JP2010227060A - 標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラム - Google Patents

標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラム Download PDF

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【課題】測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値を正確に決定することができる、標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムを提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、初期鋳型量に相当する量を、初期鋳型量を示す値に変換する標的核酸測定方法であって、理論式は、指数パラメータである環境係数、および、初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、を特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムに関する。
従来、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以後、「ＰＣＲ」と記す。）と呼ばれる核酸増幅反応が報告されている。ＰＣＲは、核酸分子中の特定核酸領域を容器内で約１００万倍にも増幅するものである。ＰＣＲを利用することにより、標的核酸の特定核酸領域を、増幅された状態で検出することが可能となり、感度的には１分子の核酸から病原体を検出することも可能となっている。
この増幅された特定核酸領域の一般的な検出方法としては、ＰＣＲ終了後の反応溶液をアガロース電気泳動により分離した後に染色し、バンドの移動度（分子量）で判別する方法や、この反応溶液をドットハイブリダイゼーション法により検出する方法が行われている。
ここで、従来のＰＣＲを利用した核酸検出方法においては、一旦、ＰＣＲ終了後の反応溶液を反応容器から取り出して処理するものであるため、増幅された特定核酸領域が環境中に飛散する場合がある。飛散した特定核酸領域が実験室内の他の検体に混入すると、この核酸が次のＰＣＲの鋳型核酸となってしまい、他の検体の検査において偽陽性の要因となるおそれがある。
そのため、近年、試料中の核酸増幅量に相当する蛍光強度を、熱サイクル毎に測定するリアルタイムＰＣＲという方法が提案されているが、依然として、試料中の標的核酸の初期鋳型量を分析することが難しいという欠点がある。すなわち、増幅量が少ない場合は蛍光強度が微弱なため測定ができず、そのため増幅反応混合物中の初期鋳型量に相当するサイクル数０における蛍光強度を正確に算出することは困難である。
そこで、初期鋳型量の測定方法として、特許文献１が開示されている。この測定方法では、まず、一つの被検試料は、未知濃度の特異的核酸配列を有し、他の被検試料は、同じ特異的核酸配列を異なる既知濃度で含む複数の被検試料を準備する。そして、既知濃度および未知濃度の被検試料を、複数のサイクルについて並行して熱サイクルに供する。つづいて、被検試料から輻射される蛍光を測定し、実時間で各反応混合物がある強度（例えば、検出レベル以上の所定の強度）をもって蛍光を発するための必要なサイクル数（以後、「ＣＴ値」と記す。）を決定する。そして、既知濃度の被検試料における、特異的核酸配列の濃度対ＣＴ値を示す検量線を作成し、未知核酸濃度の被検試料のＣＴ値を作成した検量線にあてはめ、未知濃度の被検試料中の特異的核酸配列の初期鋳型量を決定する。
また、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（製品名）の製品説明資料には、基準とした試料のＣＴ値の差から相対値を求める相対定量法である比較ＣＴ法が示されている（非特許文献１参照）。この方法では、基準とした試料のＣＴ値の差から相対値を求め、ＰＣＲ増幅効率を１００％と仮定して、初期鋳型量を決定する。
また、特許文献２には、以下の初期鋳型量の測定方法が開示されている。この測定方法では、まず、被検試料を、複数のサイクルについて熱サイクルに供する。この時、被検試料から核酸が増幅された量に相当する蛍光が輻射されるので、この輻射された蛍光を測定する。そして、測定した値を、ｄｓＤＮＡのモル濃度に変換し、ｄｓＤＮＡのモル濃度対サイクル数の測定曲線を得る。そして、出発プライマーモル濃度をパラメータの一つとする理論曲線にこの測定曲線をあてはめ、サイクル数０におけるｄｓＤＮＡのモル濃度つまり被検試料中の初期鋳型量を決定する。
特開平７−１６３３９７号公報 特開平８−６６１９９号公報
"今だからこそリアルタイムＰＣＲ〜検量線を引かなくても定量できる？"、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００９年、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ、［平成２１年２月２４日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｗｅｂｓｉｔｅ／ｊｐ／ｂｉｏｂｅａｔ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｊｓｐ？ＣＯＬＵＭＮＰＧＣＤ＝７８９７３＆ＣＯＬＵＭＮＣＤ＝７６４４８＆ＴＹＰＥ＝Ｃ＆ＢＩＯＣＡＴＥＧＯＲＹＣＤ＝７＞
しかしながら、従来の測定方法においては、検量線を必要とする場合には、多数の既知濃度の被検試料を準備しなければならず未知濃度の被検試料の処理数が少なくなり、一方、検量線を必要としない場合には、実際のＰＣＲ増幅効率が必ずしも正確に反映されず、得られた初期鋳型量の正確性が低いという問題点を有していた。
例えば、特許文献１に記載の測定方法では、毎回ＰＣＲ増幅効率が反映された検量線を作成するため、得られる初期鋳型量の正確性が高いものの、毎回の実験毎に検量線を作成する必要があり、既知濃度の被検試料を多量に用意しなければならないという問題がある。また、複数の既知濃度の被検試料のＰＣＲを行う必要があるため、未知濃度の被検試料の処理数が減ってしまうという問題がある。
また、従来の比較ＣＴ法による測定方法（非特許文献１参照）では、検量線作成用の複数の既知濃度の被検試料を必要とせず、多量の未知濃度の被検試料を処理できるものの、ＰＣＲ増幅効率を１００％と仮定しているため、実際のＰＣＲ増幅効率（多くの場合、１００％とならない。）が結果に反映されず、得られた初期鋳型量の正確性が低くなってしまうという問題がある。
また、特許文献２に記載の方法では、検量線を必要とせず、同時に実際のＰＣＲ増幅効率を結果に反映するので、得られる初期鋳型量の正確性が高く、多量の未知濃度の被検試料を処理できるとも考えられる。しかしながら、蛍光測定値をｄｓＤＮＡのモル濃度に変換するには、事前に用意された蛍光測定値とｄｓＤＮＡモル濃度との関係を用いるため、この時の蛍光測定条件と、ＰＣＲにより測定曲線を得る時の測定条件が異なると、理論式のパラメータである出発プライマー濃度と被検試料における増幅核酸のモル濃度との関係が不正確となってしまい、理論式が成立しなくなるという問題がある。また、特許文献２に記載の理論式では、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映できるものではないため、測定曲線を理論式にあてはめた結果得られた初期鋳型量の正確性が低くなるという問題もあった。
本発明は、上記問題点に鑑みて創案されたものであり、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができる、標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムを提供することを目的とする。
このような目的を達成するため、本発明の標的核酸測定方法は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する標的核酸測定方法であって、前記理論式は、指数パラメータである環境係数、および、前記初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、を特徴とする。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式における、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、前記反応促進係数、および、前記反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータ、および、前記環境係数により、前記核酸増幅反応の増幅効率を定義すること、を特徴とする。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式は、前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記初期鋳型量に相当する量に対する、前記熱サイクル数ごとの前記増幅効率に１を加えた数の総乗で表すこと、を特徴とする。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記理論式は、以下に示す式であること、を特徴とする。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎ０は、前記初期鋳型量に相当する量、ｊは、前記熱サイクル数、Ｎｊは、前記熱サイクル数ｊにおける標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎｍａｘは、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、ρは、前記反応促進係数、μは、前記反応阻害係数、Ｋは、前記環境係数である。）
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、最小二乗法を用いて前記理論式にあてはめること、を特徴とする。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記理論式にあてはめることにより、前記反応促進係数および／または前記反応阻害係数を求め固定化すること、を特徴とする。
Figure 2010227060
 （ここで、Δｎは、前記増加率であり、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量である。）
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、２本鎖ＤＮＡの不在では信号を発しないが２本鎖ＤＮＡの存在時にのみ信号を発する、インターカーレーターからの信号の測定値であり、以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、を特徴とする。
ａ）前記被検試料と同一の前記標的核酸を有する標準試料から、前記被検試料と同条件で前記核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量を測定して、前記被検試料と同条件で前記インターカーレーターを添加した前記増幅産物の希釈系列を調製する工程、
ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記インターカーレーターからの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度との関係式を決定する工程、および、
ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記標的核酸の前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する工程。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、前記核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生するレポーター分子からの信号の測定値であり、以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、を特徴とする。
