CN117286227A - 一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，包括将PCR扩增后的文库进行qubit上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；按照预先设置的稀释倍数换算公式，将qubit浓度换算成qPCR浓度，进行混样稀释，后进入下一步的模板制备。本发明提出的改进Qubit能够进行精确定量，指导合理安排样本的上样量和多样品混样比例；定量混样方法能够改善二代测序混样均匀性，能准确均一化文库的浓度，产出数据量更为均一，使数据利用率更高，获取高数据量的测序数据。复测率降低，降低成本。
Description
技术领域
本申请属于基因检测定量技术领域，具体涉及一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法。
背景技术
高通量测序文库（NGS文库）制备的目的是，在片段化后的待测核酸片段上连接特异性的接头序列，让它们能够在高通量测序平台上进行测序。NGS文库的质量对于高通量测序（NGS）产出的数据质量至关重要。过低估计文库的大小，容易导致多重模板太多，数据质量不高；过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或高估文库的量都会影响测序质量与效果。因此，NGS文库在上机测序之前，需要对其浓度进行精准测定，以便上机测序时能够调整得到合适的上机测序浓度，最终获得最优的测序数据结果。
传统的高通量测序流程中使用多种文库定量方法，例如qPCR定量法、分光光度计（如NanoDrop）、荧光染料法（Qubit）或电泳（Bioanalyzer），广泛采用的是Qubit®荧光定量方法和qPCR定量方法。
Qubit®荧光定量方法是利用Qubit®荧光定量仪，以及配套的Qubit试剂，其原理为特定荧光染料选择性地特异性靶分子结合，发射荧光信号，随后被定量仪检测。双链DNA定量的具体做法为，首先将Qubit dsDNA检测试剂盒中浓缩的检测试剂和稀释缓冲液按照1:199的比例配置混合液，随后取DNA文库2μL，加入到198μL混合液中，震荡混匀，上机定量。然而该方法具有选择局限性，Qubit dsDNA检测试剂对双链DNA（dsDNA）具有高度选择性。待检测样本在提取建库的过程中，难免会有一些特殊的处理方式来达到自己的实验目的。然而该处理方式极有可能会导致建出的DNA文库存在特殊结构，该特殊结构会严重影响QubitdsDNA对二代测序文库的准确定量，在实践过程中，经常会发生根据qubit定量进行浓度测定后，上机测序，最终获得的测序数据质量参差不齐，均一性变差。并且标本的上样量受限制。
NGS文库QPCR法定量检测，是使用特异性引物仅扩增样品中两端接头连接完整的文库分子，即可以进行测序的文库，可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，避免非特异性检测，测定值与真实值最接近，并且检测灵敏度最高，非常适合低浓度文库（PCR-free文库）的检测，因此，qPCR是DNA文库定量的金标准，是目前行业内进行文库定量的首选方法。其定量检测的基本原理是，将检测待测NGS文库的检测结果，与标准品制备的标准曲线进行比较，通过标准曲线进行相对定量，然后再根据待测NGS文库的片段与标准品片段的大小差异进行定量结果的校正。理论上，现有的NGS文库染料法QPCR定量检测，能够比较准确的定量NGS文库，混样比例均一、稳定，为上机测序提供准确的浓度信息。但是qPCR定量却延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性降低，而且qPCR对人员操作的稳定性、熟练性要求过高，容易出现人为失误。
基于以上两种定量方法学的缺陷，我们将两种方法通过公式及实验经验值进行了优化，提出了本发明。
发明内容
针对现有文库定量技术中qPCR定量虽然比较准确的定量NGS文库，混样比例均一、稳定。但是，延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性降低，而且qPCR对人员操作的稳定性、熟练性要求过高，容易出现人为失误。Qubit定量文库，时间短，操作简单方便，但是特异性较差等问题。本申请将两种方法通过公式及实验经验值进行了优化。
具体的，本申请提供一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，包括：
将PCR扩增后的文库进行qubit上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；
按照预先设置的稀释倍数换算公式，将qubit浓度换算成qPCR浓度，进行混样稀释，后进入下一步的模板制备；
所述换算公式为；
其中，DNA文库浓度为qubit测定得到的浓度值，单位为ng/μL；660（Da）为DNA一个碱基对的相对分子质量；pM为换算成qPCR后的浓度值，单位为pmol/ul。
