JP6442538B2 - 核酸をリアルタイムで定量化する方法 - Google Patents
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Description
本開示は、定量リアルタイムＰＣＲを用いた核酸の定量化の分野に関連する。
最近、核酸を定量化する方法が、分子生物学の多くの分野、特に分子診断学の分野で重要になっている。定量ＰＣＲ（以下、ｑＰＣＲ）は、遺伝子発現レベルを定量化する最も感度の高い方法の一つとされており、選択遺伝子の発現ファイルを検出及び定量化する一般的なツールとなっている。
今までのところ、絶対定量化が、定量増幅を行うのに用いられるもっとも一般的なアプローチとなっている。つまり、各ｑＰＣＲについて、同一の増幅反応における同一の核酸配列の既知の濃度を用いた複数の段階希釈（serial-diluted）がされる標準制御（standard curve）を増幅する必要がある。標準曲線が蛍光信号分布により生成され、参照としての機能を果たす。その後、未知のサンプルの濃度が、その標準曲線を用いた補間演算により取得される。
しかし、その方法には複数の欠点及び制限がある。第一に、使用する試薬の量が標準曲線を構築するのに膨大となる。これは、未知のサンプルの量に関わらず、各ｑＰＣＲについての標準曲線を取得する必要があるためである。補間演算が未知のサンプルのコピー数（copy number）を取得するのを可能にするべく、標準曲線のサイクル閾値又はＣｔ値が必要となるため、これは重要である。試薬及び制御の膨大な消費は、各ｑＰＣＲの実行による検査費用の増大となり、コストの増大につながる。
第二に、絶対定量化は、補間演算のためのインデックスとして、各標準制御のＣｔ値を用いて、未知のサンプルのコピー数を取得する。しかし、Ｃｔ値の定義は製造会社次第であり、製造会社も異なる調整方法を行っている。加えて、Ｃｔ値の決定に影響を与える外部要素が多くある。たとえ、ｑＰＣＲが、固定濃度、同一の増幅条件で同一の器具を用いて同一の核酸配列に実行されたとしても、依然として、異なるオペレータ又は違った増幅反復によって得られるＣｔ値にばらつきがあるという結果が示唆される。つまり、任意の未知のサンプルの正しいコピー数の計算のためには、段階希釈がされる標準制御は、外部変動を一定に保ち、未知のサンプルとともに（along with）増幅されなければならない。
第三に、同一のｑＰＣＲ検査においても、依然として、バックグラウンド値（background value）及び全ての操作ばらつきが無視されると、試薬の濃度がＣｔ値に影響を与える。このようなばらつきは見過ごすことができない。例えば、増幅が可変のプライマー濃度（primer concentration）についてのみ行われる場合、異なるプライマー濃度を有する各サンプルの一定標準曲線の調整が、依然として、ＤＮＡコピー数を取得するのに必要となる。
まとめると、Ｃｔ値そのものは絶対的なものではなく、特定の状態に達するときのあるＰＣＲサンプル増幅のサイクル数を表しているにすぎない。このため、その値は、異なる条件による実験により変化し、Ｃｔ値そのものの絶対的な値は、なんら参照とすることができない。つまり、現在の方法を用いたコピー数の取得が高精度であるにものの、この複雑な手順を、操作ばらつきを最小限にするために専門的に訓練されたオペレータが行うことが必要である。
現在のリアルタイムｑＰＣＲは、Ｃｔ値を利用して、標的サンプル絶対又は相対定量化を行う。しかし、いずれの方法も二、三の仮定に依存している。（１）対数期での増幅は、試薬の使い尽くし（exhaustion）によって制限されない（つまり、増幅効率は、
）こと、（２）増幅効率は一定であること、及び（３）標準及び標的サンプルの増幅効率は同一であること、である。
W. Liu及びD.A. Saintは、Biochemical and Biophysical Research Communications p.347-353, vol.294 2002 において、シグモイド曲線フィッティングを用いることによるラインフィッティング(line-fitting)のための新たな数学的モデルを提案した。これは、各サイクルについての蛍光信号及び、増幅中の増大した蛍光色素強度の傾きファクタという、２ファクタに基づいたサイクル数を定義している。しかし、提案モデルは実用的ではない。
