CN107574231A - 用以实时定量核酸的方法 - Google Patents
用以实时定量核酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107574231A CN107574231A CN201710285801.0A CN201710285801A CN107574231A CN 107574231 A CN107574231 A CN 107574231A CN 201710285801 A CN201710285801 A CN 201710285801A CN 107574231 A CN107574231 A CN 107574231A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- reference sample
- amplification
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 102
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 80
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 claims description 94
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 53
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 18
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 13
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 9
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 8
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical group [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 7
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011017 operating method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 abstract 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 14
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 102000015494 Mitochondrial Uncoupling Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010050258 Mitochondrial Uncoupling Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102100029820 Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050002686 Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
- G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用以实时定量核酸的方法。本发明的一种实时定量标的核酸的方法包括，在一样本中，经由与标的核酸共享相同核酸序列的参照样本，来建立拷贝数对指定参数的参考表，之后，获得标的样本的指定参数，并经由查找参考表和内插而获得拷贝数。本发明的用于定量标的核酸的方法，标的核酸会被独立地定量，而无需使用校准曲线与标准对照相比较。本发明不仅提供了一种新的定量方法，而且还提出一种消除会伴随扩增效率、聚合酶活性、引物浓度和仪器变异的变因的新标准操作方法。
Description
技术领域
本发明内容是关于借助定量实时聚合酶链式反应(PCR)的核酸定量技术领域。
背景技术
现今在分子生物学的许多领域中，用于定量核酸的多种方法是重要的，特别是在分子诊断的领域中。定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction，下文称为qPCR)被认为是定量基因表达水平的最灵敏的方法之一，并且正成为用于检测和定量所选基因表达谱(expression profiles)的常用工具。
到目前为止，绝对定量是用于进行定量扩增(quantitative amplification)最常用的方法。也就是说，对于每个qPCR而言，在相同的扩增反应中，需要以具有已知浓度的相同核酸序列来扩增几个连续稀释过的标准对照。经由检测其荧光信号的分布来产生标准曲线，并作为参考之用。然后，藉由使用标准曲线的内插计算来获得未知样本的浓度。
然而，对于所述方法还存在有几种缺点和限制。首先，不管未知样本的量为何，用来建立标准曲线所使用试剂的量很大，因为需要获得每个qPCR的标准曲线。这是至关重要的，因为需要标准曲线的循环阈值(Cycle Threshold values)，或称为Ct值，使得内插计算能够进行，以获得未知样本的拷贝数。如此将导致大量试剂和对照组的消耗，使得进行每个qPCR的成本增加，亦导致测试费用的增加。
其次，绝对定量使用每个标准对照的Ct值来作为内插计算的索引，而获得未知样本的拷贝数。然而，Ct值的定义局限于制造商，其亦进行多样的校准方法。此外，有很多外部因素会影响Ct值的确定。结果表明，即使使用具有相同扩增条件的相同仪器，在固定浓度下而在相同的核酸序列上进行qPCRs，由不同操作者或相异的扩增重复所获得的Ct值之间仍有着变异。因此，为了要有任何未知样本的正确拷贝数计算，连续稀释的标准对照必须要与未知样本一起扩增，来保持外部变量的恒定。