作为本申请的进一步说明，所述qubit上机定量浓度测定过程具体为：将PCR扩增后的文库按照一张芯片的上样标本进行分组，每一组专人取DNA文库2μL，加入到198μL混合液中，震荡混匀，避光2分钟后，进行qubit上机定量浓度测定。
作为本申请的进一步说明，所述经验常数取值为3。
作为本申请的进一步说明，所述DNA文库的平均长度=DNA片段长度+已知接头长度；根据测序可以得出，所述DNA片段长度为135，所述已知接头长度为 100，故所述DNA文库的平均长度为235。
作为本申请的进一步说明，所述方法还包括：
根据每个样本的上机混合量、换算得到的qPCR浓度、预设稀释倍数及上机调整系数得到每个样本的混合体积；
对所述混合体积求和得到所有样本的总体积，将每个样本的上机混合量求和得到上机混合总量，根据所述上机混合总量和所述总体积求得样本的上机平均浓度；
将所述上机平均浓度稀释至预设经验上机浓度，进行模板制备，然后进行上机测序。
作为本申请的进一步说明，所述每个样本的混合体积计算公式为：
。
作为本申请的进一步说明，所述上机平均浓度的计算公式为：。
作为本申请的进一步说明，所述经验上机浓度取60 pmol/L。
与现有技术相比，本申请具有以下有益的技术效果：
本发明提出的改进Qubit能够进行精确定量，指导合理安排样本的上样量和多样品混样比例；定量混样方法能够改善二代测序混样均匀性，能准确均一化文库的浓度，产出数据量更为均一，使数据利用率更高，获取高数据量的测序数据。复测率降低，降低成本。
本发明采用Qubit dsDNA定量操作方法简单，节省时间，提高了劳动效率，同时将其测量浓度换算成QPCR浓度后，使数据利用率更高，提高了上样量。
附图说明
图1为本发明实施例提供的现有文库定量混样方法QPCR检测的时效性效果图。
图2（a）为本发明实施例提供的优化前Qubit方法的pooling混样文库表；图2（b）为本发明实施例提供的Qubit与QPCR定量换算后的pooling混样文库表。
图3（a）为本发明实施例提供的优化前Qubit定量的文库上机得到的DNA Reads数；图3（b）为本发明实施例提供的Qubit与QPCR定量换算后的文库上机得到的DNA Reads数。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本发明要解决的核心问题是寻求一种使得qubit文库定量的准确性更高并能够改善二代测序混样均匀性的定量混样方法，进而获得高质量的测序结果。为解决上述问题，本发明进行实验优化开发，通过使用qPCR以及QubitdsDNA检测试剂盒进行大量的同一批样本浓度定量，计算出二者之间的关系系数，然后根据经验公式将qubit浓度进行换算成qPCR浓度后进行混样稀释，并且由qubit的一步稀释改成qPCR两步稀释，最终发现，处理后的定量结果能够显著改善文库定量的均一性。提高了测序质量，获得了最优的测序结果。将样本的复测率由之前的10%降低到5%以下。同时检测时间变短，对操作人员的技术水平要求相对较低，操作极其简单。
具体的，本申请实施例提供了一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，包括如下步骤：
步骤1：将PCR扩增后的文库进行qubit上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；
步骤2：按照预先设置的稀释倍数换算公式，将qubit浓度换算成qPCR浓度，进行混样稀释；
步骤3：根据每个样本的上机混合量、换算得到的qPCR浓度、预设稀释倍数及上机调整系数得到每个样本的混合体积；
步骤4：对所述混合体积求和得到所有样本的总体积，将每个样本的上机混合量求和得到上机混合总量，根据所述上机混合总量和所述总体积求得样本的上机平均浓度；
步骤5：将所述上机平均浓度稀释至预设经验上机浓度，进行模板制备，然后进行上机测序。
上述换算公式为；
其中，DNA文库浓度为qubit测定得到的浓度值，单位为ng/μL；660（Da）为DNA一个碱基对的相对分子质量；pM为换算成qPCR后的浓度值，单位为pmol/ul；根据实验室多次计算与实验后，将经验常数取值为3，能够保证最终结果的准确性。
进一步的，所述DNA文库的平均长度=DNA片段长度+已知接头长度；根据测序可以得出，所述DNA片段长度为135，所述已知接头长度为 100，故所述DNA文库的平均长度为235。
具体的，所述qubit上机定量浓度测定过程具体为：将PCR扩增后的文库按照一张芯片的上样标本进行分组，每一组专人取DNA文库2μL，加入到198μL混合液中，震荡混匀，避光2分钟后，进行qubit上机定量浓度测定。
上述每个样本的混合体积计算公式为：
；
由于每一个barcode（标签）碱基数量不同，故需要设置不同的调整系数；以取文库DNA溶液原液2μL的量和预设稀释倍数（eg：2、3、4、5等）来确定稀释补水量的取样体积。
上述上机平均浓度的计算公式为：；上述经验上机浓度取为60pmol/L。
实施例1
本发明所使用实验材料：
