CN114292964B - 西番莲病毒的组合引物对及多重rt-pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西番莲病毒的组合引物对及多重RT‑PCR检测方法，该检测方法包括：提取待检样品的RNA，以此为模板进行多重RT‑PCR反应。在反应体系中，需加入西番莲病毒的组合引物对、缓冲液、酶、RNA模板和双蒸水，设定反应程序，进行反应。反应完成后，取出反应物，与核酸上样缓冲液按照产物：缓冲液=3:1比例混合均匀，点入琼脂糖凝胶孔中电泳，通过凝胶成像仪观察结果。本发明提供了一组用于同时鉴定西番莲东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、西番莲潜隐病毒和柑橘弹状病毒四种病毒的特异性引物，及一种基于多重RT‑PCR技术快速检测鉴定这四种病毒的方法，该方法方便快捷、一个反应可同时检测四种病毒，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种西番莲病毒的组合引物对及多重RT-PCR检测方法。
背景技术
西番莲又名百香果，广泛种植于热带和亚热带地区，在我国广东、广西、福建、江西、贵州、云南等省份均有栽培。西番莲果实含有130多种芳香类物质，香味独特，富含维生素C、类胡萝卜素、花青素等，营养价值高，当年种植即可挂果，挂果寿命可达10年，是一种经济效益相当可观的热带作物。病毒病是西番莲种植过程中影响其经济价值的重要因素之一，目前西番莲上已报道的病毒种类超过30种。东亚西番莲病毒(East Asian Passifloravirus,EAPV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)、西番莲潜隐病毒(Passiflora latent virus,PLV)和柑橘弹状病毒(Citrus-associatedcytorhabdovirus,CiaRV)是田间常见的4种病毒。EAPV是西番莲石果病的病原之一，可引起果实果皮变厚变硬，果肉少或无，果实风味变差；TeMV单独感染西番莲可引起植株叶片黄化、花叶，皱缩、畸形的症状，整株树势变弱；PLV单独感染植株可在叶片上引起系统的花叶症状；CiaRV感染植株可能与植株叶片的花叶和黄化症状相关。这4种病毒在田间经常两种、三种甚至四种混合侵染，而混合侵染可能会在寄主上引起更剧烈的症状。针对这些病毒病害，并无有效的化学药剂可以达到治疗的效果。现在生产上针对病毒病害的防控主要是通过清除田间病树、种植无病毒苗木和切断传播途径来防控，而这些防控措施的实施，需要准确、灵敏、快速的检测方法作为基础。针对这四种病毒，已经建立了单重聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法，TeMV以成功制备多克隆抗体，可用于单种病毒的快速检测。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，即在同一个反应中加入两对以上的引物，同时在同一个模板或不同模板之间进行多个核酸片段的扩增。与常规PCR相比，多重PCR技术拥有单个PCR的灵敏和特异性，又更加快捷、经济、增加了检测的通量，已应用于多种植物、动物病原检测中。反转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription–Polymerase chain reaction,RT-PCR)是PCR技术应用的变形，先将RNA转录成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段，广泛应用于RNA病毒的检测中。目前针对西番莲中以上四种病毒还未建立多重RT-PCR检测方法。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种西番莲病毒的组合引物对及多重RT-PCR检测方法。本发明根据TeMV的外壳蛋白基因(coat protein,CP)区域、EAPV的VPg基因区域、CiaRV的N基因区域特设计3对特异性的扩增引物，PLV的引物找寻于文献中，利用一步法多重RT-PCR技术，
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种检测西番莲病毒的组合引物对，其特征在于：所述西番莲病毒包括EAPV、TeMV、CiaRV和PLV；
EAPV-F：GAATGGTCACAACCCCAAC(SEQ ID NO.1)；
EAPV-R：TATCTAGGCATATACGGCTCT(SEQ ID NO.2)；
TeMV-F：GAATTGGATAGACAAGCCAT(SEQ ID NO.3)；
TeMV-R：CCACCTTTACGAATTCATTG(SEQ ID NO.4)；
CiaRV-F1：ATATTCACCCCGATAACCAAGG(SEQ ID NO.5)；
CiaRV-R1：GACACCCTGATAGAATCGAG(SEQ ID NO.6)；
PLVReh-RT-F：ATGCAAACAATGGGTAAGCA(SEQ ID NO.7)；
PLVReh-RT-R：TCGTTAAATTGCGAATACGG(SEQ ID NO.8)。
一种检测西番莲病毒的多重RT-PCR检测方法：其包括如下步骤：
(1)、模板RNA的提取：提取待检样品的RNA，待检样品是感染了四种病毒的西番莲样品；
(2)、一步法多重RT-PCR扩增反应：在20μL PCR管中配制反应体系：引物混合液2.8μL，2×one Step Mix缓冲液10.0μL，One Step酶混合液0.8μL，RNA模板1.0μL，RNase Free双蒸水5.4μL补齐20μL反应体系。将上述反应管放于PCR仪器反应槽中，设定反应程序为：50℃，孵育30min，94℃预变性4min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环，72℃再延伸7min；