第三，即使在相同的qPCR测试中，当中的背景值和所有操作变因都被忽略，试剂的浓度仍然会影响Ct值。像是这样的变异不容小觑。例如，如果只有引物浓度是唯一的变数来进行扩增，则仍然需要以不同引物的浓度来校准每个样本的恒定标准曲线，以获得DNA拷贝数。
总之，Ct值本身不是绝对的，并且只能表示当特定PCR样本扩增到特定状态时的循环数。因此，此值将由于实验时的不同条件而变化，并且Ct值的绝对值本身不可能会有任何的参照价值。也就是说，尽管使用当前方法所获得拷贝数的高精确度，但是需要专业训练过的操作员进行复杂的操作程序，以使得操作变异最小化。
目前实时qPCR是利用Ct值来进行标的样本的绝对或相对定量。然而，这两种方法都基于一些假设：(1)指数期的扩增不受试剂耗尽限制(即，扩增效率为≈1)；(2)扩增效率恒定；和(3)标准品和标的样本的扩增效率相同。
W.Liu和D.A.Saint在2002年时，提出了一种以S形曲线拟合而用于线段拟合的新的数学模型(Biochemical and Biophysical Research Communications p.347-353,vol.2942002)，其中基于两种因子来定义循环数：每次循环的荧光信号，和在扩增期间增加的荧光染料强度的斜率因子。但是所提出的方法并不实用。
发明内容
为了改进上述的问题，在此提出了一种用于绝对qPCR的新方法。首先，藉由扩增其连续稀释过的参考样本，将拷贝数标准化至其指定的参数，并经由校准来建立参照表。其次，使用相同的分析方法来校准标的核酸的结果，然后参考参照表中的指定参数，而获得拷贝数。藉由本发明，操作员不需要与未知样本一起进行多种标准的定量，同时拷贝数与Ct值无关。
简言之，本发明内容多方面针对一种克服现有技术缺点的核酸实时定量的方法。本发明的目的，特别是要提供用于定量标的核酸(以下称为标的样本)的方法，使得标的样本能被独立地量化，而不需要不时地执行标准曲线。本发明不仅提供了一种新的定量方法，而且还提出了消除会伴随qPCR的扩增效率、聚合酶活性、引物浓度和仪器变因的Ct变数的新标准操作方法。
在本发明中，参考样本和标的样本等两者的扩增，可以以光学信号(荧光信号，磷光信号等)和化学感应器(氢离子，焦磷酸盐等)等来监测，只要其与扩增成比例。
根据本发明的一个方面，优选实施例中的方法包括：a)建立拷贝数对指定参数的参照表；b)扩增标的样本；c)实时测量标的样本的扩增；d)分析所侦测到的信号，以获得标的样本的指定参数；和e)查找参照表和依据参照表进行内插，以获得标的样本的拷贝数。其中，由以下步骤对参照表进行校准和监测：i.)准备和扩增参考样本；ii.)实时测量参考样本的扩增；iii.)分析所侦测到的信号，以获得每个参考样本的指定参数；和iv.)建立拷贝对指定参数的参照表。所侦测到标的样本的信号，将使用与参考样本相同的工序来进行分析。
根据本发明的另一方面，参考样本和标的样本所侦测到的信号，将以双参数S形函数(two-parametric sigmoid function)和正规化工序(normalizing process)来分析。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于定量标的核酸的方法，其包括以下步骤：
(a)从具有与标的核酸相同核酸序列的参考样本群，来建立拷贝数对指定参数的一种参照表，其中所述参照表是经由以下步骤来校准和拟合：
i.准备和扩增参考样本群；
ii.实时监测和侦测参考样本群的扩增；
iii.分析所侦测到的信号群，以得到每个参考样本的指定参数；以及
vi.建立拷贝数对指定参数的参照表；
(b)扩增标的核酸；
(c)实时监测和侦测标的核酸的扩增；
(d)分析所侦测到的信号群，以获得标的核酸的指定参数；以及
(e)由参照表进行查找和内插，以获得标的核酸的拷贝数。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，标的核酸和参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，步骤iii和步骤(e)在扩增饱和时，将所侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，步骤iii和步骤(e)使用以下的S形函数来拟合每个参考样本的曲线：
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述正规化信号是一种荧光信号。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，步骤iii和步骤(e)是以曲线本身的斜率将每个系列稀释的循环数正规化。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于定量标的核酸的方法，其包括以下步骤：
(a)从具有与标的核酸相同的核酸序列的参考样本群，来建立拷贝数对正规化循环数的参照表，其中所述参照表是经由以下步骤来校准和拟合：
i.准备参考样本群；
ii.扩增参考样本群；
iii.实时监测和侦测参考样本群的扩增；
iv.当扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
v.使用以下的S形函数来拟合每个系列稀释的曲线：
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率；
vi.以曲线本身的斜率将每个参考样本的循环数正规化；以及
viii.重复步骤v，得到每个参考样本的t1/2；
(b)扩增标的核酸；
(c)实时监测和侦测标的核酸的扩增；
(d)当标的核酸的扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