上述した問題を改善するため、絶対ｑＰＣＲについての新たな方法を提案する。第一に、コピー数を、段階希釈がされた参照サンプルを増幅することにより、指定パラメータに標準化し、調整を通じて参照テーブルを生成する。第二に、同一の分析方法を用いて、標的核酸の結果を調整し、その後、コピー数が、指定パラメータで参照テーブルを参照することにより得られる。本発明を通じて、オペレータは未知のサンプルとともに複数の標準の定量化を行う必要がなく、コピー数はＣｔ値から独立している。
簡潔には、本開示の観点は、上述したような先行技術の不利な点を克服する、核酸をリアルタイムで定量化する方法に向けられている。本開示の目的は、標的核酸（以下、標的サンプル）の定量化方法であって、特に、標準カーブを時折求める必要性からは独立した、標的サンプルを定量化する方法を提供することである。この発明は新たな定量化方法を提供するだけではなく、増幅効率、ポリメラーゼ活性、プライマー濃度を伴うｑＰＣＲのＣｔ変化及び器具ばらつきを取り除いた、新たな標準的な動作方法を提供する。
本開示では、参照サンプル及び標的サンプルの増幅は、それが増幅に比例する限り、光学信号（蛍光信号、リン光信号等）及び科学センサ（水素イオン、ピロリン酸等）により監視されることができる。
本開示のある観点によれば、好ましい実施形態での方法は、ａ）コピー数対指定パラメータの参照テーブルを構築する工程と、ｂ）標的サンプルを増幅する工程と、ｃ）標的サンプルの増幅をリアルタイムで測定する工程と、ｄ）検出信号を分析して、標的サンプルの指定パラメータを取得する工程と、ｅ）参照テーブルを検索及び補間して、標的サンプルのコピー数を取得する工程と、を含む。それらの工程のうち、参照テーブルは、ｉ）参照サンプルを準備及び増幅する工程と、ｉｉ）参照サンプルの増幅をリアルタイムで監視及び検出する工程と、ｉｉｉ）検出信号を分析して、各参照サンプルの指定パラメータを取得する工程と、ｉｖ）コピー数対指定パラメータの参照テーブルを構築する工程と、により調整及び監視される。標的サンプルの検出信号は、参照サンプルと同じプロセスで分析される。
本開示の他の観点によれば、参照サンプル及び標的サンプルの両方の検出信号は、２パラメータシグモイド関数及び正規化プロセスにより分析される。
この発明の概要は、下記の発明を実施するための形態でさらに説明される、本開示のいくつかの観点を簡潔に特定するのに設けられている。この発明の概要は、本開示の肝要な又は必須の特徴を特定することを意図しておらず、特許請求の範囲を限定することも意図していない。
文言「観点」は、「少なくとも一つの観点」として読まれるものである。上記に説明された観点及び本開示の他の観点は、例を介して図示され、添付の図面の内容に限定されない。
本発明のこれらの及び他の目的は、種々の図面（figures and drawings）に示される好ましい実施形態についての次の発明の実施するための形態を読めば、当業者には疑いなく明らかとなるものである。
本開示のより完全な理解は、添付の図面を参照することによりなされてよい。
次の説明は、単に本開示の原理を示しているにすぎない。本開示で規定されている全ての例及び条件付きの言葉（conditional language）は、原則的に、読者が本開示の原理及び発明者により与えられた概念を理解して、本技術分野を促進させるという教育上の目的のためだけのものであり、そのように特に規定された例及び条件に限定されることなく解釈されるものであることを明確に意図している。
さらに、本開示の原理、観点及び実施形態を規定する、本開示での全ての陳述は、本開示の例と同様に、それらの構造的及び機能的均等物の両方を包含することを意図している。追加的に、そのような均等物は、現在知られている均等物及び将来開発される均等物、つまり、構造によらず、同一の機能を行うように後々開発される任意の要素の両方を含むことを意図している。