Qubit dsDNA检测试剂盒，又称Qubit双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒，购自Invitrogen TM公司，货号Q32854;0.5m1PCR薄壁管购自Axygen公司，型号MCT-060-C;0.2m1PCR八连排管购自Axygen公司，型号PCR-05-C等。QPCR标准品及试剂来自于高通量测序试剂盒自带。
本实施例依据博奥测序平台分析原始文库及原始数据，来设计本发明技术方案。
1、现有文库定量混样方法的问题分析
博奥测序平台配套的文库定量试剂全部都是QPCR方法，延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性如图1所示。降低为了缓解人手少，工作量大的压力，本发明团队尝试使用Qubit的方法进行文库定量。在临床使用qubit定量方法进行文库浓度定量混样，上机测序后，发现同一芯片的文库产出数据量的均一性极度不好，使得有的文库数据量产出过多，而有的文库产出数据量产出过低从而导致重测率过高，增加了成本。所以本发明将寻找一种方法平衡QPCR实验过程久及消耗人力，及qubit的测量浓度特异性差，数据量不均匀，标本上样量少导致实验成本高的问题。
2、数据产出不均匀定量分析
使用文库定量方法金标准QPCR法，对用qubit定量的同一批文库进行QPCR定量分析，二者之间的数据存在一定的相关性， Qubit定量结果与QPCR的相关性。
本实验对文库使用Qubit测定dsDNA的浓度，分析Qubit浓度与QPCR定量结果间的相关性。具体结果如下，dsDNA的定量结果与QPCR的定量结果有极高的相关性；如图2所示；
3、优化后的实验流程在胎儿游离DNA文库定量中的应用
一、待测文库DNA的制备
提取22例血浆游离DNA样本，利用21三体18三体13三体检测（半导体测序法）进行文库构建，利用Qubit4.0检测文库的浓度。
二、稀释文库DNA
将得到的文库DNA按照优化后的pooling混样文库表定样上机浓度为60umol/L进行模板制备。
三、上机检测
将得到的文库DNA按照Qubit定量方法稀释后进行均匀混合后上机测序，得到的Reads数见图3。根据图3显示，Qubit与QPCR定量换算后的文库上机得到的DNA Reads数比优化前得到的更均匀，各个样本均在4M-6M之间，Unique Reads都能达到3.0M，可以满足给出报告的要求；而优化前利用Qubit方法定量得到每个样本的reads:数据量不均一相差很大。
需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，其特征在于，包括：
将PCR扩增后的文库进行qubit上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；
按照预先设置的稀释倍数换算公式，将qubit浓度换算成qPCR浓度，进行混样稀释，后进入下一步的模板制备；
所述换算公式为；
其中，DNA文库浓度为qubit测定得到的浓度值，单位为ng/μL；660（Da）为DNA一个碱基对的相对分子质量；pM为换算成qPCR后的浓度值，单位为pmol/ul。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述qubit上机定量浓度测定过程具体为：将PCR扩增后的文库按照一张芯片的上样标本进行分组，每一组专人取DNA文库2μL，加入到198μL混合液中，震荡混匀，避光2分钟后，进行qubit上机定量浓度测定。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经验常数取值为3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA文库的平均长度=DNA片段长度+已知接头长度；根据测序可以得出，所述DNA片段长度为135，所述已知接头长度为 100，故所述DNA文库的平均长度为235。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据每个样本的上机混合量、换算得到的qPCR浓度、预设稀释倍数及上机调整系数得到每个样本的混合体积；
对所述混合体积求和得到所有样本的总体积，将每个样本的上机混合量求和得到上机混合总量，根据所述上机混合总量和所述总体积求得样本的上机平均浓度；
将所述上机平均浓度稀释至预设经验上机浓度，进行模板制备，然后进行上机测序。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述每个样本的混合体积计算公式为：。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上机平均浓度的计算公式为：。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经验上机浓度取60 pmol/L。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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