(e)使用以下的S形函数来拟合标的核酸的曲线：
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是该曲线的一斜率；
(f)以曲线本身的斜率将标的核酸的循环数正规化；
(g)重复步骤(e)，得到标的核酸的t1/2；以及
(h)经由查找参照表，以获得样本中包含标的核酸的拷贝数。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，标的核酸和参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
具体地，所述用于定量标的核酸的方法中，所述侦测到的信号是一种荧光信号。
根据本发明的另一方面，提供了一种从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法，其包括以下步骤：
(a)准备参考样本群；
(b)扩增参考样本群；
(c)实时监测和侦测参考样本群的扩增；
(d)当扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
(e)使用以下的S形函数来拟合每个参考样本的曲线：
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率；
(f)以曲线本身的斜率，将每个参考样本的循环数正规化；
(h)重复步骤(e)，来得到每个参考样本的t1/2；以及
(i)建立在步骤(h)中所得到的每个参考样本的t1/2的参照表。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测参考样本群的扩增。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测参考样本群的扩增。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
具体地，所述从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法中，所述信号是一种荧光信号
本发明内容是简要地识别本发明的一些方面，并在以下的段落中进一步的描述。本发明内容不旨在标识本发明的关键或必要特征，也不旨在限制任何保护范围。
术语“方面”将被解读为“至少一个方面”。前述的方面和本发明于此的其它方面将以实施例的方式例示，但不限于附图。
本发明的上述和其余目的，在阅读了以下由多样的附图与所表述优选实施例的具体实施方式后，无疑地将对本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
在参照附图后，可以对本发明达成更加完整的理解，其中：
图1绘示用于建构拷贝数对指定参数的参照表过程的一个实施例。
图2绘示用于建构拷贝数对指定参数的参照表过程的另一个实施例。
图3绘示决定标的样本拷贝数的方法。
图4绘示实施例1的荧光信号的侦测到信号。
图5显示将荧光信号正规化而落入实施例1的0-1的范围内的结果。
图6显示实施例1的S形曲线拟合的结果。
图7显示正规化循环数和再拟合实施例1的结果。
图8A至图8D显示正规化循环数和再拟合实施例2的结果。
图9A至图9D显示正规化循环数和再拟合实施例3的结果。
具体实施方式
以下仅说明本发明的原理。因此，应当理解的是，尽管在其中没有明确描述或示出，本领域技术人员将能够设计出各种的安排，但体现本发明的原理并仍包括在其精神和范围内。
再者，本文列举的所有实施例和条件性语言主要旨在出于教示目的，以帮助读者理解本发明的原理，和发明人为促进本领域进展而贡献的概念，并要解释为不局限于这些具体叙述的实施例和条件。
此外，本文中记载本发明的原理、方面和实施例，及其特定实施例的所有陈述，旨在包括其结构性和功能性的均等。另外，这些均等意图包括当前已知的均等以及未来开发的等效物，即，之后所开发的、执行相同功能的任何元件，而不管其结构为何。
除非本文另有明确说明，否则附图未按比例绘制。
如图1所示，本发明针对一种核酸的实时定量方法。图1绘示方法100的一个实施例，此方法100可以用于从参考样本来建构参照表，以提供拷贝数对于在进行定量计算时有用的指定参数的资讯。在一个方面，建构参照表的方法可以适合在实时操作PCR的工序中，其中的扩增计算是进行查找参照表和依参照表进行内插，以获得标的样本的拷贝数，又标的样本与参考样本共享相同的核酸序列，并在相同条件下扩增。
方法100在开始时要准备参考样本(步骤110)，并实时测量扩增(步骤111)。参考样本和标的样本这两者的扩增，可经由实时监测在扩增过程中产生的光学信号(荧光信号、磷光信号等)来进行实时监测，或为扩增副产物的化学感应器(氢离子、焦磷酸盐等)，或是其它特定的材料，只要其与扩增成比例即可。
一旦扩增完成时，分析来自参考样本所侦测到的信号(步骤112)，然后使用拷贝数对指定参数的资讯来建构参照表(步骤113)。然后，在相同的条件下扩增标的样本(步骤114)，同时实时测量其扩增(步骤115)。在分析所侦测到的信号(步骤116)之后，标的样本的拷贝数即可以参照表，经由比较指定参数的值而得知(步骤117)。使用本发明所提出这种新颖的定量方法，可以消除伴随扩增效率、聚合酶活性、引物浓度和仪器变异的变因。
在本发明的另一个实施方式中，参考样本和标的样本的扩增，是在扩增期间加入发射荧光信号的染料来监测。染料也可以被在扩增过程中会产生光学信号(荧光信号，磷光信号等)的其他材料(染料、分子信标、探针等)，或是为扩增副产物的化学感应器(氢离子、焦磷酸盐等)或是其它特定的材料所替代，只要其与扩增成比例即可。
如图2和图3所示，以S形曲线拟合函数来分析参考样本和标的样本所侦测到的信号。这是因为S形曲线函数在模配(model)PCR扩增上，显示出比阈值(threshold method)方法所基于的指数模型更加有效。本实施例中，用于分析所侦测到信号的双参数S形函数如下所示：