本開示で明確に特定されない限りは、図面は縮尺通りには描かれていない。
図１に示されるように、本発明は、核酸をリアルタイムで定量化する方法に向いている。図１は、複数の参照サンプルから参照テーブルを構築して、定量化計算を行うのに有益なコピー数対指定パラメータの情報を提供するのに用いられることのできる方法１００の一実施形態を示す。一つの観点においては、参照テーブルを構築する方法は、リアルタイムＰＣＲプロセスで行うのに適合することができ、ここで、定量化計算は、参照テーブルを検索及び補間して、同一条件で増幅し、参照サンプルと同一の核酸配列を共有する標的サンプルである、標的サンプルのコピー数を取得することによって行われる。
方法１００は、１１０において参照サンプル準備し、１１１において増幅をリアルタイムで測定することによって開始する。参照サンプル及び標的サンプルの両方の増幅が、増幅中に生成される光学信号（蛍光信号、リン光信号等）又は、増幅の副産物又は他の特定の材料である化学センサ（水素イオン、ピロリン酸）を、それらが増幅に比例する限りにおいて、監視することによってリアルタイムで監視されることができる。
一旦増幅が完了すると、１１２において参照サンプルから検出信号を分析し、１１３において、コピー数対指定パラメータを用いて参照テーブルが構築される。その後、１１４において、標的サンプルが増幅されるとともに、１１５においてリアルタイムでその増幅を測定する。１１６において、検出信号を分析した後、１１７において、指定パラメータの値を参照テーブルと比較することによって、標的サンプルのコピー数が分かる。この開示された発明により提案されるこの新たな定量化アプローチを用いることによって、増幅効率、ポリメラーゼ活性、プライマー濃度を伴う変化及び器具ばらつきが取り除かれる。
本発明の他の実施形態においては、参照サンプル及び標的サンプルの増幅は、増幅中に蛍光信号が発せられるＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）色素を加えることによって監視される。ＥｖａＧｒｅｅｎ色素は、増幅中の光学信号（蛍光信号、リン光信号等）又は、増幅の副産物又は他の特定の材料である化学センサ（水素イオン、ピロリン酸等）であって、それらが増幅に比例する限りにおいて、それらを生成する他の材料に置換されることができる（ＳＹＢＲ（登録商標）１、分子標識（molecular beacon）、プローブ等）。
参照サンプル及び標的サンプルの検出信号は、図２及び図３に示されるように、シグモイド曲線フィッティング関数（sigmoidal curve fitting function）によって分析される。これは、閾値方法が基づく指数モデルよりも、シグモイド関数がＰＣＲ増幅をより効率よくモデル化することがうかがえるためである。この実施形態において検出信号を分析するのに用いられる２パラメータシグモイド関数を下記に記載する。
ここで、ＮＳは正規化信号であり、ｔはサイクル数であり、ｔ１／２は反応光が最大反応光の半分に達する部分サイクル（fractional cycle）であり、τは該曲線の傾きである。二つの可変（variants）は、ｔ１／２及びτである。
この実施形態において、指定パラメータは、ｔ１／２である。本実施形態には二つの動作パートがある。図２は、参照サンプルから参照テーブルを構築するプロセスを示す。図３は、参照テーブルの検索及び補間によって標的サンプルのコピー数を取得するプロセスを示す。２００において、ユーザが、まず、参照テーブルを準備する。２１０において、標的サンプル内ものと同一の核酸配列を共有する参照サンプルのＰＣＲ増幅領域が準備され、２１１において、増幅及び蛍光信号による監視がされる。一旦増幅が完了すると、２１２ａ〜２１２ｄにおいて、検出信号が正規化及びシグモイド曲線フィッティングによって分析されて、ｔ１／２を取得する。その後、２１３において、参照テーブルがコピー数対ｔ１／２を用いて構築される。その後、３１４において、標的サンプルが準備され、参照サンプルと同一の条件下で増幅されるとともに、３１５において、それの増幅をリアルタイムで測定する。３１６ａ〜３１６ｄにおいて、標的サンプルの検出信号を分析した後、３１７において、参照テーブルから標的サンプルのｔ１／２の検索及び補間によって、標的サンプルのコピー数が分かる。
