CN115856060B - 一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于寡核苷酸类药物蛋白结合率的检测领域，具体公开了一种基于电泳迁移率的变化，对比电泳条带的灰度值来检测寡核酸类药物与人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法；具体包括以下步骤：1）药物样品的制备、2）血浆样品T的制备、3）游离样品F的制备、4）电泳、5）数据分析；本发明方法操作方便快捷，能在较短的时间内检测出寡核苷酸类药物的血浆蛋白结合率，且不需要昂贵的仪器设备；检测灵敏度高，根据实验要求最低可以检测出的浓度为0.5µg/mL；准确度高，较传统方法受干扰因素少且非特异性吸附少。本发明对于寡核苷酸类药物的药性评价与检测具有较高的参考价值，方法价格低廉，适合推广应用。

Description

一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结 合率的方法

技术领域

本发明属于寡核苷酸类药物蛋白结合率检测领域，具体公开了一种基于电泳迁移率的变化，对比电泳条带的灰度值来检测寡核酸类药物与人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法。

背景技术

血浆蛋白结合(PPB)是影响药物药代动力学和药效学的重要因素，通常是在药物开发期间进行研究。PPB可影响药物的处置（例如：组织分布、清除率、生物半衰期等），由于只有未结合的药物才能进入作用部位并发挥其药理作用，因此在相关生理条件下表征寡核苷酸治疗药物PPB的程度和性质非常重要。

影响PPB测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等，需根据化合物的特征，结合研究的实际目的，选择合适的测定方法反应真实的化合物特性。目前常用的检测方法有：平衡透析法、超滤法、超速离心法等。由于血浆蛋白中分子大小、形状、质量和密度的不同，影响了寡合苷酸的沉降速度（超速离心）和多孔膜的排阻限度（超滤和平衡透析）。因此这些方法在检测过程中存在初始平衡状态的改变、非特异性结合、体积变换、和蛋白渗漏等问题，会大大影响检测的准确度，因此有必要建立一种快速且准确检测寡核苷酸类药物与人体血浆蛋白结合率的方法。凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA/RNA结合序列相互作用的技术，基于蛋白结合核酸在电泳期间通过天然凝胶培养基迁移时的迁移率变化可用于定性和定量分析。我们根据同浓度游离态药品和血浆中游离态药物的灰度值之比来确定其蛋白结合率。目前尚未有将EMSA法应用于检测寡核苷酸类药物在人体及实验动物中的血浆蛋白结合率的实验。

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开了一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法。

本发明的技术方案如下：

一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，包括以下步骤：

1）药物样品的制备：将待检测的寡核苷酸类药物制备成具有浓度梯度的多个药物样品；

2）血浆样品T的制备：将药物样品按照一定的体积比与血浆混合，混匀后水浴孵育，得血浆样品T；

3）游离样品F的制备：将药物样品按照一定的体积比与缓冲液混合，混匀后水浴孵育，得游离样品F；

4）电泳：制备12%~16%Tris-甘氨酸Page胶，将血浆样品T加入DNA上样缓冲液，将游离样品F加入蛋白上样缓冲液，分别混匀后上样进行跑胶；

5）数据分析：跑胶完成后将Page胶放在GelstainRed核酸染料中浸泡，再用成像系统进行成像，最后将图片进行处理与分析，根据相同浓度游离态药品和血浆中游离态药物的灰度值之比来确定其蛋白结合率。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，所述步骤1）中的浓度梯度中的梯度数量大于等于3。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，所述步骤1）中的浓度梯度范围为0.5μg/mL-50μg/mL。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，步骤2）中，药物样品按照1:19-49的体积比与血浆混合，恒温孵育温度为35-40℃，孵育20-40min。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，步骤3）中，药物样品按照1:19-49体积比与缓冲液PBS混合，恒温孵育温度为35-40℃，孵育20-40min。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，步骤4）中，所述Tris-甘氨酸Page胶的浓度为12%-16%，并使用Tris-甘氨酸-天然电泳缓冲液。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，步骤4）中，Page胶放在GelstainRed核酸染料中浸泡30-60min。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，所述寡核苷酸类药物为Oxiumo(Alnylam公司制造并上市的产品)、Inotersen(Ionis公司制造并上市的产品)。