ａ）前記レポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列を調製する工程、
ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記蛍光分子からの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度との関係式を決定する工程、および、
ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記標的核酸の前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値である前記濃度に変換する工程。
また、本発明の標的核酸測定方法は、上記記載の標的核酸測定方法において、前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、前記核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生させるレポーター分子からの信号の測定値であり、以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、を特徴とする。
ａ）前記被検試料と同一の前記標的核酸を有する標準試料から、前記被検試料と同条件で前記核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量を測定して、前記増幅産物の希釈系列を調製する工程、
ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記レポーター分子からの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度の関係式を決定する工程、および、
ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記標的核酸の前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する工程。
また、本発明は、標的核酸測定装置に関するものであり、本発明の標的核酸測定装置は、記憶部と制御部を少なくとも備え、前記記憶部は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備え、前記制御部は、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、前記初期鋳型量相当量算出手段により算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換手段と、を備えたことを特徴とする。
また、本発明は、標的核酸測定システムに関するものであり、本発明の標的核酸測定システムは、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を前記熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムであって、前記記憶部は、前記測定部により測定された、前記熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとの前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備え、前記制御部は、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、前記初期鋳型量相当量算出手段により算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換手段と、を備えたことを特徴とする。
また、本発明は、標的核酸測定プログラムに関するものであり、本発明の標的核酸測定プログラムは、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置に実行させるための標的核酸測定プログラムであって、前記記憶部は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、を備えており、前記制御部において、前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティングステップと、前記理論式フィッティングステップにおいてフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出ステップと、前記初期鋳型量相当量算出ステップにおいて算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換ステップと、を実行させることを特徴とする。
この発明の標的核酸測定方法によれば、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した初期鋳型量に相当する量を、初期鋳型量を示す値に変換する方法において、理論式は、指数パラメータである環境係数、および、初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む。これにより、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができるという効果を奏する。
また、本発明の標的核酸測定装置によれば、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶し、記憶した熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した初期鋳型量に相当する量を、初期鋳型量を示す値に変換する。これにより、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができるという効果を奏する。
また、本発明の標的核酸測定システムによれば、測定装置は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を熱サイクル数ごとに測定し、情報処理装置は、測定された、熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとの標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶し、記憶した熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した初期鋳型量に相当する量を、初期鋳型量を示す値に変換する。これにより、測定した核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができるという効果を奏する。
また、本発明の標的核酸測定プログラムによれば、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶し、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する情報処理装置において、記憶された熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した初期鋳型量に相当する量を、初期鋳型量を示す値に変換する方法を実行させる。これにより、測定した核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができるプログラムを提供することができるという効果を奏する。
図１は、本発明の概要を示すフローチャートである。 図２は、本発明が適用される標的核酸測定装置１００の構成の一例を示すブロック図である。 図３は、本実施の形態における標的核酸測定装置１００の処理の一例を示すフローチャートである。 図４は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ７９００（商品名）の測定装置により得られた測定データの一例を示す図である。 図５は、横軸を熱サイクル数ｎとして、縦軸に増加率Δｎを示した図である。 図６は、図５において、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たすフィッティング領域を切り出して実測値と理論値を比較した図である。 図７は、増幅産物量と蛍光強度の関係を示す図である。 図８は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の各パラメータの算出結果を示す図である。 図９は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。 図１０は、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を表した図である。 図１１は、従来例としてＣｔ値による検量線を用いて初期鋳型量を算出した結果を示す図である。 図１２は、本実施例２−１と従来例における初期鋳型量の算出結果を比較した図である。 図１３は、ＦＡＭ分子のモル濃度と蛍光強度との関係を示す図である。 図１４は、被検試料Ｎｏ．３、Ｎｏ．４の各パラメータの算出結果を示す図である。 図１５は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。 図１６は、増幅産物量（鋳型量）と蛍光強度の関係を示す図である。 図１７は、被検試料Ｎｏ．５、Ｎｏ．６の各パラメータの算出結果を示す図である。 図１８は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。 図１９は、Ｃｔ値対鋳型量を示す検量線を表した図である。 図２０は、従来例としてＣｔ値による検量線を用いて初期鋳型量を算出した結果を示す図である。 図２１は、本実施例２−３と従来例における初期鋳型量の算出結果を比較した図である。
以下に、本発明にかかる標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について図１を参照して説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。ここで、図１は、本発明の概要を示すフローチャートである。
図１に示すように、まず、本発明は、核酸増幅反応における熱サイクル数（ｎ）を設定する（ステップＳＡ−１）。すなわち、核酸増幅反応を繰り返し行うための熱サイクルの回数（ｎ）が設定される。
そして、本発明は、被検試料に対し核酸増幅反応を行い、標的核酸を増幅させる（ステップＳＡ−２）。
そして、本発明は、熱サイクル数（ｎ）と対応付けて、標的核酸の増幅量に相当する量（以下、「増幅量相当量」と呼ぶ。）を測定する（ステップＳＡ−３）。ここで、「増幅量」とは、熱サイクル数１から当該サイクル数までに増幅された標的核酸の総量を意味する。また、「増幅量相当量」とは、任意の指標によって得られる標的核酸の増幅量に相当する量であり、例えば、２本鎖ＤＮＡの存在時に信号を発するインターカーレーターからの信号の測定値や、増幅反応時の伸張反応により信号を発生させるレポーター分子からの信号の測定値等である。
そして、本発明は、当該熱サイクル数が熱サイクル数（ｎ）に到達したか否かを判断し（ステップＳＡ−４）、熱サイクル数（ｎ）に到達していない場合（ステップＳＡ−４、Ｎｏ）、ステップＳＡ−２に戻る。一方、熱サイクル数（ｎ）に到達した場合（ステップＳＡ−４、Ｙｅｓ）、核酸増幅反応と、それに伴う増幅量相当量の測定を終了する。