参照サンプル及び標的サンプルを分析する検出信号の肝要な手順２１２ａ〜２１２ｄ及び３１２ａ〜３１２ｄ並びにそれらの原理を下記に記載する。
ａ） 参照サンプルの信号を検出した後、各参照サンプルのバックグラウンド値を減算し、その後、２１２ａにおいて、蛍光信号の変化を０〜１の範囲内に正規化する。この工程の後、蛍光信号は正規化されていることになる。この工程の目的は、反応変動（光源又は検出器拡大率の僅かな違い等）により引き起こされる基準信号の非一貫性を低下させることである。
ｂ） 次に、２１２ｂにおいて、正規化された蛍光信号及びサイクル数は、２パラメータシグモイド関数によりフィットされる（fitted）。この工程の後、各参照サンプルのｔ１／２及びτが取得されている。これら二つのパラメータ、ｔ１／２及びτは、この増幅の全ての参照サンプルの傾向線を表す。これら２つのパラメータは、参照サンプルのコピー数及び増幅効率の情報を提供する。
ｃ） ２１２ｃにおいて、サイクル数をτで除算して、サイクル数を記録するｘ軸が正規化される。増幅効率は、（１）異なるｑＰＣＲ操作毎及び（２）あるｑＰＣＲ操作において増幅されるサンプル毎のいずれの状況でも変化するため、コピー数を推定することは難しい。このため、この工程は、コピー数を正規化されたサイクル数にのみ関連させることを意図している。
ｄ） ２１２ｄにおいて、各参照サンプルの曲線をシグモイド関数により再フィッティングし、各参照サンプルのｔ１／２が取得される。ｔ１／２は、コピー数にのみ関連している。つまり、ｔ１／２は、各参照サンプルのコピー数が異なるときにのみ異なるものである。各参照サンプルのｔ１／２は、異なる増幅効率に対しては一定のままである。
ｅ） 参照テーブルは、参照サンプルの各異なる各濃度に対応する各ｔ１／２によって組織化される。参照テーブルが構築された後に、参照サンプルと同一の核酸配列を共有する標的サンプルを定量化する必要性があれば、３１７において、標的サンプルのコピー数は参照テーブルと比較及び補間を行うことによって取得されることができる。参照テーブルは、次の工程、３１４における、標的サンプルの増幅を完了する工程と、３１５における、蛍光信号を取得する工程と、３１６ａ〜３１６ｄにおける、同様のデータ処理による、値を処理して標的サンプルのｔ１／２を得る工程とにより得られる。
ａ） 参照サンプルの信号を検出した後、各参照サンプルのバックグラウンド値を減算し、その後、２１２ａにおいて、蛍光信号の変化を０〜１の範囲内に正規化する。この工程の後、蛍光信号は正規化されていることになる。この工程の目的は、反応変動（光源又は検出器拡大率の僅かな違い等）により引き起こされる基準信号の非一貫性を低下させることである。
ｂ） 次に、２１２ｂにおいて、正規化された蛍光信号及びサイクル数は、２パラメータシグモイド関数によりフィットされる（fitted）。この工程の後、各参照サンプルのｔ１／２及びτが取得されている。これら二つのパラメータ、ｔ１／２及びτは、この増幅の全ての参照サンプルの傾向線を表す。これら２つのパラメータは、参照サンプルのコピー数及び増幅効率の情報を提供する。
ｃ） ２１２ｃにおいて、サイクル数をτで除算して、サイクル数を記録するｘ軸が正規化される。増幅効率は、（１）異なるｑＰＣＲ操作毎及び（２）あるｑＰＣＲ操作において増幅されるサンプル毎のいずれの状況でも変化するため、コピー数を推定することは難しい。このため、この工程は、コピー数を正規化されたサイクル数にのみ関連させることを意図している。
ｄ） ２１２ｄにおいて、各参照サンプルの曲線をシグモイド関数により再フィッティングし、各参照サンプルのｔ１／２が取得される。ｔ１／２は、コピー数にのみ関連している。つまり、ｔ１／２は、各参照サンプルのコピー数が異なるときにのみ異なるものである。各参照サンプルのｔ１／２は、異なる増幅効率に対しては一定のままである。