进一步的，上述一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，包括以下步骤：

1）药物样品的制备：将待检测的寡核苷酸类药物制备成具有1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL浓度的寡核苷酸类药物样品；

2）血浆样品T的制备：将不同浓度的寡核苷酸类药物分别取10μL与190μL血浆混合，涡旋混匀，置于37ºC水浴孵育30min得血浆样品T；

3）游离样品F的制备：将不同浓度的寡核苷酸类药物分别取10μL与1×PBS溶液190μL，涡旋混匀，置于37ºC水浴孵育30min得游离样品F；

4）电泳：血浆样品T取50μL加入10μL6×DNA上样缓冲液，涡旋混匀，游离样品F取40μL加入10μL5×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，然后取10μLT样品和12μLF样品分别加入12%~16%Tris-甘氨酸Page胶的胶孔内，再加入Tris-甘氨酸-天然电泳缓冲液至外槽的1/3处；

5）数据分析：设置电压为120V，条带跑至胶面2/3处停止，将Page胶放在GelstainRed核酸染料中浸泡40min，再进行成像，最后将图片用ImageJ进行处理与分析，根据相同浓度游离态药品和血浆中游离态药物的灰度值之比来确定其蛋白结合率，其公式如下所示：

血浆蛋白结合率（%）=（1-GS_F/GS_T）×100%；

GS_F：血浆中样品游离态的灰度值；

GS_T：参比样品的灰度值；

灰度值用待测条带积分后的峰面积表示。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果:

本发明公开了一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法，克服了传统检测方法中步骤繁琐，检测时间长，准确性受环境影响大的缺陷，本发明方法操作方便快捷，能在较短的时间内检测出检测寡核苷酸类药物的血浆蛋白结合率，且不需要昂贵的仪器设备；检测灵敏度高，根据实验要求最低可以检测出的浓度为0.5µg/mL；准确度高，较传统方法受干扰因素少且非特异性吸附少。本发明对于寡核苷酸类药物的药效评价与检测具有较高的参考价值，方法价格低廉，适合推广应用。

附图说明

图1为取高、中、低浓度（50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL）的寡核苷酸药物在1×PBS、血浆及空白血浆（不含寡核苷酸药物）的电泳图（每个样品跑两条平行带），其中条带a1、a2为50μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；b1、b2为5μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；c1、c2为0.5μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；d1、d2为50μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；e1、e2为5μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；f1、f2为0.5μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；g1、g2为不含寡核苷酸药物的空白血浆的电泳条带；

图2为图1中相应的电泳条带（a1-f2），经过ImageJ软件对条带的灰度值进行计算后，转换为相应的峰面积图，经过积分后能够得到相应的条带的寡核苷酸药物相对浓度。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

EMSA法检测人体血浆蛋白结合率的准备：

1.Page胶：12%~16%Tris-甘氨酸天然胶；

2.电泳缓冲液：1×Tris-甘氨酸-天然电泳缓冲液；

3.上样缓冲液：6×DNA上样缓冲液、5×蛋白上样缓冲液；

4.显色剂：GelstainRed核酸染料；

用上述反应体系按以下方法对核苷酸类药品和人体血浆的蛋白结合率进行检测。

1.样品预处理：

1）配制成2mg/mL的Oxiumo药品（Alnylam公司制造并上市的产品）储备液；

2）依次将储备液稀释成高中低浓度工作液（1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL）；

3）取10μL高中低浓度工作液分别加入190μL1×PBS溶液，制成游离态样品。取10μL高中低浓度工作液分别加入190μL血浆，制成血浆样品。

4）将游离态样品、血浆样品置于恒温水浴摇床，37℃水浴30min。

2.样品添加：

1）制备12%~16%Tris-甘氨酸Page胶，再加入Tris-甘氨酸-天然电泳缓冲液至外槽的1/3处；

2）取50μL游离态样品加入10μL6×DNA上样缓冲液，涡旋混匀。取40μL血浆样品加入10μL5×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀。