そして、本発明は、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量を理論式にあてはめる（ステップＳＡ−５）。ここで、本発明の理論式は、指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量（以下、「初期鋳型量相当量」と呼ぶ。）を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含んで構成される。すなわち、本発明は、このステップＳＡ−５において、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量に理論式が適合（フィッティング）するように理論式のパラメータを決定する。
ここで、理論式において、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータおよび環境係数により、核酸増幅反応の増幅効率を定義してもよい。また、理論式は、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表してもよい。また、本発明は、最小二乗法を用いて理論式にあてはめてもよく、パラメータの少なくとも一つを固定値としてもよい。
そして、本発明は、増幅量相当量があてはめられた理論式から、初期鋳型量相当量を算出する（ステップＳＡ−６）。例えば、本発明は、フィッティングによりパラメータが決定された理論式に基づいて、初期鋳型量相当量の算出を行う。
そして、本発明は、算出した初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値（コピー数や質量、物質量、濃度等）に変換する（ステップＳＡ−７）。例えば、増幅量相当量として、被検試料中に添加された、２本鎖ＤＮＡの不在では信号を発しないが２本鎖ＤＮＡの存在時にのみ信号を発する、インターカーレーターからの信号の測定値を用いる場合、本発明は、以下の工程ａ）〜ｄ）にて、初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値に変換する。
工程ａ）：被検試料と同一の標的核酸を有する標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、標的核酸の増幅産物の増幅量を測定して、被検試料と同条件でインターカーレーターを添加した増幅産物の希釈系列を調製する。
工程ｂ）：工程ａ）で調製された希釈系列におけるインターカーレーターからの信号を、被検試料と同条件で測定して測定値を取得する。
工程ｃ）：工程ｂ）で取得された測定値と、工程ａ）で調製された希釈系列の濃度との関係式を決定する。
工程ｄ）：工程ｃ）で決定された関係式に基づいて、初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値に変換する。
なお、以上の変換方法は、一例であり、上述のインターカーレーターに替えて、核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生するレポーター分子を用いて、上述の工程ａ）〜ｄ）と同様に、初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値に変換してもよい。また、レポーター分子を用いる場合、上述の工程ａ）において、レポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列を調製してもよい。
以上が本発明の概要である。このように、本発明は、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率を正確に反映させることができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値を正確に決定することができる。
［標的核酸測定装置の構成］
次に、本発明にかかる標的核酸測定装置の構成について図２を参照して説明する。図２は、本発明が適用される標的核酸測定装置１００の構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
図２において標的核酸測定装置１００は、概略的に、制御部１０２と通信制御インターフェース部１０４と入出力制御インターフェース部１０８と記憶部１０６を備えて構成される。ここで、制御部１０２は、標的核酸測定装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等である。また、入出力制御インターフェース部１０８は、入力部１１２や出力部１１４や測定部１１６に接続されるインターフェースである。また、記憶部１０６は、各種のデータベースやテーブルなどを格納する装置である。これら標的核酸測定装置１００の各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやファイル（測定データファイル１０６ａ、理論式ファイル１０６ｂ、関係式ファイル１０６ｃ等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段である。例えば、記憶部１０６は、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベース等を格納する。
これら記憶部１０６の各構成要素のうち、測定データファイル１０６ａは、核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ等）における熱サイクル数に対応付けて、熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量相当量を記憶する増幅量相当量記憶手段である。
また、理論式ファイル１０６ｂは、理論式を記憶する理論式記憶手段である。ここで、理論式ファイル１０６ｂに記憶される理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋ、および、初期鋳型量相当量Ｎ０を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量（以下、「飽和量相当量」と呼ぶ。）Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータを含んで構成される。
ここで、理論式ファイル１０６ｂに記憶される理論式は、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータ、および、環境係数により、核酸増幅反応の増幅効率を定義してもよい。更に、理論式は、増幅量相当量Ｎｎを、初期鋳型量相当量Ｎ０に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表してもよい。例えば、理論式は、以下に示す式でもよい。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
また、理論式ファイル１０６ｂは、理論式のパラメータの値を記憶してもよく、例えば、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、環境係数Ｋ、および、飽和量相当量Ｎｍａｘの少なくとも１つを固定値として記憶してもよい。
また、関係式ファイル１０６ｃは、初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値に変換するための関係式を記憶する関係式記憶手段である。すなわち、この関係式ファイル１０６ｃに記憶される関係式は、初期鋳型量相当量および増幅量相当量を表す単位から、初期鋳型量および標的核酸の増幅量を表す単位に変換するための関係式である。例えば、この関係式は、増幅量相当量を表すために用いた測定値（例えば、蛍光強度や信号測定値等）と、標的核酸の量（鋳型量）を示す値（コピー数や質量、物質量、濃度等）との関係式である。
また、図２において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力部１１２や出力部１１４や測定部１１６の制御を行う。ここで、出力部１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカを用いることができる（なお、以下においては出力部１１４をモニタとして記載する場合がある）。また、入力部１１２としては、キーボードや、マウス、マイク等を用いることができる。
また、測定部１１６は、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、増幅量相当量を熱サイクル数ごとに測定する測定手段である。一例として、測定部１１６は、リアルタイムＰＣＲ装置等における測定手段として構成される。なお、測定部１１６により測定された熱サイクルごとの増幅量相当量は、制御部１０２の制御により、測定データとして測定データファイル１０６ａに格納される。
また、図２において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや、各種の処理手順等を規定したプログラム、および、所要データを格納するための内部メモリを有する。そして、制御部１０２は、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部１０２は、機能概念的に、理論式フィッティング部１０２ａ、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂ、初期鋳型量値変換部１０２ｃを備えて構成されている。
このうち、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された熱サイクル数ごとの増幅量相当量を、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式にあてはめて、当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段である。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、熱サイクルごとに測定された増幅量相当量に理論式が最も適合（フィッティング）するように理論式のパラメータを決定する。
ここで、理論式フィッティング部１０２ａは、最小二乗法を用いて理論式へのあてはめを行ってもよい。また、理論式フィッティング部１０２ａは、理論式ファイル１０６ｂに記憶された、反応促進係数ρ、反応阻害係数μ、環境係数Ｋ、飽和量相当量Ｎｍａｘ等のパラメータの値を読み出し、このうち少なくとも一つのパラメータを固定値として理論式のフィッティングを行ってもよい。また、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された増幅量相当量のうち最大値を、飽和量相当量Ｎｍａｘとして理論式のフィッティングを行ってもよい。また、理論式フィッティング部１０２ａは、以下の式で表される増加率Δｎが、０以上１以下である領域において測定された増幅量相当量のみを理論式にあてはめることにより、反応促進係数ρや反応阻害係数μ等のパラメータを固定化してもよい。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、増加率Δｎが、０以上１以下である熱サイクル数の範囲において測定された増幅量相当量のみを理論式にあてはめてフィッティングを行い、求めた反応促進係数ρや反応阻害係数μ等のパラメータの値を固定値として理論式ファイル１０６ｂに格納してもよい。
Figure 2010227060
 （ここで、Δｎは、増加率であり、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量である。）
また、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式フィッティング部１０２ａによりフィッティングされた理論式から、初期鋳型量相当量を算出する初期鋳型量相当量算出手段である。例えば、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式フィッティング部１０２ａによるフィッティング結果である理論式のパラメータの値に基づいて、初期鋳型量相当量Ｎ０を算出して出力部１１４に出力する。