ｅ） 参照テーブルは、参照サンプルの各異なる各濃度に対応する各ｔ１／２によって組織化される。参照テーブルが構築された後に、参照サンプルと同一の核酸配列を共有する標的サンプルを定量化する必要性があれば、３１７において、標的サンプルのコピー数は参照テーブルと比較及び補間を行うことによって取得されることができる。参照テーブルは、次の工程、３１４における、標的サンプルの増幅を完了する工程と、３１５における、蛍光信号を取得する工程と、３１６ａ〜３１６ｄにおける、同様のデータ処理による、値を処理して標的サンプルのｔ１／２を得る工程とにより得られる。
本発明を、次の例によりさらに説明する。
例１ 異なるプライマー濃度の調整（Calibration）
工程Ａ． ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
例１ 異なるプライマー濃度の調整（Calibration）
工程Ａ． ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
ｇＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＢＬＯＯＤ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｎ．Ｖ．）を用いて、血液全体から分離される。ｇＤＮＡ濃度は、１０ｎｇ／μｌにまで調整される（以下、参照サンプル）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するプライマーは、ＵＣＰ１シーケンスを増幅するのに用いられる。プライマーシーケンスは、表１に示される。二つの段階単一希釈（two serial single dilutions）が、０．４μＭから、０．２μＭ及び０．１μＭのプライマー濃度で用意される。表２に示されるように、各プライマー量について、実験は二回行われる。
増幅反応は、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ リアルタイムシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素によりリアルタイムで測定及び監視されるように実行される。各反応混合物体積は２５μｌであり、次の条件下で増幅される。
反応混合物は、まず、９４℃で２分間培養される。実際の増幅反応は、次のスキーム従って、４５サイクルで実行される。
９４℃１０秒 → ６０℃で１０秒→７２℃で１５秒
工程Ｂ：データ分析
９４℃１０秒 → ６０℃で１０秒→７２℃で１５秒
工程Ｂ：データ分析
図４は、監視された蛍光信号の検出信号を示す。図５に示されるように、参照サンプルの信号を検出した後に、各参照サンプルのバックグラウンド値を減算し、その後、２１２ａにおいて、蛍光信号の変化を０〜１の範囲内に正規化する。
図６に示されるように、２１２ｂにおいて、正規化された蛍光信号及びサイクル数は、２パラメータシグモイド関数によりフィットされる。この工程における決定係数（R-square）は０．９９９よりも大きい（ｒ＞０．９９９）。参照サンプルのｔ１／２及びτは下記のように記載される。
図７に示されるように、２１２ｃにおいて、サイクル数をτで除算して、各サイクル数軸が正規化される。この工程における決定係数も０．９９９よりも大きい（ｒ＞０．９９９）。２１２ｄにおいて、各参照サンプルの曲線をシグモイド関数により再フィッティングし、表４に示されるように、各参照サンプルのｔ１／２が取得される。各参照サンプルのｔ１／２は、異なるプライマー濃度によっては変化されない。
例２ 異なるｄＮＴＰ濃度の調整
工程Ａ． ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
工程Ａ． ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
ｇＤＮＡ抽出及び増幅の条件及びプロセスは、次の点を除いて、表５に記載されるように、例１と同一である。
ａ） 二つの段階単一希釈（two serial single dilutions）が、０．４ｍＭから、０．２、ｍＭ及び０．１ｍＭのｄＮＴＰ濃度で用意される。