3）将10μL混合后游离态样品和12μL混匀后血浆样品分别加入Page胶的胶孔内。

3.跑胶：设置电压为120V，条带跑至胶面2/3处停止。

4.染色：将Page胶放在GelstainRed核酸染料中浸泡40min，最后成像，如附图1中的条带a1-g2所示，每个样品跑两条平行带，其中条带a1、a2为50μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；b1、b2为5μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；c1、c2为0.5μg/mL寡核苷酸药物在1×PBS中的电泳条带；d1、d2为50μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；e1、e2为5μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；f1、f2为0.5μg/mL寡核苷酸药物在血浆中的电泳条带；g1、g2为不含寡核苷酸药物的空白血浆的电泳条带。

如图1，随着寡核苷酸药物浓度（50μg/mL-0.5μg/mL）的下降，条带亮度也随之减小（如c1和c2亮度低于b1和b2，b1和b2亮度低于a1和a2；f1和f2亮度低于e1和e2，e1和e2亮度低于d1和d2；空白血浆g1和g2无条带）；相同浓度的寡核苷酸药物在1×PBS、血浆中的条带亮度不同，参比样品(即在PBS中的药物)亮度大于在血浆中的游离态药物亮度，如a1和a2亮度大于d1和d2，b1和b2亮度大于e1和e2，c1和c2亮度大于fi和f2。

5.结果分析：运用ImageJ软件对条带的灰度值进行检测，灰度值即为各个条带的峰面积，如图2中a1-f2所示，对比相同浓度处游离态样品（即参比样品）与血浆样品中游离态的灰度值，比如（a1和d1相比，b1和e1相比、c1和f1相比，以此类推）根据公式：血浆蛋白结合率（%）=（1-GS_F/GS_T）×100%（GS_F：血浆中样品游离态的灰度值；GS_T：参比样品的灰度值），即可知道该浓度药品的血浆蛋白结合率。

6.数据结果：经过检测该药物在高、中、低浓度（50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL）与人体血浆的蛋白结合率分别为26.4%、37.4%、70.1%。同时我们还测定了不同种属的血浆蛋白结合率。药品在高、中、低浓度（50μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL）与CD-1小鼠血浆和食蟹猴血浆中的蛋白结合率分别为26.7%、40.5%、68.9%和24.1%、38.1%、67.8%。

由以上实施例可知，本发明所述的方法克服了传统检测方法中步骤繁琐，检测时间长，准确性受环境影响大的缺陷，具有设备要求低，实验方便快捷、成本低廉的优点；同时本发明所述的方法在能够方便的对比分析各批次寡核苷酸类药物的蛋白结合率，能够满足药物研发阶段对于核苷类药物蛋白结合率的进行批量检测和比较的需求。

发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种快速检测寡核苷酸类药物和人体及实验动物血浆蛋白结合率的方法在核苷类药物蛋白结合率批量检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

1）药物样品的制备：将待检测的寡核苷酸类药物制备成具有1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL浓度的寡核苷酸类药物样品；所述寡核苷酸类药物为小干扰RNA药物Oxiumo；

2）血浆样品T的制备：将不同浓度的寡核苷酸类药物分别取10μL与190μL血浆混合，涡旋混匀，置于37ºC水浴孵育30min得血浆样品T；所述血浆来自人类、CD-1小鼠、食蟹猴中的一种；

3）游离样品F的制备：将不同浓度的寡核苷酸类药物分别取10μL与1×PBS溶液190μL，涡旋混匀，置于37ºC水浴孵育30min得游离样品F；

4）电泳：血浆样品T取50μL加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，游离样品F取40μL加入10μL 6×DNA上样缓冲液，涡旋混匀，然后取10μL T样品和12μL F样品分别加入12%~16%Tris-甘氨酸Page胶的胶孔内，再加入Tris-甘氨酸-天然电泳缓冲液至外槽的1/3处；

5）数据分析：设置电压为120V，条带跑至胶面2/3处停止，将Page胶放在GelstainRed核酸染料中浸泡40min，再进行成像，最后将图片用ImageJ或Protocal或Photoshop灰度值检测软件进行处理与分析，根据相同浓度参比药物和血浆中游离态药物的灰度值之比来确定其蛋白结合率，其公式如下所示：

血浆蛋白结合率（%）=（1-GS_F/GS_T）×100%；

GS_F：血浆样品中游离态的灰度值；

GS_T：参比样品的灰度值；

灰度值用待测条带积分后的峰面积表示；

寡核苷酸类药物最低检出浓度0.5µg/mL。