また、初期鋳型量値変換部１０２ｃは、関係式ファイル１０６ｃに記憶された関係式に基づいて、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂにより算出された初期鋳型量相当量を、初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換手段である。一例として、初期鋳型量を示す値の単位は、コピー数（ｃｏｐｙ）や、質量（ｐｇ、ｎｇ）、物質量（ｍｏｌ）、濃度（ｍｏｌ／ｍｌ）等である。
ここで、初期鋳型量値変換部１０２ｃは、以下に示す調製方法（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で調製された希釈系列について、被検試料と同条件で測定部１１６を介して測定された測定値と、入力部１１２を介して入力された当該希釈系列の濃度との関係式を決定し、関係式ファイル１０６ｃに格納してもよい。
調製方法（Ｉ）：被検試料と同一の標的核酸を有する標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件でインターカーレーターを添加した増幅産物の希釈系列を調製する。
調製方法（ＩＩ）：被検試料に添加したレポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列を調製する。
調製方法（ＩＩＩ）：被検試料と同一の標的核酸を有し、同条件でレポーター分子を添加した標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件で増幅産物の希釈系列を調製する。
以上が、本標的核酸測定装置１００の構成の一例である。ここで、標的核酸測定装置１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク３００に通信可能に接続されてもよい。この場合、通信制御インターフェース部１０４は、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続されるインターフェースであり、標的核酸測定装置１００とネットワーク３００（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。図２において、ネットワーク３００は、標的核酸測定装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネット等である。
また、標的核酸測定装置１００は、測定データやパラメータ等に関する外部データベースや、標的核酸測定装置として機能させるための外部プログラム等を提供する外部システム２００に、ネットワーク３００を介して通信可能に接続されてもよい。
図２において、外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、標的核酸測定装置１００と相互に接続され、利用者に対して測定データや理論式やパラメータの値等に関する外部データベースや、情報処理装置を標的核酸測定装置として機能させるための標的核酸測定プログラム等の外部プログラム等を提供する機能を有する。ここで、外部システム２００は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよい。また、外部システム２００のハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置およびその付属装置により構成してもよい。また、外部システム２００の各機能は、外部システム２００のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
［標的核酸測定装置１００の処理］
次に、このように構成された本実施の形態における本標的核酸測定装置１００の処理の一例について、以下に図３を参照して詳細に説明する。ここで、図３は、本実施の形態における標的核酸測定装置１００の処理の一例を示すフローチャートである。
図３に示すように、リアルタイムＰＣＲ装置等の測定部１１６が、核酸増幅反応における熱サイクル数に対応付けて増幅量相当量（例えば、インターカーレーターやレポーター分子等からの信号の測定値）を熱サイクル数ごとに測定すると、標的核酸測定装置１００の制御部１０２は、熱サイクル数および熱サイクル数ごとに測定された増幅量相当量に関する測定データを、測定部１１６を介して取得し、測定データファイル１０６ａに格納する（ステップＳＢ−１）。
そして、理論式フィッティング部１０２ａは、測定データファイル１０６ａに記憶された熱サイクル数ごとの増幅量相当量を、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式にあてはめて、理論式のフィッティングを行う（ステップＳＢ−２）。すなわち、理論式フィッティング部１０２ａは、熱サイクル数ごとの増幅量相当量に理論式が最も適合（フィッティング）するように、最小二乗法等を用いて理論式のパラメータの値を調整して決定する。ここで、理論式フィッティング部１０２ａにより用いられる理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋの他、反応促進係数ρや、反応阻害係数μ、飽和量相当量Ｎｍａｘ等のパラメータにより、核酸増幅反応の増幅効率が定義されていてもよい。また、理論式は、一例として、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表し、好適には、理論式は以下の式で表される。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
そして、理論式フィッティング部１０２ａは、フィッティング結果である理論式の各パラメータの値を理論式ファイル１０６ｂに格納する（ステップＳＢ−３）。例えば、理論式フィッティング部１０２ａは、最小二乗法等を用いて理論式が増幅量相当量に最も適合（フィッティング）するように最適化したパラメータの値を、フィッティング結果として理論式ファイル１０６ｂに格納する。
そして、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂは、理論式ファイル１０６ｂに記憶された理論式のパラメータの値に基づいて、初期鋳型量相当量Ｎ０を算出し、入出力制御インターフェース部１０８を介して出力部１１４に出力する（ステップＳＢ−４）。
そして、初期鋳型量値変換部１０２ｃは、関係式ファイル１０６ｃに記憶された関係式に基づいて、初期鋳型量相当量算出部１０２ｂにより算出された初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値（濃度値等）に変換する（ステップＳＢ−５）。ここで、初期鋳型量値変換部１０２ｃは、以下の調製方法（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）により調製された希釈系列について、被検試料と同条件で測定部１１６を介して測定された希釈系列の測定値と、入力部１１２を介して入力された希釈系列の濃度との関係式を決定して、関係式ファイル１０６ｃに格納し、格納した当該関係式に基づいて、増幅量相当量または初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値に変換してもよい。
調製方法（Ｉ）：被検試料と同一の標的核酸を有する標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件でインターカーレーターを添加した増幅産物の希釈系列を調製する。
調製方法（ＩＩ）：被検試料に添加したレポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列（蛍光分子のモル濃度等を特定した希釈系列）を調製する。
調製方法（ＩＩＩ）：被検試料と同一の標的核酸を有し、同条件でレポーター分子を添加した標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件で増幅産物の希釈系列を調製する。
以上が標的核酸測定装置１００の処理の一例である。なお、上記の説明では、濃度を特定した希釈系列を調製することを一例として示したが、本実施の形態はこれに限られず、インターカーレーターやレポーター分子等の指標物質と核酸鋳型量との関係（例えば、モル比で１：１の対応関係）に応じて、コピー数や質量、物質量等の単位で特定した希釈系列を調製して関係式を作成してもよい。
以上、本実施の形態によれば、核酸増幅反応における熱サイクル数ごとに測定された増幅量相当量を、理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行い、フィッティングされた理論式から、初期鋳型量相当量Ｎ０を算出し、算出した初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値に変換する場合において、理論式は、指数パラメータである環境係数Ｋ、および、初期鋳型量相当量Ｎ０を含み、かつ、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータを含むので、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値を正確に決定することができる。
また、本実施の形態によれば、理論式において、飽和量相当量Ｎｍａｘ、反応促進係数ρ、および、反応阻害係数μのうち少なくとも一つのパラメータ、および、環境係数Ｋにより、核酸増幅反応の増幅効率を定義するので、実際の増幅効率を更に正確に反映することができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
また、本実施の形態によれば、理論式は、増幅量相当量を、初期鋳型量相当量Ｎ０に対する、熱サイクル数ごとの増幅効率に１を加えた数の総乗で表すので、測定された増幅量相当量をそのまま当てはめることができ、実際の増幅効率をより正確に反映することができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
また、本実施の形態によれば、理論式は、以下に示す式であるので、実際の増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
また、本実施の形態によれば、最小二乗法を用いて理論式にあてはめるので、より正確にフィッティングを行うことができ、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができるという。
また、本実施の形態によれば、以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された増幅量相当量を理論式にあてはめることにより、反応促進係数ρおよび／または反応阻害係数μを求め固定化するので、測定された増幅量相当量のうち適切な領域のみを用いて、より正確に初期鋳型量を示す値を決定することができる。
Figure 2010227060
 （ここで、Δｎは、増加率であり、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量である。）
また、本実施の形態によれば、増幅量相当量として、被検試料中に添加された、２本鎖ＤＮＡの不在では信号を発しないが２本鎖ＤＮＡの存在時にのみ信号を発する、インターカーレーターからの信号の測定値を用いる場合において、以下の調製方法（Ｉ）により調製された希釈系列について、被検試料と同条件で測定された測定値と、当該希釈系列の濃度との関係式を決定し、決定した関係式に基づいて、増幅量相当量または初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値に変換するので、正確な関係式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
