞中，已知支持细胞培养适应的IBV毒株Beaudette的复制的细胞系。将20微升IBV-H52病毒RNA与10μl p-mIBV和p-IBV-N的转录物反应混合物一起使用GenePulser电穿孔设备(Bio-Rad)中的850V和25μF的两个脉冲通过电穿孔转染至BHK-21细胞中。将转染的BHK-21细胞接种至LR7细胞的单层上并在37℃下孵育。
在转染后2天，当观察到LR7单层中的合胞体时，收获上清液并通过LR7细胞上的两轮噬斑纯化来纯化病毒。使用表4中指定的引物组，通过RT-PCR和Sanger测序进行候选重组体的基因组的最后三分之一的表征。来自鼠源化IBV(m)IBV毒株#1B3-IIA的储备物在LR7细胞上生长并滴定。
靶向RNA重组和重组IBV的拯救
通过经由p-IBV生成的供体RNA和受体病毒mIBV之间的靶向RNA重组将IBV刺突胞外域引回至mIBV基因组中来生成重组IBV(rIBV-wt)。将LR7细胞用mIBV以0.4的MOI(感染复数)感染4小时。通过使用850V和50μF的两个脉冲将来自p-IBV的加帽的跑掉的(run-off)供体转录物转染至mIBV感染的LR7细胞中。将电穿孔的LR7细胞在温热的DMEM中稀释至2ml，并制备100至10-3的10倍稀释液。将200微升LR7细胞悬浮液在10日龄含胚SPF鸡蛋中进行尿囊内注射，每个稀释度5个蛋。将所述蛋每天两次对光检查，并针对胚胎死亡进行评分。在死亡时或7天后，将蛋转移至4℃，并且在16-24小时后，无菌收集AF用于RT-qPCR，并将每个蛋的绒毛尿囊膜(CAM)固定在10％福尔马林中用于IHC。将来自用最高稀释度的电穿孔LR7细胞接种的卵的AF(其中通过RT-qPCR和IHC检测病毒)在8日龄ECE中进行另外两轮终点稀释。使用表4中指定的引物组，通过RT-PCR和Sanger测序进行候选重组体的基因表征。
表4–引物序列
a引物IBV.F73和mIBV.F47的序列是相同的。b对于引物组[E]和[I]，rIBV delta变体的扩增子长度(其中基因3和/或5缺失)在括号中给出
IBV、mIBV和MHV的免疫荧光双重染色
通过IBV和MHV的免疫荧光双重染色进行mIBV的嵌合性质的生物学表征。将BHK-21和LR7细胞在盖片上繁殖并分别以1.0的MOI接种IBV Beaudette和MHV A59和mIBV#1B3-IIA。在第一轮感染期间，对于IBV、MHV和mIBV，将细胞分别在8、51/4和10hpi之后在室温下用PBS 4％多聚甲醛(Aurion,Wageningen,The Netherlands)固定20分钟。将细胞用含有0.1％Triton X-100的PBS透化，与正常山羊血清(NGS)一起孵育，并与NGS中的两种一抗的组合一起孵育45-60分钟：1:400稀释的兔抗MHV多血清k134[Rottier等人,1981,J.Virol.38:20-26]以及1:400稀释的鸡抗IBV-H120血清或1:200稀释的小鼠MAb Ch/IBV26.1[Thermo Fisher Scientific]。在用IBV毒株HI 20反复免疫SPF鸡之后获得鸡抗IBV-H120血清。将细胞用PBS 0.05％Tween-20洗涤三次，并在黑暗中与NGS中1:200稀释的两种荧光染料标记的二抗的组合一起孵育45分钟：Alexa Fluor 488山羊抗鸡IgY以及AlexaFluor 568山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG以及Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG[Invitrogen，作为Thermo Fisher Scientific的一部分]。将细胞洗涤三次，并将核在黑暗中用PBS中的300nM DAPI染色5-10分钟。将细胞用milliQ洗涤一次，并用Fluorsave(Calbiochem by Merck Millipore,Billerica,MA,USA)封固。使用具有滤光器13、A和N2.1的Olympus BX60显微镜用Leica DFC425C彩色CCD和Leica LAS-AF软件(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)观察载片。
重组IBV变体的卵内生长曲线
将8日龄ECE用103ELD50的IBV-H52、重组IBV野生型(rIBV-wt，该病毒的氨基酸序列与IBV H52的氨基酸序列相同，但核苷酸序列由于基因组序列中的所谓的沉默突变而不同)、rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab或rIBV-Δ3ab5ab接种。将蛋每天两次进行对光检查，并且在孵育0、12、24、36、48、60和72小时之后，将每种病毒毒株的五个预定蛋转移至4℃持续16-24小时，并且无菌收获AF并储存在-80℃下。如果每种病毒毒株的一个或多个胚胎在预定的收集时间点前≥12小时死亡，则该时间点被排除在进一步分析之外。