ｂ） プライマー濃度は、０．４μＭである。
工程Ｂ：データ分析
ａ） 二つの段階単一希釈（two serial single dilutions）が、０．４ｍＭから、０．２、ｍＭ及び０．１ｍＭのｄＮＴＰ濃度で用意される。
ｂ） プライマー濃度は、０．４μＭである。
図８Ａ〜図８Ｄに示されるように、例１と同様の処理工程で検出信号を分析し、取得されたｔ１／２は、コピー数のみに関連している。各参照サンプルのｔ１／２は、異なるｄＮＴＰ濃度により変化されない。検出信号が図８Ａに示される。図８Ｂは、２１２ａにおける、各参照サンプルのバックグラウンド値の減算及び蛍光信号の変化の０〜１の範囲内への正規化を示す。蛍光信号を正規化した後に、図８Ｃに示されるように、２１２ｂにおいて、正規化された蛍光信号及びサイクル数は、２パラメータシグモイド関数によりフィットされる。２１２ｃにおいて、各サイクル数軸がτでサイクル数を除算することによって正規化される。２１２ｄにおいて、各参照サンプルの曲線をシグモイド関数により再フィッティングする。その結果は、図８Ｄに示される。
例３ 参照テーブル構築
例３ 参照テーブル構築
３つの異なる濃度テンプレートが例３では用いられて、コピー数対ｔ１／２の参照テーブルを構築する。
工程Ａ ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
工程Ａ ２１０における、ＵＣＰ１ ｇＤＮＡ（参照サンプル）の増幅
ｇＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＢＬＯＯＤ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｎ．Ｖ．）を用いて、血液全体から分離される。ｇＤＮＡ濃度は、１０ｎｇ／μｌにまで調整される。ここから、二つの段階単一段階希釈が、２．５ｎｇ／μｌ及び０．６２５ｎｇ／μｌのｇＤＮＡの濃度で用意される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するプライマーは、ＵＣＰ１シーケンスを増幅するのに用いられる。プライマーシーケンスは、すでに表１に示されている。表６に示されるように、各プライマー量について、実験は二回行われる。増幅反応は、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ リアルタイムシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素によりリアルタイムで測定及び監視されるように実行される。各反応混合物体積は２５μｌであり、次の条件下で増幅される。
工程Ｂ：データ分析
図９Ａ〜図９Ｄに示されるように、例１と同様の処理工程で検出信号を分析し、取得されたｔ１／２は、コピー数のみに関連している。検出信号が図９Ａに示される。図９Ｂは、２１２ａにおける、各参照サンプルのバックグラウンド値の減算及び蛍光信号の変化の０〜１の範囲内への正規化を示す。蛍光信号を正規化した後に、図９Ｃに示されるように、２１２ｂにおいて、正規化された蛍光信号及びサイクル数は、２パラメータシグモイド関数によりフィットされる。この工程における決定係数は０．９９９よりも大きい（ｒ＞０．９９９）。２１２ｃにおいて、各サイクル数軸がτでサイクル数を除算することによって正規化される。２１２ｄにおいて、各参照サンプルの曲線をシグモイド関数により再フィッティングする。その結果は、図９Ｄに示される。
各コピー数のｔ１／２が表７に示される。これらはコピー数が異なるときにのみ異なるものである。
例４ 標的サンプル定量化
標的サンプルのＤＮＡテンプレートとして、５ｎｇをとっても、増幅条件及びプロセスは、例３における参照サンプルと同一である。３１４において、標的サンプルを増幅した後、３１５において、蛍光信号をリアルタイムで監視及び検出する。標的サンプルのｔ１／２は、検出した信号を例３の３１６ａ〜３１６ｄと同一の処理工程で分析した後に得られる。