調製方法（Ｉ）：被検試料と同一の標的核酸を有する標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件でインターカーレーターを添加した増幅産物の希釈系列を調製する。
また、本実施の形態によれば、増幅量相当量として、被検試料中に添加された、核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生するレポーター分子からの信号の測定値を用いる場合において、以下の調製方法（ＩＩ）により調製された希釈系列について、被検試料と同条件で測定された測定値と、当該希釈系列の濃度との関係式を決定し、決定した関係式に基づいて、増幅量相当量または初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値に変換するので、正確な関係式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
調製方法（ＩＩ）：被検試料に添加したレポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列を調製する。
また、本実施の形態によれば、増幅量相当量として、被検試料中に添加された、核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生させるレポーター分子からの信号の測定値を用いる場合において、以下の調製方法（ＩＩＩ）により調製された希釈系列について、被検試料と同条件で測定された測定値と、当該希釈系列の濃度との関係式を決定し、決定した関係式に基づいて、増幅量相当量または初期鋳型量相当量Ｎ０を、初期鋳型量を示す値に変換するので、正確な関係式を用いて、初期鋳型量を示す値をより正確に決定することができる。
調製方法（ＩＩＩ）：被検試料と同一の標的核酸を有し、同条件でレポーター分子を添加した標準試料から、被検試料と同条件で核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量（濃度等）を測定して、被検試料と同条件で増幅産物の希釈系列を調製する。これにて、本実施の形態の一例の説明を終える。
つづいて、本実施の形態にかかる実施例１について、以下に図４〜図６を参照して説明する。
［理論式］
まず、本実施例１で用いる理論式について、以下に説明する。
本実施例１にかかるリアルタイムＰＣＲシステムにおいて、ＰＣＲに必要な溶液は、適切な緩衝液や、２種の相補的オリゴヌクレオチドプライマー、過剰量の４種のヌクレオチドトリホスファート、ＤＮＡポリメラーゼ、未知量のターゲット核酸分子等により構成される。このような構成において、ＰＣＲ反応におけるＰＣＲ産物の量Ｎｎは、次式で表される。
Figure 2010227060
 （ここで、ρは増幅係数であり理想的には１であるが、実際には、システムの条件（実験条件）により０〜１の値となる（ρ＝０の場合は、増幅なし）。μは、阻害係数であり理想的には０であるが、ピロリン酸などによる増幅阻害物質の影響により０〜∞の値となる（μ＝∞の場合は、増幅なし）。また、ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）は、ポリメラーゼの作用特性関数であり、その値は、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１における、ポリメラーゼの数Ｎｚｎ−１、ポリメラーゼの比活性Ａｚｎ−１、伸長時間Ｔｘ（秒）、鋳型の塩基長Ｌｔ、プライマーの塩基長Ｌｐに依存する。）
ポリメラーゼが完全に機能するときには、ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）＝１であるので、（１）式は、次式となる。
Figure 2010227060
しかし、実際の条件下では、ポリメラーゼは完全には機能していないと考えられる。また、ポリメラーゼの作用特性関数ｐ（Ｎｚｎ−１，Ａｚｎ−１，Ｔｘ，Ｌｔ，Ｌｐ）の具体的な数式は明らかでないため、本実施例１では、これに替えて変数Ｋを導入して、式（２）を次式のように変更する。
Figure 2010227060
ここで、（１）式、（２）式および（３）式におけるＮｍａｘは、ＤＮＡの飽和量（ＰＣＲの熱サイクルを繰り返した場合のＤＮＡの飽和量）であり、次式で与えられる。
Ｎｍａｘ＝Ｎｐ０＋Ｎ０ （４）
（ここで、Ｎｐ０は初期のプライマーの数、Ｎ０は、鋳型ＤＮＡの数である。）
そして、（３）式により、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎにおけるＤＮＡの数は、次式で表される。
Figure 2010227060
さらに、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎにおけるＤＮＡの増加率（増幅効率）Δｎは、（３）式により、次式で表される。
Figure 2010227060
そして、（６）式から明らかなように、増加率Δｎおよび増幅係数ρは、理論上、以下の関係式となる。
Figure 2010227060
本実施例１では、以上の理論式（具体的には、（５）式）に基づいて、最小二乗フィッティングを行う。具体的には、増幅量相当量Ｎｎが高精度に検出できる複数のＮｎを、（５）式を用いて最小二乗フィッティングすることにより、ρ、μ、Ｎ０およびＮｍａｘを得る。そして、このようにして求められたＮ０を鋳型ＤＮＡの推定数量（初期鋳型量相当量）とする。ここで、ρ、μおよびＮｍａｘの全てがシステム条件で共通の定数（固定値）であれば、フィッティングは、求めるべきパラメータが少なくなり、計算は容易となる。なお、ρは、システム条件により、Ｎｍａｘは溶液の量により変化することが考えられるので、固定値とせず変数のままでもよい。
ここで、以上のように構成された本実施例１の理論式と、従来の理論式の差異について説明する。
例えば、特許文献２において開示されている式には、前述のプライマーとポリメラーゼの量が導入されている。ここで、特許文献２の式において、濃度をＤＮＡ数とし、さらに阻害係数を用いて書き換えると、次式が得られる。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎ−１およびＮｎは、それぞれ、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１およびｎにおけるＤＮＡの数である。また、ｅＶはＤＮＡの残存確率、ρは増幅係数、μは阻害係数、Ｎ０は鋳型ＤＮＡの数、Ｎｐ０は初期のプライマーの数である。また、Ｎｚｎ−１およびＡｚｎ−１は、それぞれ、ＰＣＲの熱サイクル回数ｎ−１におけるポリメラーゼの数および比活性であり、Ｔｘは伸長時間（秒）、Ｌｔは鋳型の塩基長、Ｌｐはプライマーの塩基長である。また、ＤＮＡの飽和量Ｎｍａｘは次式で与えられる。）
Ｎｍａｘ＝Ｎｐ０＋Ｎ０ （９）
ここで、ポリメラーゼが十分に機能し、さらに、ｅＶ＝１である場合は、（９）式により、次式が得られる。
Figure 2010227060
したがって、（１０）式は、次式と表すことができる。
Figure 2010227060
次に、特許文献２では、Ｎｎがポリメラーゼの機能不全に支配される場合の（１）式は次式で表わされるとしている。
Figure 2010227060
このように、特許文献２から導かれる（１２）式の第２項では、Ｎｎ−１が含まれておらず理解できない。また、初期のポリメラーゼの数Ｎｚ０および比活性Ａｚ０についての説明がなく実施できない。さらに、（８）式は、第２項のいずれか最小の値を採用するものであり、現実にどちらの式でもフィッティングできることになり、どちらを採用すべきかが分からず、フィッティングに利用できない。本来、フィッティングを行うにあたって、これらの２つの式は１つにまとめられるべきであり、１つにまとめられた場合に現実に近いシステム構造ができるものと考えられる。
この特許文献２に記載の式に比較して、本実施例１で用いられる理論式（５）は、ＰＣＲの熱サイクル全てにわたって統一した式で表現され、フィッティングに利用可能となるものである。
また、ＰＣＲの熱サイクルに従って変動するポリメラーゼの作用特性関数に替えて、一つの指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入することにより、様々なパラメータ（例えば、ポリメラーゼの数、ポリメラーゼの比活性、伸長時間、鋳型の塩基長、プライマーの塩基長等）を省略することができ、理論式のフィッティングを容易にすることができる。
なお、上記の説明においては、ポリメラーゼの作用特性関数に代替するものとして、指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入するよう説明を行ったが、この指数パラメータ（環境係数Ｋ）が代替するパラメータは、ポリメラーゼに関するパラメータのみに限られない。
すなわち、実際のＰＣＲによる核酸増幅反応とその測定において、測定される増幅量相当量に基づく実際の増幅効率は、ポリメラーゼの作用特性のみならず、様々な既知の因子や未知の因子からの影響を受ける。本実施例１において、理論式における増幅効率に、指数パラメータ（環境係数Ｋ）を導入することにより、それらの多様な因子によるパラメータを一つのパラメータで代替することができ、かつ、実際の増幅効率によく一致させることができることが分かった。
なお、一例として、環境係数Ｋに影響を与える既知の因子としては、以下のものがある。すなわち、測定装置関係の因子としては、サーマルサイクラーによる、設定温度との誤差や、昇温速度、降温速度等の他、測光部による、感度（ＣＣＤと光源）や画像濃度変換処理等の因子がある。また、アプリケーション関係の因子としては、酵素（ポリメラーゼ等）の耐熱性や、プライマー配列による増幅効率の違い、酵素（ポリメラーゼ等）の種類による増幅効率の違い等の因子がある。このように、理論式の増幅効率に導入される指数パラメータの環境係数Ｋは、これらの既知因子によるパラメータや、現在知られていない未知因子によるパラメータに代替することができるものである。
［フィッティング方法］
次に、本実施例１における、具体的なフィッティングの方法について図４〜図６を参照して説明する。
フィッティング時に考慮すべき点は、できるだけ多くの有効データを参照することである。ここで、図４は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ７９００（商品名）の測定装置により得られた測定データの一例を示す図である。図４において、実線は、測定データの実測値（増幅量相当量）による測定曲線を表し、破線は、フィッティングされた理論式の理論曲線を示している。また、横軸は、熱サイクル数ｎを表し、縦軸は、増幅量相当量Ｎを表している。
図４において、理論値は、上述した（５）式を用いて計算した。ただし、データが飽和点まで測定されているものとして、飽和量相当量Ｎｍａｘは、測定された増幅量相当量の最大値（ここでは、３．２７４４９９）とした。なお、簡易的に、増加率Δｎが負の値が出現するまでの測定データであれば、飽和点までのデータと認定した。ただし、厳密には、データは飽和点まで至っていないので、シミュレーションで得られる有限Ｎｍａｘと、生データ（測定データ）の有限Ｎｍａｘが等しくなるように、更にフィッティングの繰り返し計算を行うべきである。なお、ここでは、Ｋ＝１として（例えば、ポリメラーゼが完全に機能する場合を想定して）計算している。
この測定データについて、上述した式（６）により増加率Δｎ特性を描くと、図５に示すように表現できる。図５は、横軸を熱サイクル数ｎとして、縦軸に増加率Δｎを示した図であり、実線は、測定データの実測値による増加率Δｎのグラフ線を表し、破線は、フィッティングされた理論式による増加率Δｎの理論曲線を示している。
図５に示すように、理論値は、上述した（７）式の関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たしているが、測定誤差（主にバックグラウンドノイズ）のために実測値は、この関係式を満たさない場合がある。そのため、好適には、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たさないデータ区間を外し、それ以外の増加率Δｎの単純減少区間をフィッティング領域とすることが望ましい。ここで、図６は、図５において、関係式（０≦Δｎ≦ρ≦１）を満たすフィッティング領域を切り出して実測値と理論値を比較した図である。