其中NS是正规化的荧光信号，t是循环数，t1/2是反应的荧光量达到最大反应荧光量的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率。t1/2和τ是两个变量。
在本实施例中，指定参数为t1/2。本实施例有两个操作部分。图2绘示从参考样本建构参照表的过程。图3绘示出经由查找参照表和依参照表进行内插，而获得标的样本的拷贝数的过程。使用者首先准备好来自参考样本的参照表(步骤200)。参考样本的PCR扩增区域，其与标的样本共享相同的核酸序列，系准备(步骤210)、扩增和监测实时的荧光信号(步骤211)。一旦扩增完成，就以正规化和S形曲线拟合来分析所侦测到的信号，而获得t1/2(步骤212a至步骤212d)。然后使用拷贝数对t1/2来建构参照表(步骤213)。然后，在与参考样本相同的条件下，准备和扩增标的样本(步骤314)，同时实时测量其扩增(步骤315)。在分析过标的样本所侦测到的信号(步骤316a至步骤316d)之后，经由查找参照表和依参照表对标的样本的t1/2进行内插，即可得知标的样本的拷贝数(步骤317)。
分析参考样本(步骤212a至步骤212d)和标的样本(步骤316a至步骤316d)所侦测到信号的关键工序及其操作理论如下：
a)在侦测到参考样本的信号之后，减去每个参考样本的背景值，然后将荧光信号的变异正规化至0-1的范围中(步骤212a)。在这个步骤之后，荧光信号即被正规化。此步骤的目的是在于减少由反应变异所引起的不一致的基线信号。(如光源或检测器放大的微小差异等)
b)其次，以两参数的S形函数将正规化的荧光信号和循环数来加以拟合(fit)(步骤212b)。在此步骤之后，获得每个参考样本的t1/2和τ。这两个参数，t1/2和τ，表示此次扩增的所有参考样本的趋势线。这两个参数提供了参考样本的拷贝数和扩增效率的资讯。
c)将循环数除以τ，并将记录循环数的x轴正规化(步骤212c)。由于扩增效率在这两种情况下都会变化，(1)对于不同的qPCR操作而言，和(2)对于某一次qPCR操作中扩增的每个样本而言，所以就会很难估计拷贝数。因此，本步骤旨在，只将拷贝数关联至被正规化后的循环数。
d)以S形函数将每个参考样本的曲线再拟合，于是获得每个参考样本的t1/2(步骤212d)。t1/2仅与拷贝数有关。也就是说，只有当每个参考样本的拷贝数不同时，t1/2才会不同。每个参考样本的t1/2，对于不同扩增效率都会保持恒定。
e)以对应于参考样本每个不同浓度的每个t1/2，来组织参照表(步骤213)。在建立了参照表之后，如果还需要定量与参考样本共享相同核酸序列的标的样本时，则可以经由与参照表相比较和依据参照表进行内插，来获得标的样本的拷贝数(步骤317)，参照表则是由以下步骤完成标的样本的扩增(步骤314)所得到的荧光信号(步骤315)而获得，并以相同的数据处理步骤来处理数值(步骤316a至步骤316d)，以获得标的样本的t1/2(步骤317)。
本发明以下列实施例来加以进一步阐明：
实施例1不同引物浓度的校准
步骤A.UCP1 gDNAs的扩增(参考样本群)(步骤210)
使用 DNA BLOOD Mini Kit(QIAGEN N.V.)从全血中分离gDNA。将gDNA浓度调节至10ng/μl(以下称为参考样本群)。
使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物，来扩增UCP1序列。引物序列如表1所示。从0.4μM来制备两个系列，引物浓度为0.2μM和0.1μM，的单一稀释液。如表2所示，对于每个量的引物而言，实验重复进行两次。
表1.引物序列
进行扩增反应，并以BioRad CFX Connect Real-time System(BioRadLaboratories,Inc.)的染料来实时测量和监测。每个反应混合物的体积为25μl，并在以下条件下扩增：
表2.参考样本的扩增条件
将反应混合物首先在94℃温育2分钟。实际扩增反应则根据以下方案，进行过45次循环：
94℃10秒→60℃10秒→72℃15秒。
步骤B.数据分析
图4绘示出监测荧光信号所侦测到的信号群。如图5所示，在侦测到参考样本的信号之后，减去个别参考样本的背景值，然后再将荧光信号的变数正规化到0-1内的范围(步骤212a)。
如图6所示，将正规化的荧光信号和循环数，以双参数的S形函数来拟合(步骤212b)。在此步骤中的R平方大于0.999(r>0.999)。参考样本的t1/2和τ如下所示：
表3.在以S形函数曲线拟合(步骤212b)每个样本后的t1/2和τ
| t1/2 | τ | ||
| No.1 | 0.4μM | 27.87 | 1.5239 |
| No.2 | 0.4μM | 27.9 | 1.4428 |
| No.3 | 0.2μM | 29.773 | 1.6063 |
| No.4 | 0.2μM | 29.826 | 1.614 |
| No.5 | 0.1μM | 37.16 | 1.9203 |
| No.6 | 0.1μM | 37.038 | 1.9301 |
如图7所示，将循环数除以τ，然后将每个循环数的轴正规化(步骤212c)。本步骤中的R平方也大于0.999(r>0.999)。将每个参考样本的曲线，以S形函数再拟合，而获得每个参考样本的t1/2(步骤212d)，如表4所列。每个参考样本的t1/2，不因不同的引物浓度而有所改变。
表4.正规化(步骤212c)后每个参考样本的t1/2
| t1/2 | ||
| No.1 | 0.4μM | 18.289 |
| No.2 | 0.4μM | 19.338 |
| No.3 | 0.2μM | 18.535 |
| No.4 | 0.2μM | 18.48 |
| No.5 | 0.1μM | 19.351 |
| No.6 | 0.1μM | 19.19 |
实施例2校准不同的dNTP浓度
步骤A.UCP1 gDNAs的扩增(参考样本群)(步骤210)