標的サンプルのｔ１／２の値は、１８．４９７である。３１７において、標的サンプルのコピー数は、取得されたｔ１／２を参照テーブルと比較及び補間すると、４．０３ｎｇである。相対エラーは、理論値に対して２０パーセント未満である。
当業者であれば、本装置及び本方法の多様な修正物及び代替物が、発明の教示を保持しつつなされることができることに容易に気づくだろう。したがって、上記の開示は、添付の特許請求の範囲の境界によってのみ制限されるものとして解釈されるべきである。
Claims (14)
- 標的核酸を定量化する方法であって、
前記標的核酸と同一の核酸配列を有する複数の参照サンプルから、コピー数対正規化サイクル数の参照テーブルを構築する工程ａであって、該参照テーブルは、
前記参照サンプルを準備する工程ｉと、
前記参照サンプルを増幅する工程ｉｉと、
前記参照サンプルの増幅をリアルタイムで監視及び検出する工程ｉｉｉと、
前記増幅が飽和したときに、検出信号を正規化して、０から１の範囲内に分類する工程ｉｖと、
シグモイド関数
前記曲線の傾きによって各参照サンプルのサイクル数を正規化する工程ｖｉと、
前記工程ｖを繰り返して、各参照サンプルのｔ１／２を取得する工程ｖｉｉｉと、
により、調整及びフィッティングする、工程ａと、
前記標的核酸を増幅する工程ｂと、
前記標的核酸の増幅をリアルタイムで監視及び検出する工程ｃと、
前記標的核酸の増幅が飽和したときに、検出信号を０から１の範囲内に正規化する工程ｄと、
シグモイド関数
前記曲線の傾きによって前記標的核酸のサイクル数を正規化する工程ｆと、
前記工程ｅを繰り返して、前記標的核酸のｔ１／２を取得する工程ｇと、
前記参照テーブルを検索することによって、サンプル内に含まれる前記標的核酸のコピー数を取得する工程ｈと、を含む方法。 - 前記標的核酸及び前記参照サンプルの増幅反応は、リアルタイムＰＣＲである、請求項１に記載の方法。
- 前記標的核酸及び前記参照サンプルの増幅は、光学デバイス又は化学センサにより監視及び検出される、請求項１に記載の方法。
- 前記化学センサは、水素イオン又はピロリン酸である、請求項３に記載の方法。
- 前記標的核酸及び前記参照サンプルの増幅は、ＤＮＡ結合色素、インターカレート色素、プローブ又は分子標識を用いた前記光学デバイスにより監視及び検出される、請求項３に記載の方法。
- 前記光学デバイスは蛍光信号検出デバイスであり、
ＤＮＡ結合色素が、光で励起した後の二本鎖核酸との相互作用により、前記蛍光信号検出デバイスにより検出される蛍光信号を発する、請求項３に記載の方法。 - 前記検出信号は蛍光信号である、請求項１に記載の方法。
- 標的核酸と同一の核酸配列を有する複数の参照サンプルからコピー数対正規化サイクル数の参照テーブルを構築する方法であって、
前記参照サンプルを準備する工程ａと、
前記参照サンプルを増幅する工程ｂと、
前記参照サンプルの増幅をリアルタイムで監視及び検出する工程ｃと、
前記増幅が飽和したときに、検出信号を正規化して、０から１の範囲内に分類する工程ｄと、
シグモイド関数
前記曲線の傾きによって各参照サンプルのサイクル数を正規化する工程ｆと、
前記工程ｅを繰り返して、各参照サンプルのｔ１／２を取得する工程ｈと、
前記工程ｈで得られた各参照サンプルのｔ１／２の前記参照テーブルを構築する工程ｉと、を含む方法。 - 前記参照サンプルの増幅反応は、リアルタイムＰＣＲである、請求項８に記載の方法。
- 前記参照サンプルの増幅は、光学デバイス又は化学センサにより監視及び検出される、請求項８に記載の方法。
- 前記化学センサは、水素イオン又はピロリン酸である、請求項１０に記載の方法。
- 前記参照サンプルの増幅は、ＤＮＡ結合色素、インターカレート色素、プローブ又は分子標識を用いた光学デバイスにより監視及び検出される、請求項８に記載の方法。
- 前記光学デバイスは蛍光信号検出デバイスであり、
ＤＮＡ結合色素が、光で励起した後の二本鎖核酸との相互作用により、前記蛍光信号検出デバイスにより検出される蛍光信号を発する、請求項１０に記載の方法。 - 前記検出信号は蛍光信号である、請求項８に記載の方法。
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