図６に示すように、この測定データにおいて、フィッティング領域は、熱サイクル数ｎ＝２７〜３３における７点のデータであった。次に、この７点の測定データのうちの２点（ｎ＝２７およびｎ＝３３）の増幅量相当量Ｎを用いて、フィッティングを行い、反応促進係数ρおよび反応阻害係数μを求めた。
上述した（６）式において、Ｋ＝１とすると次式が得られる。
Figure 2010227060
そして、（１３）式および（１４）式から、次式のようにρおよびμが得られる。
Figure 2010227060
そして、（１５）式および（１６）式に、実測データ（ｎ＝２７および３３の増幅量相当量）を代入することにより、ρ＝１．０６、μ＝３．５８が得られた。さらに、２点のΔ値に一致するように、初期鋳型量相当量Ｎ０を決定すると、Ｎ０＝５ｘ１０−９が得られた。以上、本実施例１では、理解の容易のため、２点フィッティング（連立方程式を解くことにより係数を求める方法）を行う例について説明したが、これに限られず、最小二乗法による多点フィッティング（より好適には、７点フィッティング）を行ってもよい。また、本実施例１においては、もともと反応系での理論式なので検出輝度が式中に登場しないが、この関係を正確に記述するために、輝度ベースの理論式を用いてもよい。
つづいて、本実施の形態にかかる実施例２について、以下に図７〜図２１を参照して説明する。
（実施例２−１）
まず、実施例２−１として、以下に、インターカーレーターを用いたリアルタイムＰＣＲによる標的核酸の測定方法を示す。
（１）増幅産物濃度と蛍光強度の関係
ここで、実施例２−１における測定条件を以下に示す。本実施例２−１において、以下に示すように、被検試料と同じ標的核酸であるヒトβ―グロビン遺伝子に関する、プライマー、鋳型ＤＮＡおよび試薬を用意し、標準試料を調製した。
＜反応液組成＞
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・試薬：２×ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （商品名）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、最終濃度１×）
・鋳型ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，Ｍａｌｅ （商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｃａｔ＃Ｇ１４７１、最終濃度２０００ｐｇ／μｌ）
そして、調製した標準試料に対して、以下に示すＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。
＜ＰＣＲ条件＞
・ｑＰＣＲ装置：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲ温度条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
そして、ＰＣＲ産物に対し、プライマー除去、精製後に、増幅産物の吸光度を測定し、吸光度より増幅産物の濃度を求めた。その後、上述のＰＣＲ反応液と同様の組成となるように希釈系列を作成し、被検試料のＰＣＲ時と同条件にて蛍光強度を測定した。ここで、図７は、増幅産物量と蛍光強度の関係を示す図である。その結果、図７に示すように、増幅産物量（ｙ）と蛍光強度（ｘ）の関係式として、「ｙ＝３６２４００１ｘ」が得られた。
（２）被検試料ＰＣＲ
以下に示す条件で、被検試料Ｎｏ．１（鋳型調製量：８００ｐｇ／μｌ）、Ｎｏ．２（鋳型調製量：２５０ｐｇ／μｌ）を調製した。
＜反応液組成＞
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・試薬：２×ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （商品名）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、最終濃度１×）
・鋳型ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，Ｍａｌｅ （商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｃａｔ＃Ｇ１４７１）
・鋳型ＤＮＡ最終濃度：被検試料Ｎｏ．１ ８００ｐｇ／μｌ、被検試料Ｎｏ．２ ２５０ｐｇ／μｌ
また、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２について、以下のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行い、熱サイクル数に対する蛍光強度を測定し増幅曲線を得た。
＜ＰＣＲ条件＞
・ｑＰＣＲ装置：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲ温度条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
（３）初期鋳型量測定
得られた増幅曲線を、以下の理論式にあてはめ、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の各パラメータの値を算出した。ここで、図８は、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の各パラメータの算出結果を示す図である。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
図８に示す初期鋳型量相当量Ｎ０の値は、図７における蛍光強度に相当する値である。そこで、増幅曲線より理論式を用いて算出したＮ０の値を、図７に示す近似式（関係式）である「ｙ＝３６２４００１ｘ」のｘにあてはめ、増幅産物量ｙの値、すなわち、ここでは被検試料の初期鋳型量を示す値を算出した。ここで、図９は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。
（４）従来法
ここで、本実施例２−１による算出結果と対比を行うため、従来法であるＣｔ値による検量線を用いて、被検試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．２の初期鋳型量を算出した。
まず、Ｃｔ値による検量線を作成するため、上記被検試料の調製方法にて、初期鋳型量の最終濃度が２０００ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、１２５ｐｇ／μｌ、３１．２５ｐｇ／μｌとなるように標準試料を調製し、ＰＣＲを行い、ｑＰＣＲ装置に搭載されているソフトウエアからＣｔ値を求め、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を作成した。ここで、図１０は、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を表した図である。
つづいて、図１０の検量線により被検試料の初期鋳型量の定量を行うため、上述の被検試料Ｎｏ．１（鋳型調製量：８００ｐｇ／μｌ）、Ｎｏ．２（鋳型調製量：２５０ｐｇ／μｌ）に対しＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。そして、求めたＣｔ値から図１０に示す検量線を用いて、被検試料のそれぞれの初期鋳型量を算出した。ここで、図１１は、従来例としてＣｔ値による検量線を用いて初期鋳型量を算出した結果を示す図である。
（５）結果比較
以上のように、実施例２−１および従来例において、初期鋳型量（ｐｇ／μｌ）を算出した。ここで、図１２は、本実施例２−１と従来例における初期鋳型量の算出結果を比較した図である。
図１２に示すように、実施例２−１により算出された初期鋳型量は、従来法と同等以上の精度で、調製時の値（鋳型調製量）を示していることが確認された。これにより、本実施例２−１によれば、従来法のような多量の標準試料によるＰＣＲを必要とする検量線を用いずに、一つの標準試料をＰＣＲに用いるだけで被検試料の初期鋳型量を精度良く算出できることが確認された。なお、本実施例２−１の標準試料は、初期鋳型量が既知のものを用いたが、初期鋳型量が未知のものも使用可能である。また、本実施例２−１では、算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の値を、標的核酸の初期鋳型量を示す値に変換したが、これに限られず、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量Ｎｎを初期鋳型量を示す値（単位）に変換してから、Ｎ０の初期鋳型量を示す値を算出しても同じ結果が得られる。
（実施例２−２）
つづいて、実施例２−２として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによる標的核酸の測定方法を以下に示す。
（１）蛍光物質濃度と蛍光強度の関係
実施例２−２で用いる被検試料のＰＣＲ試薬であるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにおけるレポーター分子は、蛍光色素ＦＡＭ（以後、「ＦＡＭ」と記す。）である。被検試料においてＰＣＲにより増幅される標的核酸分子数と、励起されるＦＡＭ分子数は等しいので、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量は、ＦＡＭの蛍光強度となる。
そこで、被検試料のＰＣＲ反応液と同様の組成となるように、ＦＡＭの希釈系列を作成し、被検試料のＰＣＲ時と同条件にてＦＡＭの蛍光強度を測定した。ここで、図１３は、ＦＡＭ分子のモル濃度と蛍光強度との関係を示す図である。その結果、図１３に示すように、ＦＡＭ分子のモル濃度（ｙ）と蛍光強度（ｘ）の関係式として、「ｙ＝１．１７６３×１０−１１×ｘ」が得られた。
（２）被検試料ＰＣＲ
以下に示す条件で、被検試料Ｎｏ．３（鋳型調製量：８００ｐｇ／μｌ）、Ｎｏ．４（２５０ｐｇ／μｌ）を調製した。
＜反応液組成＞
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・プローブ：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ （ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ（商品名）、最終濃度０．２μＭ）
・試薬：２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・鋳型ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，Ｍａｌｅ （商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｃａｔ＃Ｇ１４７１）
・鋳型ＤＮＡ最終濃度：被検試料Ｎｏ．３ ８００ｐｇ／μｌ、被検試料Ｎｏ．４ ２５０ｐｇ／μｌ
また、被検試料Ｎｏ．３、Ｎｏ．４について、以下のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行い、熱サイクル数に対する蛍光強度を測定し増幅曲線を得た。
＜ＰＣＲ条件＞
・ｑＰＣＲ装置：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲ温度条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
（３）初期鋳型量測定
得られた増幅曲線を、以下の理論式にあてはめ、被検試料Ｎｏ．３、Ｎｏ．４の各パラメータの値を算出した。ここで、図１４は、被検試料Ｎｏ．３、Ｎｏ．４の各パラメータの算出結果を示す図である。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
