CN112538549A - 一种噬菌体活性现场快速检测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种噬菌体活性现场快速检测试方法，包括S1：RNA提取；S2：反转录；S3：引物设计；S4：配置PCR反应体系；S5：PCR扩增；S6：测序；S7：实时定量检测。本发明采用PCR和实时定量的方式，对噬菌体活性进行检测，使得检测的精确度和准确度更好；且在RNA提取提取的加入异丙醇离心后，静置1‑2h能够保证试管中的溶液挥发完全，从而得到的RNA浓度更高，为后续的检测提供保证。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体活性现场快速检测试方法。
背景技术
噬菌体(Bacteriophage)是在1907年和1909年分别由Twort和D.Herelle各自独立发现，噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体作为病毒的一种，具有病毒特有的一些特性：个体微小；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。
发酵工业常受噬菌体的危害，当出现噬菌体的时，轻则导致发酵周期长、影响产量，重则引起工厂停产，例如在发酵工业应用较广泛的是枯草芽孢杆菌，由于其具有发酵周期短、产物丰富、可利用开发价值高等优点，使它能够应用在食品加工、农业生产、能源开发等多个方面，但枯草芽孢杆菌极易感染噬菌体，枯草芽孢杆菌发酵工业受到的危害也尤其严重，因此对噬菌体活性的检测显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种噬菌体活性现场快速检测试方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种噬菌体活性现场快速检测试方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用；
S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；
S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：
SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；
SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；
S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管；
S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增；
S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；
S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。
优选的是，所述步骤S1中的RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O采用不同的试剂瓶盛装。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S4中PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S4中PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.21μL以及噬菌体cDNA 3μL。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S5中PCR反应循环参数为：
94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性15-30s，50-60℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止。
上述任一方案中优选的是，所述步骤S1中RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA。
本发明的技术效果和优点：该噬菌体活性现场快速检测试方法采用PCR和实时定量的方式，对噬菌体活性进行检测，使得检测的精确度和准确度更好；且在RNA提取提取的加入异丙醇离心后，静置1-2h能够保证试管中的溶液挥发完全，从而得到的RNA浓度更高，为后续的检测提供保证。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种噬菌体活性现场快速检测试方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用，RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O采用不同的试剂瓶盛装，RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA；
S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；
S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：
SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；
SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；
S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管，PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL，PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.2 1μL以及噬菌体cDNA 3μL；
S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增，PCR反应循环参数为：
94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性15s，50℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止；
S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；
S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。
实施例2：
一种噬菌体活性现场快速检测试方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用，RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O采用不同的试剂瓶盛装，RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA；
S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；
S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：
SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；
SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；
S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管，PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL，PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.2 1μL以及噬菌体cDNA 3μL；
S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增，PCR反应循环参数为：
94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性22s，55℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止；
S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；
S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。
实施例3：
一种噬菌体活性现场快速检测试方法，按照先后顺序包括以下步骤：
S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用，RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O采用不同的试剂瓶盛装，RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA；
S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；
S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：
SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；
SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；
S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管，PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL，PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.2 1μL以及噬菌体cDNA 3μL；
S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增，PCR反应循环参数为：
94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止；
S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；
S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。
实施例4：
本发明还提供一种噬菌体活性现场快速检测试方法，主要步骤为：
将样本直接浸泡于噬菌体液体中20-30min，取出后进行10倍逐级梯度稀释，分别取各级梯度稀释液100μL于选择培养基平板/TSA平板(依具体菌种种类决定)上进行涂布；
同时将未经浸泡的样本进行10倍逐级梯度稀释，后分别取各级梯度稀释液100μL于平板上进行涂布作为对照；
各处理重复3次，计算平均值，涂布完成后于目标温度下进行培养，待培养结束后取出平板统计菌落数量，对比相同稀释梯度下噬菌体浸泡处理的样本菌落数量与对照菌落数量；
若经噬菌体浸泡处理的样本菌落数量＜对照菌落数量，说明噬菌体具活性；若噬菌体浸泡处理的样本菌落数量≥对照菌落数量，说明噬菌体不具活性。
该方法用时由目标菌种生长时间决定，通常仅1天，若目标菌种生长迅速，生长周期6-8h，则该方法耗时更短。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
S1：RNA提取：采用RNA提取液对待测样本进行RNA提取，得到RNA备用；
S2：采用反转录试剂盒对上述步骤得到的RNA进行反转录，得到cDNA备用；
S3：利用primer 5.0设计引物，引物序列为：
SEQ ID NO.1：5，-TACCGTCCTTTTTCGGCTT-3，；
SEQ ID NO.2：3，-TGGTGGACGATACGCTGGC-5，；
S4：使用PCR反应液配置PCR反应体系，同时设置阳性对照和阴性对照，即获得阳性对照管、待测管和阴性对照管；
S5：将上述阳性对照管、待测管和阴性对照管放入到PCR仪中设定PCR参数，进行PCR扩增；
S6：取上述扩增结束的PCR液2μL，进行琼脂糖凝胶电泳，将待测管中与阳性对照管对应的条带进行回收测序，为所需条带序列，则选用步骤S2中的引物序列为实时定量的引物；
S7：利用上述噬菌体的cDNA为模板，加入实时定量试剂进行实时定量实验，来检测噬菌体的活性。
2.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S1中的RNA提取液包括氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O，且氯仿、异丙醇、乙醇和DEPC H2O采用不同的试剂瓶盛装。
3.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S4中PCR反应液包括13μM Taq DNA聚合酶50μL、150μM dNTP 100μL、SyBr染料200μL、15μM尿嘧啶糖基化酶50μL。
4.根据权利要求3所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S4中PCR反应体系为20μL，包括所述PCR反应液15μL、所述引物SEQ ID NO.1 1μL、所述引物SEQ ID NO.2 1μL以及噬菌体cDNA3μL。
5.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S5中PCR反应循环参数为：
94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性15-30s，50-60℃退火1min，72℃延伸20s，35个循环；10℃停止。
6.根据权利要求1所述的一种噬菌体活性现场快速检测试方法，其特征在于：所述步骤S1中RNA提取的具体步骤为取少量待测样本2-4μL，加入相应5倍体积的RNA提取液，均匀混合后置于水浴锅中，水浴锅的温度为60℃，放置30-50min，取出后涡旋震荡仪震荡5-10min，然后再放入65℃的水浴锅中20min，取出后加入等体积的异丙醇，室温放置5min，12000rpm离心5min后弃上清，然后静置1-2h，使其溶液挥发，加入20μL无菌水溶解制得所述样品RNA。
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| US20060216720A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-09-28 | Carvalho Maria Da Gloria | Development of a real-time PCR assay for detection of pneumococcal DNA and diagnosis of pneumococcal disease |
| CN110938678A (zh) * | 2015-09-02 | 2020-03-31 | 上海旺旺食品集团有限公司 | 快速恒温检测单核细胞增生李斯特菌的方法、引物组及试剂盒 |
-
2020
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