gDNA萃取和扩增的条件和过程与实施例1相同而列在表5中，除了：a.从0.4mM制备两个系列单一稀释液的dNTP浓度为0.2mM和0.1mM，b.引物的浓度为0.4μM。
表5.参考样本的扩增条件
步骤B.数据分析
如图8A至图8D所示，利用与实施例1相同的处理步骤来分析所侦测到的信号，所获得的t1/2仅与拷贝数有关，并且每个参考样本的t1/2不因不同的dNTP浓度而改变。所侦测到的信号绘示于图8A。图8B绘示减去每个参考样本的背景值，并将荧光信号的变异正规化到0-1的范围内(步骤212a)。在正规化荧光信号之后，以双参数的S形函数来拟合(步骤212b)正规化的荧光信号和循环数，如图8C所示。将循环数除以τ值，来对每个循环数轴进行正规化(步骤212c)。将每个参考样本的曲线以S形函数再拟合(步骤212d)。结果示于图8D。
实施例3建立参照表
在实施例3中，使用三种不同浓度的模板，来建立拷贝数对t1/2的参照表。
步骤A.UCP1 gDNAs的扩增(参考样本群)(步骤210)
使用 DNA BLOOD Mini Kit(QIAGEN N.V.)从全血中分离gDNA。将gDNA浓度调节至10ng/μl。由此制备gDNA浓度为2.5ng/μl和0.625ng/μl的两个系列的单一稀释液。
使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物来扩增UCP1序列。引物序列已见于表1。如表6所示，对于每种量的gDNA而言，实验重复进行两次。进行扩增反应，并以BioRad CFXConnect Real-time System(BioRad Laboratories,Inc.)的染料来实时测量和监测。每个反应混合物的体积为25μl，并在以下条件下扩增：
表6.参考样本群的扩增条件
步骤B.数据分析
如图9A至图9D所示，利用与实施例1相同的处理步骤来分析所侦测到的信号，所获得的t1/2仅与拷贝数有关。所侦测到的信号绘示于图9A。图9B绘示减去每个参考样本的背景值，并将荧光信号的变数正规化到0-1的范围内(步骤212a)。在正规化荧光信号之后，以双参数的S形函数来拟合(步骤212b)正规化的荧光信号和循环数，如图9C所示。此步骤中的R平方大于0.999(r>0.999)。将循环数除以τ值，来对每个循环数轴进行正规化(步骤212c)。将每个参考样本的曲线以S形函数再拟合(步骤212d)。结果示于图9D。
每个拷贝数的t1/2如表7所示。它们仅在拷贝数不同时才不同。
表7
| UCP-1的拷贝数 | t1/2 |
| 0.625ng | 18.280 |
| 2.5ng | 19.217 |
| 10ng | 20.580 |
实施例4标的样本的定量
以5ng gDNA作为标的样本的DNA模板，扩增条件和过程与实施例3中的参考样本相同。在扩增标的样本(步骤314)之后，实时监测和侦测荧光信号(步骤315)。在利用与实施例3相同的处理步骤来分析侦测到的信号之后，获得标的样本的t1/2(步骤316a至316d)。
标的样本的t1/2的值为18.497。在将获得的t1/2比较并内插到参照表之后，标的样本的拷贝数为4.03ng(步骤317)。相对误差小于理论值的20％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 克雷多生物医学私人有限公司
<120> 用以实时定量核酸的方法
<130> GAI17TW1161
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UCP1的前置引物
<400> 1
cagttaagag cctttgccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UCP1的反置引物
<400> 2
tccttggaat ccagaactac 20
Claims (24)
1.一种用于定量标的核酸的方法，包括以下步骤：
(a)从具有与标的核酸相同核酸序列的参考样本群，来建立拷贝数对指定参数的一种参照表，其中所述参照表是经由以下步骤来校准和拟合：
i.准备和扩增参考样本群；
ii.实时监测和侦测参考样本群的扩增；
iii.分析所侦测到的信号群，以得到每个参考样本的指定参数；以及
vi.建立拷贝数对指定参数的参照表；
(b)扩增标的核酸；
(c)实时监测和侦测标的核酸的扩增；
(d)分析所侦测到的信号群，以获得标的核酸的指定参数；以及
(e)由参照表进行查找和内插，以获得标的核酸的拷贝数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，标的核酸和参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤iii和步骤(e)在扩增饱和时，将所侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤iii和步骤(e)使用以下的S形函数来拟合每个参考样本的曲线：
<mrow>
<mi>N</mi>
<mi>S</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mn>1</mn>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>+</mo>
<msup>
<mi>e</mi>
<mrow>
<mo>-</mo>
<mrow>
<mo>(</mo>
<mrow>
<mi>t</mi>
<mo>-</mo>
<msub>
<mi>t</mi>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>/</mo>
<mn>2</mn>
</mrow>
</msub>
</mrow>
<mo>)</mo>
</mrow>
<mo>/</mo>
<mi>&tau;</mi>
</mrow>