上述引物混合液含有上述8条特异性引物(EAPV-F/R；TeMV-F/R；CiaRV-F1/R；PLVReh-RT-F/R)，其中引物EAPV-F/R在反应体系中的终浓度为0.3p mol·L-1，引物TeMV-F/R和CiaRV-F1/R在反应体系中的终浓度为0.15p mol·L-1，引物PLVReh-RT-F/R在反应体系中的终浓度为0.1p mol·L-1。
(3)结果判定：上述反应管在PCR仪器上反应完成后，吸取5μL反应产物，与2μL10×DNA Loading Buffer混合均匀(即与核酸上样缓冲液按照产物：缓冲液＝3:1比例混合均匀)后，点入制备好的浓度为1.5％的琼脂糖凝胶孔中，120V电压下，电泳30min后，在凝胶成像仪下紫外波段(260nm)下观察电泳结果，通过凝胶上是否可以观察到特异性的扩增片段来判定结果。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了一组用于同时鉴定西番莲上EAPV、TeMV、PLV和CiaRV四种病毒的特异性引物，及一种基于多重RT-PCR技术快速检测鉴定这四种病毒的方法，该方法方便快捷、一个反应可同时检测四种病毒，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明的一步法多重RT-PCR与一步法单重RT-PCR结果对比示意图。
图2为本发明应用于检测田间22份西番莲样品的电泳结果。
具体实施方式
本发明提供了一种西番莲病毒的组合引物对及多重RT-PCR检测方法。
1.一步法多重RT-PCR反应体系的准备
(1)、反应选取南京诺唯赞公司的一步法RT-PCR扩增试剂盒(HiScriptⅡone stepRT-PCR kit，货号：P611-01)，反应液中依次加入试剂盒中2×one Step Mix溶液10.0μL，RNase-free ddH2O 5.4μL；
(2)、引物液：包括终浓度为0.3p mol引物EAPV-F/R、0.15p mol引物TeMV-F/R和CiaRV-F1/R、和0.1p mol的引物PLVReh-RT-F/R，八条引物序列分别为：
EAPV-F：5＇-GAATGGTCACAACCCCAAC-3＇
EAPV-R：5＇-TATCTAGGCATATACGGCTCT-3＇
TeMV-F：5＇-GAATTGGATAGACAAGCCAT-3＇
TeMV-R：5＇-CCACCTTTACGAATTCATTG-3＇
CiaRV-F1：5＇-ATATTCACCCCGATAACCAAGG-3＇
CiaRV-R1：5＇-GACACCCTGATAGAATCGAG-3＇
PLVReh-RT-F：5＇-ATGCAAACAATGGGTAAGCA-3＇
PLVReh-RT-R：5＇-TCGTTAAATTGCGAATACGG-3＇
(3)、一步法酶混合液：One step enzyme mix溶液，加入0.8μL。
2.模板RNA的提取：
模板RNA提取采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂来进行，操作参照说明书，具体步骤如下：
(1)称取0.1g左右新鲜干净叶片切碎，置于液氮预冷研磨管中，再将研磨管固定在研磨机上快速研磨；
(2)取出研磨管，开启管盖，用牙签快速挑取适量组织粉末在含有1mL TRIzolReagent裂解液预冷离心管中，并剧烈混匀，室温静置10min；
(3)4℃，12900r/min离心5min，取800μL上清液在1.5mL无酶离心管中，用移液枪加入约1/5体积(即160μL)预冷氯仿，剧烈震荡后4℃静置7min；
(4)4℃，12900r/min离心5min，取500μL上清转至新1.5mL无酶离心管，加入等体积异丙醇，并轻柔混匀，置于-20℃冰箱静置沉淀30min以上；
(5)4℃，12900r/min离心10min，去上清，加入1mL预冷75％酒精进行清洗，4℃、8000r/min离心1min，去上清，重复该操作2次；
(6)4℃瞬时离心10s，用200μL枪头吸出多余酒精，置于安全生物柜风干10min，加入20μL灭菌水溶解，并4℃、8000r/min离心1min；
(7)总RNA采用Nanodrop 2000检测其浓度和纯度，加入1μL提取的RNA作为反应模板，剩余RNA保存至-20℃备用。
3.一步法多重RT-PCR的扩增反应程序
在20μL PCR管中依次加入以上反应液，将PCR管放置于PCR仪器上，设定反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环，72℃再延伸7min。反应结束后取出反应管进行琼脂糖凝胶电泳。
4.结果判定：
取5μL反应产物，与2μL 10×DNA Loading Buffer混合均匀后，点入制备好的浓度为1.5％的琼脂糖凝胶孔中，120V电压下，电泳30min后，在凝胶成像仪下紫外波段下观察电泳结果。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 赣南师范大学
<120> 西番莲病毒的组合引物对及多重RT-PCR检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 1
gaatggtcac aaccccaac 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 2
tatctaggca tatacggctc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 3
gaattggata gacaagccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 4
ccacctttac gaattcattg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 5
atattcaccc cgataaccaa gg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 6
gacaccctga tagaatcgag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 7