図１４に示す初期鋳型量相当量Ｎ０の値は、図１３における蛍光強度に相当する値である。そこで、増幅曲線より理論式を用いて算出したＮ０の値を、図１３に示す近似式（関係式）である「ｙ＝１．１７６３×１０−１１×ｘ」のｘにあてはめ、モル濃度ｙの値、すなわち、ここでは被検試料の初期鋳型量を示す値（モル濃度）を算出した。ここで、図１５は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。なお、図１５の相対比は、Ｎｏ．４の値を基準としたＮｏ．３の値の相対比を示す。
（４）結果比較
図１５に示すように、本実施例２−２で算出した初期鋳型量の算出結果は、被検試料の鋳型調製量とよく相関が取れていることが確認された（鋳型調製量の相対比３．２０に対し算出結果３．２１）。これにより、本実施例２−２によれば、従来法のように多量の標準試料によるＰＣＲを必要とすることなく、かつ、検量線を用いずに、レポーター分子である蛍光物質の濃度と蛍光強度の関係を得るだけで、被検試料の初期鋳型量を精度良く算出できることが確認された。また、従来法では、被検試料中の全核酸量は測定できたが、実際に増幅される標的核酸量の測定は不可能であったのに対し、本実施例２−２を用いることで、従来法では不可能であった標的核酸量の測定が可能となった。
（実施例２−３）
つづいて、実施例２−３として、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによる標的核酸の測定方法の他の実施例を以下に示す。
（１）増幅産物濃度と蛍光強度の関係
ここで、実施例２−３における測定条件を以下に示す。本実施例２−３において、以下に示すように、被検試料と同じ標的核酸であるヒトβ―グロビン遺伝子に関する、プライマー、鋳型ＤＮＡおよび試薬を用意し、標準試料を調製した。
＜反応液組成＞
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・プローブ：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ（商品名）、最終濃度０．２μＭ）
・試薬：２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・鋳型ＤＮＡ：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ，Ｍａｌｅ （商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｃａｔ＃Ｇ１４７１、最終濃度２０００ｐｇ／μｌ）
そして、調製した標準試料に対して、以下に示すＰＣＲ条件にてＰＣＲを行った。
＜ＰＣＲ条件＞
・ｑＰＣＲ装置：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲ温度条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
そして、ＰＣＲ産物に対し、プライマー除去、精製後に、増幅産物の吸光度を測定し、吸光度より増幅産物の濃度を求めた。その後、上述のＰＣＲ反応液と同様の組成となるように希釈系列を作成し、被検試料のＰＣＲ時と同条件にて蛍光強度を測定した。ここで、図１６は、増幅産物量（鋳型量）と蛍光強度の関係を示す図である。その結果、図１６に示すように、鋳型量（ｙ）と蛍光強度（ｘ）の関係式として、「ｙ＝５０７３８０３ｘ」が得られた。
（２）被検試料ＰＣＲ
以下に示す条件で、被検試料Ｎｏ．５（鋳型調製量：８００ｐｇ／μｌ）、Ｎｏ．６（鋳型調製量：２５０ｐｇ／μｌ）を調製した。
＜反応液組成＞
・プライマー：ヒトβ―グロビン（最終濃度０．３μＭ）
・プローブ：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ（商品名）、最終濃度０．２μＭ）
・試薬：２×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・鋳型ＤＮＡ最終濃度：被検試料Ｎｏ．５ ８００ｐｇ／μｌ、被検試料Ｎｏ．６ ２５０ｐｇ／μｌ
また、被検試料Ｎｏ．５、Ｎｏ．６について、以下のＰＣＲ条件にてＰＣＲを行い、熱サイクル数に対する蛍光強度を測定し増幅曲線を得た。
＜ＰＣＲ条件＞
・ｑＰＣＲ装置：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ （商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
・ＰＣＲ温度条件：９５℃／１０分→（９５℃／３０秒→６０℃／１分）×４０サイクル
（３）初期鋳型量測定
得られた増幅曲線を、以下の理論式にあてはめ、被検試料Ｎｏ．５、Ｎｏ．６の各パラメータの値を算出した。ここで、図１７は、被検試料Ｎｏ．５、Ｎｏ．６の各パラメータの算出結果を示す図である。
Figure 2010227060
 （ここで、Ｎｎは、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎ０は、初期鋳型量相当量、ｊは、熱サイクル数、Ｎｊは、熱サイクル数ｊにおける増幅量相当量（蛍光強度）、Ｎｍａｘは、飽和量相当量、ρは、反応促進係数、μは、反応阻害係数、Ｋは、環境係数である。）
図１７に示す初期鋳型量相当量Ｎ０の値は、図１６における蛍光強度に相当する値である。そこで、増幅曲線より理論式を用いて算出したＮ０の値を、図１６に示す近似式（関係式）である「ｙ＝５０７３８０３ｘ」のｘにあてはめ、鋳型量ｙの値、すなわち、ここでは被検試料の初期鋳型量を示す値を算出した。ここで、図１８は、初期鋳型量の算出結果を示す図である。
（４）従来法
ここで、本実施例２−３による算出結果と対比を行うため、従来法であるＣｔ値による検量線を用いて、被検試料Ｎｏ．５、Ｎｏ．６の初期鋳型量を算出した。
まず、Ｃｔ値による検量線を作成するため、上記被検試料の調製方法にて、初期鋳型量の最終濃度が２０００ｐｇ／μｌ、５００ｐｇ／μｌ、１２５ｐｇ／μｌ、３１．２５ｐｇ／μｌとなるように標準試料を調製し、ＰＣＲを行い、ｑＰＣＲ装置に搭載されているソフトウエアからＣｔ値を求め、Ｃｔ値対初期鋳型量を示す検量線を作成した。ここで、図１９は、Ｃｔ値対鋳型量を示す検量線を表した図である。
つづいて、図１９の検量線により被検試料の初期鋳型量の定量を行うため、上述の被検試料Ｎｏ．５（鋳型調製量：８００ｐｇ／μｌ）、Ｎｏ．６（鋳型調製量：２５０ｐｇ／μｌ）に対しＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。そして、求めたＣｔ値から図１９に示す検量線を用いて、被検試料のそれぞれの初期鋳型量を算出した。ここで、図２０は、従来例としてＣｔ値による検量線を用いて初期鋳型量を算出した結果を示す図である。
（５）結果比較
以上のように、実施例２−３および従来例において、初期鋳型量（ｐｇ／μｌ）を算出した。ここで、図２１は、本実施例２−３と従来例における初期鋳型量の算出結果を比較した図である。
図２１に示すように、実施例２−３により算出された初期鋳型量は、従来法と同等以上の精度で、調製時の値（鋳型調製量）を示していることが確認された。これにより、実施例２−３によれば、従来法のような多量の標準試料によるＰＣＲを必要とする検量線を用いずに、一つの標準試料をＰＣＲに用いるだけで被検試料の初期鋳型量を精度良く算出できることが確認された。なお、実施例２−３の標準試料は、初期鋳型量が既知のものを用いたが、初期鋳型量が未知のものも使用可能である。また、本実施例２−３では算出した初期鋳型量相当量Ｎ０の値を、標的核酸の初期鋳型量を示す値に変換したが、これに限られず、熱サイクル数ｎにおける増幅量相当量Ｎｎを初期鋳型量を示す値（単位）に変換してから、Ｎ０の初期鋳型量を示す値を算出しても同じ結果が得られる。
以上で、本実施例２の説明を終える。なお、上記実施例２においては、増幅量相当量（蛍光強度）と鋳型量との関係が線形で表されることを前提として関係式を導出したが、これに限られず、よりよい近似が得られる場合には非線形の関係式を導いてもよい。
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
例えば、標的核酸測定装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、標的核酸測定装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するように構成してもよい。
また、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
このほか、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
また、標的核酸測定装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
例えば、上述の実施形態においては、測定部１１６は、標的核酸測定装置１００が備える一手段として構成したが、本発明はこれに限られず、核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えたリアルタイムＰＣＲ装置等の測定装置として構成してもよい。すなわち、上記測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムとして、本発明を構成してもよいものである。そして、本標的核酸測定システムにおいて、測定装置の測定部は、上記実施の形態における測定部１１６の機能を有し、情報処理装置の記憶部と制御部は、上記実施の形態における標的核酸測定装置１００の記憶部１０６と制御部１０２の機能を有し、同様の効果を奏するよう構成される。
また、標的核酸測定装置１００の各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行われる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラム（例えば、標的核酸測定プログラム）にて実現してもよく、また、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現してもよい。尚、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて標的核酸測定装置１００に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶部１０６などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部を構成する。
また、このコンピュータプログラムは、標的核酸測定装置１００に対して任意のネットワーク３００を介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
また、本発明に係るプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
記憶部１０６に格納される各種のデータベース等（測定データファイル１０６ａ、理論式ファイル１０６ｂ、関係式ファイル１０６ｃ等）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
また、標的核酸測定装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
以上、詳細に説明したように、本発明にかかる標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラム並びに記録媒体によれば、測定された核酸の増幅量に相当する量をそのまま当てはめることができ、実際のＰＣＲ増幅効率を正確に反映することができる理論式を用いて、増幅反応混合物中のサイクル数０における初期鋳型量を示す値を正確に決定することができ、医療や製薬や創薬や生物学研究や臨床検査などの様々な分野において極めて有用である。
１００ 標的核酸測定装置
１０２ 制御部
１０２ａ 理論式フィッティング部
１０２ｂ 初期鋳型量相当量算出部
１０２ｃ 初期鋳型量値変換部
１０４ 通信制御インターフェース部
１０６ 記憶部
１０６ａ 測定データファイル
１０６ｂ 理論式ファイル
１０６ｃ 関係式ファイル
１０８ 入出力制御インターフェース部
１１２ 入力部
１１４ 出力部
１１６ 測定部
２００ 外部システム
３００ ネットワーク

Claims (12)

  1. 核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を、理論式にあてはめることにより、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を算出し、算出した前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する標的核酸測定方法であって、
    前記理論式は、
    指数パラメータである環境係数、および、前記初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含むこと、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
  2. 請求項１に記載の標的核酸測定方法において、
    前記理論式における、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、前記反応促進係数、および、前記反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータ、および、前記環境係数により、前記核酸増幅反応の増幅効率を定義すること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
  3. 請求項２に記載の標的核酸測定方法において、
    前記理論式は、前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記初期鋳型量に相当する量に対する、前記熱サイクル数ごとの前記増幅効率に１を加えた数の総乗で表すこと、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
  4. 請求項３に記載の標的核酸測定方法において、
    前記理論式は、以下に示す式であること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
    Figure 2010227060
     （ここで、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎ０は、前記初期鋳型量に相当する量、ｊは、前記熱サイクル数、Ｎｊは、前記熱サイクル数ｊにおける標的核酸の増幅量に相当する量、Ｎｍａｘは、前記標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、ρは、前記反応促進係数、μは、前記反応阻害係数、Ｋは、前記環境係数である。）
  5. 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
    最小二乗法を用いて前記理論式にあてはめること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
  6. 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
    以下の式で表される増加率が、０以上１以下である領域において測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を前記理論式にあてはめることにより、前記反応促進係数および／または前記反応阻害係数を求め固定化すること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
    Figure 2010227060
     （ここで、Δｎは、前記増加率であり、Ｎｎは、前記熱サイクル数ｎにおける前記標的核酸の増幅量に相当する量である。）
  7. 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
    前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、２本鎖ＤＮＡの不在では信号を発しないが２本鎖ＤＮＡの存在時にのみ信号を発する、インターカーレーターからの信号の測定値であり、
    以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
    ａ）前記被検試料と同一の前記標的核酸を有する標準試料から、前記被検試料と同条件で前記核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量を測定して、前記被検試料と同条件で前記インターカーレーターを添加した前記増幅産物の希釈系列を調製する工程、
    ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記インターカーレーターからの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
    ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度との関係式を決定する工程、および、
    ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する工程。
  8. 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
    前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、前記核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生するレポーター分子からの信号の測定値であり、
    以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
    ａ）前記レポーター分子と同一の信号を発生させる蛍光分子の希釈系列を調製する工程、
    ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記蛍光分子からの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
    ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度との関係式を決定する工程、および、
    ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値である前記濃度に変換する工程。
  9. 請求項１乃至４のいずれか一つに記載の標的核酸測定方法において、
    前記標的核酸の増幅量に相当する量は、前記被検試料中に添加された、前記核酸増幅反応時の伸長反応により信号を発生させるレポーター分子からの信号の測定値であり、
    以下の工程ａ）〜ｄ）にて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換すること、
    を特徴とする標的核酸測定方法。
    ａ）前記被検試料と同一の前記標的核酸を有する標準試料から、前記被検試料と同条件で前記核酸増幅反応を行い、当該標的核酸の増幅産物の増幅量を測定して、前記増幅産物の希釈系列を調製する工程、
    ｂ）前記工程ａ）で調製された前記希釈系列における前記レポーター分子からの信号を、前記被検試料と同条件で測定して前記測定値を取得する工程、
    ｃ）前記工程ｂ）で取得された前記測定値と、前記工程ａ）で調製された前記希釈系列の濃度の関係式を決定する工程、および、
    ｄ）前記工程ｃ）で決定された前記関係式に基づいて、前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する工程。
  10. 記憶部と制御部を少なくとも備えた標的核酸測定装置であって、
    前記記憶部は、
    核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
    指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
    を備え、
    前記制御部は、
    前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、
    前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、
    前記初期鋳型量相当量算出手段により算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換手段と、
    を備えたことを特徴とする標的核酸測定装置。
  11. 核酸増幅反応における熱サイクル数、および、標的核酸の増幅量に相当する量を前記熱サイクル数ごとに測定する測定部を備えた測定装置と、記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置と、を備えた標的核酸測定システムであって、
    前記記憶部は、
    前記測定部により測定された、前記熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとの前記標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
    指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、かつ、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
    を備え、
    前記制御部は、
    前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティング手段と、
    前記理論式フィッティング手段によりフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出手段と、
    前記初期鋳型量相当量算出手段により算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換手段と、
    を備えたことを特徴とする標的核酸測定システム。
  12. 記憶部と制御部を少なくとも備えた情報処理装置に実行させるための標的核酸測定プログラムであって、
    前記記憶部は、
    核酸増幅反応における熱サイクル数、および、前記熱サイクル数ごとに測定された標的核酸の増幅量に相当する量を記憶する増幅量相当量記憶手段と、
    指数パラメータである環境係数、および、被検試料中の初期鋳型量に相当する量を含み、標的核酸増幅時の飽和量に相当する量、反応促進係数、および、反応阻害係数のうち少なくとも一つのパラメータを含む理論式を記憶する理論式記憶手段と、
    を備えており、
    前記制御部において、
    前記記憶部に記憶された前記熱サイクル数ごとに測定された前記標的核酸の増幅量に相当する量を、前記理論式にあてはめて当該理論式のフィッティングを行う理論式フィッティングステップと、
    前記理論式フィッティングステップにおいてフィッティングされた前記理論式から、前記初期鋳型量に相当する量を算出する初期鋳型量相当量算出ステップと、
    前記初期鋳型量相当量算出ステップにおいて算出された前記初期鋳型量に相当する量を、前記初期鋳型量を示す値に変換する初期鋳型量値変換ステップと、
    を実行させるための標的核酸測定プログラム。
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