</msup>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述正规化信号是一种荧光信号。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤iii和步骤(e)是以曲线本身的斜率将每个系列稀释的循环数正规化。
11.一种用于定量标的核酸的方法，包括以下步骤：
(a)从具有与标的核酸相同的核酸序列的参考样本群，来建立拷贝数对正规化循环数的参照表，其中所述参照表是经由以下步骤来校准和拟合：
i.准备参考样本群；
ii.扩增参考样本群；
iii.实时监测和侦测参考样本群的扩增；
iv.当扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
v.使用以下的S形函数来拟合每个系列稀释的曲线：
<mrow>
<mi>N</mi>
<mi>S</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mn>1</mn>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>+</mo>
<msup>
<mi>e</mi>
<mrow>
<mo>-</mo>
<mrow>
<mo>(</mo>
<mrow>
<mi>t</mi>
<mo>-</mo>
<msub>
<mi>t</mi>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>/</mo>
<mn>2</mn>
</mrow>
</msub>
</mrow>
<mo>)</mo>
</mrow>
<mo>/</mo>
<mi>&tau;</mi>
</mrow>
</msup>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率；
vi.以曲线本身的斜率将每个参考样本的循环数正规化；以及
viii.重复步骤v，得到每个参考样本的t1/2；
(b)扩增标的核酸；
(c)实时监测和侦测标的核酸的扩增；
(d)当标的核酸的扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
(e)使用以下的S形函数来拟合标的核酸的曲线：
<mrow>
<mi>N</mi>
<mi>S</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mn>1</mn>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>+</mo>
<msup>
<mi>e</mi>
<mrow>
<mo>-</mo>
<mrow>
<mo>(</mo>
<mrow>
<mi>t</mi>
<mo>-</mo>
<msub>
<mi>t</mi>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>/</mo>
<mn>2</mn>
</mrow>
</msub>
</mrow>
<mo>)</mo>
</mrow>
<mo>/</mo>
<mi>&tau;</mi>
</mrow>
</msup>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是该曲线的一斜率；
(f)以曲线本身的斜率将标的核酸的循环数正规化；
(g)重复步骤(e)，得到标的核酸的t1/2；以及
(h)经由查找参照表，以获得样本中包含标的核酸的拷贝数。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，标的核酸和参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测标的核酸和参考样本群的扩增。
16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述侦测到的信号是一种荧光信号。
18.一种从具有与标的核酸的相同核酸序列的参照样本群建立拷贝数对正规化循环数的参照表的方法，包括以下步骤：
(a)准备参考样本群；
(b)扩增参考样本群；
(c)实时监测和侦测参考样本群的扩增；
(d)当扩增饱和时，将侦测到的信号群正规化而落在0-1的范围内；
(e)使用以下的S形函数来拟合每个参考样本的曲线：
<mrow>
<mi>N</mi>
<mi>S</mi>
<mo>=</mo>
<mfrac>
<mn>1</mn>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>+</mo>
<msup>
<mi>e</mi>
<mrow>
<mo>-</mo>
<mrow>
<mo>(</mo>
<mrow>
<mi>t</mi>
<mo>-</mo>
<msub>
<mi>t</mi>
<mrow>
<mn>1</mn>
<mo>/</mo>
<mn>2</mn>
</mrow>
</msub>
</mrow>
<mo>)</mo>
</mrow>
<mo>/</mo>
<mi>&tau;</mi>
</mrow>
</msup>
</mrow>
</mfrac>
</mrow>
其中NS是一种正规化信号，t是一种循环数，t1/2是反应光达到最大反应光的一半时的部分循环，τ是曲线的斜率；
(f)以曲线本身的斜率，将每个参考样本的循环数正规化；
(h)重复步骤(e)，来得到每个参考样本的t1/2；以及