atgcaaacaa tgggtaagca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 8
tcgttaaatt gcgaatacgg 20
Claims (5)
1.一种西番莲病毒的组合引物对，其特征在于：所述西番莲病毒包括东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、西番莲潜隐病毒和柑橘弹状病毒；
所述东亚西番莲病毒的上游引物如：GAATGGTCACAACCCCAAC，下游引物如：TATCTAGGCATATACGGCTCT；
所述夜来香花叶病毒的上游引物如：GAATTGGATAGACAAGCCAT，下游引物如：CCACCTTTACGAATTCATTG；
所述柑橘弹状病毒的上游引物如：ATATTCACCCCGATAACCAAGG，下游引物如：GACACCCTGATAGAATCGAG；
所述西番莲潜隐病毒的上游引物如：ATGCAAACAATGGGTAAGCA，下游引物如：TCGTTAAATTGCGAATACGG。
2.一种西番莲病毒的多重RT-PCR检测方法：其特征在于：其包括如下步骤：
（1）、提取待检西番莲植物的总RNA；
（2）、在多重RT-PCR反应体系中，加入如权利要求1所述的组合引物对、缓冲液、双蒸水、酶和RNA模板，然后设定反应程序；
（3）、反应完成后，取出反应物，与上样缓冲液混合均匀，点入琼脂糖凝胶孔中电泳，在凝胶成像仪上观察结果。
3.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT-PCR检测方法：其特征在于：步骤（1）中，所述西番莲病毒包括东亚西番莲病毒、夜来香花叶病毒、西番莲潜隐病毒和柑橘弹状病毒。
4.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT-PCR检测方法：其特征在于：步骤（2）中，所述组合引物对包括东亚西番莲病毒的上游引物如：GAATGGTCACAACCCCAAC，下游引物如：TATCTAGGCATATACGGCTCT；
夜来香花叶病毒的上游引物如：GAATTGGATAGACAAGCCAT，下游引物如：CCACCTTTACGAATTCATTG；
柑橘弹状病毒的上游引物如：ATATTCACCCCGATAACCAAGG，下游引物如：GACACCCTGATAGAATCGAG；
西番莲潜隐病毒的上游引物如：ATGCAAACAATGGGTAAGCA，下游引物如：TCGTTAAATTGCGAATACGG。
5.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT-PCR检测方法：其特征在于：步骤（2）中，所述反应程序为：50℃，孵育30 min，94℃预变性4 min，94℃变性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃再延伸7 min。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108486283A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-09-04 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法 |
| CN110846440A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-28 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 |
| CN111424118A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-07-17 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种西番莲病毒病原多重复合pcr检测方法 |
| CN113025750A (zh) * | 2021-02-20 | 2021-06-25 | 广东省科学院生物工程研究所 | 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108486283A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-09-04 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法 |
| CN110846440A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-28 | 福建省农业科学院果树研究所 | 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 |
| CN111424118A (zh) * | 2020-04-24 | 2020-07-17 | 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 | 一种西番莲病毒病原多重复合pcr检测方法 |
| CN113025750A (zh) * | 2021-02-20 | 2021-06-25 | 广东省科学院生物工程研究所 | 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
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| Simultaneous detection and differentiation of four viruses in passion fruit plants by a multiplex RT‑PCR;Aijun Huang等;Tropical Plant Pathology;第48卷(第1期);23-29 * |
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