将尿囊液样品在不含Ca和Mg的PBS中稀释10倍，并用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen)并使用HamiltonStarlet移液机器人(Reno,Nevada,USA)添加载体RNA来提取核酸。用改编自Callison等人2006(J.Virol.Methods.138:60-65)的方案，通过RT-qPCR分析提取的核酸的IBV RNA的量。简而言之，应用相同的引物和探针，并使热概况适用于使用ABI TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Thermo Fisher Scientific的Applied Biosystems)和Roche480LightCycler。运行所有核酸样品并使用IBV-H52的10倍稀释系列作为参照一式三份进行分析。
实施例3：疫苗和攻击病毒的制备：
对于动物实验，测试了五种IBV，野生型IBV-H52、rIBV-wt、rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3ab5ab。所有病毒都在8日龄的含胚SPF蛋(GD,Deventer,Netherlands)中繁殖。收获尿囊液，等分并在-80℃下储存直至进一步使用。使用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)10倍稀释的病毒测定病毒滴度。将每种稀释液的五个蛋用100μl接种至8日龄的含胚SPF蛋的尿囊腔中，将蛋密封并在37℃下孵育。接种后前24小时内的胚胎死亡被认为是非特异性的。将蛋每天进行对光检查，直至接种后第7天。显示IBV特异性迹象(胚胎的卷曲和矮化，下榻胚胎、红色胚胎或出血性胚胎的杵状，以及肾脏中可能的白尿酸盐沉积物)的死胚胎和胚胎被认为是阳性的。遵循Reed和Muench[Reed,L.J.,和H.Muench(1938).Asimple method ofestimating fifty percent endpoints.Am J Epidemiol 27:493–497]的方法计算蛋感染剂量50％(EID50)。对于疫苗接种，将病毒在无菌PBS中稀释以获得103EID50/0,1ml的滴度。Massachussetts血清型的攻击病毒M41(获得自GD Deventer,Deventer,The Netherlands)在11日龄的含胚SPF蛋(VALO BioMedia GmbH,Osterholz-Scharmbeck,Germany)中繁殖。接种后24小时收获尿囊液，等分并在-80℃下储存直至进一步使用。如上所述测定病毒滴度，除了使用11日的含胚SPF蛋。对于攻击感染，将IBV毒株M41在无菌PBS中稀释以获得103EID50/0,1ml的目标滴度。
实施例4：Δ3ab、Δ5ab、Δ3ab5ab的疫苗效力数据1
材料和方法：用SPF蛋(GD,Deventer,Netherlands)孵化用于本研究的鸡。将鸡分成七组。第1-6组含有15只鸡，而10只鸡被分配至第7组中。在一日龄时，将鸡转移至具有调节湿度(40-70％)和温度(20-21℃)的具有HEPA过滤供应和废气的隔离器中。根据当地和国家对动物福利建议的要求，将动物保持在圈养条件下。将光照方案调节至每天12小时黑暗和12小时光照。随意提供饲料和水。转移至隔离器之后，将第1-5组的鸡在1日龄时用0,1ml稀释的疫苗(103EID50/0,1ml)经由滴眼途径(0.05ml/眼)接种。基于病毒滴定后获得的滴度确定稀释因子。第1组的鸡用IBV-H52接种，而第2-5组的鸡用rIBV-wt(第2组)、rIBV-Δ3ab(第3组)、rIBV-Δ5ab(第4组)、rIBV-Δ3ab5ab(第5组)接种。第6组的鸡未接种疫苗并充当攻击对照。第7组的鸡充当严格阴性对照(SNC)，并且既没有接种疫苗也没有攻击。在疫苗接种后7天，从第1-6组各取出5只鸡，将其安乐死并从每只鸡取出气管。如上所述，将第1-6组的鸡在疫苗接种后第21天用103-EID50/0.1mL的攻击病毒M41经由滴眼途径进行攻击。在攻击后7天，将所有鸡安乐死并取出气管。将从疫苗接种后第7天和攻击感染后第7天回收的气管切成10个横向切片。将气管切成上部的三个横截面、中间部分的四个横截面和下部的三个横截面。将切片用预热的PBS冲洗，并在取样后不迟于2小时通过低倍放大显微镜检查纤毛活动。对于给定的气管切片，当内环的至少50％显示剧烈的纤毛运动时，纤毛活动被认为是正常的。如果10个环中不少于9个显示正常的纤毛活动，则认为鸡在疫苗接种后第7天不受用于疫苗接种的病毒的影响或不受攻击病毒的影响，因此在攻击感染后7天被保护免于攻击。
结果：在疫苗接种后和感染后，观察各组的鸡的临床体征。疫苗接种后，无一鸡显示可能与疫苗接种相关的疾病体征。疫苗接种后两天时发现第3组的一只鸡死亡。进行的尸检显示卵黄囊感染。在攻击感染后，在疫苗接种第1-5组和SNC第7组中没有观察到临床体征。需要提及的是，从第1组(IBV-H52)，在攻击感染后一天取出一只鸡并进行安乐死。然而，这只鸡在疫苗接种后第18天(其为攻击感染前3天)已经抑郁。尸检揭示轻微的消化观察和超负荷的作物，表明消化系统病症。相比之下，来自攻击的未接种疫苗组的四只鸡在攻击感染后2天和3天之间显示感染性支气管炎典型的呼吸体征。
通过分析纤毛得分评价每种病毒的致病性。当内环的≥50％显示剧烈的纤毛运动时，纤毛活动被定义为对于给定的气管切片没有影响，其得分为2。得分在0-4的标度上，其0为百分之百的纤毛正在运动。1的得分意味着大约75％的气管纤毛显示运动。纤毛运动的50％、25％和<25％分别导致2、3和4的得分。最高的气管损伤得分是40，这是10个得分为4的气管切片的总和。将每只鸡的每个得分的总和取平均值并分析差异。表5中列出不同组的平均气管损伤得分。该研究的结果显示三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)中的每一种都可以安全地施用。这是因为，由于在施用一个剂量的缺失突变体(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)后7天时的平均纤毛停滞得分显著低于(p<0.05)当施用于日龄SPF产蛋鸡时施用重组亲本病毒(rIBV-wt)后7天的平均气管损伤得分。当比较缺失突变体(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)与IBV-H52时，观察到类似的效果。此外，在施用病毒基因组中含有缺失的三种测试项目之一后，没有一只鸡显示IB的显著临床体征或死于可归因于测试项目的原因。总之，与在上述缺失突变体IBV中不含缺失的对照(rIBV-wt或IBV-H52)相比，所有三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)更安全。
表5.在疫苗接种后7天不同组的平均气管损伤得分
组 疫苗 平均得分
1 IBV-H52 26
2 rIBV-wt 40
3 rIBV-Δ3ab 8
4 rIBV-Δ5ab 19
5 rIBV-Δ3abΔ5ab 8
6 NV* 2
*未接种疫苗
此外，分析基因组中含有缺失的重组IBV(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)是否能够使用毒性IBV毒株M41诱导针对攻击感染的保护。靶向攻击剂量为103EID50/鸡，其在100μl稀释的病毒中以50μl通过滴眼法施加至每只眼中。攻击病毒的反滴定揭示，攻击剂量为103.78EID50/100μl，比计划高几乎10倍。
表6.在攻击感染后7天不同组的保护和平均气管损伤得分
*未接种疫苗
**未接种疫苗/未攻击
该测试符合根据欧洲药典EP 0442的所有有效性标准，因为所有受攻击的对照鸡都显示极度的纤毛活动活力的丧失，如40的平均得分所示。此外，在疫苗接种和攻击之间的观察期期间，不超过10％的接种疫苗或对照鸡显示异常的临床体征或死于不能归因于测试疫苗的原因。该研究的结果显示三种测试的在病毒基因组中含有缺失的重组IBV(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)中的每一种的效力，因为接种疫苗的鸡无一在用IBV毒株M41攻击之后显示临床体征或死亡。
对于测试项目rIBV-Δ3ab，9只鸡中的6只(67％)符合EP 0442中所述的关于效力的攻击后测试(10个气管环中的9个显示正常的纤毛活动)。对于测试项目rIBV-Δ5ab，10只鸡中的10只(100％)被保护免于攻击感染，并且对于测试项目rIBV-Δ3abΔ5ab，10只鸡中的3只(30％)被保护免于攻击感染。有趣的是，在用野生型病毒IBV-H52接种疫苗后，9只鸡中的4只(44％)受保护，而10只鸡中的7只(70％)在用rIBV-wt接种疫苗后被保护免于攻击感染。出乎意料的低保护率可能由使用的攻击病毒的相当高滴度引起，因为甚至IBV-H52也不能诱导≥90％的保护。总之，所有三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)可以比对照(rIBV-wt或IBV-H52)更安全地施用，然而，所有突变体至少与对照一样有效。
实施例5
Δ3ab、Δ5ab、Δ3ab5ab的疫苗效力数据2
材料和方法：为了验证实验结果，从开始重复上述实验(实施例1至4)以具有第二独立数据集。根据如上已经描述的方法第二次生成构建体。使用含有相同基因缺失的病毒(Δ3ab、Δ5ab、Δ3ab5ab)和作为对照的非修饰病毒(IBV-H52、rIBV-WT)进行疫苗接种和攻击实验。如实施例4下所述设计实验。为了清楚起见，第1组的鸡用IBV-H52接种，而第2-5组的鸡用rIBV-wt(第2组)、rIBV-Δ3ab(第3组)、rIBV-Δ5ab(第4组)、rIBV-Δ3ab5ab(第5组)接种。第6组的鸡未接种疫苗和攻击并充当攻击对照。第7组的鸡充当严格阴性对照(SNC)，并且既没有接种疫苗也没有攻击。将鸡在1日龄时用103EID50/鸡接种疫苗，并在疫苗接种后21天以103EID50/鸡用毒性IBV毒株M41进行攻击。两种病毒接种均经由滴眼进行。为了分析病毒的安全性，如实施例4所述，在疫苗接种后7天，在第1-5组每组5只鸡和第7组(SNC)的5只鸡中研究气管的纤毛活动。为了研究病毒在攻击感染后保护免于气管损伤的能力，在攻击感染后第7天分析剩余鸡的气管的纤毛活动。如实施例4下所述研究气管的纤毛活动。在实验过程期间，每天观察所有鸡的临床体征。
结果：在任何组中在疫苗接种后和攻击感染后都没有报告与疫苗施用相关的临床观察结果。如实施例4中所述研究气管损伤得分，但有一个例外。在疫苗接种后第7天，由于动物福利原因，将SNC的5只鸡用作阴性对照用于气管纤毛中的损伤的评分。简而言之，气管的最高得分为40，这表明对气管纤毛的最大可能损害。在表7中，显示疫苗接种后7天每个第1组5只鸡的平均损伤得分。所有三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)可以比对照(rIBV-wt或IBV-H52)更安全地施用，如平均损伤评分所示(表7)。因此，上述结果得到验证。当与IBV-H52和rIBV-wt相比时，三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)更安全。
表7.在疫苗接种后7天不同组的平均气管损伤得分
组 疫苗 平均得分
1 IBV-H52 26
2 rIBV-wt 19
3 rIBV-Δ3ab 5
4 rIBV-Δ5ab 15
5 rIBV-ΔabΔ5ab 11
7 SNC* 5
*严格阴性对照
此外，测试含有基因组缺失的重组IBV(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)是否能够使用毒性IBV毒株M41诱导针对攻击感染的保护。靶向攻击剂量为103EID50/鸡，其在100μl稀释的病毒中以50μl通过滴眼法施加至每只眼中。攻击病毒的反滴定揭示，攻击剂量为103.36EID50/100μl，其在预期范围内。
攻击感染是有效的，因为所有受攻击的未接种疫苗的对照鸡(第6组)都显示纤毛活动的活力的极度丧失，如在攻击感染后7天的39的平均得分所示(表8)。此外，在疫苗接种和攻击之间的观察期期间，在鸡中没有观察到归因于疫苗应用的临床体征。
总之，所有三种重组IBV测试项目(rIBV-Δ3ab、rIBV-Δ5ab和rIBV-Δ3abΔ5ab)在作为疫苗应用后比对照(rIBV-wt或IBV-H52)更安全，然而，所有突变体至少与对照一样有效。
表8.在攻击感染后7天不同组的保护和平均气管损伤得分
*未接种疫苗
**严格阴性对照(未接种疫苗/未攻击)
实施例6单一缺失突变体Δ3a、Δ3b、Δ5a、Δ5b的生成和测试
材料和方法：
在基因3a、3b、5a或5b中具有单一缺失的质粒的构建。为了分析单一蛋白3a、3b、5a或5b是否对IBV的毒力具有影响，所述蛋白的表达通过单一缺失突变体失活。为此，合成生成含有3a、3b、5a或5b的缺失的cDNA片段，并通过Genscript连接至pUC57-simple中(pUC57-Δ3a；pUC57-Δ3b,pUC57-Δ5a,pUC57-Δ5b)。用限制酶NheI和PmlI切割质粒pUC57-Δ3a，并将适当的IBV-特异性cDNA序列连接至NheI/PmlI切割的质粒p-IBV-5-1b-S-SIR中(参见表1)以获得p-IBV-5-1b-S-SIR-Δ3a。在下一步中，将质粒p-IBV-3T(也参见表1)用EcoRI切割，并将cDNA-片段连接至EcoRI切割的p-IBV-5-1b-S-SIR-Δ3a中以获得p-IBV-5-lb-S-SIRΔ3a-3T，现在称为p-IBV-Δ3a。采用相同策略用于生成p-IBV-Δ3b，除了使用质粒pUC57-Δ3b的片段。为了生成含有5a或5b缺失的质粒，选择不同的克隆程序。为此，将质粒pUC57-Δ5a用两种限制酶(AfeI、NheI)切割，并将洗脱的cDNA片段连接至适当切割的p-IBV-3T中，以获得p-IBV-Δ5a-3T。将质粒p-IBV-Δ5a-3T用EcoRI切割，并将洗脱的cDNA片段连接至EcoRI-切割的p-IBV-5-1b-S-SIR中以获得靶质粒p-IBV-5-lb-S-SIRΔ5a-3T，现在称为p-IBV-Δ5a。使用相同策略用于生成p-IBV-Δ5b，除了使用质粒pUC57-Δ5b。
在辅助蛋白3a、3b、5a和5b中具有单一缺失的重组IBV的生成。如上所述生成在3a、3b、5a或5b的编码区中含有缺失的IBV。简而言之，如实施例2中所述生成来自线性化质粒p-IBV-N和质粒p-IBV-Δ3a、p-IBV-Δ3b、p-IBV-Δ5a或p-IBV-Δ5b的跑掉转录物。如实施例2中所述进行重组IBV的生成，其使用用mIBV感染的LR7细胞，随后用四种组合的cRNA(cRNA-IBV-N,cRNA-IBV-Δ3a；cRNA-IBV-N,cRNA-IBV-Δ3b；cRNA-IBV-N,cRNA-IBV-Δ5a；cRNA-IBV-N,cRNA-IBV-Δ5b)转染。重组病毒(rIBV-Δ3a、rIBV-Δ3b、rIBV-Δ5a、rIBV-Δ5b)随后如实施例2中所述拯救，并如实施例3中所述繁殖。使用Reed和Muench[Reed,L.J.,和H.Muench(1938).Asimple method of estimating fifty percent endpoints.Am JEpidemiol 27:493–497]，每个稀释度使用5个蛋，在8日龄的含胚SPF蛋中测定最终病毒储备物的以EID50计的病毒滴度。
动物实验：如实施例4中所述进行动物实验。每组15只SPF鸡以103EID50/鸡在100μl的IBV-H52(第1组)、rIBV-wt(第2组)、rIBV-Δ3a(第3组)、rIBV-Δ3b(第4组)、rIBV-Δ5a(第5组)或rIBV-Δ5b(第6组)经由滴眼途径接种疫苗。第7组和第8组的10只鸡未接种疫苗。第8组的鸡充当严格阴性对照(SNC)，其既没有接种疫苗也没有攻击。所有鸡都被保持在隔离器中以省略组之间的病毒传播。在疫苗接种后第7天，如实施例4所述，取出第1-6组的5只鸡和第8组的5只鸡，用于评价气管的纤毛活动。在疫苗接种后第21天，使用103EID50/鸡在100μl毒性IBV毒株M41中用第1-7组的鸡进行攻击感染，而第8组鸡未受攻击。将所有组的剩余鸡进行安乐死，并在攻击感染后7天取出气管用于分析气管的纤毛活动，如实施例4中所述。
在表9中，显示疫苗接种后第7天的纤毛活动的气管得分的平均值。统计分析揭示，实验组3-6(rIBV-Δ3a、rIBV-Δ3b、rIBV-Δ5a、rIBV-Δ5)的损伤得分统计学差异地低于(p<0.05)第2组(rIBV-wt)的得分。当比较缺失突变体(rIBV-Δ3a、rIBV-Δ3b、rIBV-Δ5a、rIBV-Δ5)与IBV-H52时，观察到类似的效果。
表9.在疫苗接种后7天不同组的平均气管损伤得分
组 疫苗 平均得分
1 IBV-H52 25
2 rIBV-wt 36
3 rIBV-Δ3a 18
4 rIBV-Δ3b 18
5 rIBV-Δ5a 16
6 rIBV-Δ5b 23
8 SNC* 4
*严格阴性对照
攻击感染是有效的，因为所有受攻击的对照鸡(第7组)都显示纤毛活动的活力的极度丧失，如在攻击感染后7天的36的平均得分所示(表10)。
用对照IBV(IBV-H52、rIBV-wt)或缺失突变体(rIBV-Δ3a、rIBV-Δ3b、rIBV-Δ5a和rIBV-Δ5b)接种疫苗的鸡被保护免于攻击感染，因为纤毛活动的平均损伤得分显著低于未接种疫苗、但受攻击的鸡的损伤评分(第7组)。总之，在基因3a、3b、5a或5b任一者中含有缺失的IBV在幼鸡中是减毒的，但当用Massachusettes血清型的毒性IBV(此处为毒株M41)攻击时，可以与其亲本(IBV-H52)和重组亲本毒株(rIBV-wt)相当地诱导显著的保护。
表10.在疫苗接种后7天不同组的平均气管损伤得分
组 疫苗 平均得分
1 IBV-H52 1
2 rIBV-wt 2
3 rIBV-Δ3a 9
4 rIBV-Δ3b 5
5 rIBV-Δ5a 11
6 rIBV-Δ5b 8
7 NV* 36
8 SNC(NV/NC)** 0
*未接种疫苗
**严格阴性对照(未接种疫苗/未攻击)
本文公开和要求保护的所有组合物和方法可以根据本公开在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经在优选实施方案方面进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对所述组合物和方法以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，同时可以实现相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修饰被视为在以下权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。
序列表
<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司
<120> 针对感染性支气管炎病毒的疫苗
<130> P01-3188
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 348
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 1
augauccaaa gucccacguc cuucuuaaua guauuaauuu ugcuuuggug uaaacuugua 60
cuaaguuguu uuagagaguu uauuauagcg cuucaacaac uaacacaagu uuuacuccaa 120
auuaucgaua guaauuuaca gucuagacug acccuuuggc acagucuaga cuaauguuaa 180
acuuagaagc aauuauugaa acuggugauc aagugauuca aaaaaucagu uucaauuuac 240
agcauauuuc aaguguauua aacacagaag uauuugaccc cuuugacuau uguuauuaca 300
gaggagguaa uuuuugggaa auagagucag cugaagauug uucaggug 348
<210> 2
<211> 385
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 2
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acucaguuaa gaguauuaga uagguuaauu uuagaucacg gaccaaaacg cgucuuaacg 120
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aagcagagcc uugucccgcg uguaccuccc uaguauucca agggaaaacu ugugaggaac 360
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<210> 3
<211> 34
<212> DNA
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<211> 30
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<211> 21
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<212> DNA
<213> infectious bronchitis virus
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> infectious bronchitis virus
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<212> DNA
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<400> 28
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<210> 29
<211> 174
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 29
augauccaaa gucccacguc cuucuuaaua guauuaauuu ugcuuuggug uaaacuugua 60
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<210> 30
<211> 195
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 30
auguuaaacu uagaagcaau uauugaaacu ggugaucaag ugauucaaaa aaucaguuuc 60
aauuuacagc auauuucaag uguauuaaac acagaaguau uugaccccuu ugacuauugu 120
uauuacagag gagguaauuu uugggaaaua gagucagcug aagauuguuc aggugaugau 180
gaauuuauug aauaa 195
<210> 31
<211> 198
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 31
augaaauggc ugacuaguuu uggaagagca guuauuucuu guuauaaagc ccuacuauua 60
acucaguuaa gaguauuaga uagguuaauu uuagaucacg gaccaaaacg cgucuuaacg 120
ugugguaggc gagugcuuuu aucucaauua gauuuaguuu auagguuggc auauacgccc 180
acccaaucgc ugguauga 198
<210> 32
<211> 249
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 32
augaauaaua guaaagauaa uccuuuucgc ggagcaauag caagaaaagc gcgaauuuau 60
cugagagaag gauuagagug uguuuacuuu cuuaacaaag caggacaagc agagccuugu 120
cccgcgugua ccucccuagu auuccaaggg aaaacuugug aggaacacac agauaauaau 180
aaucuuuugu cauggcgagc gguaagacaa cugggaagac agacgcccca gcgccaguca 240
ucaaacuag 249
<210> 33
<211> 173
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 33
augauccaaa gucccacuag uuucuuaaua guauuaauuu ugcuuuggug uaaacuugua 60
cuaaguuguu uuagagaguu uauuauugcc cuucaacaac uaacacaagu uuuacuccaa 120
auuaucgaua guaauuuaca gucuagacug acccuuuggc acagucuaga cua 173
<210> 34
<211> 175
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 34
auguuaaacu uagaagcaau uauugaaacc ggugaucaag ugauucaaaa aaucaguuuc 60
aauuuacagc auauuucaag uguauuaaac acagaaguau uugaccccuu ugacuauugu 120
uauuacagag gagguaauuu uugggaaaua gagucagcug aagauuguuc aggug 175
<210> 35
<211> 194
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 35
augaaauggc ugacuaguuu uggaagagca guuauuucuu guuauaaagc ccuacuauua 60
acucaguuaa gaguauuaga uagguuaauu uuagaucacg gaccaaagcg agucuuaacg 120
ugugguaggc gagugcuuuu aucucaauua gauuuaguuu auagguuggc auauacgccc 180
acccaaucgc uggu 194
<210> 36
<211> 90
<212> RNA
<213> infectious bronchitis virus
<400> 36
augaauaaua guaaagauaa uccuuuucgc ggagcaauag caagaaaagc gcgaauuuau 60
cugagagaag gauuagagug uguuuacuuu 90
<210> 37
<211> 15
<212> RNA
<213> Artifical RNA
<400> 37
uuaaauaaau aguaa 15
<210> 38
<211> 109
<212> PRT
<213> infectious bronchitis virus
<400> 38
Met Met Asn Leu Leu Asn Lys Ser Leu Glu Glu Asn Gly Ser Phe Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Tyr Ile Phe Val Gly Phe Leu Ala Phe Tyr Leu Leu Gly
20 25 30
Arg Ala Leu Gln Ala Phe Val Gln Ala Ala Asp Ala Cys Cys Leu Phe
35 40 45
Trp Tyr Thr Trp Leu Val Ile Pro Gly Val Lys Gly Thr Ala Phe Val
50 55 60
Tyr Lys Tyr Thr Tyr Gly Arg Lys Leu Asn Asn Ser Glu Leu Glu Ala
65 70 75 80
Val Val Val Asn Glu Phe Pro Lys Asn Gly Trp Asn Asn Lys Asn Pro
85 90 95
Ala Asn Phe Gln Asp Val Gln Arg Asn Lys Leu Tyr Ser
100 105

Claims (18)

1.包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中：
-ORF 3a；和/或
-ORF 3b；和/或
-ORF 5a；和/或
-ORF 5b被失活。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中：
-所述ORF 3a的失活不影响ORF S的表达和/或其不影响S蛋白的活性，
-所述ORF 3b的失活不影响ORF 3c的表达和/或其不影响E蛋白的活性，
-所述ORF 5b的失活不影响ORF N的表达和/或其不影响N蛋白的活性。
3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述失活是ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分缺失，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分截短，ORF3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分倒置，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的部分重新定位，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b内的核酸插入，ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b内的核酸取代。
4.权利要求1至3中任一项的免疫原性组合物，其中ORF 3a和/或ORF 3b和/或ORF 5a和/或ORF 5b的起始密码子被失活。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述起始密码子的失活是缺失、取代或倒置。
6.权利要求1至5中任一项的免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5’-末端和ORF 3c的起始密码子的5’-末端间，ORF 3a和/或ORF 3b的1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置，或其中在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和/或ORF 3b的1至348个核苷酸被缺失、取代或倒置。
7.权利要求1至6中任一项的免疫原性组合物，其中在ORF 3a的起始密码子的5'-末端和ORF 3c的起始密码子的5'-末端间，或在ORF 3a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:1的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ ID NO:1的核苷酸348间，ORF 3a和/或ORF 3b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少176个核苷酸、至少180个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少340个核苷酸被缺失、取代或倒置。
8.权利要求1至7中任一项的免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，ORF 5a和/或ORF 5b的1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置，或其中在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5’-末端至SEQ IDNO:2的核苷酸385间，ORF 5a和/或ORF 5b的1至385个核苷酸被缺失、取代或倒置。
9.权利要求1至8中任一项的免疫原性组合物，其中在ORF 5a的起始密码子的5’-末端和ORF N的起始密码子的5’-末端间，或在ORF 5a的起始密码子(AUG，SEQ ID NO:2的核苷酸1-3)的5'-末端至SEQ ID NO:2的核苷酸385间，ORF 5a和ORF 5b的至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少125个核苷酸、至少150个核苷酸、至少170个核苷酸、至少190个核苷酸、至少195个核苷酸、至少200个核苷酸、至少225个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少380个核苷酸被缺失、取代或倒置。
10.权利要求1至9中任一项的免疫原性组合物，其中所述IBV是减毒的。
11.权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物，其中所述IBV是重组的。
12.权利要求1至11中任一项的包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b被失活。
13.权利要求1至11中任一项的包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 5a和ORF 5b被失活。
14.权利要求1至11中任一项的包含IBV(感染性支气管炎病毒)的免疫原性组合物，其中所述ORF 3a和ORF 3b以及ORF 5a和ORF 5b被失活。
15.用于免疫受试者的方法，其包括向此类受试者施用根据权利要求1至14中任一项所述的免疫原性组合物。
16.治疗或预防有需要的受试者中由IBV引起的临床体征的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的免疫原性组合物。
17.与相同物种的非免疫对照组的受试者相比减少有需要的受试者中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的免疫原性组合物。
18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述免疫原性组合物皮下、肌内、口服、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼施用。
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