(i)建立在步骤(h)中所得到的每个参考样本的t1/2的参照表。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，参考样本群的扩增反应，是实时聚合酶链式反应。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，以光学装置或化学传感器来监测和侦测参考样本群的扩增。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述化学传感器是一种氢离子或一种焦磷酸盐。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述光学装置在DNA结合染料、嵌入染料、探针或分子信标的帮助下，进行监测和侦测参考样本群的扩增。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述光学装置是一种荧光信号检测装置，并且所述DNA结合染料在与双链核酸相互作用而用光激发后，发射由所述荧光信号检测装置所检测的一种荧光信号。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述信号是一种荧光信号。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15/201,623 US10510436B2 (en) | 2016-07-05 | 2016-07-05 | Using serial dilutions of reference samples to construct a reference table for sigmoidal fitting in real-time PCR copy number analysis |
| US15/201,623 | 2016-07-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107574231A true CN107574231A (zh) | 2018-01-12 |
Family
ID=59034473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710285801.0A Withdrawn CN107574231A (zh) | 2016-07-05 | 2017-04-27 | 用以实时定量核酸的方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10510436B2 (zh) |
| EP (1) | EP3266880A1 (zh) |
| JP (1) | JP6442538B2 (zh) |
| CN (1) | CN107574231A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020181602A1 (zh) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 深圳市检验检疫科学研究院 | 绝对定量方法、装置、计算机设备和存储介质 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102022207161A1 (de) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Verfahren zum Quantifizieren einer Lösung und mikrofluidische Analysevorrichtung |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101012484A (zh) * | 2004-09-01 | 2007-08-08 | 三星电子株式会社 | 从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法 |
| US20140005066A1 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-02 | Advanced Liquid Logic Inc. | Multiplexed PCR and Fluorescence Detection on a Droplet Actuator |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4440857B2 (ja) | 2004-09-01 | 2010-03-24 | 三星電子株式会社 | リアルタイム核酸増幅データから初期核酸濃度を定量化する方法 |
| CN101532063B (zh) | 2008-11-19 | 2011-08-31 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 黄尾鰤腹水病毒的实时定量rt-pcr快速检测方法 |
| JP5950740B2 (ja) | 2012-07-24 | 2016-07-13 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸増幅分析装置及び核酸増幅分析方法 |
| EP2971090B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-06 | Gen-Probe Incorporated | Calibration method, apparatus and computer program product |
| WO2016006612A1 (ja) | 2014-07-08 | 2016-01-14 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 核酸増幅装置、核酸増幅方法及び核酸増幅用チップ |
-
2016
- 2016-07-05 US US15/201,623 patent/US10510436B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-02 JP JP2017017299A patent/JP6442538B2/ja active Active
- 2017-04-27 CN CN201710285801.0A patent/CN107574231A/zh not_active Withdrawn
- 2017-06-02 EP EP17174311.5A patent/EP3266880A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101012484A (zh) * | 2004-09-01 | 2007-08-08 | 三星电子株式会社 | 从实时核酸扩增数据中定量核酸初始浓度的方法 |
| US20140005066A1 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-02 | Advanced Liquid Logic Inc. | Multiplexed PCR and Fluorescence Detection on a Droplet Actuator |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020181602A1 (zh) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 深圳市检验检疫科学研究院 | 绝对定量方法、装置、计算机设备和存储介质 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018000188A (ja) | 2018-01-11 |
| US10510436B2 (en) | 2019-12-17 |
| US20180011967A1 (en) | 2018-01-11 |
| JP6442538B2 (ja) | 2018-12-19 |
| EP3266880A1 (en) | 2018-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2044432B1 (en) | Minimizing effects of dye crosstalk | |
| JP4718431B2 (ja) | 分析法及び分析装置 | |
| Rebrikov et al. | Real-time PCR: a review of approaches to data analysis | |
| US10002229B2 (en) | Automatic threshold setting and baseline determination for real-time PCR | |
| US20200035329A1 (en) | Methods and systems for visualizing and evaluating data | |
| US10041884B2 (en) | Nucleic acid analyzer and nucleic acid analysis method using same | |
| CN110619927B (zh) | 一种实时荧光定量pcr的数据分析方法 | |
| CN109564189B (zh) | 电泳图谱分析 | |
| CN107574231A (zh) | 用以实时定量核酸的方法 | |
| KR101771402B1 (ko) | 핵산 정량 방법 | |
| CN105389479B (zh) | 用于分析核酸扩增反应的分析方法和系统 | |
| EP2002013A2 (en) | Assessment of reaction kinetics compatibility between polymerase chain reactions | |
| KR101969846B1 (ko) | Ｐｃｒ 데이터 및 다른 데이터에서 크로스토크의 영향을 보상하여 핵산을 분석하는 방법 및 장치 | |
| EP3126518B1 (en) | Methods and systems for pcr quantitation | |
| US20220326179A1 (en) | Biological Sample Analysis Device and Biological Sample Analysis Method | |
| TW201444979A (zh) | 用於核酸樣品的測量方法 | |
| Hawkins et al. | Rapid and easy protocol for quantification of next-generation sequencing libraries | |
| US20230094386A1 (en) | Method and Device for Carrying out a qPCR Process | |
| Fu et al. | Assumption-free analysis for amplification-based quantitative nucleic acid detection | |
| WO2022220686A1 (en) | Method for providing a detection output which is representative for the presence of a molecule of interest | |
| JP2011015620A (ja) | 標的核酸測定方法、標的核酸測定装置、標的核酸測定システム、および、標的核酸測定プログラム | |
| CN113337584A (zh) | 一种pH敏感的核酸定量检测方法和装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180112 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |